Молекулярно-генетическая характеристика и таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо, представителей антигенного комплекса Бханджа

Климентов, Александр Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетическая характеристика и таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо, представителей антигенного комплекса Бханджа
ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая характеристика и таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо, представителей антигенного комплекса Бханджа"

На правах рукописи .....

Климентов Александр Сергеевич

Молекулярно-генетическая характеристика и таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо, представителей антигенного комплекса Бханджа (семейство

Випуауігісіае)

03.01.03 - молекулярная биология 03.02.02 - вирусология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 6 МАИ 2013

МОСКВА 2013

005058486

Работа выполнена в ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского» Министерства Здравоохранения РФ и ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов

им. М.П.Чумакова» РАМН

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор кандидат биологических наук, доцент Официальные оппоненты: доктор биологических наук, кандидат медицинских наук, профессор, начальник вирусологического центра НИИ микробиологии Министерства Обороны

доктор биологических наук, профессор, ФГБУ НИИ вирусологии им Д.И.Ивановского Министерства

Здравоохранения РФ, зав. лабораторией

Бутенко Александр Михайлович Гмыль Анатолий Петрович

Борисевич Сергей Владимирович

Забережный Алексей Дмитриевич

Ведущая организация:

ФГБУ «Научно-исследовательский им. И.И. Мечникова» РАМН.

Институт вакцин и сывороток

часов на заседании НИИ вирусологии

Защита состоится _2013 года в /г-

диссертационного совета Д 208.131.01 при имени Д.И. Ивановского Министерства Здравоохранения РФ по адресу: 123098, Москва ул. Гамалеи, 16.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского Министерства Здравоохранения РФ. Автореферат разослан ¿3

2013 года.

Учёный секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук

Бурцева Елена Ивановна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Семейство Bunyaviridae - самое многочисленное среди РНК-геномных вирусов, оно насчитывает более 350 представителей, объединенных в 5 родов. Большинство буньявирусов принадлежит к экологической группе арбовирусов, передающихся через укусы кровососущих членистоногих: комаров, москитов, мокрецов и клещей.

К семейству Bunyaviridae относятся многие вирусы, вызывающие заболевания человека, в их числе: энцефалиты JIa Кросс и Калифорнийский, лихорадки долины Рифт и Крымская-Конго и другие. За последние несколько лет были открыты еще несколько буньявирусов, патогенных для человека и домашних животных. В 2009 г. в Китае была выявлена тяжелая лихорадка с синдромом тромбоцитопении (SFTS), этиологически связанная с новым флебовирусом, переносимым клещами (Yu et al.,

2011). В том же году в США из крови больных со сходными симптомами был выделен вирус, названный Heartland, родственный вирусу SFTS (McMullan et al.,

2012). В Германии в 2011 г. был обнаружен ортобуньявирус, названный Schmallenberg, вызывающий крупные эпизоотии среди крупного рогатого скота, коз и овец. Заболевание характеризуется лихорадкой, снижением продукции молока, а также гибелью новорожденных животных (Hoffmann et al., 2012).

Несмотря на выраженное значение буньявирусов и вызываемых ими инфекций в патологии человека и животных, данные по молекулярно-генетической характеристике и таксономии многих из них весьма ограничены или отсутствуют. Это в полной мере относится к вирусу Бханджа, вызывающему острые лихорадочные заболевания человека. Описан случай тяжелого менингоэцефалита при естественном заражении вирусом Бханджа через укус клеща (Vesenjak-Hirjan et al., 1980).

Прототипный штамм вируса Бханджа (IG690) был изолирован в 1954 г. из клещей Haemaphysalis intermedia, собранных с козы в Индии. Впоследствии циркуляция вируса Бханджа была установлена во многих странах Африки, Азии и Европы, а на территории бывшего СССР в южных регионах России, Армении и Молдавии. Вирус Бханджа и африканские вирусы Кисмайо (Сомали) и Форекария (Гвинея) на основании перекрестных связей, выявленных в реакции связывания

комплемента (РСК) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА), были объединены в антигенную группу Бханджа (Бутенко и соавт., 1979; Boiro et al., 1986; Digoutte & Heme, 1985). На основании данных электронной микроскопии вирус Бханджа был включен в состав семейства Bunyaviridae, в категорию буньяподобных вирусов (Murphy et al., 1973). Для вирусов Бханджа, Кисмайо и Форекария не установлено антигенных связей с другими представителями семейства Bunyaviridae, их таксономическое положение не определено. Вся доступная в литературе информация о вирусе Бханджа представляет собой либо сообщения о выделении вируса или обнаружении специфических антител, либо данные по экспериментальному заражению животных. Информация о вирусах Форекария и Кисмайо еще более ограничена. К началу выполнения данной работы какие-либо данные молекулярно-генетических исследований вирусов группы Бханджа отсутствовали, что определяет актуальность диссертационной работы.

Цель и задачи исследования

Цели работы заключались в определении таксономического положения вирусов Бханджа и Кисмайо, и создании ОТ-ПЦР тест-системы, позволяющей детектировать и идентифицировать эти вирусы в полевых и клинических материалах.

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

• Определить нуклеотидные последовательности геномов штамма IG690 вируса Бханджа и штамма Rh91 вируса Кисмайо.

• На основании сравнения аминокислотных последовательностей белков, кодируемых геномами вирусов Бханджа и Кисмайо с соответствующими белками других буньявирусов выявить их филогенетическое положение.

• Сконструировать олигонуклеотидные праймеры, специфически амплифицирующие участок генома вирусов Бханджа и Кисмайо.

• Провести апробацию созданной пары праймеров на полевом материале.

Научная новизна и практическая значимость работы

1. Впервые определены полногеномные нуклеотидные последовательности прототипного штамма IG690 вируса Бханджа и штамма Rh91 вируса Кисмайо. На основании множественного выравнивания выведенных аминокислотных последовательностей вирусов Бханджа и Кисмайо с последовательностями представителей семейства Bunyaviridae и филогенетического анализа впервые установлена принадлежность этих вирусов к роду Phlebovirus. Последовательности сегментов генома вируса Бханджа были депонированы в GenBank с кодами доступа КС521440-КС521442.

2. Создана ОТ-ПЦР тест-система, позволяющая амплифицировать фрагмент L сегмента генома флебовирусов длиной 507 нуклеотидов (по последовательности полимеразы вируса лихорадки долины Рифт (NC014397)). Продемонстрирована специфичность разработанной тест-системы с использованием различных арбовирусов.

3. Созданная ОТ-ПЦР тест-система была апробирована на полевом материале, собранном в различных регионах европейской части РФ. В результате проведенной работы в клещах Ixodes persuJcatus, Deracentor reticulatus и Hyalomma scupense обнаружены фрагменты РНК-полимеразы пяти новых представителей рода Phlebovirus.

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на IV Ежегодном Всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (г. Москва, 26-28 марта 2012 г.), X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации (г. Москва, 12-13 апреля 2012 г.), конференции совета молодых ученых ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (Московская область 27 апреля 2012 г.), XII международном симпозиуме по болезням, переносимым клещами, IJSTD XII (Германия, г. Веймар, 20-23 марта 2013 г.).

Материалы диссертации были доложены и рассмотрены на заседании объединенного Совета по предварительной экспертизе диссертационных работ ФГБУ «НИИ вирусологии им. Д.И.Ивановского» Минздравсоцразвития России по проблемам «Молекулярная биология» и «Общая вирусология и инфекционные болезни» от 27 сентября 2012 г.

Публикации

По материалам диссертации опубликована 1 статья в научном журнале, рекомендованном ВАК, 2 - в сборниках материалов конференций и 2 тезисных сообщения.

Объем и структура диссертации

Работа представлена 119 страницами печатного текста, иллюстрирована 27 рисунком и 8 таблицами и состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы и списка цитированной литературы, включающего 146 источников (14 отечественных и 132 иностранных).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы

Вирусы и штаммы

В работе были использованы вирусы из коллекции лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского МЗ РФ, а также штаммы ЕК78 и Б23 вируса Уукуниеми из коллекции лаборатории биологии арбовирусов ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН (табл. 1).

Обследованные клеши

Клещевые суспензии были любезно предоставлены Г.Г. Каргановой,

заведующей лабораторией биологии арбовирусов НИИ полиомиелита и вирусных

энцефалитов им. М.П.Чумакова РАМН, а также Институтом биологии Карельского

научного центра РАН, Службой по защите прав потребителей и благополучия

человека по Ставропольскому краю, Центрами гигиены и эпидемиологии в

Ставропольском крае и Рязанской области. Сбор клещей проводили в период с 2005

по 2012 гг. в Ставропольском крае, Республике Карелия, а также Калининградской, Московской и Рязанской областях (табл. 2).

Таблица 1. Штаммы вирусов, использованные в работе.

Систематическое положение Вирус Штамм Год и источник выделения

Bunyaviridae, ssRNA(-), unassigned Бханджа (BHAV) IG690* 1954 г., клещи Haemaphysalis intermedia

Кисмайо (KISV) Rh91 1974 г., клещи Rhipicephallus pulchellus

Rh92 1974 г., клещи Rhipicephallus pulchellus

Phlebovirus Уукуниеми (UUKV) S23* 1959 г., клещи Ixodes ricinus

ЕК78 1970 г., клещи Ixodes ricinus

Неаполитанской москитной лихорадки (SFNV) Sabin* 1944 г., кровь больного

Сицилианской москитной лихорадки (SFSV) Sabin* 1943 г., кровь больного

Тоскана (TOSV) ISS.PhB* 1971 г., москиты Plebolomus perniciosus

Лихорадки долины Рифт (RVFV) Entebbe 1944 г., москиты Eretmapodites

Nairovirus Крымской-Конго Геморрагической лихорадки (CCHFV) LEIV 10145 Uz 1958 г., клещи Hyalomma asialicum

Orthobunyavirus Батаи (BATV) MM2222* 1955 г., комары Culex gelidus

Тягина (TAHV) Bardos 92* 1958 г., комары Aedes caspius

Инко (INKV) KN3641* 1964 г., комары Aedes communis punctor

Flaviviridae, ssRNA(+), Flavivirus Западного Нила (WNV) Ast-986 2005 г., кровь больного

Желтой лихорадки (YFV) Dakar год и источник выделения неизвестен

Togaviridae, ssRNA(+), Aphavirus Синдбис (SINV) 574 1964 г., пул органов желтой цапли (Ardeola ralloides).

Чикунгунья (CHIKV) 634029 1963 г., кровь больного

Orthomyxoviridae, ssRNA(-), Thogotovirus Дхори (DHOV) Ig611313* 1961 г., клещи Hyalomma dromedarii

Reovlridae, dsRNA, Orbivirus Кемерово (KEMV) K-10* 1962 г., клещи Ixodespersulcatus

* отмечены прототипные штаммы вирусов.

Таблица 2. Территории сбора, видовой состав клещей, год сбора, количество обследованных клещей и пулов.

Территории сбора Виды клещей Год сбора Количество пулов/клещей

Республика Карелия Ixodes persulcatus 2008, 2012 85/162

Калининградская обл. Ixodes ricinus 2005, 2007 75/75

Московская обл. Ixodes ricinus 2008 20/38

Ставропольский край Dermacentor reticulatus D. marginatus, Hyalomma marginatum, Haemaphysalis punctata, H. scupense, Rhipicephalus rossicus, R. sanguineus, Ixodes ricinus 2011, 2012 194/1133

Рязанская обл. Ixodes ricinus 2011 6/6

Всего 342/1414

Методы исследований

Частичная очистка вирусов Бханджа и штамма Rh91 вируса Кисмайо из суспензий мозга инфицированных новорожденных белых мышей была произведена центрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Вируссодержащие фракции определяли методом иммуноферментного анализа с использованием поликлональных антител к вирусам Бханджа и Кисмайо, а также иммуноблота. В качестве первичных антител использовали ИАЖ мышей, иммунизированных вирусами Бханджа или Кисмайо, а в качестве вторичных - кроличьи антимышиные антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена (Promega).

Тотальную РНК из вируссодержащего материала выделяли реагентом "Тризол" (Gibco BRL) и переводили в двунитевую ДНК с использованием рендомизированного олигонуклеотида с адаптером FR28-RT-N: 5'-GCCGGAGCTCTGCAGATATC-NNNNNNNN-3'(CHHTOfl), как для синтеза первой цепи при помощи обратной транскриптазы SuperScriptH (Invitrogen), так и для синтеза второй цепи при помощи фрагмента Klenow ехо- ДНК-полимеразы I Е. coli (Fermentas). Амплификацию проводили с использованием олигонуклеотида,

комплементарного адапторному участку. Продукты ПЦР разделяли в 1% агарозном геле, фрагменты длиной 300-1200 пар нуклеотидов выделяли из геля с помощью коммерческого набора QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagene) и клонировали с использованием набора InsTAclone PCR Cloning Kit (Fermentas).

Секвенирование клонов проводили с использованием универсальных праймеров M13/pUC (Fermentas/Promega) на автоматическом секвенаторе Beckman Coulter CEQ 8000.

Для обработки последовательностей использовали пакет программ LaserGene DNAStar v7.0. Выравнивание аминокислотных последовательностей проводили с помощью подпрограммы ClustalW в программе MEGA5. Филогенетический анализ проводили методом ближайших соседей (Neighbour-Joining). При построении филогенетического дерева использовали р-дистанцию (p-distance). Статистическую значимость топологии полученных деревьев оценивали «bootstrap» тестом (1000 реплик).

Результаты и обсуждение

Определение таксономического положения вирусов Бханджа и Кисмайо

Подход, использованный нами для определения нуклеотидной последовательности геномов вирусов Бханджа и Кисмайо, был основан на методе неспецифичной амплификации нуклеиновых кислот с одного рендомизированного праймера с адаптором (sequence independent single primer amplification (SISPA)). В качестве исходной матрицы для создания геномных библиотек была использована тотальная РНК, изолированная из частично очищенных в градиенте плотности сахарозы препаратов вирусов Бханджа и Кисмайо. На рис. 1 приведены результаты анализа фракций сахарозных градиентов, использованных для выделения РНК, с помощью иммуноблота с использованием антител к вирусам Бханджа (А) и Кисмайо (Б).

. К1БУ ВНАУ „ г ККУ ВНАУ

А. Б. -40

27 к'Да ^

2бкДа— " ИпиикиГ 26 кДа

—36

7й к Ля_

Я6**- 25

24 1,'Да ^ 21 24кДа-

-16

- 15

Рис. 1. Иммуноблоты фракций сахарозных градиентов, содержащие вирусы Бханджа (ВНАУ) и Кисмайо (К18У), окрашенные антителами к вирусам Бханджа (А) и Кисмайо (Б). В правых от блотов колонках указаны маркеры молекулярных масс, кДа, в левых - расчетные массы и положения окрашиваемых вирусспецифических белков.

Антитела к вирусу Бханджа окрашивают во фракции, содержащей вирус Бханджа, два белка с молекулярными массами -26 и -27 кДа (рис. 1А). Антитела к вирусу Кисмайо в этой же фракции достоверно окрасили, по-крайней мере, один белок массой -26 кДа (рис. 1Б). Во фракции, содержащей вирус Кисмайо, антитела к этому вирусу окрашивают полосу, соответствующую молекулярной массе -24 кДа, которая, вероятнее всего, представляет собой 2 белка с близкими молекулярными массами (рис. 1Б). Антитела к вирусу Бханджа также окрашивают в этой фракции, по-крайней мере, один белок молекулярной массой -24 кДа (рис. 1 А). Известно, что мажорным белком при буньявирусной инфекции является белок нуклеокапсида. Поэтому, можно предположить, что выявленные нами в иммуноблоте перекрестно окрашиваемые белок вируса Бханджа массой -26 кДа и белок вируса Кисмайо массой -24 кДа, вероятнее всего, являются белками нуклеокапсида. Наличие перекрестного окрашивания по нуклеокапсидным белкам между вирусами Бханджа и Кисмайо выявляемое методом иммуноблота хорошо коррелирует с данными перекрестных опытов РСК, в которых также участвуют белки нуклеокапсида. Подобную выявленным нами белкам вирусов Бханджа и Кисмайо молекулярную массу имеют только нуклеокапсидные белки представителей родов РЫеЪох1ги$ и Ог11юЪипут1гт.

Однако природа белка вируса Бханджа массой -27 кДа и второго белка массой -24 кДа вируса Кисмайо остается неясной. Подобные белки, отличающиеся по

массе от белка нуклеокапсида на 2-4 кДа, были выявлены в препаратах очищенных вирусов Крымской-Конго геморрагической лихорадки (Гмыль, 2003) и Дугбе (Cash, 1985).

Нами было секвенировано более 200 клонов библиотеки вируса Бханджа и около 50 клонов — вируса Кисмайо. Большинство секвенированных клонов содержали вставки ДНК генома мыши (98% для библиотеки вируса Бханджа и 92% -вируса Кисмайо), как правило, нуклеотидные последовательности 18S либо 28S рибосомальных РНК. Тем не менее, в геномной библиотеке вируса Бханджа было обнаружено 4, а в библиотеке вируса Кисмайо 5 клонов, содержащих последовательности, не имевших значимой гомологии ни с одной из нуклеотидных последовательностей баз данных NCBI. В связи с этим было проведено сравнение выведенных аминокислотных последовательностей с базами данных NCBI. В результате было обнаружено, что 6 из 9 выведенных аминокислотных последовательностей имеют родство с белками, кодируемыми геномами представителей рода Phlebovirus. В одном из клонов библиотеки вируса Бханджа содержалась нуклеотидная последовательность, которая на аминокислотном уровне имела сходство в 39% с участком, расположенном между 694 и 750 аминокислотами предшественника поверхностных гликопротеинов (кодируется средним (М) сегментом генома) вируса тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении (Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus (SFTSV), код доступа NCBI: JQ684872). Выведенные аминокислотные последовательности еще двух клонов этой же библиотеки имели сходство в 38% с участком со 160 по 216 аминокислоту и в 52% с участком с 825 по 937 аминокислоту полимеразы флебовирусов (кодируется большим (L) сегментом генома) Армеро (HQ661805) и SFTS (JQ684871), соответственно. Аминокислотные последовательности двух клонов библиотеки вируса Кисмайо имели сходство в 48% с участками с 549 по 689 и с 865 по 978 аминокислоту полимеразы вируса SFTS. Еще один клон имел сходство 52% с участком с 991 по 1071 аминокислоту предшественника гликопротеинов вируса STFS (AFI45082). На основании полученных нуклеотидных последовательностей были сконструированы специфические олигонуклеотиды, которые были использованы для праймерной "прогулки" и создания библиотек.

Клонов, содержащих последовательности S сегмента в библиотеках вирусов Бханджа и Кисмайо, обнаружено не было. Однако предварительный анализ полученных последовательностей L и М сегментов показал, что, вероятнее всего, исследуемые вирусы являются представителями рода Phlebovirus. В связи с этим были предприняты попытки амплифицировать участки, кодирующие нуклеокапсидный белок, при помощи олигонуклеотидных праймеров, отжигающихся на соответствущий участок S сегмента генома флебовирусов. На основании выравнивания доступных в базах NCBI нуклеотидных последовательностей S сегментов флебовирусов, переносимых клещами, были созданы праймеры, позволяющие амплифицировать участок с 224 по 840 нт кДНК S сегмента генома этих вирусов:

PhltickS224nts: 5'-GTC-ATC-ATY-GTS-TTT-GCY-YT-3' PhltickS840ntas: 5'-ARG-RGR-TCT-AAT-TTW-GYC-KRA-TT-3' Полученные ампликоны вирусов Бханджа и Кисмайо на аминокислотном уровне продемонстрировали соответственно 48% гомологии (62% идентичности) и 51% гомологии (65% идентичности) с участком с 57 по 225 аминокислоту нуклеокапсидного белка вируса SFTS (ADZ04484). На основании полученных нуклеотидных последовательностей были сконструированы специфические праймеры и дальнейшее определение нуклеотидных последовательностей S сегментов также проводили методом праймерной «прогулки».

Праймерные «прогулки» по всем сегментам генома вирусов Бханджа и Кисмайо были завершены с использованием олигонуклеотидов, отжигающихся на консервативные концевые последовательности сегментов генома флебовирусов: PhleboPCR CTG-CGG-ATC-CGG-ACA-CAR-AG BhKisL3 end GAG-GAC-ACA-AAG-ACC-GCC-AGC-TG

BhKisM5endl GGA-GAC-ACA-AAG-ACG-CCA-GTT-ATC BhKisM5end2 GGA-GAC-ACA-AAG-ACG-CCA-GCT-ATC BhKisM3end ACA-CAA-AGA-CCG-CCA-GCA-TTG-G

BhKisS5end ACA-CAA-AGA-AGC-CGC-TAA-CGA-ATC

BhKisS3endl ACA-CAG-AGA-AGC-CGC-AGA-ATG-GAC BhKisS3end2 ACA-CAG-AGA-AGC-CGC-AAA-ATG-GAC Таким образом, нам удалось определить полную последовательность генома вируса Бханджа. Длина L сегмента составила 6333 нуклеотида, М сегмента 3304 нт и S - 1870 нт. Полученные последовательности сегментов генома вируса Бханджа были депонированы в GenBank с кодами доступа КС521440-КС521442.

Для генома вируса Кисмайо были определены полные последовательности L (6344 нуклеотида), М (3323 нуклеотида) и S (1879 нуклеотидов) сегментов генома.

Для определения таксономического положения вирусов Бханджа и Кисмайо выведенные аминокислотные последовательности белков, кодируемых L, М и S сегментами генома, были проанализированы при помощи множественного выравнивания с белками других представителей семейства Bunyaviridae. Анализ показал, что наиболее высокое сходство белка, кодируемого L сегментом генома исследуемых вирусов, наблюдается с полимеразой представителей рода флебовирусов: 52% гомологии с SFTSV и вирусом Heartland (HRTV). Гомология между вирусами Бханджа и Кисмайо на этом участке составляет 85%.

М сегменты вирусов Бханджа и Кисмайо кодируют белок, наиболее близкородственный поверхностным гликопротеинам флебовирусов (35% гомологии с SFTSV и вирусом Heartland). На этом участке гомология между вирусами Бханджа и Кисмайо достигает 60%.

Гомология нуклеокапсидного белка вирусов Бханджа и Кисмайо с SFTSV и HRTV составляет 53%. Гомология между вирусами Бханджа и Кисмайо на этом участке составляет 75%. Гомология между вирусами Бханджа и Кисмайо на участке, кодирующем неструктурный белок NSs, достигает 49%.

На филогенетических деревьях, построенных для полимеразы (рис. 2L), поверхностных гликопротеинов (рис. 2Gn и 2Gc) и нуклеокапсидного белка (рис. 2N), кодируемых представителями семейства Bunyaviridae, секвенированные нами вирусы Бханджа и Кисмайо достоверно группируются с вирусами, входящими в род Phlebovirus. Следует отметить, что их ближайшими родственниками (хотя весьма дальними) являются вирус тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении (SFTSV) и вирус Heartland.

Результаты проведенного нами молекулярно-генетического анализа геномов вирусов Бханджа и Кисмайо позволяют сделать заключение, что исследованные вирусы являются новыми представителями рода Phlebovirus, в составе семейства Bunyaviridae.

К настоящему моменту в базе данных NCBI были опубликованы полные последовательности сегментов генома штаммов IG690, R-1819, 1ЬАг2709 и М3811 вируса Бханджа; штаммов PoTi4.92 и М3443 вируса Пальма (рассматривается как штамм вируса Бханджа); и штамма DakArk4927 вируса Форекария (записи JQ9563 76-JQ9563 81 от 31.07.2012 и JX961616-JX961630 от 21.01.2013). Результаты, полученные авторами подтверждают выводы, сделанные в нашей работе, о принадлежности вирусов группы Бханджа к роду Phlebovirus (Dilcher et al., 2012 и Matsuno et al., 2013).

Нами был проведен филогенетический анализ выведенных последовательностей белков (рис. 3) вирусов Бханджа и Кисмайо, полученных в данной работе, а также последовательностей вирусов группы Бханджа, опубликованных Dilcher et al. и Matsuno et al. и вирусов группы Уукуниеми (Palacios et al., 2013). На приведенных филогенетических деревьях вирусы группы Бханджа достоверно группируются вместе. Вирусы группы Бханджа и вирусы-возбудители тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении (SFTSV и HRTV) являются наиболее близкими внутри рода Phlebovirus и формируют кластер, отдельный от вирусов групп Уукуниеми и москитных лихорадок.

По генетической дистанции видно, что вирус Кисмайо отдален от остальных вирусов группы Бханджа, тогда как дистанции между вирусами Форекария, Пальма и Бханджа сравнимы с дистанциями между штаммами вируса Бханджа. Данные филогенетического анализа позволяют сгруппировать вирусы Бханджа, Пальма и Форекария по их географическому происхождению.

Тафглггиз

Рис. 2. Филогенетические деревья построены на основании выравнивания последовательностей полимеразы (Ь), гликопротеина Сп (вп), гликопротеина Ос (Сс) и нуклеокапсидного белка (Ы) вирусов Бханджа и Кисмайо и представителей всех родов семейства Випусп>1Г1с]ае. Цифры в узлах деревьев соответствуют бутстреп-подцержке. Положение вирусов Бханджа и Кисмайо на деревьях указано стрелкой. Вирус воикако на деревьях отмечен *,

поскольку предложено выделить его в отдельный от флебовирусов род (Marklewitz et al., 2011). Для вирусов Бханджа и Кисмайо приведены общепринятые сокращения BHAV и KISV, соответственно. STFSV - Severe fever with thrombocytopenia syndrome (код доступа в NCBI для L, Gn, Gc и N белков: ADZ04509, ADZ04471, YP006504092); HRTV - Heartland virus (AFP33395, AFP33393, AFP33389) UUKV - Uukuniemi virus (NP941973, NP941979, P22025); SFSV - Sandfly Sicilian Turkey virus (YP004382742-YP004382744); SFNV - Sandfly fever Naples (AEL29668, YP089671, YP089668); RVFV - Rift Valley fever virus (YP003848704, YP003848705, YP003848707); TOSV - Toscana virus (P37800); AGUV - Aguacate virus (YP004414703, YP004414702, YP004414705); CDUV - Candiru virus (YP004347992-YP004347994); ZTV - Zaliv Terpenia virus (AEL29693, AEL29694, AEL29696); PPV - Precarious point virus (AEL29677, AEL29679, AEL29680); EGAV - EgAN 1825-61 virus (AEL29653-AEL29655); GOUV - Gouleako virus (ABP68557, AEJ38174); TSWV - Tomato spotted wilt virus (NP049362, NP049359, NP049361); WSMoV - Watermelon silver mottle virus (NP620752, NP620767, NP620771); GBNV - Groundnut bud necrosis virus (NP619688, NP619703, NP619701); TZSV - Tomato zonate spot virus (YP001740047, YP001740044); CaCV - Capsicum chlorosis virus (YP717924, YP717923); INSV - Impatiens necrotic spot virus (NP619710, NP619691, NP619709); MYSV - Melon yellow spot virus (YP717933, YP717935, YP717921); HTNV - Hantaan virus (NP941982, NP941977); ANDV - Andes virus (NP604473, NP604472, NP604471); DOBV - Dobrava-Belgrade virus (NP942555, NP942554, NP942553); SEOV - Seoul virus (NP942558, NP942557, NP942556); SNV - Sin Nombre virus (NP941976, NP941974, NP941975); TPMV - Thottapalayam virus (YP001911124); TULV - Tula virus (NP942124, NP942586, YP004928153); PUUV - Puumala virus (NP941983, NP941984); BUNV -Bunyamwera virus (NP047211, NP047212, NP047213); OROV - Oropouche virus (NP982304, NP982303, NP982305); AKAV - Akabane virus (YP001497159, YP001497160, YP001497161); LACV - La Crosse virus (NP671968, NP671969, NP671970); DUGV - Dugbe virus (NP690576, NP690575, NP690574); CCHFV - Crimean-Congo hemorrhagic fever virus (YP325663, NP950235, NP950237).

98 г ВНАУ М31 юГМШЛУ 1<-1 ""[■ РАЬУ М34 „п1 РАЬУ Ро'П

ВНАУ МЭ811 -1819 М3443 що'РЛиУРоТИ.Я

_»виду-4

Ж1 виду Ю690

_р В11ЛУ !ЬАг2709

100*- РОКУ

¡¡-С

-К1$у -4

-1ЮТУ

- ШКУ

- /.IV -ШАУ -РРУ

— ТО$У

— БГОУ -СОКУ

-$1Р8У

-КУГУ

-лаиу

-ТЯ^'У

Европа

Африка

группа Уукуннеми

Москитные лихорадки

вп

III—вимгк-ш?

1<»Р-1ШАУМЗИ11

_. РА1.У Ро1¿1.92

РЛ1Л' МЗ-МЗ ,

_. ПИЛУ КИИ

Ю0> |)|1ЛУ

_[-ВНАУЬАЙТО

К»1- ГОКУ

— 5Г1'5У

— I тту

— иику —/.ту

— ЕОАУ

— РРУ

—кг от

-ЮТУ

— 5Р5У

—лс.да

— СВЦУ -Т5»'У

вс

Африки

группа Уукунисми

Мосюпнме .жхорадкн

г—BIWVR.H1» ' П— ВНАУММП

|_| РА1.У РоТ14.92

гоПРЛ!^»«.!«

_.ПНЛУЮИО

тоПвилу^ 111 (А V !ЪЛг2709 ГОНУ

— ИЩУ

— 1Д1КУ

— /.ТУ

— ЮЛУ

—ют

— кгау -спиу

-КУГУ -

— лоиу

-ТвЛ'У

Евронв

Африка

гр>пна Уукунисми

\Ь1СИИТИМ<

лихорадки

„|—ВИДУ МИН г]гШ1АУ и-иге ЮНЧ_,РА1УММ«

- РЛ1.У рога.« _

«Т- 11НЛУ1СМ0

_1Ш1ЛУ |*ЬЛг270У

"икр ГОКУ ОакАгМ927

-ШУ М

-ЦПУ

¡01-

-ШКУ — ¿ГГУ

-сриу —лоиу

Алия Афрми

фупиа

М<>СККШМС лихоратки

Рис. 3. Филогенетические деревья построены на основании выравнивания последовательностей полимеразы (Ь), гликопротеина вп (Сп), гликопротеина вс (вс) и нуклеокапсидного белка (Ы) вирусов группы Бханджа и представителей рода РИ/еЬоу^гиз. Для вирусов, не приведенных на рис. 2, использованы следующие обозначения: штамм Ю690 вируса Бханда, секвенированный в настоящей работе - ВНАУ; штаммы 1?)191 и КЪ92 вируса Кисмайо соответвенно - К15У Ш191 и К18У ЯЬ92; штаммы вируса Бханджа - ВНАУ Ю690 (коды доступа 1ч[СВ1: АвС60111-АОС60113), ВНАУ М3811 (АР066272-АР066274), ВНАУ 11-1819 (АОС60107, АСС60108, АСС60110), ВНАУ ¡ЬАг2709 (АСС60115-АСС60117); штаммы вируса Пальма - РАЬУ М3443 (АР066276-АР066278), РАЬУ РоИ4.92 (АСС60099-АСС60101), штамм вируса Форекария - РОЯУ ОакАгк4927 (А0сб0103-А0сб0105).

Разработка ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вирусов Бханджа и Кисмайо

На основании полученных данных о принадлежности вирусов Бханджа и Кисмайо к роду РЫеЪотгиз, близости вирусов группы Бханджа к флебовирусам возбудителям тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении и того, что этиологическими агентами лихорадочных заболеваний человека, имеющих в анамнезе присасывание клеща, являются неизученные представители рода было принято решение расширить список мишеней разрабатываемой нами тест-системы. Создание универсальной ОТ-ПЦР тест-системы для детекции всех флебовирусов значительно повышает ценность нашей работы.

В качестве мишени для олигонуклеотидных праймеров был выбран ген полимеразы, представляющий собой наименее вариабельный участок генома. Дизайн праймеров проводили на основании выравнивания всех первичных аминокислотных последовательностей гена полимеразы флебовирусов, представленных в международной базе данных ЫСВ1 на октябрь 2011 г. (всего 187 последовательностей). В качестве мишеней вырожденных праймеров были выбраны два участка последовательности, находящиеся на расстоянии 169 аминокислотных остатков (здесь и далее все номера аминокислот и расстояния приводятся согласно аминокислотной последовательности полимеразы вируса лихорадки долины Рифт (УР003 848704)). Первый участок протяженностью 8 аминокислот (с 759 по 766 ак)

для отжига прямого праймера содержит консервативные для флебовирусов аминокислоты в У-ЬСЫКЕЕ, аминокислота в 761 позиции вариабельна.

750 760 770 780 790

BHAV

KISV

TOSV

SFNV

CDUV

AGUV

SFSV

UUKV

SFTSV

RVFV

Massilia

Granada

Ja cunda

Alenquer

Maldonado

Ariquemes

Echarate

Itaituba

Mucura

Morumbi

Ñique

Serra Norte

Turuna

Oriximina

Durania

Ixcanal

Armero

Utique

Arbia

Corfou

Tehran

Adria

Рис. 4. Фрагмент выравнивания консервативного участка полимеразы флебовирусов с 750 по 790 аминокислоту, использованный для дизайна прямого вырожденного праймера. Использованы обозначения и сокращения, как и на рис 2. Нумерация аминокислот согласно последовательности RVFV. Выделен участок-мишень олигонуклеотидного праймера, стрелкой указано направление праймера. Белыми буквами на черном фоне обозначены аминокислоты, которые консервируются более чем в 60% аминокислотных последовательностей, использованных для построения выравнивания. Серым цветом выделены гомологичные аминокислоты. Тире обозначены пропуски в аминокислотных последовательностях, образовавшиеся при построении выравнивания. Коды доступа NCBI последовательностей, не приведенных на рисунке 2: TOSV — Toscana virus (Р37800), Massilia virus (ABG56143), Granada virus (ADO 17679), Jacunda virus (AEA29965), Alenquer virus (AEA30054), Maldonado virus (AEA30055), Ariquemes virus (AEA30056), Echarate virus (AEA30058), Itatuba virus (AEA30059), Mucura virus (AEA30060), Morumbi virus (AEA30061), Nique virus (AEA30062), Serra Notre virus (AEA30063), Turuna virus (AEA30064), Oriximina virus (AEA30065), Durania virus (AEB70976), Ixcanal virus (AEB70982), Armero virus (AEB70984), Utique virus (ADD82853), Arbia virus (ABI15195), Corfou virus (ADD65203), Tehran virus (ADD65204), Adria virus (ADR78562).

SKNKgK KNFgE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE

"ï'Hknkee

JïgKNKEE iYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE iYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE JYFKNKEE

GISCSPfcQMWSi GMSCS PSQMVNSi

ES E

LT A

PT T

PT 'I'

T г r GT E DN N GRYT SSPE

EPlESTp flu*

r-stn[|F-rpl: "Ш : m T[

dpideM il HSbRPffi I

iDiiffl 5 NTLRI:® 5 N:--LRr S g

m/1, p.D В g

N^lreM

NSLRDM SPLRC® 3KICI®

sklldB

SKLLDffl RPTKDjJ SEIRCVH

rttkeIJ flPlDíjJ SeireihJ

В подавляющем большинстве случаев в этой позиции находится фенилаланин, в случае флебовирусов, выделенных в Китае - тирозин, вирусы Бханджа, Кисмайо и Уукуниеми кодируют лейцин в этой позиции (рис. 4).

Обратный праймер синтезирован на участок с 921 аа по 927 аа, который входит в известный полимеразный Рге-А мотив. Избранный участок содержит консервативные аминокислоты рНСО-ЯЕ. Аминокислота в 925 позиции вариабельна, но в подавляющем большинстве случаев в этой позиции стоит лейцин или аспарагиновая кислота (рис. 5).

BHAV

KISV

TOSV

SFNV

CDUV

AGUV

SFSV

UUKV

SFTSV

RVFV

Massilia

Granada

Jacunda

Alenquer

Maldonado

Ariquemes

Echarate

Itaituba

Mucura

Morumbi

Ñique

Serra Norte

Turuna

Oriximina

Durania

Ixcanal

Armero

Рис. 5. Фрагмент выравнивания консервативного участка полимеразы флебовирусов с 895 по 945 аминокислоту, использованный для дизайна обратного вырожденного праймера. Использованы обозначения и сокращения, как и на рис 2 и рис. 4.

На эти последовательности были синтезированы смеси вырожденных праймеров:

Прямой: РЫР2_10-2011 ООС-ТАС-ТТС-ААЯ-ААУ-ААК-САЫ-ОА Обратный: РЫМ2_10-2011 СТС-ТСТ-САО-ЮС-ЮС-ЯТО-УТО Продукт амплификации имеет длину 507 нт (согласно последовательности полимеразы вируса лихорадки долины Рифт (N0014397)). Созданные праймеры

являются компромиссом между специфичностью и количеством вариантов праймеров в смеси, условно ограниченных 64. Для уменьшения числа вариантов в обратный праймер были введены инозиновые основания.

Проверка специфичности праймеров

Способность сконструированных олигонуклеотидов специфично амплифицировать выбранный участок генома была продемонстрирована на коллекции кДНК следующих флебовирусов: лихорадки долины Рифт, Неаполитанской и Сицилианской москитных лихорадок, Тоскана и Уукуниеми. В качестве отрицательных контролей были использованы арбовирусы, геном которых представлен оцРНК(-), оцРНК(+) и дцРНК (табл. 1). Для синтеза кДНК использовали статистические гексануклеотидные затравки. Соответствие ампликона каждому вирусу подтверждено секвенированием.

Сконструированные праймеры специфически амплифицируют участок Ь сегмента генома вируса Бханджа и двух штаммов вируса Кисмайо (рис. 6). Последовательности двух штаммов вируса Кисмайо на нуклеотидном уровне имеют 98,7% идентичности.

Созданная пара праймеров позволяет специфично амплифицировать кДНК всех флебовирусов, использованных в работе, включая вирус лихорадки долины Рифт и штамм ЕК78 вируса Уукуниеми (на рис. 6 не показано), и не амплифицирует ни один из вирусов, тестированных в качестве отрицательных контролей.

Дизайн олигонуклеотидных праймеров выполнен нами на основании выравнивания значительно большего числа последовательностей флебовирусов, чем в используемой в настоящее время системе детекции флебовирусов (вапсЬег-Зесо й а1., 2003). А способность созданной нами пары праймеров специфично амплифицировать целевой участок генома была проверена на большей коллекции флебовирусов. Поэтому у нас есть основания утверждать, что разрабатываемая нами тест-система превосходит вышеупомянутую, она универсальна и специфична для всех известных на настоящий момент вирусов рода РИ1еЬог1гш.

Детекция флебовирусов в полевом материале

На следующем этапе нами проведено обследование суспензий клещей, собранных в различных регионах РФ, на присутствие флебовирусов с использованием созданных праймеров. В качестве исходных матриц была использована тотальная РНК, выделенная из клещевых суспензий. В реакции обратной транскрипции в качестве затравки использовали рендом гексамеры. Всего обследовано 1414 иксодовых клещей, объединенных в 342 пула (табл. 2).

Рис. 6. Гель-электорофорез, демонстрирующий специфичность сконструированных праймеров. Ожидаемый амплифицируемый фрагмент РНК-полимеразы флебовирусов длиной около 507 пн указан стрелкой. Представители рода флебовирусв обозначены квадратной скобкой. Использованные сокращения: (ВНАУ) - вирус Бханджа; (КІБУ Ші91 и 11(192) - штаммы Иі91 и ЯЬ92 вируса Кисмайо; (БРЫУ) - вирус неаполитанской москитной лихорадки; (8Р8У) - вирус сицилианской москитной лихорадки; (Т05У) - вирус Тоскана; (1ШКУ) - штамм Э23 вируса Уукуниеми; (ВАТУ) - вирус Батаи; (ТАНУ) - вирус Тягиня; (1ЫКУ) - вирус Инко; (ССГОУ) -вирус Крымской-Конго геморрагической лихорадки; (ОНОУ) - вирус Дхори; (\таУ) - вирус лихорадки Западного Нила; (УРУ) - вирус Желтой лихорадки; (8ГЫУ) - вирус Синдбис; (СНІКУ) - вирус Чикунгунья; (КЕМУ) - Вирус Кемерово; М\¥ - маркер молекулярного веса.

В обследованном полевом материале были обнаружены 22 положительных образца: суспензии 18 клещей Ixodes persulcatus собранных в Республике Карелия и в Ставропольском крае - три пула клещей Dermacentor reticulatus и один пул Hyalomma scupense. Были определены нуклеотидные последовательности полученных ампликонов и проведено их сравнение с базами данных NCBI.

Последовательности, обнаруженные в республике Карелия были названы Педасельга (12 ампликонов), Кижи (5) и Гомсельга (1). Три последовательности, обнаруженные в клещах D. reticulatus в Ставропольском крае были идентичны на 99% и обозначены Ставрополь, последовательность, обнаруженная в пуле Н. scupense, — Андропов.

На нуклеотидном уровне последовательности, выделенные в республике Карелия, не имели значимых гомологий с последовательностями флебовирусов. Однако последовательность Педасельга на участке со 147 по 272 нуклеотид имела 73% идентичности с участком с 150 по 275 нуклеотид последовательности мРНК гипотетического белка Ixodes scapularis. (рис. 7)

>ref |XM_002402445 .11 Ixodes scapularis hypothetical protein, mRNA Length=378

PdSlg 148 TTATTGCGTTGACTTGAGCAAGGCAAAGCTACAGAAGATGTGGGGTGAGAAAGTGGAGGA 207

III I I I I I I I I I I I I I I II III I I I I I I I I I I I I I I II II III I I.scap 150 TTACTGCGTAGACTTGAGCCTGGTTGAGCGAAAGAAGATGTGGGGCGACAATGTGCAAAG 209

PdSlg 208 CATGATCTCCAACGACATACTGGAATCTCTGGGTGGCTACTCTCTAGAGCAGCTCGGAAC 267

I I I I I I I II I I I I I I I I I I I I I I II I I I I I I I III I I I I I I I I I I.scap 210 CATGATCATGGATGACATCCTGGAATCGCTGGGAGGGTACACCTTTGAAGAGCTGGGAAC 269

PdSlg 268 GCTAAA 273 II II

I.scap 270 CCTCAA 275

Рис. 7. Выравнивание нуклеотидных последовательностей Педасельга (обозначена PdSlg) и гипотетического белка Ixodes scapularis (обозначена I.scap, код доступа NCBI ХМ002402445).

Выведенная аминокислотная последовательность Педасельга имела 62% сходства (42% идентичности) с участком с 769 по 922 аминокислоту полимеразы вируса EgAN 1825-61 группы Уукуниеми (код доступа NCBI AEL29654). Аминокислотная последовательность Кижи имела 64% сходства (39% идентичности) с участком с 769 по 907 аминокислоту полимеразы вируса Precarious

point группы Уукуниеми (AEL29680). Последовательность Гомсельга продемонстрировала 66% сходства (51% идентичности) с участком с 738 по 904 аминокислоту полимеразы вируса Odrenisrou группы москитных лихорадок (AEL29670).

Последовательности, обнаруженные в Ставропольском крае, на нуклеотидном уровне обнаружили сходство с последовательностью L сегмента вируса Precarious point (НМ566181): Последовательность Ставрополь на участке с 376 по 459 нуклеотид с участком с 2699 по 2782 нуклеотид с 74% идентичности; последовательность Андропов — с 52 по 2451 нуклеотид с участком с 2372 по 2451 нуклеотид - 73% идентичности.

Таким образом, можно сделать заключение, что обнаруженные в клещах последовательности Ставрополь, Андропов, Педасельга, Кижи и Гомсельга принадлежат новым представителям рода Phlebovirus. Данные выводы были дополнительно подтверждены при помощи филогенетического анализа. На филогенетическом дереве (рис. 8) вирус Бханджа, штаммы Rh91 и Rh92 вируса Кисмайо и последовательности Педасельга, Гомсельга, Кижи, Ставрополь и Андропов с высокой степенью достоверности группируются с представителями рода Phlebovirus. Ближайшим, хотя и весьма дальним, родственником последовательностей Ставрополь и Андропов является вирус Уукуниеми, а последовательности Педасельга и Кижи расположены на отдельной ветви, удаленно от этих вирусов. Интересно, что последовательность Гомсельга обнаруживает родство с флебовирусами группы москитных лихорадок.

По результатам поиска в базе NCBI нуклеотидная последовательность вируса Педасельга на участке со 148 по 273 нуклеотид обнаружила 73% идентичности с 150 по 275 нуклеотид мРНК гипотетического белка Ixodes scapularis (код доступа NCBI ХМ002402445). Требовалось выяснить, какое отношение имеет мРНК гипотетического белка к геному клеща и доказать, что последовательность Педасельга это фрагмент полимеразы неохарактеризованного флебовируса.

Последовательность гипотетического белка была получена при осуществлении проекта Ixodes scapularis genome (ISG). Выявление деталей происхождения этой последовательности затруднительно, о функциях этого белка также ничего не

известно. Данная последовательность демонстрирует 50% гомологии и 32% идентичности с участком с 739 по 885 аминокислоту полимеразы вируса Уукуниеми (№941973). На основании этого можно предположить, что последовательность гипотетического белка имеет вирусную природу.

99 г

100г

100

100 г

100

■ AGUV

— RVFV

— SFSV TOSV

iOo'SFNV

-CDUV

-Gomselga ^

-SFTSV

— 11RTV -BHAV ■ K1SV Rh91

100LKJSVRh92

-Pedaselga-^

-КМ <4

-Stavropol

-Andropov ^

-PPV

EGAV UUKV ZTV

-GOUV

-TSWV

-BUNV

• HTNV -DUGV

группа Уукуниеми

Phlebovirus

(переносимые

москитами)

Phlebovirus

(переносимые

клещами)

0.05

Рис. 8. Филогенетическое дерево построено на основании выравнивания аминокислотных последовательностей участка полимеразы, амплифицируемого с использованием сконструированных олигонуклеотидов (с 767 по 920 аминокислоту согласно последовательности RVFV, код доступа YP003 848704). Обозначения последовательностей и коды доступа представлены в подписи к рис. 2L. Штаммы Rh91 и Rh92 вируса Кисмайо обозначены соответвенно KISV Rh91 и K1SV Rh92.

Известно, что геном клещей содержит фрагменты генома переносимых ими

вирусов. В работе (А1ЬегсН & а1., 2012) ампликоны 13 из 50 культур клеток клещей

содержали короткий фрагмент, идентичный фрагмену гена нуклеокапсидного белка вируса Крымской-Конго геморрагической лихорадки. Однако на других участках последовательности ампликонов не было обнаружено сходства ни с участками генома вируса ККГЛ, ни других найровирусов. Авторам не удалось амплифицировать «вирус» при помощи набора праймеров, амплифицирующих участки трех сегментов генома ККГЛ в обследованных «найроположительных» культурах. Методами электронной микроскопии в этих культурах не удалось обнаружить буньяподобных вирусных частиц, что отметает версию о вирусе, инфицирующем клетки клещей.

Последовательность Педасельга существенно длиннее последовательности, содержащейся в геноме Ixodes scapularis. Таким образом, можно предположить, что в Республике Карелия имеет место циркуляция неохарактеризованного вируса Педасельга, представителя рода Phlebovirus.

Достоверно утверждать, что амплифицированная нами последовательность имеет вирусную природу, нам бы позволило выделение вируса Педасельга. Попытки его выделения на перевиваемых культурах клеток СПЭВ, ВНК-21 и Vero, а также в н.б.м. оказались безрезультатны. С этой целью предполагается использовать перевиваемую культуру клеток клещей IRA 19.

Выводы

1. Впервые определены полногеномные нуклеотидные последовательности прототипного штамма IG690 вируса Бханджа и штамма Rh91 вируса Кисмайо. Длина L, M и S сегментов генома вируса Бхаджа составляет 6333, 3304 и 1807 нуклеотидов соответственно, вируса Кисмайо - 6344, 3323 и 1879 нуклеотидов соответственно.

2. На основании множественного выравнивания и филогенетического анализа установлено, что исследуемые вирусы являются новыми представителями рода Phlebovirus. Их ближайшими родственниками (хотя весьма дальними) являются вирус тяжелой лихорадки с синдромом тромбоцитопении (SFTSV) и вирус Heartland (HRTV). Белок, кодируемый L сегментом генома вирусов Бханджа и Кисмайо, имеет 52% гомологии с полимеразой SFTSV и HRTV. Гомология белка, кодируемого M

сегментом генома вирусов Бханджа и Кисмайо, и предшественника поверхностных гликопротеинов SFTSV и HRTV достигает 35%. Гомология нуклеокапсидного белка вирусов Бханджа и Кисмайо с N белком SFTSV и HR.TV составляет 53%. Гомология аминокислотных последовательностей полимеразы вирусов Бханджа и Кисмайо достигает 85%, предшественника гликопротеинов — 60%, нуклеокапсидного белка -75%.

3. Создана универсальная ОТ-ПЦР тест-система, позволяющая детектировать участок L сегмента генома флебовирусов в экспериментальных и полевых материалах. Продемонстрирована специфичность (способность выявлять только целевую РНК) созданной тест-системы с использованием различных арбовирусов.

4. При помощи созданной тест-системы в клещах Ixodes persulcatus, Dermacentor reticulatus и Hyalomma scupense, собранных в Республике Карелия и Ставропольском крае, детектированы пять РНК-изолятов вирусов — кандидатов для включения в род Phlebovirus. У четырех из них выявлено родство с вирусами группы Уукуниеми, один продемонстрировал наиболее высокое сходство с вирусами группы москитных лихорадок.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Климентов A.C., Гмыль А.П., Бутенко A.M., Гмыль JI.B., Исаева О.В., Ларичев В.Ф., Хуторецкая Н.В., Карганова Г.Г. Таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо (семейство Bunyaviridae). Эпидемиология и инфекционные болезни 2012, №4, с. 4-8.

2. Климентов A.C., Ковальчук И.В., Соломащенко Н.И., Пурмак К.А., Романенко E.H., Тихонова Г.А., Бугмырин C.B., Беспятова Л.А., Иешко Е.П., Козловская Л.И., Шевцова A.C., Романова Л.Ю., Холодилов И.С., Хуторецкая Н.В., Карганова Г.Г., Гмыль А.П. Разработка универсальной тест-системы для детекции рибонуклеиновой кислоты Флебовирусов. Инфекционные болезни том 10 приложение №1 Материалы IV Ежегодного Всероссийского конгресса по инфекционным болезням (Москва, 2628 марта 2012 г.) сс 183-184.

3. Климентов A.C., Хуторецкая Н.В., Исаева О.В., Бугмырин C.B., Холодилов И.С., Беспятова Л.А., Иешко Е.П., Козловская Л.И., Шевцова A.C., Романова Л.Ю.,

Ковальчук И.В., Соломащенко Н.И., Пурмак К.А., Романенко Е.Н., Тихонова Г.А., Карганова Г.Г., Гмыль А.П. Апробация пан-флебовирусной ОТ-ПЦР тест-системы. Инфекция и иммунитет Том 2, №1-2, с.82-83. Материалы X съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемиологического благополучия населения Российской Федерации (Москва, 12-13 апреля 2012 г.).

4. Климентов А.С. Разработка универсальной тест-системы для детекции РНК Флебовирусов. Тезисы докладов Конференция совета молодых ученых ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. Московская область 27 апреля 2012, с 17.

5. Klimentov A.S., Khutoretskaya N.V., Butenko A.M., Isaeva O.V., Larichev V.F., Bugmyrin S.V., Kholodilov I.S., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Iu., Karganova G.G., Gmyl A.P. Рап-phlebovirus RT-PCR: identification of novel phlebovirus species. Programme and abstracts of XII International Jena symposium on tick-borne diseases (Weimar, Germany 21-23 of March 2013), p. 41.

Благодарности

Я выражаю искреннюю благодарность д.б.н. профессору A.M. Бутенко и к.б.н. А.П. Гмылю за научное руководство, неизменную поддержку и участие в подготовке диссертации. Я глубоко признателен д.б.н. Г.Г. Каргановой за помощь и внимание к настоящей работе.

Благодарю сотрудников лаборатории биологии и индикации арбовирусов НИИ вирусологии, к.б.н. В.Ф. Ларичева и к.б.н. Н.В. Хуторецкую за активное сотрудничество при проведении исследований.

Хочу поблагодарить сотрудников ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН к.б.н. Гмыль JI.B., к.б.н. Козловскую Л.И., к.б.н. Исаеву О.В., Белову O.A., Холодилова И.С., Простову М.А., к.б.н. Романову Л.Ю. и сотрудника Института биологии Карельского центра РАН к.б.н. Бугмырина C.B. за непосредственную помощь и участие в данной работе.

Я благодарен всем соавторам моих работ, не упомянутых выше, за помощь в проведении исследований.

Подписано в печать: 19.04.2013 Объем 1,0 п.л Тираж 100 экз. Заказ № 72 Отпечатано в типографии «Реглет» 119606, г. Москва, пр-т Вернадского, д. 39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Климентов, Александр Сергеевич, Москва

Министерство Здравоохранения Российской Федерации ФГБУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского

Российская Академия Медицинских Наук ФГБУ Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П.Чумакова

04201357048 На правах рукописи

Климентов Александр Сергеевич

Молекулярно-генетическая характеристика и таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо, представителей антигенного комплекса Бханджа (семейство Випуамт(1аё)

03.01.03 - молекулярная биология 03.02.02 - вирусология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители: д.б.н., профессор Бутенко A.M. к.б.н., доцент Гмыль А.П.

МОСКВА 2013

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................4

Актуальность проблемы.........................................................................................4

Цели и задачи исследования..................................................................................5

Научная новизна и практическая значимость......................................................6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.......................................................................................8

2.1 Общая характеристика семейства Випуамтйае.............................................8

2.1.1 История и классификация.............................................................................8

2.1.2 Особенности морфологии и строения........................................................11

2.1.3 Стратегия кодирования генома...................................................................15

2.2 Характеристика вирусов антигенной группы Бханджа..............................22

2.2.1 История изучения.........................................................................................22

2.2.2 Экология........................................................................................................25

2.2.3 Физико-химическая характеристика..........................................................30

2.2.4 Биологические свойства..............................................................................31

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.............................................................................36

3.1 Вирусы..............................................................................................................36

3.2 Бактериальный штамм....................................................................................38

3.3 Клещевые суспензии.......................................................................................39

3.4 Олигонуклеотиды............................................................................................40

3.5 Частичная очистка вирусов Бханджа и Кисмайо.........................................41

3.6 Иммуноферментный анализ (ИФА)..............................................................41

3.7 Электрофорез белков в полиакриламидном геле.........................................42

3.8 Вестерн-блот....................................................................................................43

3.9 Выделение тотальной РНК.............................................................................44

3.10 Обратная транскрипция................................................................................45

3.11 Достройка комплементарной цепи..............................................................45

3.12 Полимеразная цепная реакция (ПЦР).........................................................46

3.13 Электорофорез в агарозном геле.................................................................46

3.14 Клонирование ДНК.......................................................................................47

3.15 Секвенирование ДНК....................................................................................50

3.16 Компьютерный анализ последовательностей и филогенетический анализ .................................................................................................................................50

4. РЕЗУЛЬТАТЫ...................................................................................................52

4.1 Очистка вирусов Бханджа и Кисмайо в градиенте сахарозы и определение вируссодержащих фракций..................................................................................52

4.2 Определение нуклеотидных последовательностей геномов вирусов Бханджа и Кисмайо...............................................................................................55

4.3 Определение таксономического положения вирусов Бханджа и Кисмайо .................................................................................................................................59

4.4 Разработка ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вирусов Бханджа и Кисмайо..................................................................................................................77

4.5 Определение специфичности праймеров......................................................80

4.6 Апробация созданной тест-системы на полевом материале......................83

4.7 Филогенетический анализ последовательностей.........................................83

5. ОБСУЖДЕНИЕ.................................................................................................89

6. ВЫВОДЫ...........................................................................................................99

7. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................101

8. БЛАГОДАРНОСТИ........................................................................................103

9. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ...............................................................................104

1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

К семейству Bunyaviridae относятся многие вирусы, вызывающие заболевания человека, в их числе: энцефалиты Ла Кросс и Калифорнийский, лихорадки долины Рифт и Крымская-Конго и другие [48, 131].

За последние несколько лет были открыты еще несколько буньявирусов, патогенных для человека и домашних животных. В 2009 г. в Китае была выявлена тяжелая лихорадка с синдромом тромбоцитопении (SFTS), этиологически связанная с новым флебовирусом, переносимым клещами [144, 145]. В том же году в США из крови больных со сходными симптомами был выделен вирус, названный Heartland, родственный вирусу SFTS [95]. В Германии в 2011г. был обнаружен ортобуньявирус, названный Schmallenberg, вызывающий крупные эпизоотии среди крупного рогатого скота, коз и овец. Заболевание характеризуется лихорадкой, снижением продукции молока, а также гибелью новорожденных животных [62].

Несмотря на выраженное значение буньявирусов и вызываемых ими инфекций в патологии человека и животных, данные по молекулярно-генетической характеристике и таксономии многих из них весьма ограничены или отсутствуют. Это в полной мере относится к вирусу Бханджа, вызывающему острые лихорадочные заболевания человека [1, 31, 114]. Описан случай тяжелого менингоэцефалита при естественном заражении вирусом Бханджа через укус клеща [138].

Прототипный штамм вируса Бханджа IG690 был изолирован в 1954 г. из клещей Haemaphysalis intermedia, собранных с козы в Индии [127]. Впоследствии циркуляция вируса Бханджа была установлена во многих странах Африки, Азии и Европы [67, 68]. Вирус Бханджа, наряду с африканскими вирусами Кисмайо (Сомали) и Форекария (Гвинея), на основании перекрестных связей, выявленных в реакции связывания комплемента (РСК) и реакции торможения гемагглютинации (РТГА), объединены в антигенную группу Бханджа [5, 27, 41]. На основании данных электронной микроскопии вирус Бханджа был включен в состав семейства Bunyaviridae, в категорию буньяподобных вирусов [99]. Для вирусов Бханджа, Кисмайо и Форекария не установлено антигенных связей с другими представителями семейства Bunyaviridae, их таксономическое положение не определено. Вся доступная в литературе информация о вирусе Бханджа представляет собой либо сообщения о выделении вируса или обнаружении специфических антител, либо данные по экспериментальному заражению животных. Информация о вирусах Форекария и Кисмайо еще более ограничена. К началу выполнения данной работы какие-либо данные молекулярно-генетических исследований вирусов группы Бханджа отсутствовали, что определяет актуальность диссертационной работы.

Цели и задачи исследования

Для достижения этих целей были поставлены следующие задачи:

• Определить нуклеотидные последовательности геномов штамма Ю690 вируса Бханджа и штамма ЯЪ91 вируса Кисмайо.

• Провести апробацию созданной пары праймеров на полевом материале.

Научная новизна и практическая значимость

1. Впервые определены полногеномные нуклеотидные последовательности прототипного штамма Ю690 вируса Бханджа и штамма Ш191 вируса Кисмайо. На основании множественного выравнивания выведенных аминокислотных последовательностей вирусов Бханджа и Кисмайо с последовательностями представителей семейства Випу№тс1ае и филогенетического анализа впервые установлена принадлежность этих вирусов к роду РЫеЪочггш. Последовательности сегментов генома вируса Бханджа были депонированы в ОепВапк с кодами доступа КС521440-КС521442.

2. Создана ОТ-ПЦР тест-система, позволяющая амплифицировать фрагмент Ь сегмента генома флебовирусов длиной 507 нуклеотидов (по последовательности полимеразы вируса лихорадки долины Рифт (МСО14397)). Продемонстрирована специфичность разработанной тест-системы с использованием различных арбовирусов.

3. Созданная ОТ-ПЦР тест-система была апробирована на полевом материале, собранном в различных регионах европейской части РФ. В результате проведенной работы в клещах Ixodes persulcatus, Dermacentor reticulatus и Hyalomma scupense обнаружены фрагменты РНК-полимеразы пяти новых представителей рода Phlebovirus.

Апробация работы

Публикации

По результатам диссертации опубликована 1 статья в научном журнале «Эпидемиология и Инфекционные болезни» 2012 г., №4, с. 4-8; 2 - в сборниках материалов конференций и 2 тезисных сообщения.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1 Общая характеристика семейства Bunyaviridae

2.1.1 История и классификация

В 1975 году крупная группа арбовирусов, имеющих общую морфологию, морфогенез и антигенные свойства, была объединена в семейство Bunyaviridae [126]. В настоящее время в семейство входят 4 рода вирусов животных: Phlebovirus, Orthobunyavirus, Nairovirus, Hantavirus', и один род вирусов растений - Tospovirus. В табл. 1 приведены вирусы-прототипы родов, распространение и основные хозяева представителей родов.

Таблица 1. Роды семейства Випуаутс1ае, распространение вирусов, основные переносчики и хозяева.

Род Прототипный вирус Распространив вирусов рода Основные хозяева Основные прокормители

Orthobunyavirus Вирус Bunyamwera По всему миру Комары, москиты, Человек, домашний скот

Hantavirus Вирус Hantaan По всему миру Грызуны —

Nairovirus Вирус Dugbe По всему миру Клещи Человек, домашний скот

Phlebovirus Вирус Rift Valley fever Европа, Азия, Африка, Америка Комары, москиты, клещи Человек, домашний скот

Tospovirus Вирус Tomato spotted wilt По всему миру Трипсы Растения

Исторически разделение буньявирусов на рода, а родов на группы, субтипы и комплексы, проводилось на основании их серологических взаимодействий. Основные реакции, используемые в классификации, это реакция связывания комплемента (РСК), реакция торможения

гемагглютинции (РТГА) и реакция нейтрализации (РН) [32, 124]. Для классификации также использовали сравнение частичных последовательностей генома. Однако главным ограничением такого подхода было малое количество доступных последовательностей [100].

В семействе Випуаут&с1ае насчитывается 19 вирусов в составе 7 серогрупп и 21 несгруппированный вирус, для которых не было обнаружено антигенных связей с вирусами известных родов (табл. 2) [100]. По этой причине секвенирование генома может служить единственным основанием для их классификации. Проводимая в настоящее время массовая расшифровка полных последовательностей геномов буньявирусов, позволит создать более полную классификацию вирусов семейства.

Таблица 2. Неклассифицированные вирусы семейства Bunyaviridae.

Антигенная группа Вирус, прототипный штамм

Бханджа Bhanja virus - IG690

Forecariah virus - ArK4927

Kismayo virus - A3641

Кайсоди Kaisodi virus - IG14132

Lanjan virus - Mal TP94

Silverwater virus - Can 131

Маппутта Mapputta virus - AusNRM186

Gan Gan virus - NB6057

Maprik virus - MK7532

Trubanaman virus - AusMRM3630

Окола Okola virus - Dak YM50/64

Tanga virus -TanzMP1329

Резистенция Resistencia virus - AG80-504

Antequera virus - AG80-226

Barranqueras virus -AG80-381

Йоге Yogue virus - DakAnD5634

Kasokero virus - UGZ52969

Несгруппированные вирусы Bangui virus - DakHB745

Belem virus - BeAnl41106

Belmont virus - R8659

Bobaya virus - AnB2208d

Caddo Canyon virus

Chim virus - LEIV-858Uz

Enseada virus - 75V25880

Issyk-Kul virus - LEIV-315K

Keterah virus - P6-1361

Kowanyama virus - Aus MRM1178

Lone Star virus - USA TMA1381

Pacora virus - PanJ19

Para virus - BeAn280577

Razdan virus - LEIV-2741 Ar

Santarem virus - BeAn238758

Sunday Canyon vims - PJVIL52301-11

Tai virus - ArA 94/79

Tamdy virus - LEIV-1308z

Tataguine virus - DaKIPD/A252

Wanowrie virus - IG700

Witwatersrand virus - SAArl062

Yacaaba virus - NB6028

2.1.2 Особенности морфологии и строения

2.1.2.1 Морфология

Ранние исследования методами электронной микроскопии и негативного окрашивания показали, что вирионы буньявирусов сферические или плейоморфные, в зависимости от способа фиксации [93]. Диаметр вириона колеблется от 90 до 110 нм. По его поверхности равномерно распределены шипообразные выступы высотой 5-10 нм, образованные гликопротеинами [102, 126]. Такая морфология (рис. 1А) типична для всех буньявирусов и данные электронной микроскопии являются основанием для включения вирусов в это семейство [99]. Martin et al. [93] отмечают некоторые тонкие различия в морфологии представителей различных родов буньявирусов. Авторы объясняют это либо особенностями взаимодействия красителя с гликопротеинами, либо различиями в расположении гликопротеинов на поверхности вириона.

Ранее предполагалось, что вирусы семейства Bunyaviridae не имеют строго определенной формы. Благодаря комбинированию новых методов электронной криомикроскопии и томографической реконструкции [20, 134] были определены 3-х мерные нативные конформации вирионов двух представителей рода Phlebovirus: вируса Уукуниеми [102] и вируса лихорадки долины Рифт [55, 72, 128] с разрешением около 6 нм. На препарате внеклеточного неокрашенного вируса Уукуниеми установлено, что шипы на его поверхности образуют структуры подобные полым цилиндрам. В основании шипов, предположительно, расположены 5 и 6-гранные кластеры, образующие т.н. Т=12 симметрию [28, 102]. Поверхность вируса лихорадки долины Рифт формируют 122 капсомера, также упорядоченные в Т=12 икосаэдрической решетке, наиболее вероятно, состоящей из 720 гетеродимеров гликопротеинов [55, 72].

Рис. 1. а) Электронная микрофотография вируса JIa Кросс, масштаб 100 нм [48]. б) 3-х мерная модель вириона буньявирусов на примере вируса Уукуниеми. Обозначены: гликопротеиновые шипы (1), мембрана (2), рибонуклеопротеины (3) [102].

Полученная модель (рис. 1Б), по утверждению авторов, полностью соответствует всем вирусам рода Phlebovirus. Таким образом, флебовирусы имеют уникальную архитектуру, находясь на границе между истинно плейоморфными и икосаэдрическими вирусами. Только исследования вирусов остальных родов методами криотомографии ответят на вопрос насколько такое сочетание плейоморфизма и упорядоченности аномально [102]. Данные криотомографических исследований получены также для представителей рода Hantavirus: вирусов Хантаан и Тула. Их вирионы плейоморфны, имеют округлую либо вытянутую форму, на поверхности вириона расположены шипы, образованные четырьмя субъединицами, каждая из которых, по-видимому, сформирована димерами гликопротеинов [24, 71]. Внутри семейства, по-видимому, имеет место значительное разнообразие в структуре гликопротеиновой решетки.

2.1.2.2 Строение вириона и физико-химические свойства Вирион буньявирусов состоит из четырех структурных белков: РНК-зависимой РНК-полимеразы (L белка), белка нуклеокапсида (N) и поверхностных гликопротеинов (Gn и Gc) [48]. Молекулярная масса вириона составляет 300-400 МДа, плавучая плотность в CsCl - 1,2-1,21 г/см3; в

сахарозе - 1,16-1,18 г/см , коэффициент седиментации - 350-500 S20W [100].

Геном буньявирусов представлен тремя сегментами одноцепочечной РНК, обозначенными согласно их размерам; L (large), М (medium) и S (small); негативной или амбисенс полярности. Он составляет порядка 1-2% от веса вириона. Каждый сегмент РНК упакован в индивидуальный нуклеокапсид диаметром 2-2,5 нм, с капсидом связываны несколько молекул L белка, образуя рибонуклеопротеиновый комплекс (рибонуклеопротеин, РНП) [100]. На модели вируса Ла Кросс показано, что вирусная частица содержит около 2100 молекул N белка и 25 молекул РНК-полимеразы [101].

Рибонуклеопротеиновые комплексы трех типов упакованы в двухслойную мембранную оболочку, толщиной около 4-5 нм, в мембрану оболочки заякорены гликопротеины. Нуклеокапсиды имеют вид нитевидных уплотнений внутри вириона, имеющих контакты с мембраной на постоянном расстоянии, это свидетельствует о взаимодействии цитоплазматического хвоста гликопротеина Gn с N белками в составе РНП. Вероятно, данное взаимодействие играет важную роль в процессе упаковки генома [103, 130].

В отличие от друг

Информация о работе

Климентов, Александр Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.01.03

Диссертация

Молекулярно-генетическая характеристика и таксономическое положение вирусов Бханджа и Кисмайо, представителей антигенного комплекса Бханджа - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы