Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт

Сальников, Николай Игоревич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт"

На правах рукописи

005056'^

Сальников Николай Игоревич

ВЫЯВЛЕНИЕ И ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ГЕНОМОВ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОЛЕЗНИ НАЙРОБИ И ЛИХОРАДКИ ДОЛИНЫ РИФТ

03.01.06 — Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

15 ноя тг

Покров-2012

005055232

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии (ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии

Научный руководитель:

доктор биологических наук,

профессор Цыбанов Содном Жамьянович

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии)

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Балышева Вера Ивановна

(ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров)

доктор биологических наук,

старший научный сотрудник Ярыгина Елена Игоревна

(ФГБОУ ВПО МГАВМиБ, г. Москва)

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Федеральны! центр охраны здоровья животных» (ФГБУ «ВНИИЗЖ»), г. Владимир

Защита диссертации состоится «30» ноября 2012 г. в 12.30 часов н; заседании диссертационного совета Д 006.003.01 при Государственно» научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институ ветеринарной вирусологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу 601120, Владимирская область, г. Покров, ГНУ ВНИИВВиГу Россельхозакадемии. Тел./факс: 8 (49243) 6-21-25.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИВВиК* Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « 25 » октября 2012 г.

Размещен на официальном сайте ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии www.vniivvim.ru и на официальном сайте ВАК России www.vak2.ed.gov.ro

Ученый секретарь диссертационного совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, кандидат биологических наук

Е.А. Балашова

1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ 1.1 Актуальность

Вирусы болезни Найроби и лихорадки долины Рифт (ЛДР) - представители семейства Випуттйае - являются возбудителями опасных заболеваний животных и человека [1,17].

Болезнь Найроби - инфекционная вирусная болезнь овец, характеризующаяся острым течением, поражением нервной системы, органов кровообращения и дыхания. Представляет опасность для человека, вызывая лихорадку и геморрагические явления. Переносчиками возбудителя являются иксодовые клещи, в изобилии распространенные в Кении, Уганде, Конго (район озера Киву) и ЮАР (провинция Наталь), где постоянно регистрируется болезнь Найроби [6,10].

Лихорадка долины Рифт — это антропозоонозная, особо опасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока. Вирус ЛДР обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. Вирус передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей. Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, т.к. обуславливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных. Болезнь зарегистрирована в Кении, Уганде, Южно -Африканской республике, Родезии, Судане, Анголе, Мозамбике, Нигерии, Экваториальной Гвинее и Австралии [2].

Поскольку оба вируса поражают одни и те же виды животных, обладают перекрывающимися ареалами и вызывают инфекции со сходными клиническими проявлениями, дифференциация их друг от друга является актуальной.

Изучению вирусов болезни Найроби и ЛДР посвящено большое количество работ отечественных и зарубежных исследователей. За рубежом разработаны и широко используются тест - системы для выявления генома вируса ЛДР методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени [7,11,15,16]. Кроме того, в базе данных генетической информации (ОспВапк) депонировано большое количество полноразмерных нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов

1.2 Степень разработанности проблемы

и изолятов вируса ЛДР. Помимо молекулярно-генетических, разработано больше количество серологических методов для обнаружения вируса ЛДР и антител нему. В ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии разработана методик твердофазного иммуноферментного анализа, позволяющая обнаруживать вир> ЛДР в различных образцах биологического материала (пробах органов, культура клеток, крови) [3].

В отличие от вируса ЛДР, исследованием генома вируса болезни Найроб занимается лишь небольшая группа сотрудников Центра по контролю предотвращению особо опасных заболеваний (США). Ими проведен секвенирование и филогенетический анализ азиатских и африканских штамме вируса болезни Найроби [13]. Однако в научной литературе нет данных разработке методов генодиагностики вируса болезни Найроби, а также методе дифференциальной диагностики вирусов болезни Найроби и ЛДР.

В данной работе определены нуклеотидные последовательности фрагменте генов и проведен филогенетический анализ музейных штаммов вирусов болезн Найроби и ЛДР. Предложены способы выявления генома вируса болезни Найроб методами гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времен! Представлена методика дифференциации геномов вирусов болезни Найроби ЛДР на основе мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

1.3 Цель и задачи исследования

В связи с вышеуказанным, основной целью исследований являлас разработка средств выявления геномов вирусов болезни Найроби и лихорадк долины Рифт.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующи задачи:

1) разработать тест - системы для выявления генома вируса болезн Найроби методами ОТ-ПЦР с электрофоретической детекцией результатов и режиме реального времени, определить их чувствительность и специфичность;

2) разработать тест - систему на основе мультиплексной ОТ - ПЦР в режим реального времени для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР определить её чувствительность и специфичность;

3) определить нуклеотидные последовательности различных участков гено музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР;

4) провести филогенетический анализ геномов музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР.

1.4 Научная новизна работы

Впервые определены нуклеотидные последовательности генов N и Gn четырех штаммов вируса болезни Найроби (NSD-X, МК, ММ, ММ/К-05), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и установлено, что геномы этих штаммов филогенетически близки геному африканского штамма NSD 708 (степень нуклеотидной идентичности относительно гена N составляет 88 - 90 %, а относительно гена Gn - 97 - 98 %).

Впервые определены нуклеотидные последовательности генов NSs и Gc четырех штаммов вируса ЛДР (RVF(s)13, RVF(s)113, RVF 2002/09-ПС, 1974-ВНИИВВиМ), депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, и установлено, что геномы этих штаммов филогенетически близки геномам эпизоотического вирулентного штамма Entebbe и аттенуированного штамма Smithburn (степень нуклеотидной идентичности между последовательностями генов NSs и Gc составляет 99,0 — 99,7 %).

Впервые разработана тест-система для выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР, авторство изобретения которой подтверждено патентом РФ № 2416647 (бюллетень № 11 от 20 апреля 2011 г.).

Впервые разработаны тест - система для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени и тест-система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени.

1.5 Практическая значимость работы Разработаны "Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом гнездовой полимеразной цепной реакции", "Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", "Методические положения по выявлению РНК вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени", утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины

Россельхозакадемии Смирновым А.М. 16.11.2011, 30.11.2011 и 10.11.2011 соответственно.

1.6 Публикации результатов

По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, в том числе 1 статья журнале «Ветеринарная патология», включенном в перечень изданий рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

1.7 Апробация работы Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях Ученого совета ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии (2009-2011 гг.).

Материалы диссертации доложены на конференции "Актуальные проблем] инфекционной патологии ветеринарной медицины", посвященной 50-летт ВНИИВВиМ (г. Покров, 2009 г.), Всероссийской научно - практическо: конференции с международным участием "Молекулярная диагностика -2010" (г Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции "Высоки технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологго физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011 г.), 40М, 50Ми 6ом Международны конгрессах EPIZONE (г. Сент-Мало, Франция, 2010г.; г. Арнем, Нидерланды 2011; г. Брайтон, Великобритания, 2012).

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите В соответствии с формулой специальности 03.01.06, Биотехнология (в toi числе бионанотехнологии) — область науки об использовании живых организмог культур клеток и биологических процессов в производстве с целью получени полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду формирование экологически доброкачественной среды обитания человека i животных. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест систем на основе ПЦР и её модификаций, позволяющие выявлять геномы вирусо болезни Найроби и ЛДР в различных пробах биологического и патологическог материала. К данным тест-системам разработаны рекомбинантные положительны контроли, при создании которых применялись методы клонирования ДНК составе плазмидных векторов в клетках Escherichia coli, проведено секвенировани фрагментов S - и М - сегментов геномов штаммов вирусов болезни Найроби i

4) провести филогенетический анализ геномов музейных штаммов вирусов болезни Найроби и ЛДР.

1.4 Научная новизна работы

Россельхозакадемии Смирновым A.M. 16.11.2011, 30.11.2011 и 10.11.2011 соответственно.

1.6 Публикации результатов

Материалы диссертации доложены на конференции "Актуальные проблемь инфекционной патологии ветеринарной медицины", посвященной 50-летии ВНИИВВиМ (г. Покров, 2009 г.), Всероссийской научно - практическо] конференции с международным участием "Молекулярная диагностика -2010" (г Москва, 2010 г.), Международной научно-практической конференции "Высоки технологии, прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии физиологии и медицине" (Санкт-Петербург, 2011 г.), 4ом, 5оми 6ом Международны: конгрессах EPIZONE (г. Сент-Мало, Франция, 2010г.; г. Арнем, Нидерланды 2011; г. Брайтон, Великобритания, 2012).

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой она рекомендуется к защите В соответствии с формулой специальности 03.01.06, Биотехнология (в тог числе бионанотехнологии) - область науки об использовании живых организмов культур клеток и биологических процессов в производстве с целью получени полезных продуктов для народного хозяйства, медицины и ветеринарии целенаправленно улучшающих воздействие на окружающую среду i формирование экологически доброкачественной среды обитания человека ] животных. В диссертационной работе проведены исследования по созданию тест систем на основе ПЦР и её модификаций, позволяющие выявлять геномы вирусов болезни Найроби и ЛДР в различных пробах биологического и патологического материала. К данным тест-системам разработаны рекомбинантные положительны контроли, при создании которых применялись методы клонирования ДНК в составе плазмидных векторов в клетках Escherichia coli, проведено секвенирование фрагментов S - и М - сегментов геномов штаммов вирусов болезни Найроби и

ЛДР, депонированных в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, а также их филогенетический анализ.

Результаты научного исследования соответствуют пунктам паспорта специальности - 1,9, 11.

1.9 Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и состоит из разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список использованной литературы, включающий 27 отечественных и 110 иностранных источников, дополнена приложениями. Диссертация содержит 14 таблиц и 17 рисунков. В приложениях представлены документы, подтверждающие достоверность результатов работы, ее научную и практическую значимость.

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Высокоспецифичные и чувствительные тест-системы для выявления генома вируса болезни Найроби методами гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

2. Высокоспецифичная и чувствительная тест-система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.

3. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов N и Gn штаммов ММ, ММ/К-05, МК, NSD-X вируса болезни Найроби.

4. Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей генов NSs и Gc штаммов RVF(s)13, RVF(s)113, RVF 2002/09-ПС, 1974-ВНИИВВиМ вируса ЛДР.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы

Основной объем исследований проведен автором самостоятельно. Консультативную и методическую помощь при выполнении отдельных этапов работы оказывали следующие сотрудники института: зав. сектором изучения АЧС, к.б.н., Малоголовкин A.C. (освоение молекулярно-биологических методов); ведущий научный сотрудник лаборатории Биотехнологии, к.б.н. Капустина О.В.; зав. НЭО, к.в.н. Живодеров С.П. (эксперименты по заражению животных).

2 СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 Материалы 2.1.1 Вирусы

В работе использованы штаммы вируса болезни Найроби (ММ, ММ/К-05 МК, NSD-X) и вируса ЛДР (1974-ВНИИВВиМ, RVF 2002/09-ПС, RVF(s)113 RVF(s)13), находящиеся в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиГ\ Россельхозакадемии.

Клиническим материалом служили кровь и пробы органов (мозг, печень сердце, легкие, селезенка, лимфатические узлы) от эксперименталь» инфицированных животных.

В качестве гетерологичных образцов использовали пробы культур клеток инфицированных вирусам болезней Акабане, Ибараки, блютанга. В качеств отрицательных контролей использовали пробы крови и органов от клиничесю здоровых животных, а также интактные культуры клеток.

2.1.2 Животные

Для экспериментального заражения вирусами болезни Найроби и ЛД] использовали клинически здоровых овец и белых мышей из сектора подготовь животных ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

2.1.3 Плазмиды и бактериальные штаммы Для клонирования использовали коммерческие наборы Qiagen PCR Clonin; Kit (Qiagen, Германия) и Ins TAclone PCR cloning kit (Fermentas, Латвия). 1 качестве векторов для клонирования использовали плазмиды pDrive (Qiager Германия) и pTZ57R/T(Fermentas, Латвия) и клетки Escherichia coli штамм ТОР 10.

2.2 Методы 2.2.1 Выделение РНК Выделение РНК методом нуклеосорбции проводили по методике, описанноГ R. Boom (1990) в нашей модификации, выделение фенольно-детергентньп методом - по методике P. Chomczynski и N. Sacchi (1987) [8,9].

2.2.2 Синтез кДНК Реакцию обратной транскрипции проводили в реакционной смеси объемог 20 мкл, содержащей 10 пмоль обратного праймера; 0,03 ммоль дНТФ; 0,07 ммоль MgCl2; 1,88 ммоль КС1; 1,25 ммоль Трис-HCl (рН 7,5); 0,25 ммоль дитиотрейтола; 30 ед. MMLV-ревертазы. В пробирки с реакционной смесью под масло вносили по

5 мкл РНК, далее пробирки инкубировали на термостате в течение 30 мин при температуре 42°С и 5 мин при температуре 88°С.

2.2.3 Постановка полимеразпой цепной реакции Для постановки классического варианта ПЦР использовали амплификаторы "Терцик-МС2" (ЗАО "НПФ ДНК-технология", Россия) и "Palm Cycler" (Corbett Research, Австралия). Реакцию проводили в смеси объемом 25 мкл следующего состава: 10 пмоль каждого праймера; 0,03 ммоль дНТФ; 0,07 ммоль MgCl2; 1,88 ммоль KCl; 1,25 ммоль Трис-HCl (pH 7,5); 3 ед. Taq-полимерэзы и 5 мкл кДНК.

2.2.4 Анализ продуктов ПЦР Анализ продуктов ПЦР проводили методом электрофореза ДНК в 1,5 - 2% агарозном геле, содержащем 0,4-0,5 мкг/мл интеркалирующего красителя бромистого этидия. Электрофорез проводили, используя трис-ацетатный или трис-боратный буфер при напряженности электрического поля 8-10 В/см в течение 2030 минут.

2.2.5 Выделение и очистка продуктов ПЦР

Выделение и очистку продуктов ПЦР проводили с помощью этанольной преципитации непосредственно из реакционной смеси, а также из агарозного геля методами фенольной экстракции после механического разрушения геля, а также нуклеосорбции после растворения геля буфером на основе иодида натрия [5,14].

2.2.6 Нуклеотидное секвенирование Секвенирование очищенных амплифицированных фрагментов ДНК проводили с использованием реактивов "Big Dye v. 3.1. Terminator" и "5><Sequencing buffer" (Applied Biosystems, США) в соответствие с прилагаемой инструкцией. Реакцию ставили в параллелях с прямыми и обратными праймерами.

2.2.7 Клонирование фрагментов генов Фрагменты генов, амплифицированные методом ОТ-ПЦР лигировали с Т-векторами в соответствии с инструкциями к наборам. Методом электропорации трансформировали рекомбинантной плазмидой компетентные клетки Е. coli, штамм Тор 10 (Invitrogen, США). Методом щелочного лизиса из 1,5 - 2 мл бактериальной культуры каждого клона выделяли плазмидную ДНК, которую затем проверяли методом ПЦР на наличие вставки требуемой нуклеотидной последовательности [5,14].

2.2.8 Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей

Множественное выравнивание нуклеотидных последовательносте" проводили с использованием алгоритма "Clustal W" программы "Bio Edit 7.0.0". Для разработки олигонуклеотидных праймеров и зондов использовали программ! "Oligo 6.0" и "Primer Express". Специфичность рассчитанных олигонуклеотидо: проверяли при помощи интернет — сервиса BLAST (http://www.ncbi.gov.nlm.comj Филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей проводили помощью программы "Mega 5.05".

2.2.9. Статистическая обработка полученных результатов Полученные результаты подвергали статистической обработк общепринятыми методами, используемыми в биологии. Достоверност статистической разницы между средними величинами определяли по разностном; методу Стьюдента - Фишера [4].

3 Результаты собственных исследований 3.1 Разработка тест - системы для выявления генома вируса болезни Найроби на основе гнездовой ОТ - ПЦР На первом этапе работы провели анализ доступных в базе данных GenBanl нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов вируса болезн] Найроби. В качестве мишени для отжига праймеров была выбрана нуклеотидна последовательность гена нуклеокапсидного белка (N) малого (S) сегмента генома. Для проведения реакции обратной транскрипции и амплификации выбранноп участка генома рассчитаны 2 пары праймеров. Первая (внешняя) пара праймеро (NSD FpNSD Ri) фланкирует на последовательности геномной РНК участо: размером 930 п.о., а вторая (внутренняя) пара (NSD F2-NSD R2) - участок размерор 360 п.о., расположенный внутри первого участка.

Для проверки специфичности рассчитанных праймеров была проведен амплификация участка геномной РНК вируса болезни Найроби (штамм ММ/К-05). Синтез кДНК проводили по описанной выше методике с использованием праймера NSD Rj. Электрофорез продуктов амплификации показал, что во 2-ом раунде синтезируется фрагмент рассчитанного размера - 360 п.о. (Рис.1).

Фрагмент 360 п.о.

Рисунок 1. Электрофореграмма результатов 2-го раунда гнездовой ОТ-ПЦР. М-маркер молекулярной массы (100-1000 п.о.); 1-РНК вируса болезни Найроби (штамм ММ/К-05), 2-отрицательный контроль.

Для определения специфичности разработанной тест-системы исследовали препараты РНК, выделенной из образцов биологического и патологического материала, содержащего вирус болезни Найроби, гетерологичные вирусы, а также из интактных образцов.

Ложноположительных и ложноотрицательных результатов при этом получено не было (Рис.2).

1 2 3 4 5 6 7 8 ^^^^^ ^^^^^^ 9 I 2 —

ШШш МНр тШт ЯШ

Рисунок 2. Электрофореграмма результатов определения специфичности выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР; 1,2,3,4,6,11 - образцы, содержащие РНК вируса болезни Найроби; 5,7,8,9,10 - образцы, содержащие РНК гетерологичных вирусов, 12,13,14 - отрицательные образцы; ОКВ - отрицательный контроль выделения; ОК - отрицательный контроль; ПК - положительный контроль.

Аналитическую чувствительность определяли амплификацией РНК вируса, выделенной из последовательных десятикратных разведений вируссодержащей жидкости культуры клеток почки сайги, инфицированной вирусом болезни Найроби (штамм ММ/К-05). В ходе опыта РНК вируса болезни Найроби была выявлена в разведениях культурального материала от 10° до 106, при этом титр

максимального выявленного разведения вируса составил 0,2 lg ТЦД so/cm3-На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания тест -системы, а также разработаны методические положения по ее применению, утвержденные академиком — секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. 16.11.2011 г.

3.2 Разработка тест-системы для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ - ПЦР в режиме реального времени

Для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ - ПЦР в режиме реального времени подобраны олигонуклеотидные праймеры, фланкирующие фрагмент размером 105 п.о. гена нуклеокапсидного белка N. Для детекции продуктов амплификации в режиме реального времени подобран зонд технологии Taq -man, содержащий на 5'-конце излучатель флуоресценции HEX, а на З'-конце - гаситель BHQ2.

Оптимизацию условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием в качестве мишеней для отжига праймеров препараты РНК, выделенные из вируссодержащей жидкости культуры клеток почки сайги, инфицированной вирусом болезни Найроби (шт. ММ/К-05) и 20% суспензии мозга белых мышей-сосунков, инфицированных вирусом болезни Найроби (штамм ММ). Эмпирическим путем были подобраны оптимальная температура отжига праймеров - 63°С, концентрации MgCb (3,3 мкМ), дНТФ (0,3 мкМ), зонда (0,12 пмоль/мкл) и праймеров (0,4 пмоль/мкл) в реакционной смеси для амплификации. Амплификацию с детекцией результатов в реальном времени проводили с использованием детектирующих термоциклеров "IQ-5" (BioRad, США) и "Rotor Gene 6000" (Corbett Research, Австралия).

Для конструирования положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени использовали фрагмент S-сегмента генома размером 866 п.о. вируса болезни Найроби (штамм ММ/К-05), содержащий нуклеотидные последовательности, комплементарные праймерам ExC U, ExC D и зонду ExC Z. Данный фрагмент клонировали в составе плазмидного вектора pDrive (Qiagen, Германия).

Специфичность тест-системы оценивали путем исследования препаратов РНК вирусов болезни Найроби, лихорадки долины Рифт, блютанга, болезней

Акабане и Ибараки, а также препаратов нуклеиновых кислот, выделенных из крови интактных овец, коз и коров. Положительные результаты были получены только для препаратов РНК вируса болезни Найроби, что свидетельствует о специфичности разработанной тест-системы (Рис.4).

Аналитическую чувствительность ПЦР определяли, исследуя препараты РНК, выделенные из последовательных десятикратных разведений вируссодержащей жидкости культуры клеток почки сайги, содержащей вирус болезни Найроби с титром инфекционной активности - 6,2 ± 0,2 ТЦД5о/сМ3-Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени составило 0,2 ^ ТЦД 5о/см 3 (рис. 5).

На базе лаборатории Биофизики проведены комиссионные испытания тест -системы, а также разработаны методические положения по ее применению, утвержденные академиком - секретарем отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии 30.11.2011 г.

Cycle

Рисунок 4. Результаты определения аналитической специфичности ОТ-ПЦР в режиме реальном времени. 1,2,3,4,6,11 - образцы, содержащие РНК вируса болезни Найроби; 5,7,8,9,10,12,13 — образцы, содержащие РНК гетерологичиых вирусов, и интактные образцы; ОК — отрицательный контроль ПЦР, ОКВ - отрицательный контроль выделения; ПК -

Рисунок 5. Результаты определения аналитической чувствительности ОТ-ПЦР в режиме реальном времени. Цифрами обозначены разведения вируссодержащей жидкости культуры клеток почки сайги, инфицированной вирусом болезни Найроби, - от исходного до 10"7 ; ОК- отрицательный контроль ПЦР, ОКВ - отрицательный контроль выделения.

3.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт методом мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени

На основе анализа имеющихся в базе данных ОепВапк нуклеотидных последовательностей различных штаммов вируса болезни Найроби и ЛДР были подобраны и синтезированы 2 пары олигонуклеотидных праймеров, комплементарные генам нуклеокапсидных белков N обоих вирусов (праймеры N50 и и N80 О гибридизуются с геномом вируса болезни Найроби, праймеры ЯУР и и ЯУТ О - с геномом вируса ЛДР). Для детекции накопления продуктов амплификации генома вируса болезни Найроби использован олигонуклеотидный зонд N80 Ъ, меченый флуорофором Су5, а генома вируса ЛДР - зонд Ъ, меченый флуорофором РАМ.

Оптимизацию условий постановки ОТ-ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием в качестве мишеней для отжига праймеров препараты РНК вирусов болезни Найроби и ЛДР. Реакцию обратной транскрипции проводили по описанной выше методике с использованием праймеров N80 О и ЯУР О. Амплификацию с детекцией результатов в реальном

времени проводили с использованием детектирующих термоциклеров "IQ-5" (BioRad, США) и "Rotor Gene 6000" (Corbett Research, Австралия).

Для конструирования рекомбинантных положительных контролей к тест-системе на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени использовали амплифицированные фрагменты S- сегментов геномов вирусов болезни Найроби (штамм ММ/К-05) и ЛДР (штамм RVF-2002/09-ПС), соответственно.

Аналитическую чувствительность мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени определяли, исследуя препараты РНК, выделенные из последовательных десятикратных разведений образцов культурального материала (культуры клеток почки сайги), содержащего вирусы болезни Найроби (штамм ММ/К-05) и ЛДР (штамм RVF 2002/09-ПС). Пределом чувствительности считали максимальное разведение, при котором регистрировали положительный результат.

Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени для вируса болезни Найроби составило 2,2 ± 0,2 lg ТЦД so/см3, Для вируса ЛДР - 2,5 ± 0,3 lg ТЦД 5о/с„ 3-

Специфичность тест-системы оценивали путем исследования препаратов РНК вирусов болезни Найроби, лихорадки долины Рифт, гетерологичных вирусов, а также препаратов нуклеиновых кислот, выделенных из интактных образцов (Рис.6 и 7).

_Cycle_

Рисунок 6. Результаты определении специфичности выявления генома вируса ЛДР методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реальном времени. 1,2— образцы, содержащие РНК вируса ЛДР; 3-17 — образцы, содержащие РНК гетерологичных вирусов, и интактные образцы; ОК - отрицательный контроль ПЦР, ОКВ -отрицательный контроль выделения; ПК - положительный контроль.

Cycle

Рисунок 7. Результаты определения специфичности выявления генома вируса болезни Найроби методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реальном времени. 1-10 — образцы, содержащие РНК вируса болезни Найроби; 11-17 - образцы, содержащие РНК гетерологичных вирусов, и интактные образцы; ОК - отрицательный контроль ПЦР, ОКВ -отрицательный контроль выделения; ПК — положительный контроль.

Исследованные препараты РНК гетерологичных вирусов и интактные образцы оказались отрицательными на наличие геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР. Кроме того, было показано, что праймеры и зонд, комплементарные геному вируса болезни Найроби, не взаимодействовали с геномом вируса ЛДР, и наоборот.

3.4 Выявление генома вируса болезни Найроби в пробах органов от экспериментально зараженных белых мышей

Для определения возможности выявления генома вирусов болезни Найроби и ЛДР в пробах органов инфицированных животных были проведены эксперименты по заражению животных. С этой целью 10 белых мышей - сосунков были интрацеребрально заражены вирусом болезни Найроби (штамм ММ) в дозе 1000 MicLDso- На 3 сутки после заражения мышей убивали, от каждой были взяты пробы мозга, печени и сердца. При исследовании этих проб методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени был выявлен геном вируса болезни Найроби.

3.5 Выявление генома вируса болезни Найроби в пробах крови и органов от экспериментально зараженных вакцинированных и невакцинированных

овец

В эксперименте использованы четыре овцы. Первую и вторую овцу прививали вакциной, изготовленной из атгенуированного штамма ММ вируса болезни Найроби, третья и четвертая овцы были контрольными. Через 14 дней после иммунизации провели заражение вакцинированных и контрольных овец вирусом болезни Найроби (вирулентный штамм Ы80-Х). После инфицирования у контрольных овец (№№ 3 и 4) развилась лихорадка и в крови был выявлен геном вируса болезни Найроби. Впоследствии у овцы № 4 появились характерные клинические признаки болезни (диарея, угнетение, отказ от корма) и на 6 сутки она пала. У овцы № 3 болезнь протекала в более мягкой форме, и после 8 -дневной лихорадки животное выздоровело. Геном вируса болезни Найроби в пробах крови этой овцы выявляли с 4 до 7 суток после заражения; начиная с 8 суток (т.е. после падения температуры) геном возбудителя не выявляли) (Рис. 8).

С помощью разработанной тест - системы были исследованы пробы органов от павшей овцы. Геном вируса болезни Найроби был обнаружен в пробах сердца, печени, почек, легких, селезенки, слепой кишки и брыжеечных лимфатических узлов (Рис. 9). Вакцинированные овцы на протяжении всего времени наблюдения оставались здоровыми. В пробах крови от этих овец геном вируса болезни не обнаруживали, что свидетельствует об отсутствии репродукции вируса в их организме.

// ш

/ /

ТЬгееЬлИ

10 1 5 20 25 30 35 ВД

_Ме__

Рисунок 8. Результаты выявления генома вируса болезни Найроби в пробах крови от экспериментально инфицированных овец

Рисунок 9. Результаты выявления генома вируса болезни Найроби в пробах органов от павшей овцы. Пробы: 1-печень, 2-селезенка, 3-лимфатический узел, 4-почка, 5 - сердце, 6-легкое, 7-кишечник. ПК - положительный контроль, OK-отрицательный контроль ПЦР, ОКВ - отрицательный контроль выделения.

3.6. Секвенирование и филогенетический анализ геномов музейных штаммов

вируса болезни Найроби

Для проведения филогенетического анализа были использованы гены нуклеокапсидного белка (N) и гликопротеина (Gn) штаммов NSD-X, МК, ММ, ММ/К-05 вируса болезни Найроби, депонированных в коллекции музейных штаммов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

В результате проведенных исследований были определены нуклеотидные последовательности фрагмента (930 п.о.) гена N и фрагмента гена Gn (783 п.о.), которые были проанализированы в программе Mega 5.0. Филогенетические деревья (Рис. 10 и 11) строили по методу максимальной экономии, достоверность распределения последовательностей по группам оценивали бутстрэп - анализом со 100-кратной повторностью. Кроме того в работе были использованы геномные последовательности различных штаммов вируса болезни Найроби, доступные в базе данных генетической информации GenBank.

Рисунок 10. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена N вируса болезни Найроби (метод максимальной экономии)

NSDV strain X G1 - gene - NSDV strain MM G1 gene , NSDV strain MK G 1 - gene 961- NSDV strain MM_K-05 G1 -gene

100

-EU697952.11 NSDV strain 708

-HQ286600.1| NSDV strain 6233

,HQ286599.1| NSDV strain 779

1001EU697950.11 NSDV strain Ganjam G619

Рисунок 11. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента гена (. п вируса болезни Найроби

(метод максимальной экономии)

Проведенный филогенетический анализ нуклеотидных последовательностей обоих генов показал, что штаммы вируса болезни Найроби могут быть разделены на 2 группы: штаммы, выделенные в Африке, и штаммы, выделенные в Азии. Музейный вирулентный штамм NSD-X входит в африканскую группу, что согласуется с паспортными данными на этот штамм (был выделен Монтгомери из крови больных овец в Кении в I960 г.). Штамму NSD-X филогенетически наиболее близок кластер, включающий аттенуированные штаммы ММ, ММ/К-05 и МК. Генетические различия между нуклеотидными последовательностями геномов этих штаммов минимальны и составляют 0,5 - 1 %.

3.7 Секвенирование и филогенетический анализ геномов музейных штаммов вируса лихорадки долины Рифт

Для проведения филогенетического анализа были выбраны гены неструктурного белка (NSs) (622 п.о.) и гликопротеина Gc (956 п.о.) музейных штаммов RVF(s) 13, RVF(s)l 13, RVF 2002/09-ПС, 1974 ВНИИВВиМ вируса ЛДР, депонированные в коллекции микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии. Филогенетические деревья (Рис. 10 и 11) строили по методу максимальной экономии, достоверность распределения последовательностей по группам оценивали бутстрэп - анализом со 100-кратной повторностью (Рис. 12 и 13).

На обеих дендрограммах музейные штаммы вируса ЛДР входят в один кластер со штаммами Smithburn и Entebbe, что согласуется с данными об их происхождении. Однако анализ последовательностей гена Gc позволяет более точно проследить филогенетические взаимоотношения между этими штаммами: штаммы RVF(s)13 и RVF(s)113 наиболее близки со штаммом Smithburn, чем со штаммами RVF 2002/09-ПС и 1974-ВНИИВВиМ.

'-С

r EU574061.1I RVFV strain 2007002820

- HM586979.11 RVFV strain KEN/Bar-032/07

- JF311394.11 RVFV strain 200803170

- HM586982.11 RVFV strain TAN/Dod-002/07

- DQ380170.1| RVFV strain Saudi 2000-10911

- DQ380169.1I RVFV strain Kenya 9800523

- DQ380171.1I RVFV strain Kenya 83 (21445) DQ380163.1| RVFV strain 74HB59 M33095.11 RVFV strain 1260/78

-DQ380168.11 RVFV strain 1853/78

I DQ380167.1 [ RVFV strain Znga 98 I DQ380166.11 RVFV strain ANK-6087

-DQ380160.1| RVFV strain CAR-R1622

-DQ380144.11 RVFV strain MgH824

r DQ380147.11 RVFV strain T-46 (228113) DQ380146.1| RVFV strain ZM-657 DQ380145.1| RVFV strain ZS-6365 DQ380153.1| RVFV strain 2H-1776

- DQ380149.1 j RVFV strain ZH-501

- DQ380154.1j RVFV strain MP-12 r- DQ380151.1 [ RVFV strain ZH-548 !)- DQ380150.1| RVFV strain T1

EU312129.11 RVFV strain Vaccine strain M33090.11 RVFV strain 2269/74 DQ380158.1I RVFV strain SA-51 (Van Wyck) DQ380157.1I RVFV strain Smithburn

-RVFV strain 1974 VNIIVViM

-RVFV strain 2002/09 - PS

, RVFV strain (s)113 47l RVFV strain (s)13

-DQ380156.11 RVFV strain Entebbe

-DQ380181.11 RVFV strain ARD-38388

-DQ380180.1 [ RVFV strain OS-1

-DQ380176.11 RVFV strain Kenya 56 (IB8)

M33096.1| RVFV strain 763/70 DQ380175.1| RVFV strain SA-75 JF784388.1 [ RVFV strain 35/74 63 I JF784388.11 RVFV strain 35/74(2)

Рисунок 12. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена N8$ вируса ЛДР (метод максимальной экономии)

DQ380196.1| RVFV strain Kenya 9800523 JF311385.1| RVFV strain 200803170 - HM586971.1| RVFV strain TAN/Dod-002/07 r HM586974.1| RVFV strain KEN/Bar-Msq/187-09/07

75 | JF784387.1| RVFV strain 35/74 DQ380189.1| RVFV strain SA-75 DQ380188.1| RVFV strain 763/70

-DQ380190.1| RVFV strain Kenya 56 (IB8)

57 , DQ380191.1| RVFV strain Entebbe

I DQ380192.1I RVFV strain Kenya 57 (Rintoul)

RVFV strain 1974 VNIIVViM RVFV strain RVF 113/09-PS DQ380193.1| RVFV strain Smithbum RVFV strain RVF (s)113 24 I RVFV strain RVF (s)13

24 I F

-1-1-1-1

15 10 5 0

Рисунок 13. Филогенетическое дерево, построенное на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена Сс вируса ЛДР (метод максимальной экономии)

4. ВЫВОДЫ

1.Разработаны тест-системы для выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 0,2 lg ТЦД 5о/см3, позволяющие выявлять геном вируса болезни Найроби в крови и пробах органов от инфицированных или павших животных, а также в инфицированных культурах клеток.

2. Разработана тест-система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени, позволяющая выявлять геномы вирусов болезни Найроби и ЛДР, а также одновременно дифференцировать их между собой и другими представителями семейства Bunyaviridae. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени для вируса болезни Найроби составило 2,2 ± 0,2 lg ТЦД50/см3, для вируса ЛДР - 2,5 ± 0,3 lg ТЦД50/С„3.

3. Установлено, что в крови экспериментально зараженных овец геном вируса болезни Найроби возможно выявлять с 3 по 8 сутки после инфицирования.

4. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагментов генов N и Gn вируса болезни Найроби и филогенетического анализа установлена гомология геномов музейных штаммов X, ММ, ММ/К-05 и МК с геномом африканского штамма NSD 708 (степень нуклеотидной идентичности относительно гена N составляет 88 - 90 %, относительно гена Gn - 97 - 98 %) .

5. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагментов генов NSs и Gc вируса ЛДР и филогенетического анализа установлена гомология геномов музейных штаммов 1974 - ВНИИВВиМ, RVF 2002/09-ПС, RVF(s)l 13, RVF(s)13 с геномами штаммамов Smithburn и Entebbe (степень нуклеотидной идентичности 99,0-99,7%).

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Специфические оригинальные олигонуклеотидные праймеры могут быть использованы для определения нуклеотидных последовательностей сегментов генома вирусов Найроби и ЛДР, проведения генетической характеристики штаммов и изолятов указанных возбудителей, создания генетических паспортов вакцинных штаммов и рекомендуются для практического применения в научно-исследовательских и диагностических лабораториях.

«Методические положения по выявлению РНК вируса болезни Найроби методом гнездовой полимеразной цепной реакции», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. 16.11.2011 г.; «Методические положения по выявлению РНК вируса болезн; Найроби методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. 30.11.2011 г., «Методические положени по выявлению РНК вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексно" полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденны академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадеми] Смирновым A.M. 10.11.2011 г., предлагаются для диагностики болезни Найроби i лихорадки долины Рифт в специализированных ПЦР-лабораториях.

6. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Арбовирусы и заболевания человека // Доклад научной группы ВО! (технический доклад № 369).- Женева, 1968.- С.30-3.

2. Белов, А.В. Тест-система на основе ПЦР в реальном времени дл выявления вируса ЛДР / А.В. Белов, Т.В. Гребенникова, А.Д. Забережный, A.M. Бутенко, Т.И. Алипер // Ветеринария. - 2007. - № 6. - С.53-55.

3. Вергун, Л.Ю. Способ и набор для обнаружения вируса лихорадки долин! Рифт в биологическом материале / Л.Ю. Вергун, И.Ф. Вишняков // патент н; изобретение № 2122210; заявлено 26.05.1994; опубл. 20.11.1998.

4. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин.- М., 1990. - 352 с.

5. Маниатис, Т., Методы генетической инженерии. Молекулярно клонирование: пер. с англ. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. - М.: Мир, 1984 - 480 с.

6. Сюрин, В.Н. Вирусные болезни животных / В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко Б.В. Соловьев, И.В. Фомина - М., ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

7. Bird, Н.В. Highly Sensitive and broadly reactive quantitative reverse transcription PCR assay for high-throughput detection of Rift Valley Fever virus/ B.H. Bird, D.A. Bawiec, T.G. Ksiazek [et al.] // J. of CI. Microbiology. -2007. - V.45, № 11. - P. 3506 -3513.

8. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boon [et al.] // J. of CI. Microbiology. -1990. - V. 28, № 3.-P.495 - 503.

9. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi //Anal. Biochem.

- 1987. - Vol.162, № 1,- P.156-159.

10. Davies, F.G. Nairobi sheep disease / F.G. Davies - Parasitologia.-1997.- V.39, № 2, P. 95- 8.

11. Garcia, S. Quantitative real-time PCR detection of Rift valley fever virus and its application to evaluation of antiviral compounds / S. Garcia, J.M. Crance, A. Billecocq [et al.] // J. of CI. Microbiology. -2001. - V.39, № 12. - P. 4456 - 446.

12. Geering, W.A. Nairobi sheep disease in exotic diseases of animals/ W.A. Geering, A.J. Forman, M.J. Nunn //Aust. Gov. Publishing Service, Canberra. - 1995. - P. 159 -172.

13. Marczinke, В. I. Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia / B.I. Marczinke, S.T. Nichol // Virology. - 2002.-V.303.-№ 1 - P. 146 - 151.

14. Sambrook, J. Molecular Cloning: a laboratory manual / J. Sambrook, D.W. Russell - Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001,-V.l. -749 p.

15. Sail, A.A. Single tube and nested RT-PCR for detection of RVFV in human and animal sera//A.A. Sail, J. Thonnon, O.K. Sene / J. Virol. Methods. - 2001. - V.91.-P. 8592.

16. Sail, A.A. Use of RT-PCR in early diagnosis of Rift valley fever / A.A. Sail, E.A. Macondo, O.K. Sene [et al.] // Clin, and Diagn. Lab. Immunol. - 2002. -V.9, № 3. -P.713-715.

17. Walter, Ch.T. Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses / Ch. T. Walter, J. N. Barr // Journal of General Virology.-2011.-V.92.-P. 2467 - 2484.

7. СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сальников, Н.И. Выявление генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР / Н.И.Сальников, А.С. Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов // Актуальные проблемы инфекционной патологии ветеринарной медицины: материалы конференции молодых ученых/ ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии.

- Покров, 2009. - С. 114-118.

2. Application of genome analysis methods for identification of Nairobi shee disease agent / N.I. Salnikov, A.S. Malogolovkin, S.Zh. Tsybanov, D.V. Kolbasov//4t Annual meeting Epizone «Bridges to the future» Saint - Malo, France, 2010. - P.180.

3. Выявление геномов вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Риф методом ОТ - ПЦР в режиме «реального времени» / Н.И. Сальников, А.С Малоголовкин, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Молекулярная диагностика -201С материалы Международной конференции. - М., 2010. - Т. 2. - С. 166 -168.

4. Олигонуклеотидные праймеры, способ и тест -система для выявлени генома вируса болезни Найроби овец методом обратной транскрипции полимеразной цепной реакции в формате электрофоретической детекци продуктов амплификации / Н.И. Сальников, A.C. Малоголовкин, С.Ж. Цыбаног А.Г. Гузалова, Д.В. Колбасов // Патент на изобретение № 2416647; заявлен 09.11.2009; опубл. 20.04.2011., Бюл. № 11. - 8 с.

5. Тест-система для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ ПЦР в режиме реального времени / Н.И. Сальников, С.П. Живодеров, Н.Е Малоголовкина, С.Ж. Цыбанов, Д.В. Колбасов // Ветеринарная патология. - М. 2011.-№ 4.-С.54-57.

6. Тест-системы на основе ОТ-ПЦР в режиме реальном времени дл диагностики особо опасных экзотических буньявирусных инфекций/ Н.И Сальников, Е.О. Жабон, Е.А. Балашова, С.Ж. Цыбанов // Высокие технологии прикладные и фундаментальные исследования в фармакологии, физиологии i медицине: материалы Международной научно - практической конференции. Санкт-Петербург, 2011.-Т.2.-С.290-291.

7. Разработка и совершенствование методов диагностики лихорадки долин! Рифт / О.В. Капустина, Т.Э. Южук, Н.И. Сальников, В.Н. Пономарев, М.Е Колосова // Актуальные проблемы болезней, общих для человека и животных материалы Всероссийской научно - практической конференции с международньн участием / ООО «Экспо-Медиа». - Ставрополь, 2012.- С.172-173.

ГНУ

ДНК

кДНК

ЛДР

мкл

мРНК

ОТ-ПЦР

п.о.

ПЦР

РНК

Трис

ТЦЦ50

ЭДТА

дНТФ

рН

Мк1Л350

8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

государственное научное учреждение дезоксирибонуклеиновая кислота комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота лихорадка долины Рифт

микролитр матричная РНК

обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция пара оснований полимеразная цепная реакция рибонуклеиновая кислота ^М,К-трис(гидроксиметил)-аминометан 50%-ная тканевая цитопатогенная доза вируса этилендиаминтетрауксусная кислота дезоксирибонуклеозидтрифосфат

обратный десятичный логарифм концентрации ионов Н+ 50% - ная мышиная летальная доза вируса

Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ Россельхозакадемии, г. Покров Владимирской области Тираж 80 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Сальников, Николай Игоревич

1 ВВЕДЕНИЕ.

1.1 Актуальность.

1.2 Степень разработанности проблемы.

1.3 Цель и задачи исследования.

1.4 Научная новизна работы.

1.5 Практическая значимость работы.

1.6 Публикации результатов.

1.7 Апробация работы.

1.8 Соответствие содержания диссертации паспорту специальности, по которой рекомендуется к защите.

1.9 Структура и объем диссертационной работы.И

1.10 Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1.11 Личный вклад автора в выполнение работы.

2 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1 Общая характеристика семейства Випуаутёае

9 Распространение и пути передачи вирусов болезни

Найроби и ЛДР.

2.3 Характеристика возбудителя болезни Найроби.

2.3.1 Определение и этиология болезни Найроби.

2.3.2 Таксономическое положение вируса болезни Найроби.

2.3.3 Физико-химические свойства вируса болезни Найроби.

2.3.4 Структурная организация генома.

2.3.5 Генетическая вариабельность вируса болезни Найроби.

2.3.6 Культивирование и особенности репродукции вируса болезни Найроби.

2.4 Характеристика возбудителя лихорадки долины Рифт.

2.4.1 Определение и этиология ЛДР.

2.4.2 Таксономическое положение вируса ЛДР.

2.4.3 Физико - химические свойства вируса ЛДР.

2.4.4 Структурная организация генома вируса ЛДР.

2.4.5 Генетическая вариабельность вируса ЛДР.

2.4.6 Культивирование и особенности репродукции вируса ЛДР.

2.5 Диагностика болезни Найроби и ЛДР.

2.5.1 Патогенез и клинические признаки при болезни Найроби.

2.5.2 Патогенез и клинические признаки при ЛДР.

2.5.3 Патоморфологические изменения при болезни Найроби и ЛДР.

2.5.4 Серологическая диагностика болезни Найроби и ЛДР.

2.5.5 Полимеразная цепная реакция.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт"

3.3.3 Разработка тест-системы для выявления геномов вирусов болезни Найроби и лихорадки долины Рифт методом мультиплексной ОТ - ПЦР в режиме реального времени.60

3.3.4 Конструирование рекомбинантного положительного контроля амплификации к тест-системе для выявления генома вируса болезни Найроби методом ОТ- ПЦР в режиме реального времени.65

3.3.5 Конструирование рекомбинантных положительных контролей амплификации к тест-системе на основе мультиплексной ОТ-ПЦР в режиме реального времени.67

3.3.6 Выявление генома вируса болезни Найроби в пробах органов от экспериментально зараженных белых мышей. 68

3.3.7 Выявление генома вируса болезни Найроби в пробах органов и крови от экспериментально зараженных вакцинированных и невакцинированных овец. 68

3.3.8 Секвенирование и филогенетический анализ геномов музейных штаммов вируса болезни Найроби. 71

3.3.9 Секвенирование и филогенетический анализ геномов музейных штаммов вируса ЛДР. 74

4 ОБСУЖДЕНИЕ. 79

5 ВЫВОДЫ. 83

6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. 84

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ. 85

8 ПРИЛОЖЕНИЕ. 99

Список сокращений

ГНУ - государственное научное учреждение

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

Да - дальтон

ИФА - иммуноферментный анализ кДНК - комплементарная дезоксирибонуклеиновая кислота кДа - килодальтон

ЛДР - лихорадка долины Рифт мкл - микролитр мРНК - матричная РІЖ

МЭБ - Международное эпизоотическое бюро об/мин - обороты в минуту

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция - полимеразная цепная реакция п.о. - пара оснований

ПЦР - полимеразная цепная реакция

РНК - рибонуклеиновая кислота

Трис - ]ЧГ,]\[,М-трис(гидроксиметил)-аминометан

ТЦД50 - тканевая цитопатогенная доза вируса

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ВНК -21 -почка новорожденного сирийского хомяка дНТФ - дезоксирибонуклеозидтрифосфат рН - обратный десятичный логарифм концентрации ионов ГҐ

1ЛЭ50 - 50% - ная летальная доза вируса

МісЬБ50 - 50% - ная мышиная летальная доза вируса

1 ВВЕДЕНИЕ 1.1 Актуальность

Вирусы болезни Найроби и лихорадки долины Рифт (ЛДР) -представителисемейства Випу№Мс1ае - являются возбудителями особо опасных заболеваний животных и человека [1,3].

Болезнь Найроби - инфекционная вирусная болезнь овец, характеризующаяся острым течением, поражением нервной системы, органов кровообращения и дыхания. Представляет опасность для человека, вызывая лихорадку и геморрагические явления. Переносчиками возбудителя являются иксодовые клещи, в изобилии распространенные в регионе, где регистрируется болезнь Найроби. Болезнь постоянно регистрируется в Кении, Уганде, Конго (район озера Киву) и ЮАР (провинция Наталь)[1,3].

Лихорадка долины Рифт - это антропозоонозная, особо опасная вирусная инфекция, распространенная во многих странах Африки и Ближнего Востока.ЛДР обладает выраженной патогенностью для человека и многих видов диких и домашних копытных животных. Вирус передается через укусы комаров, при контакте с тканями и кровью заболевших животных, а также аэрогенным путем при вдыхании вируссодержащих аэрозолей.Лихорадка долины Рифт наносит огромный экономический ущерб сельскому хозяйству, т.к. обусловливает высокую гибель молодняка, а также приводит к возникновению абортов у 80-100% больных животных. Болезнь зарегистрирована в Кении, Уганде, Южно-Африканской республике, Родезии, Судане, Анголе, Мозамбике, Нигерии, Экваториальной Гвинее и Австралии [21,26].

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Сальников, Николай Игоревич

5 ВЫВОДЫ

1 .Разработаны тест - системы для выявления генома вируса болезни Найроби методом гнездовой ОТ-ПЦР и ОТ-ПЦР в режиме реального времени с аналитической чувствительностью 0,2 lg ТЦД 5о/см , позволяющие выявлять геном вируса болезни Найроби в крови и пробах органов от инфицированных или павших животных, а также в инфицированных культурах клеток.

2. Разработана тест - система для выявления геномов вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной ОТ - ПЦР в реальном времени, позволяющая выявлять геномы вирусов болезни Найроби и ЛДР, а также одновременно дифференцировать их между собой и другими представителями семейства Bunyaviridae. Рассчитанное значение аналитической чувствительности метода ОТ-ПЦР в режиме реального л времени для вируса болезни Найроби составило 2,2 ± 0,2 lg ТЦД50/см , для вируса ЛДР -2,5 ± 0,3 lg ТЦД50/см3.

3. Установлено, что в крови экспериментально зараженных овецгеном вируса болезни Найроби возможно выявлять с 3 по 8 сутки после инфицирования.

4. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагментов генов N и Gn вируса болезни Найроби и филогенетического анализа установлена гомология геномов музейных штаммов X, ММ, ММ/К-05 и МК с геномом африканского штамма NSD 708 (степень нуклеотидной идентичности относительно гена N составляет 88 - 90%, относительно гена Gn - 97 - 98 %).

5. На основе данных нуклеотидного секвенирования фрагментов генов NSs и Gc вируса ЛДР и филогенетического анализа установлена гомология геномов музейных штаммов 1974 - ВНИИВВиМ, RVF 2002/09-ПС, RVF (s)113, RVF (s) 13 с геномами штаммамов Smithburn и Entebbe (степень нуклеотидной идентичности 99,0 - 99,7 %).

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Методические положения по выявлению РІЖ вируса болезни Найроби методом гнездовой полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. 16.11.2011 г.; «Методические положения по выявлению РІЖ вируса болезни Найроби методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. 30.11.2011 г., «Методические положения по выявлению РНК вирусов болезни Найроби и ЛДР методом мультиплексной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени», утвержденные академиком-секретарем Отделения ветеринарной медицины Россельхозакадемии Смирновым A.M. 10.11.2011 г., предлагаются для диагностики болезни Найроби и лихорадки долины Рифт в специализированных ПЦР-лабораториях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Сальников, Николай Игоревич, Покров

1. Арбовирусы и заболевания человека // Доклад научной группы ВОЗ (технический доклад № 369).- Женева, 1968.- С.30-3.

2. Арбовирусы. Методы лабораторных и полевых исследований / под редакцией С .Я. Гайдамовича М., 1986.- С.11

3. Бакулов, И.А. Карантинные и малоизвестные болезни животных/ И.А. Бакулов М.: Колос, 1983.- 350 с.

4. БалышеваВ.И. Некоторые иммунобиологические свойства аттенуированного штамма вируса лихорадки долины Рифт/В.И. Балышева, О.В. Капустина, Н.И. Закутский, H.H. Власова, Т.Э. Южук, Е.Ю. Прудникова // Научный журнал КубГАУ.-№73(09).-2011.-С.1-12.

5. Белов A.B., Гребенникова Т.В., Забережный А.Д., Бутенко A.M., Алипер Т.П. Тест-система на основе ПЦР в реальном времени длявыявления вируса ЛДР // Ветеринария. 2007. - №6. - С.53-55.

6. Букринская, А.Г.Вирусология /А.Г. Букринская М.: Медицина, 1986.-С. 295-302.

7. Вергун, Л.Ю. Способ и набор для обнаружения вируса лихорадки долины Рифт в биологическом материале / Л.Ю. Вергун, И.Ф. Вишняков // патент на изобретение № 2122210, заявлено 26.05.1994, опубл. 20.11.1998.

8. Вирусные болезни животных /В.Н. Сюрин, А.Я. Самуйленко, Б.В. Соловьев, И.В. Фомина М., ВНИТИБП, 1998. - 928 с.

9. Дроздов С.Г. Лихорадка долины Рифт / / ЖМЭИ. 1984, №1. - с.3-8.

10. Кадымов, Р. А. Инфекционные болезни овец / Р. А. Кадымов, А. А. Кунаков, В. А. Седов. М.: Агропромиздат, 1987. - 303 с.

11. Книзе, A.B. Эволюция эпизоотической ситуации по лихорадке долины Рифт/ A.B. Книзе, Н.В. Дмитренко, A.A. Стрижаков // Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропозоонозов: труды Междунар. науч.- практ. конф. Покров, 2003. - Часть1.-С.93-98.

12. Н.Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин.- М., 1990. 352 с.

13. Маниатис, Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: пер.с англ. / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук.- М.: Мир, 1984. 480с.

14. Номенклатура вирусов позвоночных/В .Ю. Луговцев, Д.А.Васильев.-Ульяновск.-2002.-268с.17,Общая и частная вирусология /под.ред. В.М. Жданова и С.Я.Гайдамович. М., Медицина.-1982.- 517 с.

15. Патологоанатомическая диагностика вирусных болезней животных / Справочное издание/под ред. H.H. Архипова М.: Колос, 1984.- С. 90-92.

16. ПЦР в реальном времени / Д.В. Ребриков, Г.А. Саматов, Д.Ю. Трофимов, П.А. Семенов, A.M. Савилова, H.A. Кофиади, Д.Д. Абрамов.-М.: Бином. Лаборатория знаний, 2009.- 223с.

17. Руководство по ветеринарной вирусологии.-М.: Колос, 1965.-С. 496498.21 .Руководство по тропическим болезням / под ред. А .Я. Лысенко. -4-е издание. -М.: Медицина, 1983. 512 с.

18. Руководство по индикации возбудителей особо опасных болезней сельскохозяйственных животных в объектах ветеринарного надзора и окружающей среды /под ред. Вишнякова И.Ф., Лагуткина H.A. М., 2000.- С. 49-51

19. Румянцева, Е.А. Изучение антигенных и иммуногенных свойств культурального штамма «ММ/К-05» вируса болезни Найроби, инактивированного теотропином/Е.А. Румянцева//Ветеринарная патология. -2007. -№4.-С. 100-102.

20. Рево, М.В. Вирусы и вирусные заболевания сельскохозяйственных животных / М. В. Рево. Киев.: Госсельхозиздат УССР, 1956. - 495 с.

21. Симонян, Г.А. Ветеринарная гематология /Г.А. Симонян, Ф.Ф. Хисамутдинов. М: Колос, 1995.- 256 с.

22. Хухорова,И.Ю. Лихорадка долины Рифт : обзор/И.Ю.Хухорова, Н.И. Закутский, О.В. Капустина//Животноводство России.-2008.-№2.-С.35-36.

23. Четыре десятилетия на переднем крае борьбы с особо опасными болезнями животных/ под ред. И.А. Бакулова.- ПОСАД, 1998,- С. 83-84

24. Abdel-Wahab. Rift Valley fever infections in Egypt pathological and virological findings in men / Abdel-Wahab et al. // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1978. - V.72.-P.392-396.

25. Anderson, G.W. Immunoelectron microscopy of Rift Valley fever viral morphogenesis in primary rat hepatocytes / G.W. Anderson, F.J. Smith / / Virology. 1987. -V. 161.

26. Ansell, R.H. Attenuation of Nairobi sheep disease virus in the mouse brain / R.H. Ansell // Veter. Rec.-1957- № 69.-P. 410-412.

27. Balkhy, H.H. Rift Valley fever: an uninvited zoonosis in the Arabian peninsula / H.H. Balkhy,Z.A. Memish// Int. J. of Antimicrob. Agents. 2003. -V.21. - P.153-157.

28. Bishop, D. L. Bunyaviridae/D. L. Bishop, R.E. Shope // Comprehensive Virology.-1979,- № 14.-P. 1-156.

29. Bishop, D.L. Molecular and biochemical studies of theevolution infection and transmission of insect bunyaviruses / D.L. Bishop, В.J. Beaty B.J. // Phil. Trans. Roy. Soc. London B. 1988. - V.321, № 1207. - P.463-483.

30. Billecocq, A.NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription / A. Billecocq et.al. //J. of Virology. 2004. - V.78, №18. -P. 9798-9806.

31. Boom, R. Rapid and simple method for purification of nucleic acids / R. Boom et al. // J. of Cl. Microbiology. 1990. - V. 28, № 3. - P. 495 - 503.

32. Bowen, M.D. A reassortant bunyavirus isolated from acute haemorragic fever case in Kenya and Somalia/ M.D. Bowen et al.// Virology. 2001. - №2-P.185-190.

33. Broom, J.C. Complement fixation in Rift Valley fever /J.C. Broom, G.M. Findlay // Lancet. -1931.- № 1 .-P.609-611.

34. Bergold, G.H. Structure of 9 Arboviruses /G.H. Bergold et al. //J. Gen. Virol.- 1969,-№5, P. 135-140.

35. Coackley, W. The effect of Nairobi sheep disease virus on tissue culture systems /W. Coackley, H. Pini//J. Pathol. Bacterid.-1965. V. 90,- №2,- P. 672675.

36. Coetzer, J.A.W. The pathology of Rift Valley fever.Lesions occurring in field cases in adult cattle, calves and aborted fetuses/J.A.W. Coetzer UOnderstepoort J. Vet. Res.-1982.-№ 49.-P. 11-17.

37. Collett, M.S. Messenger RNA of the M segment RNA of Rift valley fever virus/M.S. Collett//Virology. 1986.-V.151.-P.151-156.

38. P. Clerx, J.P. Structural characteristics of nairoviruses (genus Nairovirus, Bunyaviridae) /J.P. Clerx, J. Casals, D.H. Bishop // J. Gen Virol. -1981. V.55.-P.165-78.

39. Chomczynski, P. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction / P. Chomczynski, N. Sacchi //Anal. Biochem. 1987. - V.162, № 1. - P.156-159.

40. Davies, F.G. The serological relationships of Nairobi sheep disease virus /F.G. Davies et al. //J. Comp. Pathol.-1978.-№ 88. P.519-523.

41. Dandawate, C.N. Studies on Ganjam virus with reference to viremia in vertebrate hosts & development of antibodies. /C.N. Dandawate // Indian J. Exp. Biol., 1977. - V. 15, № 11. - P. 1058-1059.

42. Daubney, R., Nairobi sheep disease / R. Daubney, J.R. Hudson //Parasit. -1931.-№ 23.-P. 507-524.

43. Daubney, R. Epizootic hepatitis of Riftvalley fever an undescribed virus disease of sheep, cattle and man from East Africa/R. Daubney, J.R. Hudson, P.C. Gamham// J. of Pathol. andBacteriol. 1931. - V.34. - P.545-579.

44. Daubney, R. Nairobi sheep disease/ R. Daubney, J.R. Hudson //Parasit. -1931.-№ 23-P. 507-524.

45. Davies, F.G. Qualitative studies of the transmission of Nairobi sheep disease virus by Rhipicephalusappendiculatus (Ixodoidea, ixodidae) / F.G. Davies, F. Mwakima //J. Comp. Pathol.- 1982. V.92. - №-1.- P. 15-20.

46. Davies, F.G. The serological relationships of Nairobi sheep disease virus / F.G. Davies et al. //J. Comp. Pathol.,-1978.-№88. P.519-523.

47. Davies, F.G.The antibody response in sheep vaccinated with experimental Nairobi sheep disease vaccines/F.G. Davies, S. Otieno, D.M. Jessett //Trop. Anim. Health. Prod.- 1977,- V.9. №3.-P.181-183.

48. Davies, F.G. The laboratory diagnosis of Nairobi sheep disease/F.G. Davies, J.Mungai, M.Taylor//Trop. Anim. HealthProd.-1997.-№9.-P.75-80

49. Dewey, R.A. Cladistic analysis of Tospovirus using molecular characters/R.A. Dewey et.al. // Mol. Phylogenet. Evol. 1997. - V.8. -P. 11-32.

50. Eisa, M. Rift Valley fever in the Sudan/M. Eisa// Bull, of An. Health and Product in Africa. -1977. V.24. - P.349-355.

51. Eisa M. Obeid H.M. Isolation and identification of the virus from arecent epizootic in Kosti District 1973/M. Eisa, H.M. Obeid // Bull.of An. Health and Product in Africa. - 1977. - V.24. - P.343-347.

52. Elliott R.M. The Bunyaviridae. New York: Plenum Press.-1996.-1250p.

53. Ellis, D.S. Rift valley fever virus: some ultrastructural observations on material from the outbreak in Egypt 1977 /D.S. Ellis et.al. //J. Gen.Virol.-1979.-V. 42.-P.329-337.

54. Era, G.M. Nairobi sheep disease: A study of its pathogenesis in sheep, goats and suckling mice /G.M. Era, S. Chema // Bull. Epiz. Dis. Afr.-1967.- №15,-P.337.

55. Findlay, S.U. Rift Valley fever or enzootic hepatitis/S.U. Findlay // Trans. R. Soc. Trop. Med.Hyg.-1931.-V.25.-P.229.

56. Garcia, S. Quantitative real-time PCR detection of Rift Valley fever virus and its application to evaluation of antiviral compounds / S. Garcia // J. of Clinical Microbiol. 2001.-V.39.-P.4456-4461.

57. Groocock, C.M. Nairobi Sheep Disease/C.M. Groocock //In Foreign Animal Diseases. Richmond, VA:United States Animal Health Association, 1998.-P.322-331.

58. Honig, J.E. Crimean-Congo hemorrhagic fever virus genome L RNA segment and encoded protein /J.E. Honig, J.C. Osborne, S.T. Nichol // Virology.2004,- V.321. № 1.- P.29-35.

59. Hoogstraal, H., Meegan J.M., Klialil G.M., Adham F.K. The Rift valley fever epizootic in Egypt 1977-78. Ecological and entomological studies /H. Hoogstraal et.al. / / Trans.R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1979. - V.73.- №.6. - P.624-629.

60. Howarth, J.A., The propagation of Nairobi sheep virus in tissue culture goat testes, goat kidneys and hamster kidneys /J.A. Howarth, C. Terpstra // J. Comp. Path.-1965.-№75.- P.437-441.

61. Ikegami,T. Rift Valley fever virus NSsmRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment/ T. Ikegamiet.al. / / J. ofVirology.2005.-V.79, № 18.-P.12106-12111.

62. Ikegami T., Peters C.J., Makino S. Rift Valley fever virus nonstructural protein NSs promotes viral RNA replication and transcription in a minigenome system / T. Ikegami, C.J.Peters, S.Makino/ / J. of Virology. 2005. - V.79, № 9. -P.5606-5615.

63. Jessett, D.M. Serological evidence of Nairobi sheep disease in Tanzania/ D.M. Jessett Trop. Anim. Health. Prod.-1978.- V.10, №2,- P.99-100.

64. Jesset, D.M. An indirect haemagglutination test for the detection of antibody to Nairobi sheep disease virus/D.M. Jessett,F.G. Davies, M.M. Rweyemamu //Res Vet Sci.-1976.- V.20, №3.- P. 276-80.

65. Joshi, M.V. Isolation of Ganjam virus from ticks collected off domestic animals around Pune, Maharashtra, India/G. Geevarghese, G.D. Joshi, Y.S. Ghodke, D.T. Mourya, A.C. Mishra//J. Med. Entomol.-2005.-V.42, №2.- P.204-206.

66. Jouan, A. An Rift Valley fever epidemic in Southern Mauritania / Jouan A.et al. / / Ann. Inst. Pasteur Virol. 1988. - V.139, № 3. -P.307-308.

67. Kashula ,V.R. Rift Valley fever as a veterinary and medical problem /V. R. Kashula / / J. Amer. Vet. Med. Assoc. 1957. - V. 131, №5. -P.219-221.

68. Keegan,K. and Collett M.S. Use of bacterial expression cloning to define the amino acid sequences of antigenic determinants on the G2 glycoprotein of Rift Valley fever virus /K. Keegan, M.S. Collett/ / J. of Virology. 1986. - V.58, № 2. -P.263-270.

69. Kouka,Saad el Din. Rift Valley fever virusinfections in Egypt: pathological and virological bindings in man /Saad el DinKouka / / Trans. R. Soc.Trop. Med. Hyg. 1979. - V.72, № 4. - P.392-396.

70. Legatsas, G. and Weiss K.E. Electron microscopic studies on BHK-21 cells infected with Rift Valley fever virus / G. Legatsas, K.E. Weiss // Arch. Gesamte Virus forsch. 1968. - V.25, № 1.-P.58-64.

71. Liu, D.Y. Phylogenetic relationships among members of the genus Phlebovirus (Bunyaviridae) based on partial M segment sequence analyses/ D.Y. Liu et al.// J. Gen. Virol.-2003.- №84-P.465-473.

72. Lupi, O.,Tyring S.K. Tropical dermatology: viral tropical diseases/O. Lupi, S.K. Tyring // J. Am. Acad. Dermatol. 2003. - V.49, № 6. - P.989-1000.

73. Le May,N. TFIIH transcription factor, a target for the Rift valley hemorrhagic fever virus N. Le May et.al. //Cell. -2004. -V.l 16. -P.541-550.

74. Marriott, A.C. Large RNA segment of Dugbenairovirus encodes the putative RNA polymerase/ A.C. Marriott, P.A. Nuttall //J. Gen Virol- 1996.-№77.-P.1775-1780.

75. Mahy, B.W. Zoonoses and haemorrhagic fever / B.W. Mahy / / Dev. Biol. Stand. 1998. -V.93.-P.31-36.

76. Marczinke, B.I. Nairobi sheep disease virus, an important tick-borne pathogen of sheep and goats in Africa, is also present in Asia/ B.I. Marczinke, S.T. Nichol //Virology.- 2002.-V.303, №1 -P. 146-151.

77. Marriott, A.C.RNA probes detect nucleotide sequence homology between members of two different Nairovirus serogroups/ A.C. Marriottet al.//Virus Res.-1990.-V.16, №1.-P.77-81.

78. Matumoto, M. Complement fixation reaction of Rift valley fever virus/M. Matumoto, S. Iwrsa, M. Endo / / Jap. J. Exp. Med. -1950. V.20. - P.501-558.

79. Mims, C.A. Rift valley fever in mice/C.A. Mims//The Br.J.ofExp.V.-№2.-1956.-120-128.

80. Miller, B.R. Isolation and genetic characterization of RVFV from Aedes vexansarabiensis. Kingdom of SaudiArabia/B.R. Miller et.al. // Emerg. Inf. Dis. -2002.-№12. P. 1492-1494.

81. Mims, C.A. and Mason P.J. Rift valley fever in mice. The properties of haemagglutinin present in infective serum/ C.A. Mims, P.J. Mason / / Brit. J. Exp. Path. 1956. - V.37. -P.423-433.

82. Morrill, J.C. Serological evidence of arboviral infections among humans of coastal Kenya/ J.C. Morrill et al.//J. Trop Med Hyg.-1991.- V. 94,№ 3.- P.166-8.

83. Montgomery, R.E. On a tick-borne gastroenteritis of sheep and goats occurring in British East Africa/ R.E. Montgomery //J. Comp. Path.-1917,- № 30-P.28-57.

84. Munz et al.// Zbl.Vet. Med. B.- 1984.-№3i.-P.537-549.

85. Munz, E. Qualitative and quantitative detection of Nairobi sheep disease virus antigen by immunoperoxidase in BHK-, sheep kidney- and tick cell cultures/ E. Munz, M. Reimann, H. Jager // Zbl. Vet. B. 1984,- V.31, №3.- P. 231-239.

86. Muri'hy, F.A. Bunyaviridae: Morphologic and morphogenetic similarities of Bunyamwera serologic supergroup viruses and several other arthropod-borne viruses/F.A. Muri'hy, A. K. Harrison, S. G. Whitfield //Intervirology.-1973.-P.297-316.

87. Mugera, G.M. Nairobi sheep disease: a study of its pathogenesis in sheep, goats and suckling mice/ G.M. Mugera, S. Chema //Bull. Epiz. Dis. Afr.- 1967.-V.15,№ 4.- P.337-354.

88. Nabeth, P., Rift Valley feveroutbreak, Mauritania, 1998: seroepidemiologic, virologic, entomologic and zoologic investigations/P. Nabeth / / Emerg. Infect. Dis. 2001. - V.7. - P.1052-1054.

89. Nairobi Sheep Disease//Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines.- Paris: World Organization for Animal Health, 2000.-P. 868-872.

90. Niklasson, B., Detection of Rift valley fever virus antigen by enzyme-linked immunosorbent assay/B. Niklasson et.al. II J. Clin.Microbiol.-1983.-V.17.-№6.

91. Niklasson, B. Antibodies to Rift Valley fever in Swedish soldiers in Egypt and the Sinai Scand /B. Niklasson, G.M. Meegan, B. Bengtsson B. / / J. Infect. Dis. 1979,-№ 11. - P.313-318.

92. Niklasson, B. Rift valley fever. Evaluation of a vaccine and development of rapid diagnostic tests /B. Niklasson. Stockholm, 1984. - 124 p.

93. Perera, L.P. Nairobi sheep disease virus isolated from Haemaphysalisintermedia ticks collected in Sri Lanka/L.P. Perera, J.S. Peiris, D.J. Weilgama// Ann Trop Med Parasitol.- 1996.- V. 90, № 1.- P.91-93.

94. Peters C.J. Pathogenesis of viral hemorrhagic fevers: Rift valley fever and Lassa fever contrasted /Peters C.J. et.al. // Rev. of Inf. Dis. 1989. - V.ll. -743-749.

95. Poelwijk F., Prins M., Goldbach R. Completion of the impatiens necrotic spot virus genome sequence and genetic comparison of the L proteins within the family Bunyaviridae/F. Poelwijk , M. Prins, R. Goldbach II J. Gen. Virol. 1997. - V.78. - P.543-546.

96. Porterfield, J.S. Bunyaviruses and Bunyaviridae / J.S. Porterfield et al. // Ihtervirology. 1975/76. - № 6. - P. 13-24.

97. Pini A., Detection of Rift valley fever virus by thefluorescent antibody technique in organs of experimentally infected animals /A. Pini, L.J. Lund, F.A. Davies/ / Res.Vet.Sci.-1970.-V.ll.-P.80.

98. Plyusnin, A. Hantaviruses: genome structure, expression and evolution/ A. Plyusnin, O. Vapalahti and A.J. Vaheri//Gen. Virol.-1996.-№77.-P.2677-87.

99. Rajagopalan, P.K. Isolation of Ganjam virus from the bird tick HaemaphysaliswellingtoniNuttall and Warburton 1907/ P.K. Rajagopalan, M.A.Sreenivassan, S.D. Paul//Indian J.Med. Res.-1970.-V.58. №9.-P.l 195-96.

100. Rao, C.V. Laboratory infections with Ganjam virus / C.V. Rao et al. // Indian J. Med. Res.- 1981.- № 74.-P. 319-324.

101. Ellis, D.S. Rift valley fever virus: some ultrastructural observations on material from the outbreak in Egypt 1977 /D.S. Ellis et.al. //J. Gen. Virol.-1979.-V. 42.-P.329-337.

102. Ramon, F. Reverse genetics system for Uukuniemi virus (Bunyaviridae): RNA polymerase I-catalyzed expression of chimeric viral RNAs / F. Ramon, R.F. Pettersson// Journal of Virology. 2001,- V.75, № 4.-P.1643-1655.

103. Rwambo, P.M. Ultrastructural studies on the replication and morphogenesis of Nairobi sheep disease virus, a Nairovirus/ P.M. Rwambo, M.K. et al. //Arch Virol. -1996.-V.141, №8.-P. 1479-92.

104. Sail, A.A. Genetic reassortment of Rift Valley fever virus in nature /A.A. Sail et.al.// J. of Virology.-1999. V.73, № 10. - P.8196-8200.

105. Sall, A.A. Use of RT-PCR in early diagnosis of Rift Valley fever / A.A. Sail et al. //Clin. AndDiagn. Lab. Immunol. 2002. -V.9. - № 3.-P.713-715.

106. Sambrook, J. Molecular cloning. A laboratory manual/J.Sambrook, D.W.Russell// Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press.-2001.-P. 132-134.

107. Schmaljohn, C.S. Bunyaviridae: The viruses and their replication/ C.S. Schmaljohn, J.W. Hooper// Fields Virology, 4' Edn. Lippincott, Williams and Wilkins, Philadelphia,-2001.-P. 1581-1602.

108. Shoemaker,T. Genetic analysis of viruses associated with emergence of RVF in Saudi Arabia and Yemen, 2000-01/T. Shoemaker et al. // Emerg. Inf. Dis. 2002. - V.8, N.12. - P.1415-1420.

109. Shope, R.E. Serological relation between RiftValley fever virus and virus of phlebotomus fever serogroup /R.E. Shope, C.J. Peters C.J., J.S. Walker// Lancet. 1980. -V. 19. - N.4.-P.886-887.

110. Shimshony, A. Rift valley fever/A. Shimshony, R. Bazzilai// Adv. Vet. Sci. Med. New York. 1983. - V.27. - P.347-425.

111. Shortridge, K.F. Hemagglutination of trypsin-modified human erythrocytes by Chagres virus/K.F. Shortridge // Arch. Virol. 1976. - V.52. -P.181-186.

112. Suzich, J.A. Expression strategy of phleboviruses: biogenesis of proteins from the Rift Valley fever virus M segment/J.A. Suzich, L.T. Kakach, M.S. Collett//J.Virol. -1990. V.64. - P. 1549 - 1555.

113. Swanepoel, R. Studies on the epidemiology of Rift Valley fever /R. Swanepoel / / J. S. Afr. Assoc. 1976. - V.47, N.2. - P.93-94.

114. Terpstra, C. Nairobi sheep disease-studies on virus properties, epizootiology and vaccination in Uganda. Diss., Univ. Utrecht/ C. Terpstra //Tijdschrift voor Diergeneeskunde, T. 95, № 13.- 1970.- P. 671-677.

115. Terpstra, C. Physical and biological properties of Nairobi sheep disease virus/ C. Terpstra// Vet Microbiol. -1983.- V.8,№6.- P.531-41.

116. Virology, second edition / Ed. By Fields B.N., Knipe D.M. et al. -New York: Raven Press.-1990.-1515 p.

117. Ward, V.K. Coding strategy of the S RNA segment of Dugbe virus (Nairovirus; Bunyaviridae)/ V.K. Ward, et al. // Virology.- 1990.- V.175, №2.-P.518-24.

118. Ward, V.K. Expression of the nucleocapsid protein of Dugbe virus and antigenic cross-reactions with other nairoviruses/V.K.Ward, et al.//Virus Res. -1992.-V. 24, № 2.-P. 223-9.

119. Walter Ch.T. Recent advances in the molecular and cellular biology of bunyaviruses/ Ch. T. Walter, J. N. Barr// Journal of General Virology.-2011,-V.92.-P.2467-2484

120. Weinbren, M.P. The developvent of a strain Nairobi sheep disease viruses non pathogenic for sheep a possible vaccine/ M.P. Weinbren//Ann. Rep. E.A. Viruses Res. Inst.- 1957-1958.- № 8.-P.12

121. Weekly disease information/WAHID Interface/OIE, 2011-2012.-Режим доступа: http://www.oie.int, свободный.-Загл. С экрана.

122. Weiss, К.Е. Studies on Rift Valley fever passive and active immunity in lambs /К.Е. Weiss // Onderstepoort J. Vet. Res. 1962. - V.9.-№l.-P.3-9.

123. Zahran, G.D. Nairobi Sheep and Goat disease/ G.D. Zahran//Handbuch der Virus infection bei Tieren.- 1968.- Band III/2.- P. 1147-1155.

124. С: 1X22) Гаянка; 2009141085/10, 09.11.2Q09

125. Д;п а лачада о і сміли і'рх>ка деЛсгші* иа-гатт: 09.11.2 СШІ рі'Х>рі! ГГ! і ¡.¡У22.) Дата иплачі: захнкі!. 09.11.200935') Оігубшгкоаалії: 20.04.2011 Імо!і. Кі 11

126. Сальнихоо Николай Игоревич (К и). Мадогсмшвкии Алехсиндр Сергеевлч (Ки). Цыйаноа Сошной Жамытоинч (ХЫ). Колбати Делис Ііладіїміїроіигч (ТШ). Гуаалоаа Анна Григорьевна (ИО')73} Патиґгаобяалатаї ы і»):

127. АТССС,АТИ'іСС:Л<ТГСЛАС,-3\ Ї> 14 5'лс;ас.с:ло'1тгс;аі":тсі:;г.с>т. и2 5і

Информация о работе

Сальников, Николай Игоревич
кандидата биологических наук
Покров, 2012
ВАК 03.01.06

Диссертация

Выявление и филогенетический анализ геномов возбудителей болезни Найроби и лихорадки долины Рифт - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы