Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выявление гаплотипов в кластере бета-глобиновых генов человека, сцепленных с аллелями бета-талассемии в Азербайджанской ССР

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выявление гаплотипов в кластере бета-глобиновых генов человека, сцепленных с аллелями бета-талассемии в Азербайджанской ССР"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВШЮШНЫа ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

На правах рукописи

ЛУКЬЯНЕНЮ Анатолий Владимирович

УДК 616.155.194.125-07:576.32/36(479.24)

ВЫЯВЛЕНИЕ ГАШЮТИПОВ В КЛАСТЕРЕ р-ГДОБШОШХ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА, СЦЕПЛЕННЫХ С АЛЛЕЛЯМИ ^-ТШССЕЬШ В АЗЕРЩДЙАНСШ ССР

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1990 г.

Работа выполнена во Всесоюзной ордена Ленина н ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре Министерства здравоохранения СССР

Научный руководитель: кандидат биологических наук Г.Я.Содовм

Официальные оппоненты: доктор биологических неук, профессор

С.А.Лямборская

кандидат' биологических наук Б.П.Соколов

Ведущее учреждение: Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР

Защита диссертации состоится " * 1990 г

в ___ часов на заседании специализированного совета 12)74.08. во Всесовзном гематологической научном центре Минздрава СССР (125167, Москва, Новозыковский проезд, д. 4а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесовзног гематологического научного центра МЗ СССР.

Автореферат разослан * " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

В.Д.Реук

lEÍItf Ш

Актуальность проблемы» Одной из наиболее распространенных

-- Г

«веявдственных гемоглобинопатий является f> -талассемия. Но пос-педнии оценкам частота носительства дефектных генов при этом заболевании, в среднем в мире составляет 3% ( Kaaaaiaa, Boehn , 1986).

К настоящему времени достигнуты значительные успехи в предупреждении р -талассемии с помощью пренатальной диагностики, притом последние достижения в области молекулярной генетики и биотехнологии на первый план выдвинули методы ДНК-диагностики, по-:кольку они позволяют провести анализ в первом триместре беременности.

Задача внедрения пренатальной ДНК-диагностики р-талассемий 5есьыа актуальна для нашей страны, тан как существую! географичос-сиа регионы с высокой частотой встречаемости этого заболевания, 'ах, в Азербайджанской ССР частота носительства ^ -талассемичес-toro гена достигает 10% (Ю.Н.Токарев, 1988).

• Применение ДН1 С-диагностики требовало предварительного иэучс— 1ия структуры ДНК, Как canoro дефектного гена, так и всего клас-epa р -глобиновых генов дефектной хромосомы. Такое нсследова-[ие позволило обнаружить в пределах £>-глобкнового кластера геям полиморфные сайги (места), узнаваемые рестриктаэами и тести-уемые блот-гибридизацией как полиморфизм длины рестриктных фраг-ентов (1ЦР5). Оказалось, что во-первых: распределение таких поли-орфных рестриктных сайтов (гаплотипов) тесно связано с опреде-енной мутацией, а во-вторых, спектр мутаций и сцепленных с ним аллотипов индивидуален для каждой популяции или этнической груп-Ь1 ( Orlela at »1. , 1982; rhein et «1. , 1988; Zheag ее al. , 988).

• Цель исследование состоит в получении ДНК-зондов для выявлена полиморфных сайтов рестрикции в пределах ¡J-глобинового клас-

тера генов, и о помощью этих зондов характерных гаплотипов, сцепленных с генами р -талассемии у больных из Азербайджанской ССР.

Задачи исследования.

• I. Определить с помощью клонированных ДНК-зондов частоты встречаемости полиморфных сайтов рестрикции в области р. -глобн-новых генов у больных р-талассемий и доноров из АзССР и выявит! информативные полиморфные сайты.

2. Получигь данные о галлогипах ¿цепленных с носитвльсгвом |5 -талассеыии в регионе АзССР.

3. Провести анализ ЦЦРФ в семьях с носительствоы р -г ал ас се-цкческого гена и выработать критерии пренатальной диагностики по информативным полиморфным сайтам рестрикции.

Научная новизна. С помощьв полученных ДНК-зондов впервые бшс определены частоты присутствия полиморфных сайтов рестрикции в пределах ^ -глобинового кластера генов у доноров и больных ромо-зиготной р -талассемией в Азербайджанской ССР. Охарактеризованы гаплотшш, сцепленные с аллелями -талассемии.

Практическая ценность. Полученные данные о частоте встречаемости полиморфных сайтов рестрикции в пределах -глобинового кластера генов, а также гаплотипах, сцепленных с р-тадассеми-ческим аллелем, позволяет вести пренатальную диагностику ^ -талассемии в семьях с пораженным ребенком в регионе АзССР.

Материалы диссертации были представлены на ВДНХ СССР в 1987 г.

Апробация диссертации. Основные положения диссертации были ' представлены на заседании проблемкой комиссии "Экспериментальная гематология и биотехнология" ЦНШГПК ИЗ СССР, на 57 и 59 научных конференциях ЦНИДГЛК Ю СССР, УШ Всесоюзном симпозиуме по целенаправленному изысканию лекарственных веществ в г.Риге, и на У1

гъаэде по генетике человека в г.Ростоке, ГДР.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано II научных работ.

Объем и структура работа. Диссертация изложена на 123 страницах машинописного текста, состоит из вледующих разделов: ваеде-ние, обзор литературы, материалы и метода исследования, результаты исследования и их обсуждение, заключение и выводы. Указатель литературы содержит 31 отечественных и 137 иностранных библиографических источников. Диссертация иллюстрирована 6 таблицами и 19 рисунками.

Работа выполнена в НИИ экспериментальной гематологии и биотехнологии Всесоюзного гематологического научного цен™ра МЗ СССР,-в лаборатории генной инженерии (зав. - доктор химических наук, профессор Н.И.Гринева).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ . Материалы и методы исследования. В работе представлены результаты галлотипировании 35 больных гомозиготной £-талассемией и 30 доноров азербайджанской национальности. Забор крови доноров проводился на республиканской СПК г.Баку. Забор крови у больных, биохимический и клинический анализ крови, на основании чего ставился диагноз - гомозиготная ^-талассемия, проводили в детской больнице £ I г.Баку и в Азербайджанском НШ гематологии и переливания крови. Эти данные любезно предоставлены проф. Т.С.Дадаше-вой и докт. Р.Ш.Рустамовым.

ДНК получали по методике, включающей в себя отделение ядерных клеток, их лизис и депротеинизацкю фенолом (Иал1аЪ1з <уб ий;,' 1982). Переваривание ДНК специфическими эндонуклеаз'ами (рестрик-тазами) проводили по прописям фирм изготовителей. Перенос ДНК на нктроцеллилозные фильтра посла электрофореза в агарозном геле,

предгибридизацию и гибридизацию с радиоактивными ДНК-зондами проводили по методу Саузерна ( Southern , 19*75) ; меченные ДН&-зоиды получали ник-грансляцией ( Uaniatio et ul. , I9à2).

■ Выделение плазмидных ДНК-зондов производили по стандартной методике, включающей рост E.coli с селективным маркером, лизис бактерий и центрифугирование в градиенте плотности CsCI ( Ташало-ь 1970).

Выделение фагового клона AH^G3, 'содержащего р-глобяновый ген и фланкирующие последовательности проводили по методике ( Woude et al. , 1979). Указанный фаговый клон был любезно предоставлен докт. T.üaniatia (США). Полиыеразную цепную реакцию (амплификацию in vitro ) с термофильной ДНК-полимеразой проводили по рекомендациям производителей фермента. Термостабильная ДНК-полимераэа любезно предоставлена д.м.н. Е.И.Шварцем, Ленинградский НИИ ядерной физики им. Б.П.Константинова. Праймеры любезно предоставлены д.х.н. Ю.А.Бердиньш, Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина, г.Москва.

Результаты исследования и их обсуждение. Для проведения работ по картированию полиморфных сайтов рестрикции из фагового клона AHàG3, содержащего вставку длиной 12,3 т.п.н., которая включает в себя ^-глобиновый ген и фланкирующие последовательности переклонировали Eco RI фрагмент длиной 5,5 т.п.н., содержа/

щий весь -глобиновый ген с 5 -областью в плазмидный вектор pUC 19 (рис. I). Этот ДНК-зонд, названный pUCI9-5,5RI, использовали в дальнейшем для выявления Hpal полиморфного сайта рестрик-

/

ций, который расположен в 3 -области -гена. Однако этот ДНК-зовд неудобен для определения полиморфных сайтов для других рестриктаз, например Hinf- I и Avail, т.к. он несет довольно длинную вставку и при блот-гибридизации с ним наблюдали большое холи-

[вciво дополнительных фрагментов, что мешало четкому тестировано) полиморфного сайта.

Для получения более коротких ДИ&-зондов, провели переклони-ювание фрагментов вставки ДНК-зонда p\JCI9-5,5RI, который рест-зицировали ферментш«! BamHI + EcoRI. Полученные ДНК-фрагменты утной: 1,9, 1,9, 0,9, 0,8 т.п.н., переклонировали в плазмид-шй вектор pUCI9 (рис. I Б). Полученный при переклонировании ЩК-зонд pUCI9-I,9BHI использовали в дальнейшей работе дня определения полиморфизма по рестриктазе Hi«f- I.

ДНК-эовд pUCI9-0,9BHIKI использовали для определения Avail юлиморфного сайта рестрикции, который расположен в пределах р-глобинового гена. Этот ДНК-зонд содержит преимущественно голько второй интрон р-глобинового гена, который практически чэ имеет гомологии с другими ДНК-последовательностями в р-гяо-Зиновоы кластере генов и при блот-гибридизации с этим ДНК-зондом не наблюдали неспецифической гибридизации с другими последовательностями кластера.

ДНК-зонды для тестирования .полиморфных сайтов рестрикции в других районах ^-глобинового кластера (район двух J генов и VPI псевдогена) были любезно представлены докт. D.LoulioriouloB (Греция). Один из таких ДНК-зоццов - рУ£ 1-3,9 содержит А1и-пов-тор внутри вставки и не может быть использован для выявления рестрикционного полиморфизма в однокопийном гене из-за моещой неспецифической гибридизации. Поэтому, часть вставки длиной 1,8 т.п.н., не содержащая А1и-повтора, была переклонирована в плазмидный вектор pUCI9. В дальнейшей работе такой ДНК-зснд, названный pUCI9-I,8yp , использовали для определения рестрикционного полиморфизма в районе псевдогена tyfi I. С его помощью тестировали два Hint II н Avail полиморфные сайты рестрикции (см. рис. I А).

- а -

АуаП

Н;** Ш Ни'. П Н;„? I А«а11 Нр&1

б е У ул ч>и $ Р 3 --□□-ЮНО-СИ-ПИ—1ГЪ—1—

Г-"' 7 4 /

/

Лнр

5,5 | 3,6 | 3,2 ! т.п.н. ЕсоИ ЕсоИ ЕсоР1

ЕсоИ Ва«Н1 Ва®Н1 Ва»Н1 ЕсоИ

_1д2__1.9

риС19-1,9ИВН1 0,8 риС 19-1.9ВН1 0,9

риС19-0,8ВН1 риС19-0,9ВН1И

Рис. I. Структура /) -глобинового кластера генов человека (А).

Стрелками обозначены тестированные полиморфные сайты рестрикции, темные линии ниже кластера -ДНК-зонды:

1. рН& 3,2 4. РиС19-0,9ВН1й1

2. риС19- 1,8 5. рУС19-5,5К1

3. риС19-1,9ВН!

Б - схема клонирования фрагментов ^-глобинового гена и его 5 -области для получения диагностических ДНК-зондов.

Определение ПДРФ с помощью ДНК-зондов. Определение ПДР'5 -остоверный, широко используемый методический подход молекулярно-иологичослих исследований. Характерные ГЩМ являются маркерами ромосом к передалтся по наследству как генетический признак. С х помощью можно определить наследование талассемического аллеля.

Однако для проведения в определенном географическом регионе одобной диагностики,необходима предварительная работа по опре-елению наиболее информативных для исследуемого региона поли-орфных сайтов рестрикции, т.е. сайтов,при помощи которых монно тлмчить талассемическую хромосому от нормальной.

В своей работе мы определили такие сайты, которые на наш зглдд должны отвечать следующим требованиям:

" I. Частота присутствия таких сайтов должна быть такой, при огорой будет наблюдаться значительное количество гетерозигот.

2. Распределение таких полиморфных сайтов в нормальных и та-ассеыических хромосомах должно быть различным, или другими сло-ами, в большинстве своем, такие хромосомы должны иметь различие гаплотшш.

3. ДНК-фрагменты, получаемые в результате присутствия, либо тори сайта,должны тестироваться блот-гибридизацией.

Мы проанализировали восемь полиморфных сайтов рестрикции реди больных гомозиготной р-талассемией и доноров азербайджанкой национальности (см.рис. I А), а именно: два H¡"«» 111 сайта, асположенные во-вторых интронах tf^ и X® генов, два Hinc П и valí сайта, расположенные в области псевдогена I, H¡<4 I и

valí сайта, расположенные в области (3 -глобинового гена и Hpal

/

айт, который расположен в 3 -области р, -глобинового гена.

.Определена частота встречаемости (табл. I) каждого из указан-ых выше полиморфных сайтов. Для сравнения приведены аналогичные

Таблица I

Частоты присутствия полиморфных сайтов рестрикции в АзССР и в других регионах мира ( АШгопагаМ.з , 1995), где ^ - доноры, ^ - больные

^ -талассемией

Полиморфный '. АзССР Греция : Италия : Индия

сайт ! pH T :' Г : ? : : BH i

HiM III 0,32 0,79 0,52 0,14 0,26 0,48 0,30 0,26

Sind III 0,20 0,08 0,30 0,07 0,06 0,37 . 0,06 0,09

Hinc II yß I 0,17 0,45 0,17 0,07 0,20 O.II 0,17 0,10

Eine II 2-yßI 0,30 0,53 0,48 0,12 0,28 0,31 0,27 0,17

Ava II I 1,00 ' 1,00 0,98 0,70 - - - -

Av» II p 0,68 0,50 0,80 0,90 0,86 0,73 0,78 0,38

H$>» I jlf 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00 1,00

и

о

(анные для других регионов мира.

Данные таблицы позволяют заключить, что Н^а Ш К сайт грисутствует более чем в два (2,5) раза чеще у больных f -тал&с-¡емией, чем у доноров (0,79 и 0,32 соответственно). Кроме того, ;рвди больных частота присутствия названного сайта выше, чем в цругих регионах мира.

Hm«i Ш JA полиморфный сайт рестрикции напротив встречает-!Я чаще у доноров, чем у больных (0,20 и 0,08 соответственно), мстота присутствия этого сайта в АзССР также отличается от дан-шх для других регионов мира.

I л

Описанные выше два Hi»<* Ш X и £ сайта из-за большой •омологии тестировались одним ДНК-зондом pHcL 3,2.

• Как видно из табл. I, Н;»с I полиморфный сайт присутст-1увт у больных р -талассеиией более чем в 2,6 раза чаще, чем у (оноров (0,45 и 0,17 соответственно), что существенно отличается

>т аналогичных показателей для других регионов мира, что также

* t

южно сказать и о Hi«» П 3 -VP I сайте, где, как у доноров, так

I у больных частота присутствия .этого полиморфного сайта ориги-■альна.

Исследование частоты присутствия АуаП полиморфного сайта рест-жкции, расположенного во втором интроне f> -глобинового гена см.рис. I), показало значительное количество гетерозиготных ал-[влей, о чем свидетельствуют данные, представленные в табл. I 0,50 для больных и 0,68 для доноров).

Тестирование Н;«}- I полиморфного сайта рестрикции (см.рис.1) юказало низкую частоту встречаемости этого сайта и отсутствие ¡цепленности его с талассемическим аллелем.

Как видно из табл. I, частоты присутствия Avail и Hpal з' -р сай-'ов-равнялись 1,0 или другими словами, в регионе АзССР они не галимор<5иы. По денкш ( K»n, Doay et il. , 197В) Hpal сайт инфор-

— ik. -

ыативен при тестировании серповидноклеточной анемии к f> -талас-семии только в популяциях темнокожих Америки и во многих регионах Африки. В других областях распространения (5 -талассемии, ча тота присутствия этого сайта рестрикции равна 1,0, что согласуется с нашими данными.

Avail YpI сайт информативен в регионах Греции и Италии ( We.i03oat , 1936), имеет там высокую сцепленность с некоторы ми р -талассемическими аллелями и используется в этих регионах для пренатальной диагностики.

Таким образом, для проведения анализа по выявлению талассе-мического аллеля в семьях из АзССР наиболее информативны H'ir«t IU Ш Jf А, Нте П I, Hino П з'-VP I и AvalIjs полиморфные сайты рестрикции.

Следует обратить внимание, что названные выше сайты имеет в большинстве своем частоты присутствия, отличные от таковых в дру гих регионах мира (см.рис. I). Эти данные свидетельствуют о воз-моялости существования в исследуемом регионе характерного набора галлотипов.

При блот-гибридизационном анализе полиморфных сайтов, расположенных в районе р-глобинового гена (H'.nf- I, Avail р и Hpal сайты), получали ДНК-фрагменты полностью совпадапцие с реет-риктной картой 1> -глобинового кластера. Это говорит о неделеци-онном типе носительства р-талассемических мутаций в АзССР.

Распределение галлотипов у больных ^-талассемией и доноров в АзССР. Для 17 из 35 больных и 14 из 30 доноров по информативным сайтам, определенным выше, удалось установить гаплотипы отдельных хромосом. Эти данные сведены .в табл. 2.

В связи с тем, что у гетерозигот по трем полиморфным сайтам невозможно определить индивидуальные гаплотипы, такие случаи не

Таблица 2

Гаплотипы больных ^-талассемией и доноров из АэССР

пп

Гаплотипы

: Больные р-талассемией

Н;«<» Ш :Н;г

гАуэП :Количество:гомози-:гетеро--:хромосом ;гота ;зигота

Ш : :

Доноры

:Кдассифик. ^:гаплотипов :( Огк!

Количество:гомо-: гетеро. ?гк:|8яЗ^ хромосом ¡зигота зигота:

I. - - - - + 6 (17,6) 2 .2 15 (53,6) 2 II I или

2. + - + + I С2,9) - I - - - - а

3. + - + + 3 (8,9) I ' I 3 (10,7) I I Ш или

4. - + - 12 (35,3) 5 2 - - - - 1У

5. ♦ + - - - - - - I (3,6) - I У1

0. - - - - - I (2,9) - I 7 (25,0) - 7 УП

7. + - - - - 2 (5,9) I. - - - - - X

8. + - - - + 4 (II.8) 2 - - - - - - -

9. - - + + - I (2,9) . - I - - - - -

10. + - - + 2 (5,9) I - - - - -

II. + - - I (2,9) - I I (3,6) - I -

12. - - + + + I (2,9) - I - - - - -

13. - - + - + - - - I (3,6) - I -

Всего:

34 (100)

12

10 28 (100) 3 22

учитывались при определении галлотидов. В случае, когда гетеро-

зиготы только два Hir><< Ш сайта, возможно определение гаплотила

£

каждой хромосомы. Это связано с тем, что субгаплотип H'mJ Ш $ и jj ^ (- +•) практически не встречается ( Aatoaaraiia et id.« . Так, например, если мы имеем распределение полиморфных сайтов в диплоидной ДНК (+/- Hind Ш 5G, +/- Hind Ш ЪА, - Hint П VP I. - Hi«« П 3-V^I, ♦ Availf ), то возможен только один вариант

распределения гаплотклов для каждой хромосомы, а именно (--- - +)

и (+ ♦ — ♦).

В нашей работе, в азербайджанском регионе выявлено 13 гапло-тилов (табл. 2), причем талассемияесхие и нормальные хромосомы сцеплены соответственно с II гаплотипами и 6 гаялотипами.

Среди выявленных гаплотклов у больных и доноров обнаружены такие, которые встречается только у больных (см.табл. 2, * 2, 4, 7, 8, 9, 10, 12) или только у доноров (» 5, 13), остальные обнаружены в обоих группах (# I, 3, б, II), причем I гапдоткп широко представлен как среди больных (17,7Х), так и сред* доноров (53,636).

Среди больных р-талассемией доминирует 4 гаплотип (35,33), причем, он ни разу не встретился у доноров. Это говорит о большой сцепленность втого гаплотила (+- + ♦-) с талассемичесюш аллвлем. Гаплотипы 2, 7, 8, 10 обнаружены также только у больных, но адесь нельзя говорить о тесной сцеплекности с дефектным аллвлем в хромосомах из-за их низкой встречаемости.

Некоторые гаплотипы: 8 (+ - - - +) к 9 (— + -) ранее не ассоциировались с носительством дефектного гена. Гапдоткп 10 (+ + --+) был обнаружен в Тунисе сцепленным с нонсенс мутацией в 39 кодоне ( 0МЬ«л1 et «I. , 1988), а гаплотип П (+ + - + -) выявлен в Индии в связи о мутацией пятого нуклеотида первого нитрона ( Treia et а. , 1986). Гапло*кп 12 (- - + + +) описан у наг-

ров ( Kan .t , 1980).

Среди 17 больных 12 были гомозиготны по гаплотипем, а 5 имели следующие комбинации гаплотипов: 3/4, А/9, 1/6, I/I2, 2/1I (см.табл. 2). Если считать, что каждый гаплотип сцеплен со своей характерной мутацией, то количество компаундов по талассемичес-кому аллелю может составлять около 30i. Количество хе гетероэигот у доноров значительно вьгае.

Таким образом, в азербайджанском регионе выявлены 12 больных р-талассемией, гомозиготных по б гаплотипаы. Это позволяет надеяться, что при последующих исследованиях ДНК этих больных удасться с помощьв секвенирования обнаружить гомозиготные мутации в р-глобиновом гене, приводящие к талассемин.

Анализ НОРД по информативным сайтам рестрикции в семьях с пораженным ребенком. Мы использовали изложенные выше способы выявления информативных полиморфных сайтов рестрикции и гаплотипи-рования больных р-талассемией для выяснения возможности проведения ДНК-диагностики и выработки ее критериев в семьях с пораженным ребенком.

Был проведен анализ ЦЦРФ в двух семьях, в которых по гематологическим данным родители гетерозиготны, а ребенок гомозиготен по р-талассемин; установлены гаплотипы каждого члена семьи. На рис. 2 и 3 показаны родословные каждой семьи, представлены информативные полиморфные сайты. В первой семье (рис. 2) для

тестирования талассемической хромосомы у каждого из родителей

с д

достаточно анализа Hind И g или g полиморфного сайта рестрикции, причем у гомозиготного по р-талассемии ребенка выявлен гаплотип (++•), который имеют оба его аллеля. Следовательно у родителей, которые имеют одинаковый субгаплотип, возможен только следующий вариант распределения двух полиморфных сайтов: (—)

для одной хроыооош, и (+ ♦ ) для другой. Причем, субгаплотип (+ +), походя из субгаплотта ребенха, оцеплен с талассемичео-ким аллелем.

После такого семейного анализа субгаплотипов можно однозначно определить, несет ли другой ребенок или плод ода/, либо две талассемичёских хромосомы. А именно, если ребенок будет иметь .субгаплотий (+ +/+ +), то он гомозиготен по талассемии, субгаплотип (+ +/—) говорит о том, что ребенок является гетерозиго-той, а оубгаллотип (- -/- -) свидетельствует о том, что ребенок, либо плод здоровы.

На рис. 3 представлен анализ частичных гаплотипов другой семьи. полиморфные сайты у родителей и ребенка позволяет

определить только одну ыутантну» хромосому, которую наследует ребенок от отца, т.о. этот сайт полуинформативен. Для тестирования талассемической хромосомы у каждого из родителей достаточно анализа АуаЛр полиморфного сайта рестрикции, у ребенка этот сайт отсутствует в обоих аллелях (на рис. 3 обведен кружком), а оба родителя гетерозиготны. Следовательно, в этой семье талассеми-чесхмй аллель у каждого из родителей сцеплен с отсутствием АаПр полиморфного сайта рестрикции.

Таким образом, можно однозначно определить, в том числе и пренатально, несет ли другой ребенок, либо плод одну или две та-лассемическяе хромосомы. Гак, если такой ребенок будет иметь суб-гаплотип (-/-), то он гомозиготен по талассемии, субгаплотип (-/■О говорит о том, что ребенок гетерозиготен, а субгаплотга (♦/+) однозначно свидетельствует о том, что ребенок, либо плод здоровы.

И;«» Ш __ 7.2 -Ъ 3.5,

:ю

ф

+ 7 g

< Avail W ИЗ 712

2.2

Я

Ш

7,2 3,5 i

Т.H.H.

3,5

А«аП

О-« 2,2

г4)

—г»

Ф

©

1

I I

о ©

Ряо. 3. Свмв8тй «нала Ш ж $А * Avallp ггсшыорфям сайтов. Пунхтяряая ягнкя - во« воюохЕы« гмиоткпи

п0сд»д7пстх лвтвз.

Лом»анн рв1х«татн й»от-п0рндявадю1,. гя» етрвл-KÄU* укмаян раихвры ДНК-фр&гивя*гст.

■i

йтак, изложенный выше анализ гапдотихшрования семей с пораженным ребенком показал, что выбранные нами полиморфные сайты рестрикции действительно информативны и могут быть использованы для пренатальной диагностики в таких семьях.

При проведении пренатальной диагностики важным фактором является скорость проведения анализа. Также необходимо иметь ввиду, что количество материала (ворсинки хориона), из которого выделяют геномнув ДНК плода, ограничено. При блот-гибридизационном анализе на определение гашгатипа плода в среднем уходит 7-10 дней и требуется около 20 мкг ДНК. Нередко такое количество материала взять за один раз не удается. В то жа время повторный забор ворсинок хориона увеличивает вероятность спонтанного аборта, либо других осложнений.

Эти недостатки устранимы при использовании метода полимераэ-ной цепной реакции (амплификации vi*ra ) с термофильной ДКК-полимеразой. 5 нашей работе этот метод был применен для определения Avail р полиморфного сайта рестрикции при проведении пренатальной диагностики в семье (рис. 4). Здесь все другие исследованные полиморфные сайты были не информативны. Из рис. 4 Б следует, что при обработке амплифицированного фрагмента (329 п.н.) рестрикта-зой Avail в случае отсутствия полиморфного сайта должно образоваться два фрагмента - 266 п.н. и 63 п.н., а в случае присутствия -три фрагмента 214, 63 и 52 п.н.

Праймеры были подобраны таким образом, чтобы амплификат со-, держал неподиморфный Avail сайт, поскольку с его помоцъю можно надежно тестировать полноту рестрикции, так как при неполной рестрикции будет виден исходный фрагмент ДНК - 329 п.н.

При проведении семейного анализа А*аПр полиморфного сайта методом амплификации Л. v/t<-« с последующей рестрикцией уста-

:(р

ш,

! -о

ш

ш

|v

щ

<- 266 214

п.а.

,2Е1

25^

Avail

4-

экзон 2

Avail*

¿¡¡at '■ т^Мп^гаааим^^тШ^

S3

214

2Е2

52

266

329

Рно. 4. Пренатальная диагностика в семье с пораженным ребенком, с применением реакции амплификации т vitro •

А. Родословная и анализ Availр полиморфного сайта рестрикции у членов семьи и плода.

Б. Схема амплификации ДЖ-фрагыента, содержащего Avail ß полиморфный сайт (обозначен - V» 2EI, 2Е2 - олигонуклеотидкые праймеры.

новлено, что мать гомозиготна (+/+-), а отец и ребенок гатероан-готен (+А) (рио. 4). Из рисунка видно, что у плода можно огтради лить только одну талассемичесху» хромосому, сцепленную о отсутствием сайта или другими словами, если плод гомозиготен (+/+), tfi он либо здоров, либо гетерозиготный носитель, а при гетерозиготном сайте' С+У-) плод либо носитель, либо больной.

У матери на 9 неделе беременности в Институте акушерства is гинекологии (Ленинград) был произведен забор материала от плода. Из биоптата хориона выделена ДНК и в амплификате определен Avail субгаплотип (+/-), на основании чего поставлен диагноз - гетерозиготная или гомозиготная р-талассемия.

Таким образом, показана применимость и эффективность метода полимеразаои цепной реакции и правильность шбора праймеров при тестировании Avail полиморфного сайта рестрикции для пренатальной диагностики ^-талассемии в семьях с пораженным ребенком.

В И В О Д Н

1. С помощь» клонированных ДНК-зондов определены частоты встречаемостн следующих полиморфных сайтов рестрикции: H'md Ш н;»<<ийа, н;«с н;«с пз'-vin, Avaiiv/Я, Avail р и

Нра 1 3 -р у больных гомозиготной р -талассемией а доноров азер< байдаанской национальности а отобраны информативные полиморфные сайты.

2. Анализ длины рестриктных фрагментов в области р -гдоби-нового гена у исследованных больных показал неделеционную природу молекулярных дефектов, приводящих к р-талассемии в регионе АэССР,

3. В исследуемом регионе выявлено 13 гаплотипов, иэ готорых 6 оказались сцеплены только с аллелями р-талассемии, а 2 с нор

ыальнымн аллелями. Пять гаплотипов обнаружены как у доноров, так и у талассемических больных.

4. Определены частоты встречаемости р -талаесемических гаплотипов, при этом доминирующий гаплотип (+ - + + -), встречающийся с частотой 35,3£, обнаружен только у больных.

5. С помощью метода амплификации »•» *.'tr0 п0 информативным полиморфным сайтам рестрикции проведен семейный анализ гаплотипов и пренатальнад диагностика, показана пригодность таких сайтов для диагностики fi-талассемии в семьях о больным ребенком.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Выявление гаплотипов анализом р-глобинового кластера специфическими ДНК-зондами (А.В.Лукьяненко, Г.Я.Соловьев, Ю.Н.То-карзв)// 1У съезд гематологов и трансфузиологов Белоруссии: Тез. докл. Минск, 1988, с. 71-72.

2. Выбор ДНК-зондов для анализа полиморфизма р-глобинового кластера у больных талассемией (А.В.Лукьяненко, Г.Я.Соловьев, Р.Ш.Рустамов н др.)// Гематология и трансфузиология. М., 1987,

» 12, с. 22-25. • •

3. Выбор ДНК-зондов для анализа полиморфизма ^ -глобинового кластера у талассемиков Азербайджанской ССР ( Г.Я.Соловьев, А.В.Лукьяненко, D.H.Токарев)// Всесоюзная конференция. Ноше направления в биотехнологии. Пущино, 1986, с. 53.

4. ДНК-диагностика тадассемии (Г.Я.Соловьев, А.В.Лукьяненко)// У съезд по генетике человека: Тез.докл. Росток, ГДР, 1988, с. 34.

5. ДНК-диагностика jl-галассемии в Азербайджанской ССР (Г.Я.Соловьев, А.В.Лукьяненко, В.Л.Сурин)// УШ Всесоюзный симпозиум по целенаправленному изысканию лекарственных веществ: Гез.

■ окл. Рига, 1989, с. 100.

6. Клонирование однотякввых ДНК-зондов и адресов для анализа провирусных и глобиновнх генов (В.Л.Сурин, Е.Л.Жукова, А.В.Ду-кышенко и др.) П П съезд гематологов и трансфузиодсгов. Тез.доил Львов, 1985, с. 173.

7. Молекулярно-биологическое изучение аномалий структуры « экспрессии ("енов глобина ори гемолитических анемиях. Зонды и

ды (А.К.Попов, Б.В.Постников, А.В.Лукьяненко и др.) // Цатериалц 57 научной сессии ЦНШГЛК. Ы., 1985, с. 125-126.

Q. Молекулярная природа делеции при ^-талассемии, установленная с помочь® метода амплификации геномной ДНК '•> (Е.И.Шварц, А.А.Гольцов, О.К.Кабоев и др.)//Биоорганичвская xKujn?, 1989, т. 5, * 4, с. 556-560.

9. Получение генно-инженерными методами индивидуальных фрагментов ДНК (ДНК-зондов), пригодных для анализа полиморфизма ^-глобинового кластера человека при талассеыиях (Г.Я.Соловьев, А.В.Лукьяненко, Д.А.Доыкинский и др.)// Материалы 58 научной сессии ЦНИИГПК, И., 1986, с. 134.

10. Характеристика двух мутационных повреждений р-глобкноро-го гена при р-талассемик в Азербайджане (А.А,Гольцов, В.Л.Су-рин, А.В.Лукьяненко и др.)// Биоорганическая химия. 1989, т. 15,

» 7, с. 1001-1002.

11. A novel ír«aonahiXt matmtlon cmalng f°-th*l«jes».«tti». la Aawbtíjm (E.I.3cliw«rta, A.á.Ool»taoy, О.К.Г»Ьо»т «t al.)// Huolele Aelde Rea»»xcii, 1989, y. I?, 10, 3997.

Л - 46048 Подписано в печать 13.02.Э0г.

Формат 60x84/16 Заказ 525 Тира* 100

Москва. Гипографи ВАСХНИЛ