Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Молекулярно-генетическая гетерогенность бета-талассимии в некоторых регионах Средней Азии

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетическая гетерогенность бета-талассимии в некоторых регионах Средней Азии"

к

- 9 3

РОССИЙСКАЯ АКЛДКМИЯ "»МЕДИЦИНСКИХ '¿ЛУК «ЕДОКО- ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПЛУЧНКЯ ЦЕНТР

На прал^-х рукописи УДК 616-056.7 + 577.2

КОЛКС!!ИГ>СЛЗЛ ТАТЬЯНА НИКОЛЛРЛЦЗЛ

ЙОЛЕКУЛЯРНО - генетическая гктнроггазиосгь БЕТА - ТАЛАССТ2НИИ в

НККСУГОШХ РКГНО:;ЛХ снвянкя АЗИИ

0:1. !)о. I:<. п;1!1 .-гик.!

л и т о г: о к г л т

диссертации на соискзпио ученой стегюш: кандидата медицинских наук

Москва - 1833 г.

Г л Сот?) 1Л1П',и',р-:и.-; ¡1 ,;,,-гго1'Л» 1;(«.•; ¡.чтлл I .ной дп.'пчюстики М<-у,ико генетического научного центра РАМН. Директор - член - корреспондент РАМН, профессор В. И. Иванов.

¡¡-¿•/ЧП1.Х: руководители:

доктор биологических наук, профессор Е. К. Гинтер кандидат биологических наук Г.Я. Соловьев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е.А. Спицин кандидат биологических наук Н.М. Александрова

Ведуд&е учреждение: Институт молекулярной биологии

им. П. Л. Онголы'.'Фдта ГЛП

Защита диссертации состоится "

У 2 00

в / О часов на заседании специализированного ученого совета (Д.001.16.01) Медико - генетического научного центра РАМН по .адресу: Москва, 115473, ул. Москворачьо, д. 1.

1эо:

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке- Медико генетического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " " :233

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

.о---/л 3

ГЦ- Ч

[?lftUi^iVi'yLUlbliL.»JT-b___xcwU- и.чжнойшчн проблемой генетики ЧёЛОВОКа

является изучение молекулярных причин наследственных болезней и их распространения в различных регионах. В настоящей работе представлены результаты молекулярно - генетического исследования бата - талассемии в Туркмении и Таджикистане.

Бета - таласоемия это аутосомпо - рецессивное, наследственное; заболевание, вызывающее нарушение биосинтеза бета - цепей гемоглобина. Заболевание характеризуется тяжелой гемолитической анемией, изменениями в паренхиматозных органах и костной система, задержкой физического развития со 100%-й смертностью у гомозигот. F>od лпчопин продолжительность жизни больных состанлпот 1,5-2 года, а при осуществлении регулярных переливаний крови и специального xojliri'lioro ЛН'ИЧШЯ - ДО 1 11- 12 лот.

По последним данным частота гетерозиготного носительства мутлптних аллолой бота - глооипог.ого гена п сродчем в мире составляет около 3% - 150 млн. человек (Kasasian, Boher., 1988).

Бета - талассемия встречается в обширной географической зоне малярийного пояса, главным образом в странах Средиземноморья и Юго -Восточной Азии. К настоящему вронони охарактеризовано Соле« 100 мутаций, прплодящих к бота - талассемии и опроделоны частоты их встречаемости для большинства популяций. __ _

В бывших республиках Средней Азии и Закавказья также выявлена бета- - талассемия^ частота гена колеблется от 0,4% до 5%, (Гинтер Е.К., Гарькавцова Р.Ф. 1984). Средняя частота гена бета - талассемии в Таджикистане составляет 1,2%, а в Туркмении - от 0,4% до 1,4*. Эта патология относится к наиболее часто встречающимся формам аномалии синтеза глобиновых цепей в этих регионах.

В ряде стран успешно действуют программы профилактики бета -талассемии, направленные на выявление гетерозиготных носителей, медико - генетическое консультирование и проведение пренатальной диагностики в семьях с риском рождения больного ребенка. Однако

такап формл профилактики может бить :*}фикти1 той только I» том случаи, когда точно известен спектр мутаций и частота каждой из молекулярных форм бета - талассемии.

К сожалению, в Средней Азии до настоящего времени молекулярно -

проводились и данные о молекулярно - генетической гетерогенности этой патологии отсутствуют.

генетической гетерогенности бета - талассемии в Туркмении и Таджикистане.

Здлдчи И^ЛРППТИНИЯ.

1. Оценка частот полиморфных сайтов рестрикции в бета глобиновом кластере с использованием метода ПЦР, выявление гаплотипов и установление их частот в популяции Туркмении и Таджикистана.

2. Выявление бета - талассемических мутаций, характерных для Туркмении и Таджикистана с использованием модифицированного метода прямого секвенирования амплифицированных фрагментов бета глобинового гена по Сэнгеру.

3. Разработка простого нерадиоактивного метода выявления гетерозиготного носительства мутаций в бета - глобиновом гене с использованием полиморазной цепной реакции.

4. Использование полученных данных для пренатгльной диагностики бета - талассемии.

Научная нопцзна. Впервые оценены частоты полиморфных сайтов рестрикции в бета - глобиновом кластере, определены гаплотипы и установлены их частоты в популяциях Туркмении и Таджикистана.

генетические исследования бета

талассемии практически не

состояла в выявлении молекулярно

Методом прямого -секвенирования-амплифицированных фрагментов.бета

глобинового гена по Сэнгеру впервые Б туркменской популяции выявлены две мутации: з£1мена С на А в первом положении второго нитрона (1У22-1) и замена и на С в пятом положении первого интрсна (1731-5) в туркменской популяции и дслоция четырех пар оснований (-ТТСТ) в 41-42 кодонах второго экэона бета - глобинового гена в таджикской популяции.

Практическая днячимпптч Полученные данные о частота встречаемости полиморфных сайтов рестрикции в бета - глобиновом кластере, а также о частотах гаплотипов, позволяют проводить пренатальную диагностику в семьях с пораженным ребенком в туркменской и таджикской популяциях методом ПДРФ с достаточно

ВЫСОКОЙ Э([«[ЮКТИГ1| юстью.

Ащзо'-кшия_диссертации^ Основные положения диссерт^щии были

доложены на научном семинаре, состоявшемся в лаборатории генных диагностикумов ГНЦ РАМН в августе 1992 года и на межлабораторном научном семинаре МГНЦ РАМН в сентябре 1992 года.

Публикации, По материалам диссертации опубликованы 2

экспоримонтальпыо научные статьи, 3 тезисов.

овьем и структура работы. Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор

литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение и выводы. Указатель литературы содержит 14 отечественных и 85 иностранных библиографических источника. Диссертация иллюстрирована 1 диаграммой, 8 схемами, 15 таблицами, 9 фотографиями.

СОДЕРЖАНИИ РАБОТЫ. ';.

Материалы и мстпли исспепования. Представленные в настоящей работе данные были собраны во время трех экспедиций в Туркмению и

Таджикистан. Всего Ныло обследоимпо 05 человек из 24 сомой из Туркмении и 30 человек из 19 семей из Таджикистана. 3 экспедиционных условиях обследование включало осмотр больных, заполнение клинико -генеалогической карты, взятие крови с полью определения гематологических показателей - НЬА2, HbF и выделения ДНК.

С цол!.« количественного определения фотальпого гемоглобина ми использовали метод Betke с соавторами (1959), определение гемоглобина А2 проводили методом электрофореза на ацетат целлюлозных пленках, предложенным Marengo - Rove (1965).

Для выделения ДНК образцы венозной крови сразу же смешивали в соотношении 1:1 с лидирующим буфером следующего состапа: 100 мМ трис-HCl, рн 8,0; 100 мМ ЭД'ГА; 27. додецилсульфат натрия. В таком хзиде cGp/J'ii;u могут храниться при обычной температуре до нескольких месяцев без существенной деградации ДНК, что значительно упрощает сбор обр.-лцом и "j к с г I о / ( и п и о I ш I j х условиях » районах с жарким климатом. После транспортировки в лабораторию лизаты инкубировали с протеиначой К » коночной концентрации 0,1 мг/мл при 37°С в точение ночи, затем подвергали стандартной процедуре экстракции фенолом, смесью фенол-хлороформ в отношении 1:1 и хлороформом (Maniatis et al., 1982).

Амплификацию фрагментов бета - глобинового кластера, включающих в себя полиморфные сайты рестрикции, проводили в объеме 30 мкл, а фрагменты, предназначенные для дальнейшего секвенирования, амплифицировали в 100 мкл. Амплификационная смесь содержала 20 мМ трис-HCl; рН 8,8; 10 мМ (NHib S04; 8,0 мМ HgCls; 170 мкг/мл BSA; 0,5 мМ каждый из деэоксинуклеоэидтрифосфатов; 0,5 - 1 мкМ каждый из праймеров; 1-4 единиц активности ДНК - полимеразы из Thermus termophilus; 0,3 - 1 мкг ДНК из крови человека. Денатурацию ДНК проводили 5 мин. при 94°С, отжиг праймеров 1 мин. при 55-60°С, синтез 1-2 минуты при 72°С. Последующие циклы включали 1 мин. при 94° С (денатурация), 1 мин. при 55-60°С (отжиг в зависимости от

тпмппратури-гибридизации праймера) и 1 - Z мин., при <annw>.

После 30 циклов амплифицированкыоз фрагменты ДНК анализировали при помощи электрофореза в 2%-ном агарозном или в 6%-ном полиакриламидном геле (ПААГ, соотношение акриламид/бисакриламид 19/1). Гидролиз фрагментов ДНК проводили в обьеме 5-10 мкл добавлением 5 од. соответствующей ростриктаэц нопоср^дстнонно и амплификационную смесь с последующей инкубацией при 37°С в течоние 2-х часов.

Для анализа частот полиморфных сайтов рестрикции исследовали пять полиморфных сайтон рострикцин в бота - глобмповом кллсторо: Hindlll в G - гамма гене, Hindlll в А - гамма гена, HincII в псевдогене и HincII в его 3' области, Avail в бета - гене.

Анализ нуклеотидной последовательности осуществляли методом прямого секвэнирования продуктов амплификации по Сзнгеру с использованием ДНК полиморазы фага Т7, либо его модификацией с использованием термостабильной Tth полимеразы и меченого праймера.

1 'НПУЛЬТЛТЫ И ОПСУЖДКНИК

Оцечка-дасхот-.долимсж'Шлх саГшэс. геегшкшш _в а _=._глсаикг£

1уркмсыш1_и_Таджикистана^_iia__ociiQBQ _прииелеш!Я._сиЕ^ несмотря на

успехи молекулярной генетики, связанные с развитием технологии тестирования мутаций, приводящих к моногенной патологии, полиморфизмы ДНК, в частности полиморфизм длины рестрикциопных фрагментов (ПДРФ), остается важным инструментом молокулярно генетических исследований. ПДРФ является маркером хромосом, передается по наследству как генетический признак и может быть использован в качества генетического маркера мутантных генов. Информативность метода значительно возрастает при совместном определении нескольких полиморфных сайтов (гаплотипов), находящихся в группе сцепления с патологическим геном, за счет увеличения

количества возможных аллелей. Так, при совместном использовании 5 полиморфных сайтов, число возможных вариантов гаплотипов равно 25 -32.

ПДРО широко применяется для пренатальной диагностики моногенной патологии, в том числе для диагностики бета - талассемии. Метод оказывается ценной альтернативой в случаях, когда в данной популяции заболевание характеризуется значительной молекулярно - генетической гетерогенностью или если не удается обнаружить молекулярный дефект в данной семье. Однако необходима предварительная информация о частотах полиморфных сайтов и гаплотипов в конкретной популяции, при помощи которых с большой долей вероятности можно отличить талассемическую хромосому от нормальной. Часто семейного ПДРФ -анализа может быть достаточно для установления носительства бета -талассемического гена и проведения пренатальной диагностики, даже в случае равновесия по сцзплению между мутантным и полиморфным сайтом в популяции.

Таким образом изучение ПДРФ в кластере бета - глобиновых генов (частичных гаплотипов) является не менее важным, чем выявление спектра бота - талассемических мутаций.

В связи с этим мы предполагали оценить частоту полиморфных сайтов рестрикции в кластере бета - глобиновых генов в нормальных и мутантных талассемических хромосомах, по - возможности выявить неравновесное сцеплоние конкретных мутаций с гаплотипами, а также определить наиболее информативные полиморфные сайты для целей пренатальной диагностики в популяциях туркмен и таджиков.

Для анализа частот полиморфных сайтов рестрикции исследовали пять полиморфных сайтов рестрикции в бета - глобиновом кластере: HindIII в G - гамма reno, HindIII в А - гамма гене, HincII в псевдогене и HincII в его з' области, Avail в бета - гене. Участок для амплификации выбирали так, чтобы в анализируемом фрагменте - по возможности присутствовали одновременно как константный, так и

11С>лмме4*1'чый сайты рестрикции. Б этом случае имеется внутренний контроль 'на полноту рестрикции. (рисунок 1.) Праймеры для амплификиции били любезно предоставлены лабораторией генных диагностикумов ГНЦ РАМН (Соловьев Г.Я., Сурин В.Л., Лукьянонко A.B., Тагиев А.Ф.).

40 30 20 10 0

G у А у i>$ 6 ß

"""TOlH lj'^.'.^ [""", l

tHmdint Hineilt t IlincII f Avall

А К KV V

/ \ i \ t\ \\ w

' : i \ 14 \ N \ \

J \ ' \ ' \ \ V \ \

f \ ! \ \ \ \ \ \

/ \ \ \ \ \ \

\ \ \ ^ \ / Ii \ 1 \ 4 N 1 \

/ II 1 \ \ \

/ I \ l \ \ 4

! \ i \ t '

\ \ \ \

Zj_ü !_? -j\ I_\_Vi_Ь

i kb

\ \ W \\

\

Рисунок 1. Схема расположения полиморфных сайтов рестрикции в бета -глобнновом кластере. Ь'остриктные карты амплифпцируемых фрагментов приведены в нижней части рисунка; полиморфные сайты яыдол^ны.

Для выявления частот полиморфизмов и гаплотипов мы анализировали 64 нормальных и 20 мутантных хромосом в туркменской популяции, 40 нормальных и 8 мутантных хромосом в таджикской популяции. Частоты полиморфных сайтов и распределение гаплотипов оценивались в смешанных популяциях Туркмении и Таджикистана отдельно в группах

Сольных или носителей Сота - т.имссомичоского гона и в группах здоровых. В последнюю группу отбирали только не родственные хромосомы. Для отбора больных и носителей использовались следующие критерии: наличие клинических проявлений гомозиготной бета талассемии, соответствующие гематологические показатели (НЬА2 и НЬГ).

Результаты распределения частот полиморфных сайтов рестрикции в бета - глобиновом кластере в туркменской и таджикской популяциях в нормальных хромосомах представлены на диаграмме. (рисунок 2.)

1.00

о.во

0.60

0.40

0.20

0.00

' ш

W//

■mv///.

щт.

V,, \

1-таджики

щ

mw//

„жф,

ШШ

HindJII Hjndlll Hindi HincJl Avail

ra

Рисунок 2. Срапноние частот полиморфных сайтов рестрикции в бета -глобиновом кластере в туркменской и таджикской популяциях (нормальные хромосомы).

С

А

Все исследованные сайты оказались полиморфными. Частоты

встречаемости полиморфных сайтов в нормальных хромосомах в обеих

«

популяциях имеют близкое значение (различие выборочных частот статистически на достоверны). Для трех из пяти сайтов значения

частот близки к 50%, то есть степень гетэрозиготности для них близка к максимально возможной - 50%. Использование их в пренатальной диагностике будет наиболее эффективным, особенно использование Avail сайта, который находится непосредственно в бота - глобиисвом гене.

Отсутствие статистически достоверных различий между выборочными значс-ниями частот генотипов и их ожидаемыми значениями при проверке выполнения равновесия Харди - Вайнберга свидетельствует о том что распределение частот генотипов по всем полиморфным сайтам рестрикции как в туркменских, так и в таджикских популяциях находится в разновесном состоянии. С целью подтверждения гипотезы об идентичности частот ПДРФ в туркменской и таджикской популяций или об их различии молекулярно - генетическими методами необходимо значительное увеличение выборки, как нормальных, так и мутантных хромосом.

Для определения гаплотипов было отобрано 64 нормальных и 20 мутантных хромосом в туркменской популяции, 40 нормальных и б мутантных в таджикской популяции. Для оценки распределения гаплотипов отбирались индивиды, чьи гаплотнпы можно было трактопать однозначно. В таблицах 1 п 2 представлены спрденип по рлепродолон;'--" гаплотипов в выборках из туркменской и таджикской популяций.

Из 32 возможных вариантов гаплотипов хромосом по ляти полиморфным сайтам рестрикции в туркменской популяции среди нормальных хромосом обнаружено 11 вариантов, а среди мутантных - 5. Удалось однозначно установить гаплотир.ы дли 34 нормальных хромосом и 14 мутантных хромосом.

В таджикской популяции выявлено 5 вариантов гаплотипоь. как в нормальных, так и в мутантных хромосомах, удалось установить гаплотипы в 20 нормальных хромосомах и 8 мутантных. Наиболее частым гаплотипом оказался I или V гаплотип по классификации Orkin (- - - -+), он преобладал и в нормальных и в мутантных хромосомах, составляя от 28% в туркменской выборке, до 50% - в таджикской.

Тлс»лицл 1. Р.-1Сп[Х)Д';лопи<> гаюкггипоп п туркмонской популяции.

Гаплотипы

кол. мут. % кол. норм. % гаплотип по хромосом хромосом Orkin

1. - - - - +

2. - - - - -

3. + + + + +

4. + - + + +

5. + - - + -

6. + + - + +

7. + +• - - +

8. + + - + -9. + + + + -

10. - - + + -

11. + - + + -

12. - - + - + boovo

28.5 21.Л 14.2 21.4 14.2

14 7 1 2

3 2

14 100.0

34

41,2 20.С 2.9 5.9

8.8 5.9 2.9 2.9 2.9 2.9 2.9 100.0

I ИЛИ V VII

III или IX

II

IV

Таблица 2. Распределение гаплотипов в таджикской популяции.

Гаплотипы кол. мут. % кол. норм. % гаплотип по

хромосом хромосом Orkin

1. - - - - + 4 50. 0 7 35.0 I или V

1. - - 1 12.5 4 20.0 VII

3. + - + 4- + 1 12.5 3 15.0 III

4. + + - + + - - 4 20.0 II

5. + + - + - - - 2 10.0 -

6. - - + - + 1' 12. 5 - - -

7.-- - + - 1 12.5 - - -

Всего 8 100. 0 40 100.0

Далоо по 2и% в оших выооркнх был представлен VII гаплотип по-0гк1п (-----), который также наблюдался в группах и мутлнтных и нормальных хромосом. Следует отметить, что II гаппотип (++-++) встретился только в нормальных хромосомах и в туркменской и в таджикской выборках, а преобладание какого-либо гаплотипа в му-]-, лп-1 ;!.]•-: щ» т. и>г 1;т: выявлено. Ноемотрл "а то, что иыоорка

не является достаточной для установления частот всех гаплотипов, уке по длнному распределению частот гаплотипов можно предположить о принципиальном сходстве частот гаплотипов в популяциях Туркмении и Таджикистана с частотами гаплотипов в популяциях Юго-Восточной Азии и Азербайджана.

Таким образом, нами определены частоты полиморфных сайтов рестрикции

в бета - глобиповом кластере, выявлены гаплотипы и определены их частоты, выявлена наибольшая степень гс-терозиготности для трех полиморфных сайтов рестрикции, один из которых расположен внутри бета - глобинового гена. Эти данные могут быть использованы д. ы П1 и-п. ггалиюм диагностики методом МДрф.ц еомья.ч с больным ребенком. Б таблице 3 обобщены результаты по обследованию семей с клиникой гомозиготной &ата - талассемии у детей для целей пренатальиой диагностики.

Таблица 3. Результаты обследования семей из Туркмении, пяти полиморфным сайтам рестрикции в бета - глобиновом кластере._

Маркировка ДНК Генотип ВгЛ2 Нп Р Глплотип Преплт. Д-Ка

Аш. 9.10. (6) + + / + + /++/ ++/ + - - 3,07 (-1-++ ++/ + + + + - > Аш. 10.11.См) ++/++/+-/++/++ 1,5 2,36 (+++++/++-++; Аш. 11.12.(о) +-/+-/+-/+-/+- 2,0 0,90 (++++-/----+)

Аш. 21.23.(6) —/—/+-/+-/+- -Аш. 20.22. (м) —/—/--/—/++ 2,9 Аш. 19.21.(о) •--/--/+-/+-/-- 2,7

3,05 (----+/--++-)

1,10 (----+/----+) +/-

0,79 <--++-/-----)

Таблица 3. Продолжение.

Маркировка ДНК Генотип НвА2 Нв Б Гаплотип Пренат. д-ка

Аш. 39. 64 . (б) 1, 92 ю, ,07 ( + -+++/ — —+)

Аш. 38. 63. (м) 2, 80 0, ,92 ( + -+++/++ +/-

Аш. 37. 62. (о) 4, 69 0, ,91 (- —+)

Аш. 45. 70. (б) 2, 20 8, ,40 ( + -+++/+- +++)

Аш. 46. 71. (м) 4, 60 0, ,47 ( + -+++/++ +

Аш. 44. 69. <о> 4, 89 1, , Ю ( + -+++/ — —+)

Аш. 49. 3. <б> 2, 60 5, ,00 (- ----/— — )

Аш. 48. 2. (м) 2, 37 3, ,00 (- -----/__ — ) +/-

Аш. 47. 1. (О) 3, 61 1, ,60 (- ----/+- ++-)

Аш. 50. 4. (б) 2, 57 6, ,70

Аш. 52. 6. (м) 3, 65 2, ,54 - +

Аш. 51. 5. (О) 2, 97 1, ,30

Ча. 59. 13. (61) 3, 5 3, ,60 (- — )

Ча. 60. 14. (62) 3, 6 3, ,80 (- —+/— — ) +/-

Ча. 58. 12. (м) 2, 21 1, ,66 (- — )

Ча. 57. 11. (о) 2, 35 2, ДО <~ — )

Аш. 75. 29. (6) 2, 0 71 ; ,00 (- —+/— —+)

АШ. 74 . 28. (м) —/- 5, 0 2, ,30 <- —+) +/-

Аш. 73. 27. (о) —/- 5, 2 1, ,76 <- —+/— — )

Аш. 106 ;.51 .(б) +-/+ 22, ,00

Аш. 107 '.52 :.(м) - - - +

Аш. юе 1.53 ¡.(О) - -

Цч ПЯТИ е<-М1'И IVtn.il» 'ТИПЫ I !М' П11 •ЛН!<'Т< 'И И <*<"МИ, Н чгчтир« 'X семьчх

возможно- - успешное'""проведение пренатальной диагностики в ЮО/С случала, причем « трех из этих семей достаточно определения генотипа плода по одному сайту рестрикции для заключения о его генотипе, в одной семьо необходимо определение частичного гаплотипа по двум сайтам. В остальных семьях пренатал/гпая диагностика ко основа ПДР& возможна, но в 50% случаев информация будет неопределенной и потребуются дополнительные усилия для тестирования мутации в бета -глобиновом гене.

_глсбииопон

индивидов. носущих мутнциет обуслопл.онпую короткой делоциой или нотмикои в амплиф) »пируом« ч* фрагменте, приподит к появлению гетородуплексов в продуктах амплификации, образующихся при отжиге цепей дикого типа с .-¡.утантными. Присутствие гетеродуплексоз обнаруживается при электрофорезе амглифпциросанкш: фрагментов в ПААГ пояалением, как правило, двух дополнительна полос, с электрофоретическ.ой подси-теость» меньшей чем у основного фрагмента. Различные мутации тэ продолах одного и того же участка ЛИК имеют индивидуальную • >лолт1»4»ратичвскую картину. Метод пснска мутации, основанный на описанном выше явлении известен под названием гетеродуплексного анализа.

Ми амшшфицнР'" ;ли оы|.и"гь сета - глобинопого г«»ил от промоторной области до середини -второго иктрона длиной в 635 пар оснований в образцах ДНК десяти больных с клиникой гомозиготьой бета талассемии иэ Туркмении и пяти гетерозиготных носителей из Таджикистана. У трех гетерозиготных носителей (два родственны;: и один не родственный индивиды) при анализе продуктов амплификации в 2%-ном агарозном геле было выявлено наличие одной дополнительной

Амплификация ДНК гетерозиготных

полосы и две дополпитольпыо полосы в 6%-пом полиакриламидном голе. Амплифицируя более короткие фрагменты, мутацию локализовали' во втором экзоне бета - глобинового гена.

Ьр

1

П

805

514 -»

Рисунок 3. Делеция четырех пар оснований в 41 - 42 кодонах бета -глобинового гона. Илоктрофороо и 2%-пом агарозиом голо. 1, норма, 2

- 4, гетерозиготные индивиды. »

Методом прямого саквенирования амплифицированных фрагментов по Сэнгеру у этих индивидов обнаружена делеция четырех пар оснований (-ТТСТ) в 41 -42 кодонах бета - глобинового гена.

Таким образом, нами показана возможность диагностики гетерозиготного носительства делеции четырех пар оснований в 41 - 42 кодонах бета - глобинового гена при помощи электрофореза продуктов амплификации п 2%-ном агарознсм геле. Простой норадиоактивный мотод гетеродуплексного анализа может быть использован для скрининга гетерозиготного носительства мутаций в бета - глобиновом гене и пренатальной диагностики.

Определение бета - тдлассемических_мутаций метопом_ПРЯМОГО

^акпениооидния по Сянгеру. Наиболее частые бета - талассемические мутации сосредоточены в 5' - области бета - глобинового гена, в

первом экзоке, первом нитроне, во Етсрсм экзоке и в 5'.._- „области _____

второго интрона бета - глобииового генз. Это составляет примерно 90% от всех мутаций, известных к сегодняшнему дню и они являются наиболее чс.ото встречающимися мутациями и мирово!! популяции.

Поэтому для амплификации и секвенирования нам;", был рыб-ран участок бота - глооинового гена, который включал в себя эти области. Он охватывал район от позиции -173 до положения 64 второго ннтронз и имел длину ВЯ1 пар оснований. Дли определения нуклаотидной последовательности бота - глобинового гена и выявления возможных мутаций был использован метод Сэнгера с применением термостабильной ДНК-полимеразы. Для секвенирования было взято 10 образцов ДНК больных гомозиготной бета - талассемией и соответствующими гематологическими показателями из Туркмении и три гетерозиготных носителя бета - глобинового гена из Таджикистана. Было выявлено три мутации, ранее не описанные к туркменской и таджикской популяциях. Мто деления четырех пар нуклоотидон в 41-42 кодонах бета глобинового гена, обнаруженная в трек образцах ДНК у представителей таджикской национальности, в двух неродственных хромосомах и дро мутации, IV К 2-1 и Т У'Л 1-5 найдены в образцах ДНК у представителей туркменской национальности в 7 хромосомах. Мутация IV 5 2-1 встретилась в 6 хромосомах и мутация ГУБ 1-5 в одной хромосоме. Обе мутации характеризуют нарушение сплайсинга в интронах и характерны для нескольких регионов. Замена в на А в первом положении второго интрона распространена в Средиземноморье и обусловливает

клинику гомозиготной бета - талассемии. У всех наших больных с наличием этой мутации была ярко выраженная клиническая картина гомозиготной бета - талассемии.

Вторая мутация - это замена О на С в пятом положении первого интрона (1У51-5) в наших исследованиях встретилась в одной хромосоме в сочетании с 17Б2-1 у пробанда с также выраженными клиническими

проянлениями, который таким образом является компаундом по этим двум мутациям.

Эта мутация впервые описана в Индии и занимает там первое место по частоте встречаемости. В шести хромосомах с мутацией IУБ2-1 было выявлено три разных гаплотипа, что свидетельствует об отсутствии жесткого сцепления данной мутации с определенным гаплотилом в популяции туркмен. Выявление мутации IУЗ 1-5, которая в основном распространена в Индии, Китае, Меланезии и 1У52-1, распространенной в Средиземноморье, может предполагать пути проникновения этих мутаций на территорию Туркмении, которая соединяет азиатский материк со странами' Средиземного моря через один из " Шелковых путей" .

Делеция четырех пар оснований в 41-42 кодонах бета - глобинового гена, обнаруженная у гетерозиготных носителей из Таджикистана, возможно не является редкой для данного региона. В наших

исследованиях она оказалась сцепленной с гаплотипом (----+), который

соответствует I или V гаплотипу по Огкгп. В Юго-Восточной Азии этой мутацией обусловлено от 23% до 43% случаев толассомии и чаще всего она сцеплена с этим же гаплотипом, что позволяет предположить вероятные пути проникновения этой мутации на территорию Таджикистана.

талассемией. Изложенный выше материал по оценке частот полиморфных сайтов рестрикции, выявления гаплотипов и установления их частот показал, что выбранные нами полиморфные сайты рестрикции действительно информативны и могут быть использованы для пренатальной диагностики в семьях с пораженным ребенком.

Методом анализа ПДРФ мы осуществили пренатальную диагностику в семье с больным гомозиготной бета - талассемией в сроке 7-8 недель беременности. Анализ проводили по пяти полиморфным сайтам рестрикции бета - глобинового кластера.

+ - ОгШ + - Hindlll, G У + - + - Hindlll, A?

--□ A + -

i

Г

I

i L

a.

в

4

+ -

--Ojfl-r- HiacII, j/p + - 0|Ю - -HincII, 3'jl,e

рисунок Л пр. патал'.пан диагностика. Анализ 11ДГО Электрофорез в ной агарозном голе.

Гаплотипи родитолэй, про5анда и плода оказались следующими: мать - (+++-+/-----), отец -(++---/------> , проб.-.пл -(------/------>,

N —

плод -(++---/-----) Ясно, что у обоих родителей хромосома, несущая

бета - талассемическую мутацию маркирована гаплотипом (-----)

мут;.птнзя Х1\5мосома плода имеет материнское происхождение. Семья оказалась полностью информативна по двум Hindlll полиморфным сайтам рестрикции a G - гамма и А - гамма генах, частично информативна по HincII сайту в псевдогене и по Avail сайту в бета - глобиновом гене и не информативна по HincII сайту в 3' - области псевдогана, поскольку оба родителя гомозиготны по отсутствию данного сайта рестрикции. По результатам анализа ПДРФ был сделан вывод о том, что

плод является гетерозиготным носителем мутации в бета - глобиновом гене. I

Так как было известно, что оба родителя являются носителями делеции двух пар оснований (-АА) в 8 кодона бета - глобинового гена, фрагменты, внутри которых расположен 8-й кодон, были подвергнуты гетеродуплексному анализу < рисунок 5) . I

1 2 3 4 5 6 7

Рисунок 5. Пренатальная диагностика. Анализ гетеродугалексов. Электрофорез в 2%-ном агарозном геле. 1-3, норма.

Как видно на фото, электрофоретическая картина ДНК плода полностью совпадает с распределением полос у обоих родителей. Таким образом, генотип плода по данным анализа гетеродуплексов однозначно трактуется как гетерозигота, что -соответствует результатам4 анализа ПДРФ.

Вся процедура диагностики от момента биопсии до получения результатов была выполнена в течение полутора суток и для анализа потребовалось не более 2 мкг ДНК плода.

-------- -------- _ ... шлииди.

1. На основе метода полимераэкой цепной реакции в Туркменской и Тад-шксу.ой популяциях оценены частоты полиморфных сайтов рестрикции в бета - глобиновом клазтеое, выявлены гаплотчпы и установлены частоты в каждой иь них в нормальных и мутантных хромосомах. Показано выполнение равновесия Харди - Вайьоерга между выборочными значениями частот генотипов и их ожидаемыми значениями, следовательно распределение частот генотипов по веем полиморфном сайтам рестрикции как в туркменских, так и в таджикских популяциях находится в равновесном состоянии. ГЗсо исследуемые слиты рестрикции оказались полиморфными в обеих популяциях, степень гетероэиготности оказалась не менее 0,4 и наиболее высока оказалась для HindiII и Avail сайта рестрикции.

2. Методом прямого секвенирования амплифицированмых Фрагментов бота - глобииопого гена по Сзнгеру впервио в туркменской и таджикской популяциях выявлено три мутации в бета - глобиновом гене: делецкя четырех пар оснований (-ТТСТ) п 41-42 кодонах второго экзока бэта - глобинового гена в Таджикистане и две мутации а уркменни: замена G на А г» первом положении второго нитрона и ;<.чм< ни ü h.-j О ч пятом положении первого интрока. Делеция четырех пар оспон.,гнй в 4 142 кодинах ьета - глобииового 'гена является обиим, нл.'.солео распространенной мутацией для всей Юго - Восточной Азии. Мутация IVS5-1 так те распространена в Юго - Восточной Азии, а мутация IVS2-1 - в странах Средиземноморья. На основании о^их дгнных можно предполагать пути проникновения этих мутаций ка территорию Туркмении И Таджикистана по одному из "Шелковых путей".

3.Предложен простой, нерадиоактивный метод скрининга гетерозиготного носитольства мутаций в бета - глобиновом гоне на основе метода полимеразной цепной реакции с использованием гетеродуплексного анализа в Среднеазиатском региона.

Л. Яолуюпныо нами по-л.г jiüiot oOvair.'iirrb i >ontrr-'jJii .i iyi<<

диагностику бета - талассемии з популяциях Средней Азии со 100% эффективностью.

ПОЛОЖЕНИЯ, EimOGiMUE НА ЗАЩИТУ

1. fia ccuoLor метода полимеразной цепной реакции в Туркменской и Таджикской популяциях оценены частоты полиморфных сайтов рестрикции в Сета - гло£: ¡новом кластере, выявлены гаплотипы и установлены частоты в каждой из них в нормальных и мутаптпых хромосомах. Показана возможность их практического использования для пренат;;л;.ной

ДИАГНОСТИКИ.

2. Впервые во вновь обследованных популяциях Туркмении и Таджикистана молекулярпо - хч.-П'Пичоскими методами jjujuuioho три мутации в бета - глобиновом гене.

3. Предложен простой норадиоактиьный метод скрининга гетерозиготного носительства мутаций в Сета - глобкыовом гене на основе метода полимеразной цепной реакции с использованием готородупл<:КС!юго анализа в Среднеазиатском регионе. .

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Колесников.-! Т.Н., Соловьев Г. Я., Сурин В. Л. и др. Молекулярная природа бета - талассемии в Таджикистане: делеция 4-х пар оснований в кодонах 41-42 бета - глобинового гена. // Генетика.- 1992.- Т. 23, И 11, С. 23-34.

2. Колесникова Т.Н., Поляка Ю.К., Сурин В. Л. и др.' Случай пронаталыюй диагностики по поводу бета - талассемии на основе техники полимеразной цепной реакции. // Генетика,- 1992.- Т.28, N 12, С. 130-134.

3. Kolesnikova Tatyana, Bobokhodjaev Zakir, Surin Vladimir and al. Molekular Detection of Mutation Beta - Thalassemia in Tadjikistan.

// Al.rstr:»..ta. 4tb lioc-t.ir.ß of t»u- Г-öoIc-ty of Hutsr.i. .V-sn Germany, Mains.- April 3 - 11., 1992. P. 312.

4. Золотухина T.B. , Кузнецов М.И. , Костюк Э. В. , Колесникова Т.Н.;: ;;р. Пр. катал; .нал диетное гика как дуть прсч'.илактцкп грожд-гг:-::.-: :t наследстзсш-.ux заболеваний. // Зесткик Российской _ Академ;:.: медицинских паук,- 1933,- N 4, С. 14-20.

о. Мазурова О. Л., Колесникова Т.Н., Матвеева Е.Б., Куз;-:«. цоь '..'.Т:., Золотухина Т. В., Гиптер Е.К. // Пренатальная ДНК - диагностика оста - талассемии в первом триместре беременности.- Вторая Всесоюзная конференция "Геном человека - 91", Переславль-Залесский, 1991,- С. 125.

Заказ № 2Б6 Тираж 100 экз. АО "Экспостроймаш"