Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мутационные повреждения бета-глобинового гена человека, определяющие развитие некоторых форм бета-талассемии в Азербайджане

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мутационные повреждения бета-глобинового гена человека, определяющие развитие некоторых форм бета-талассемии в Азербайджане"

ЛЕНИНГРАДСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

На правах рукописи

ГОЛЬЦОВ Алексей Анатольевич

УДК 576:691

МУТАЦИОННЫЕ ПОВРЕЖДЕНИЯ |Ь-ГЖ)БИНОЮГО ГЕНА ЧЕЛОВЕКА, ОПРЕДЕЛЯЩИЕ ТАОВИТИЕ НЕКОТОРЫХ СОРИ £-ТАЛАССЕМИИ В АЗЕРБАЙДЖАНЕ

03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ленинград 19у0

Работа выполнена в Ленинградском институте ядерной физики им.Б.П.Константинова АН СССР (г. Гатчина) и во Всесоюзном гематологическом паучком центре МЗ ССОР (г. Москва)

Научный руководители: доктор медицинских наук Е. И. Шварц, кандидат биологических наук Г. Я Соловьев.

ОДиииадышо оппоненты: доктор медицинских наук В. С. Гайцхоки; доктор биологических наук И. Е. Воробцова.

Ведущие учреждение - Всесоюзный научный медико-генетический центр АМН СССР (г. Москва).

Защита состоится "¿^ ¿¡Л 1Э90Г. в часов на засе-

дании специалип^юванного'совета Л 063. 57. 21 по ващите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук по специачьностн 03. 00.1С: "Генетика" при Ленинградском государственном университете но адресу: 199164, Ленинград, Б-164, Университетская набережная, 7/9.

С диссертацией мокио ознакомиться в библиотеке им. а. к Горького Ленинградского государственного университета.

Автореферат разослан

Учений секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Н.М. Иркаева

Актуальность теки. Одной из актуальных проблем генетики человека является изучение молекулярных основ наследственных заболеваний и их распространения в различных регионах. Предметом исследования в данной работе является р>-талассемия - аутоеомноре-цессивное наследственное заболевение, относящееся к классу гемоглобинопатии, связанное с нарушением биосинтеза (1-глобиновой полипептидной цепи гемоглобина.

По последним оценкам, частота гетерозиготных носителей му-тантных аллелей р-глобинового гена составляет в среднем в мире около ЗХ или примерно 150 млн человек (Нагадал, ВоЬот, 1988). Продолжительность лизни гомозигот, дат при осуществлении специальной хелатирующей терапии и частых переливаний крови, не превышает 25-30 лет.

Согласно современным представлениям, различные аллели р,-та-лаесемических генов, возникшие в регионах с высокой частотой малярийной инфекции, с течением времени получили широкое распространение под воздействием положительного селекционного давления. Однако количество часто встречающихся аллелей относительно невелико. Кроме, того, юавдая этническая популяция имеет свои специфические типы аллелей. По данным мировой статистики, до <507. всех ¡ъ-талассемий могут быть описаны 20 аллелями.

Благодаря широкому развитию молекулярно-генетических методов, к настоящему времени охарактеризованы Солее 70 точечных мутаций ртглосинового гена, приводят« к • [¡гталассемии (КиМлг, 1989), я определены частоты их встречаемости для большинства популяций Средиземноморского и Азиатского регионов. Е< ряде строи успешно действу»? программы, направленные на определение групп риска, проведение пренатальной диагностики [>-талассемии. Но недавним сообщениям, детская смертность, связанная с (у талассемией в этих регионах, понизилась в 5-10 раз по отношению к тому уровню, который мог бы быть при отсутствии этих нродущм'дительных мер.

Определение спектра р. талассеничепких »утнклй весьма актуально ДЛЯ НЗЮ.-П СТрШШ, тал К--1К оу^-егьукт ГГ-01 ¡|,Ч'1||1ч!-1М-'1!е регио-ни с ш.'окоД частотой г.сг^чг»ем.>сги чгоги зоОолытки. Н.шрим;-р, частота носители« тил:\сс.-с-":1чсччпгх п.-ил-. в Л;'с{,0-лйддгш<' д;х-1и-

грет !\1- («I. п. Токарев, Г ('лила:., до н.к. ьщ-го ь;I < ни

- А -

первичный молекулярный дефект был определен лишь у одного' больного, проживающего в этом регионе (С. А. Лимборская, 1967).

До последнего времени анализ мутационных событий в геноме человека требовал конструирования геномных или кДНК-клонотек, выделения искомых генетических, детерминант и их последующего генетического анализа. Методические трудности, возникающие при проведении такого рода исследований, накладывали определенные ограничения на возможности широкого анализа природы генетических дефектов человека. Ситуация принципиально изменилась с созданием метода специфической амплификации ДНК m vitro (полимеразная Цепная реакция - ПЦР), который сделал возможным прямое выделение фрагментов геномной ДНК.

Цель исследования состояла в определении природы мутационных повревдений JJ-глобинового гена у больных ¿-талассемией в Азербайджане.

Задачи исследования.

1. Выбрать оптимальную структуру олигонуклеотиДных прайме-ров, позволяющих амплифицировать те области 0-глобинового гена, которые характеризуются наибольшей частотой мутационных нарушений.

2. Подобрать условия для ПЦР - амплификации ДНК с использованием термоетабильной ДНК-полимеразь из Thermus thermophilic.

3. Определить мутационные повреждения b-глобинового гена прямым секвенированием соответствующих амплифицированних фрагментов ДНК больных £-талассемией.

4. Проанализировать встречаемость наиболее распространенных &--т.члассемических мутаций в Азербайджане с помощью метода ал-лельспецифической гибридизации.

Научная новизна. С помощью аллель-специфической гибридизации и секвеиирования амплифицированних ДНК-фрагментов £ глобияо-вых генов больных Д-талассемией, проживающих в Азербайджане, выявлены мутации в й и 33 кодонах; на границе 82-83 кодонов; в 1-ом, 6-ом и 1'10-ом нуклеотидах первого интрона; в. 1-ом нуклео-тиде второго интрона, Делеция гуанозина на стыке »2-83 кодонов является новой, ранее не описанной, Эталас-сомичеокой мутацией.

Практическая значимость. Осуществленная в данной работе первичная характеристика р-талассемических мутаций позволяет оп- ' ределить группу олигонуклеотидных зондов, необходимых для тестирования гетерозиготного носительства и проведения пренатальной диагностики этого заболевания в Азербайджане.

Апробация работы. Материалы диссертации опубликованы в пяти печатных работах и докладывались на VIII симпозиуме СССР-ФРГ ''Genom organization end regulation of gene activity", проходившем в июне, 1989г в Иркутске te.82); на Симпозиуме европейского биохимического общества (FEBS) "Trends on comparative rrolecular genetics", проходившем в июле 1989г в Праге (с. 51): а также на первой Всесоюзной конференции "Геном человека", проходившей в октябре 1990г в Москве (с. 182). Материаш работы отмечены первой премией на конкурсе лучших работ ЛИКФ АН СССР за 1989г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано S научных работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение и выводы. Указатель литературы содержит 13 отечественных и 103 иностранных библиографических источников. Диссертация иллюстрирована 11 таблицами и 12 рисунками.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы исследования. В работе представлены результаты анализа мутаций /1-глобинового гена у 24-х больных р-та-лассемией из Азербайджана. Взятие крови у больных, биохимический и клинический анализы, на основании которых ставился диагноз -¡ь -талассемия, были проведены в детской больнице Ко 1 г...Баку и в Азербайджанском НИИ гематологии и переливания крови. Эти данные любезно предоставлены проф. Т. С. Дадашевой и P. UL Рустамовым.

Термостабильная ДНК-полимераза из Thernus therirophilus выделена, охарактеризована и любезно предоставлена 0. К Кабоевым (ЛИЯФ им. Б. П. Константинова АН СССР). Олигонуклеотидные праймеры синтезированы в Институте биоорганнческой химии им. ti М. Шемякина АН СССР и любезно предоставлены д. х. н. Kl А. Еерлнным.

ДНК из клеток крови получаля по методике, включавшей отде-

ление ядерных меток, их лизис и депротеинизацию смесью фенол-хлороформ (Manlatis eL al, 1088).

Амплификацию ДНК проводили согласно рекомендациям фирмы Cetus в 100 мил смеси, содержащей 67 мМ ТРИС HCl pH 8,8 ; 16,6 мМ (NH4)2S0a; 6,7 мМ MgCI2; 10 мМ 2-меркаптозтапола; 6,7 мкМ ЭД-ТА; 170 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина; четыре dNTP (по

1 мМ каждого); пору праймс-ров (каждый в количестве 0,1-0,3 мкг) и 0,1-1 мкг ДНК из крови человека. Денатурацию ДНК проводили 7 мин при 97°С, отжиг праймеров Z мин при Б5°С. затем добавляли 3 единицы активности ДНК полимеразы из Thermus therirophilus и проводили синтез при 72° С в течение 4 минут. Последующие циклы включали 1 мин при 92°С (денатурация), 1 мин при 5Ь°С (отжиг) и

2 мин при 72°С (синтез). После 30 циклов амплифицированную ДНК анализировали электрофорезом в б7. полиакриламидном геле (ПАЛГ; соотношение акриламид / бис-акриламид - 29/1). Амплифицированную ДНК, при необходимости, предварительно гидролизовали рестр.лта-вами непосредственно в амплификационном буфере.

Для получения меченного амплифицированного фрагмента, 1ЩР проводили в стандартных условиях, но один из праймеров предварительно оадиоактивно метили по 5'-концу с помощью полинуклеотид-киназы фага Т4, используя реакцию переноса ¡f-фосфата с (j'-згР)АТФ на свободный 5'-ОН конец олигонуклеотида.

Секвенирование радиоактивномеченних амплифицированных фрагментов ДНК по методу Максама-Гилберта осуществляли, используя стандартную схему жидкофазной химической модификации ДНК (Maxsan, Gilbert, 1980).

Гибридизацию амплифицироватюй . ДНК с аллель-специфическими олигонуклеотидннми зондами (АСО-зонды)' проводили на капроновых фильтрах в дот-варианте по стандартной методике (В. В. Скрябин и др., 1989). Средняя удельная радиоактивность зонда составляла около 3*10враспадов/мин на мкг. Температуры плавления, гибридизации отмывки для каждого зонда индивидуальны, зависит от его структуры и приведены в таблице 1.

Гаплотнпирование ДНК Идентифицированные мутантные генотипы пациентов сопоставлялись с гаплотипами ДНК. Гаплотнпирование просолилось по пяти полиморфным сайтам: Hirvilll G* к А* , HincII уМ и З'-ff-l, и Avail ji. Данные о гаплотипах были подучены во

Всесоюзном гематологическом научном центре МЗ ССОР и любезно предоставлены к. б. н. Г. Я. Соловьевым.

Таблица 1. Температурные параметры гибридизации с АСО-бондами.

Тип Последовательность Тип т(°0) тс°с) т(°с)

мутации асо-зонда * асо плав. гибр. отмыв.

- 87 Н обаоссасассстасгягт Н 62 62 63

баоссаслсйстазбатте и 62 62 63

гес 6 тбастсстбаопазластс н 58 56 53

тбастсс'го- шаоаавтст ы 58 50 58

газ 8 тааба'^ваабтсгбссетт н 58 57 59

та лазАй- - етстбссаттАС м 58 57 59

IУБ1-1 сст6с6саштт(шатса н 60 62 62

сстазосаваттизтатса м 58 58 59

1У£11-6 (зсавбттсктатсаасш'т н 56 59 59

жасштшзатсааозтт м 58 59 59

1731-110 ст(зсстаттешстатттт н 52 51 52

ст<30стлттабтстатттт м 50 47 49

схю 39 ссттэзасс(сав)а6сттст н 60 60 60

попБепге сстт63асс(тай)аэзттст м 58 67 67

1У52-1 6аасттсаб0вт6а0тста н 56 57 58

аллсттсАасАТСАетстА ы 54 62 Б4

р5с 82/83 5'сасаасстсаа-еослсстттз' и 60 59 60

** 3' т6ттюа8ттссс0т30ааа5' 11 60 59 60

Тплав. - С40С(61С)>2°С( А+Т)]. * Последовательности написаны слева направо от 5*- к 3'-концу по 1содируюшей нити. ** Нормальный АСО-зонд комплементарен кодирующей нити ДНК, а Ыутантный соответствует кодирующей нити ДНК при [ь-талассемии.

- 8 -

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Большинство известных мутаций /i-глобинового гена человека локализовано п области от ТАТА-бокса до начала второго интрона. Поэтому, для амплификации и дальнейшего анализа нами были выбраны два участка /i-глобинового гена, захватывающие эти области (рис. 1). Первый фрагмент включает область ТАТА-бокса и первый экзон вместе с началом первого нитрона (прайморы 1Е1: 5'ССААТС'ГАСТССС-AGGAGCA-3' и 1Е2: Б' CTATTGGTCTCCTTAAACCT-3'). Второй фрагмент, выбранный для амплификации, частично перекрывает первый интрон, включает второй экзон и начало второго интрона (праймери 2Е1: 5' CACT6ACTCTCTCTQCCTAT-3' и 2Е2: 5' TATGACATGAACTTAACCAT-3').

Avail*

Miiiiii1

jjo фрагмент л зге пи

а.

экзон i I цитрон j I экзон г

1Гг

UHTPOH 2

Рис. 1. Фрагменты д-глобинового гена, выбранные для ПЦР-амплификации (черные прямоугольники I, II, III). Указаны длины Фрагментов, образующихся после рестрикции по сайтам Мае III и Avail. Avail* - сайт является полиморфным.

Определение /j-тапассемическнх мутаций прямым секвенировани-ем. Для анализа первичной нуклеотидной последовательности му-тантного /5-глобинового гена и возможного обнаружения мутаций, определяющих развитие /1-талассемии, нами были амплифицированы соответствующие фрагменты ДНК больного ¡Ь -талассемией и трех его ближайших родственников. Первоначально был проведен анализ фрагмента 11 д-глобинового гена, охватывающего второй экзон и фланкирующие участки первого и второго интронов, с помощью рестрик-тачы Avail (рис. 2). Известно, что в этом участке гена имеются

два Aval I-саАта, из которых один (нуклеотиды 21-25 экаона 2) неизменен, тогда как второй (нуклеотиды 12-16 нитрона 2) полиморфен (Antonarakis et al, 1985). Позтому, при отсутствии Avail полиморфного сайта в обоих аллелях, в результате рестрикции амплифицированного фрагмента длиной 329 пи образуются ДНК-фрагменты 266ш1 и 63 ин. Если полиморфный Avail сайт присутствует в обоих аллелях, то следует ожидать появления трех фрагментов ДНК длиной 214; 63 и 52 ин. При наличии полиморфного Avail сайта лишь в одном аллеле образуются четыре фрагмента: 26G; 214; G3 и 62 пн (рис. 1).

Проведенный рестрикционный анализ показал, что отец, мать и здоровый ребенок являются гетерозиготными носителями полиморфного Avail сайта ( рис. 2, дорожки 4, 6, В; видны фрагменты 2(10 и 214 пн), тогда как у пробанда этот сайт отсутствует ( рис 2, дорожка 2 , только фрагмент 266 пн). Следовательно, поеительетно [S -талассемического аллеля в данной семье коррелирует с отсутствием полиморфного Avail сайта, а наличие двух, скорее исего, идентичных, /Ь-талассемических аллелей у пробанда определяет развитие заболевания. Следовательно, этот генетический маркер - отсутствие полиморфного Aval I сайта - может быть использован для проведения пренатальной диагностики в этой семье.

Для анализа нуклеотидной последовательности проводили амплификацию I и 11-го фрагментов /1 -глобиносого гена пробанда с обеими комбинациями немеченого и 5'-меченого праймеров. (ааделенные фрагменты подвергали секвенированию по обеим ценим по методу Максама-Гилберта. В качестве контроля проводили секвенирование амплифицированной ДНК независимого донора.

В структуре ДНК пробанда были обнаружены две особенности. Во-первых, был подтвержден результат рестрикционного анализа: полиморфный Aval 1 сайт оказался модифицированным в результате трансверзии C-G в 1б-ом полонянин ¿-го интрона . Во-вторых, в составе восьмого кодона /Ь-глобинового гена была обнарукина дел..' ция двух аденинов (рис. 3). Именно ота делеция обуславливает развитие /Ь°-Талассе мии: сдвиг рамки считывания вызывает ион пленив Терминирующего сигнала в 21 кодоне й, таким образом, делает невоамом1ым синтез зрелого А-глобина.

Делеция двух нулпоотиглв t восьмом ко до не ¡ь -глопиновогс- re-

Рис. 2. Aval I-рестрикционный анализ фрагмента II/3-глобигового гена в семье больного/Ь-талассемией (в верхней части рисунка да-йа родословная семьи). Приведены результаты электрофореза в ЬХ ПААГ продуктов амплификации ДНК отца, матери, здорового и больного ребенка (дорожки 2, 4, 6, 8) и AvalI-рестрикты этих ДНК (1, 3, 5, 7 соответственно).*У больного наблюдается отсутствие полиморфного сайта в обоих аллелях (только фрагмент 265 пн), а его родственники являются гетеровиготами по этому маркеру (оба фрагмента 265 пн и 214 пн).

5' С Т G А G G А

1Ш

G Т С

т

G С С

3' ^

т с с т с с

А

G г-

«Г

GI

G A4G А>С Т+С С G A+G А>С

«в» fib Vt> »0. «1» ' «И»' «Ж» «и» S3 —

«»*

V.

«ч»

«а -«.

О

Oi.

— S2

«О

£3

®® G3 в» в»

/3 0 -талассемия

норма

№. 3. Делеция двух А в 8-ом кодоне /5-глобинойого гена (Г5С 8) Секвенирование фрагмента I в геноме больного /3 -талаосемией и контрольной ДНК. Приведены фрагменты секвенирующих гелей для ан-тисмысдовых цепей и даны соответствующие последовательности смысловых цепей. В рамку заключены последовательности 8-го кодо-на в норме и оставшееся после делеции динуклеотида АА звено в этого кодона при патологии.

л*

на была впервые обнаружена в 1981г в турецкой семье, а затем - у больного yj-талассемией в Ливане. Мы же впервые доказали существование тагаЯ же мутации в Азербайджанской популяции.

Эта же мутация в гомозиготном состоянии была найдена нами при секвенировании амплифицированных фрагментов /é-глобинового гена ешэ у двух больных. Во всех трех случаях делеция динуклео-тида ДА в восьмом кодоне коррелировала с отсутствием полиморфного Avail сайта за счет C-G транс-версии в 16-ом положении второго интрона. Более того, при гаплотипировании ДНК.этих больных по пяти полиморфным сайтам оказалось, что все они имеют одинаковое сочетание полиморфных маркеров и, следовательно, относятся к одному гаплотипу (IV гаплотип по Orktn et al, 1984).

Таким образом, идентифицированный нами мутантнкй амель /î-глобинозого гена характеризуется делецией со сдвигом рамки в 8 -ом кодоне в сочетании с четвертым гаплотипсм и определяет в гомозиготе развитие р-талассении у больных, проживающих в Азербайджане.

Используя метод амплификации ДНК в системе: немеченый и 5'-моченый праймер, с последующим секвенированием по Максаму -Гилберту, нам удалось определить первичные молекулярные дефекты /5-глобинового гена еше у нескольких больных из Азербайджана. При этом выбирали ДНК больных с разными гаплотипами.

Одна из обнаруженных нами мутаций представляет собой тран-зицию С-Т в 39-ом кодоне CAG (Glu) уЗ-глобинового гена, в результате которой он превращается в бессмысленный кодон TAG (рис. 4(a). Другая мутация является делецией одного нукдеотида (G) на "стыке кодонов 82 и 83 (рис. 46), так что в ноеой раже считывания уже через 13 нуклеотидных звеньев возникает бессмысленный кодон TGA. В обоих случаях /î-талассемия является прямым следствием обрыва синтезируемой полипептидной цепи, препятствующего образованию нормального fi,-глобина Мутация с образованием стоп-кодона в 39 положении широко представлена в Средиземноморской популяции. Делеция одного нуклеотида на границе 82/33 кодонов не была ранее описана ни для одного из /ъ-талассемическнх аллелей.

Таким образом, НИР-амплификация фрагментов ДНК с послэдуи>-шдм их секвенированием по методу Максама - Гилберта позволяет

однозначно идентифицировать как нуклеотидные замени, так и дело-ции в структуре [Ъ-глобинового гена в том случае, когда.оба алле-ля идентичны.

bi | о н :1 и г I !• * i; ) 1т.1

я'

.: U

Г

ге

rs sa

Г

4 с

С cj

ев г"

—* и»

РЗ G°

Us 1.т

га 8*8 0°

«т А А

S & А п.?

*** к

¿2, ~

К о д и u H 3 ( g g с )

а о

Рис 4. Оиквенироьание амнлифицироаанних фрагментов/Ь-глобиновой ДНК больных/й-талассемией: а - нонсенс мутации при транзиции С-Т н Зи кодоне (cod 39) ; б - сдвиг рамки считывания в результате долецип G в 82/83-м кодонах (FSC 82/83). Рядом с мутацией приведена соответствующая последовательность в нормв; электрофорез в Ь7. ПАЛ Г, покачаны участки секьенирующих гелей, непосредственно пклшчашщие мутации.

ХМ^СЛеДЦШ^гт'^^-'^'МИЧоск^х мутаций м1-годом гибридизации ^Ш^ШШЧ'МШН!^.Л1!!1А\У!с аллель-специфическими олигонук-jk.pt ид ними (АОО) зондами. В силу своей трудоемкости метод секве-пирошшии но может бить использован для анализа большого числа образцов. В зтой пьяни особую актуальность имеет метод аллель-опецифичискпй гибридизации, позволяющей тестировать точечные мутации и .чмнлифицирпгмшых фрагментах ДНИ. Суть метода состоит н испо.и-.к/нанип 2-х олигонукж-отидиых зондов, один из Которых К01/ш;емимта[иЛ1 мутапгному, а другой - нормальному аалелю. Различия в тсмн^ратурник параметрах гибридизации аиидоь дсшг ионмож-ность И1||'нтиф111шгчиат1. мутации в гомозиготном и гетерозиготном

«о»

:

состоянии. Поэтому в дальнейшем для тестирования различных/5-та-лассемических мутаций мы использовали метод гибридизации ампли-фицированной ДНК с ЛСО-зондами.

Такой анализ был проведен на выборке больных с использованием девяти пар ЛСО-зондов (табл. 1). Три пары зондов были выбраны на участки, мутации в которых были определены прямим секве-нированием: долеция двух А в 8-ом кодоне (FSC 8), транзиция С-Т в 39-ом кодоне (cod 39) и деления G кодон 82/83 (FSC 82/83). Остальные иесть пар ACO были выбраны исходя из спектра наиболее распостраненных в мировой популяции мутаций: C-G трансверсия в точке -87 пн, делеция одного иуклеотида (А) в e-ом кодоне, G-A транзиция в 1-ом, 110-ом нуклеотидах первого иитрона и в 1-ом нуклеотиде второго интрона (IVS1-1, IVS1-1J0, IVS2-1, соответственно) , а такде С-Т транзиция в 6-ом нуклеотиде первого интрона (IVS1-6).

При этом проводили амплификацию фрагмента Ш|5-глобинового гена длиной в 680 пн (праймерн 1350: О'- CTGTCATCCCfTAGACCTCA -3' и 2Е2), захватывающего регуляторную 5'-область в точке -110 пн, первый Э1С30Н, первый интрон и второй экзон с прилегающей к нему частью второго интрона (рис. 1). Образцы амплифицированных ДНК фиксировали в виде пятен на двух капроновых фильтрах, калдай из которых гибридизовали с Р3- меченым олигонуклеотидом, комплементарным либо нормальному, либо мутачтному аллелю /5-глобинового гена. В качестве контроля гибридизации на фильтры наносили образцы ДНК, в которых мутации были идентифицированы секвенирова-нием, a Tarase образцы ДНК, выделенные из донорской крови.

Сопоставление результатов гибридизаций с АСО-зондами, а танже данных по секвенированию, позволило полностью установить мутантный генотип обоих аллелей для 18-ти больных. У 2-х больных идентифицировано лишь по одному мутантному алле.лю. У 4-х больных ни одна из вышеперечисленных мутаций не встречается ни в одном из аллелей (см табл. 2). Ни один из тестированных образцов ДНК не дач положительных ответов при гибридизации с мутантиымн зондами на область -87ц и делению А в 6-ом кодоне (FSC 6). Полученные данные позволяют отнести к числу широко распространенных шесть мутаций (табл. 3): FSC 8, IVS1-1, iVSl-110, COD 33, FSC 82 /83 IVS2-1. Эти п.'ееть мутаций характеризует 35 ил 48- ми прознэ-

Таблица 2 . Результаты гибридизации амшшфицированных ДНК больных /ь-талаесемией с ЛСО-зондами.

Марки- Ге мат ологичес кие Гапло- Идентифицированные

ровка. показатели, X тип мутации

ДНК НЬ Аг НЬ Г «

1. 2 3,5 50,0 4 РБС в/РБС е

2. И 5 2,4 27,2 4 гее 8/РЗС 8

3. И 7 2,2 16,6 4 РЗС 8/РЗС 8

4. Б12 2,9 33,0 4/7 РБС 8/Р2С 8

а. Б27 3,2 50,0. 4/2 РБС 8/РБС 8

6. 68 3,0 22,6 - РБС 8/1751-1

7. 1 3,6 40,0 4 РБС 8/1У31-6.

в: Б19 3,2 51,0 4/3 РБО 8/РЗС 82-83

9. 10 2,0 39,3 4/10 РБС 8/1УБ2-1

10. Ь7 2,7 43,6 4/6;3/5 РБС 8/ — ■

11. 15 - - 1/6 РБС 8/ —

12. 8 - - 1/11 1У31-1/1У31-1

13. га 2,9 52,0 6 1У31-1/1У31-1

14. В28 2,2 30,0 3 РБС 82-83/ГСЗ'82-83

15. 48 - - - ГБС 62-83/1У32-1

16. Б25 1,9 41,7 8 сос! 39/соа 39

17. 19 3,1 20,0 - сой 39/1У51-110

13. 21 1,9 43,5 11/12 1УБЗ-1/1У32-1

19. 11 1.,9 25,0 1 1У31-110/Т5С44

£0. Б11 3,1 16,6 5 1У31-110/Р5С36-37

21. 5 4,1 46,0 2/9 — /

22. 13 3,0 44,0 1 -- /

23. Ы6 - - 6 — / —

21. П24 2,4 26,9 1/3 — / —

а - гаплотипи определены по пяти полиморфным сайтам:

1; (----+) 5; {+ - - - -) 3: (л + - + -)

2: ( »■+ ■-•» -() 6: ( + - - - +) 10: ( - + + + +)

3: С ( - + ,»■ +) . 7: ( - - ь ч -) 11: ( - - - +

4' ( <■ ■ + » -) 8- (+<--- +) 12: ( * »■ ч 4 -)

лизировашшх аллелей,. или 73Z. Если учесть еще три мутации (IVS1 -6, FSC 44, FSC36/37), встретившиеся лишь по одному разу в гетерозиготном состоянии, то доля охарактеризованных аллелей возрастет лишь до 79% (38 из 48).

Среди девяти выявленных мутаций наиболее часто встречалась делеция двух А в 8-ом кодоне (FSC 8) - 16 хромосом или 33% (табл. 3). Другие две обнаруженные секЕенированием мутации (FSC 82/83, COD 39) встречались с умеренными частотами, соответственно, 8Z и 6Х. Замени в 1-м нуклеотиде 1-го интрона, а также в 1-м нуклеотиде 2-го интрона имели близкие частоты встречаемости му-тантных хромосом - 10Z и 8%, соответственно. В исследуемой нами выборка мутация IVS1.-110, наличие которой в Азербайджанской популяции было показано в работе- С. Л. Лимбо рекой с соавторами (1987), встречалась с частотой 6%.

Таблица 3. Точечные мутации /5-глобинового гена, выявленные в результате анализа ампдифицированных ДНК 24-х больных /s-талас-семией, проживающих в Азербайджане.

Название Вид Количество Количество Частота

мутантного мутации гомо- гетеро- мутантных встреча-

аллеля зигот зигот хромосом емости *

FSC 8 Деления АА 5 6 16 33 Z

IVS1-1 Транзиция G-A 2 1 5 10 Z

FSC 82/03 Делеция G 1 О с 4 8 V /а

IVS2-1 Транзиция G-A 1 2 4 8 %

IVS1-110 Транзииия G-A - 3 3 6 Z

COD 39 Транзиция С-Т 1 1 3 6 %

IVS1-6 Транзиция Т-С - 1 1 о *

FSC 44 Делеция С - 1 1 2 У

FSC 36/37 Деления Т - 1 1 2 /я

FSC 6 Делеция А - - - 0

-87n Траяс-версия C-G 0

Проанализировано 48 хромосом (24 болъннх). {'дрптифупкровдны 38

мутантных хромосом (10 компаундов и 10 гомозигот). * - количество хромосом, имеющих данную мутацию, отнесенное к общему числу проанализированных хромосом, выракепное в процентах.

Отсутствие гомозигот по мутациям IVS1-U0 и 1V31-6 в рассмотренной выборке, возможно, объясняется тем, что для скрининга отбирали в основном больных с тяжелыми формами /i-талассемии. Тем не менее, следует отметить, что сочетание этих /ь+-аллелей с аллелями ведет к тяжелым формам Д-талассемии. Последнее, вероятнее псего, объясняется низким уровнем компенсации глобинового синтеза за счет фетального гемоглобина (таблица 2: ДНК 1,. И, Ы1; HbF, сответственно, 40, 2.5, 16Z).

Таким образом, на примере небольшой выборки из 48-ми fi -та-лассемических хромосом мы видим, сколь широким является спектр мутаций, характерных для глобинового гена в азербайджанской популяции. Только у 20-ти пациентов идентифицировано девять мутаций. При этом обнаружено 10 гомозигот, 10 компаундов и охарактеризовано 79% Выборга (38 мутантных аллелей). Идентификация мутаций у четырех оставшихся пациентов, вероятное всего, еще более расширит спектр /i-талассемических аллелей.

ВЫВОДЫ

1. О помощью метода праймер-зависимой амплификации ДНК in vitro выделены и проанализированы фрагменты/l-глобинових генов 24-х больных /i-талассомией, проживающих в Азербайджане.

2. Прямым секвенированием амплифицироаанных фрагментов выявлены следующие мутационные повреждения этого гена: делеция двух А в восьмом кодоне со двигом рамки считывания; транзиция С-Г н 39-ом кодоне о образованием стоп-кодона; и мутация со сдвигом рамки за счет делеции В на границе 82-83 кодонов.

3. Делеция G ь 82/83-м кодоне является новой ранее не описанной мутацией, обуславливающей /ь°-талассемию.

4. Методом алель-специфической гибридизации идентифицированы следующие мутации: G-A транзиция в 1-ом и 110-ом нуклеотидах первого интрона и 1-ом нуклеотиде второго интрона; Т-С транзиция в 6-ом нуклеотиде первого интрона

б. Отличительной чертой мутационной картины /5-глобинового гена в рассмотренной группе больных л -талассемией является кирокое

представительство различного типа мутаций, большое число компаундов. Делеция двух А в 8-ом кодоне является доминирующей мутацией (33%).

Список публикаций по теме диссертации

1. Гольцов А: А., Сурин В. Л., Лукьяненко A. R и др. Характер двух мутационных повреждений ^-глобинового гена при /i-талассемии в Азербайджане // Биоорганическая химия, 1989, т. 15, No.7, с. 1001-1002.

2. Шварц Е. И., Гольцов А. А., Кабоев О. К. и др. Молекулярная природа делеции при /1-талассемии, установленная с помощью метода амплификации геномной ДНК // Биоорганическая химия, 1989, т. 15, No. 4 с. 556-559.

3. Шварц Е. II, Кабоев O.K., Гольцов А. А. и др. Праймер-зависимая амплификация двух участков /i-глобинового гена человека // Биоорганическая химия, 1988, т. 14, No. 11, с. 1577-1579.

4. Schwartz Е. I. , Goltsov А. А. , Kaboev 0. К. et al. A navel framsshi ft mutation causing jb-thalassaemia in Azerbaijan // Nucleic Acids Reserch.-1989.- Vol.17.- No. 7. - p. 3997.

5. Soloviev G. Ya , Goltsov A. A. , SurinV.L. et al. Molecular nature of mutations causing /1-thalassemia in Azerbaijan // Biomed. Science.-1990. - Yol. 1. - No. 3. - p. 301-303.

PTil ЛИЯФ.закЛЗОЗ.тирЛОО.уч.-издл .1; 2I/XI-I9i)0r. Бесплатно