Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Спектр бета-талассемических мутаций и гаплотипов человека в Азербайджанской республике

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Спектр бета-талассемических мутаций и гаплотипов человека в Азербайджанской республике"

российская академия медицинских наук

всероссийским гематологически! научный центр

На правах рукописи ТАГИЕ8 Акгош Фахрад оглы

СПЕКТР /?-ГАЛАССЕМЙЧЕСКИХ МУТАЩИ И ГАШЮТИПОВ ЧЕЛОВЕКА В АЗЕРБАЙДЖАНСКОЙ РЕСПУБЛИКЕ.

03.00.04-биохшия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1992 г.

Рабата выполнена во Всесоюзном ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени гематологическом научном центре.

Научный руководитель: кандидат биологических наук Г.Я.Соловьев

Научшй консультант: стерший научный сотрудник В.Л.Сурин

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, В.С.Баранов кандидат биологических наук, О.В;Ввграфов

Ведущее учреждение: Институт биологии и медицинской химии All СССР.

защита диссертации соотоится "/<5~" О У 1992 г. в IУ час. на заседании специализированного совета Д 074.08.02 во Всесоюзном гематологическом научном центре (12516?, Ыосква, Новозыковский проезд, д.4а),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВГНЦ.

Автореферат разослан . & 2. 1992 г.

*

Ученый секретарь спэциалазированного совета, кандидат биологических наук

В.Д.Реук.

Актуальность__проблемы. л-Талассемия является тяжелым

наследственным аутосомно-рецессивным заболевании с высокой долей летальности у гомозигот.

По последним данным частота носительства дефектных генов при этом заболевании в среднем в мире составляет около 3%

/kazazian H.H. & Bohem 1488/. Распространение этого

заболевания носит характер краевой патологии, затрагивая районы, неблагоприятные по малярии. В Азербайджане частота носительства Р-талассемического гена достигает 10Ж /Токарев D.H. 1983/.

Основными методами лечения ^-талассемий является инфузии хелатора железа "Десферала" в сочетании с . трансфузией эритроцит арной массы шш трансплантация нормального костного мозга. Стоимость таких методов терапии исключительно высока.

Альтернативным методом является существенно более дешевая процедура - профилактика ^-талассемий, где главным этапом является пренатальная ДНК-диагностика, проводимая в первом триместре беременности. В ряде стран успешно действуют программы, направленные на определение группы риска и проведение пренатальной ДНК-диагностики /?-галассемий. Детская' смертность от данного заболевания в этих странах понизилась в 5-Ю раз по отношению к уровню, который мог бы быть при отсутствии профилактических мероприятий.

Основным моментом, определяющим возможность проведения пренатальной ДНК-диагностики, является либо знание конкретных молекулярных дефектов в ^-глобиновом гене, приводящих к tf-талассемии, либо возможность дискриминации нормальных и талассемических хромосом по полиморфным сайтам рестрикции. Можно считать доказанным, что основные ^-талассемические мутации в разных этнических группах или популяциях нежестко сцеплены с характерными гаплотипами (т.е. распределением полиморфных сайтов рестрикции вдоль р-глобшового кластера генов).

Изучение молекулярных дефектов, приводящих к ii-талассемии. показала значительное разнообразие мутаций, лежащих в основе данной болезни. К настоящему времени известно более 85 мутаций / чи,»»- а. i-щч/. Среди них наиболее часто встречающимися являются точковые замены,

делеции и вставки одного или нескольких нуклеотидов, влияющие на разные этапы функционирования /i-глобинового гена.

Результаты предыдущих исследований показали, что в Азербайджане возможно существуют несколько форм /э-талассемий, как Р°, так и Прямое определение мутаций путем

■клонирования дефектного гена и последующего секвенирования позволили выявить одну мутацию (fi* ivsi-iio) /Лимборская 1987/. Введение в практику исследований метода полимэразной цепной реакции (ПЦР) позволило значительно упростить и ускорить выявление ^-талассемических мутаций. С использованием ПЦР и прямого секвенирования го Максаму-Гилберту были выявлены 5 о°- мутации: fbcb í-f,a),

CadïV (С-Т), Fbeü-Vtíi í-ü), FbC3í>/37, FSC44 /ialovyev l3.Ya.

1990, Гольцов A.A. 1990/. Кроме того, дот-гибридизацией амшшфицированных фрагментов ^-глобинового гена с аллельспецифическими олигонуклеотидами (ACO) были обнаружены мутации: ivsi-i. wsi-6, ivs2-t /Гольцов A.A. I99Q/. .Существенно отметить тот факт, что среди обследованных ранее больных в большом числе случаев (40%) каких-либо мутаций выявить не удалось.

Полученные до настоящего времени данные свидетельствуют о существовании еще многих гэ-талассемических мутаций в Азербайджане. Можно также сделать вывод о высокой частоте встречаемости мутаций в гетерозиготном состоянии, что в значительной степени затрудняет их идентификацию и требует усовершенствования применяемых методов.

Цель_р8бдты состояла в установлении наиболее полного спектра молекулярных дефектов, приводящих к Р-талассемии в Азербайджане, с использованием методов, позволяющих достоверно тестировать мутации в гетерозиготном состоянии. Наряду о этим существенно Оыло выяснить набор гаплотипов, сцепленных с л-талассемичесюши мутация*^ в Азербайджане, наиболее простыми и точными методами, основанием на ПЦР.

Задачи__исследования. Поставленная цель определила

постановку задач:

I. Выявление /9-талассемических мутаций, характерных для

Азербайджана, и установление частоты их встречаемости с использованием прямого секвенирования амплифщированных фрагментов ^-глобинового гена.

2. Внедрение модифицированного метода секвенирования по Сэнгеру с использованием термостабильной полимеразы для тестирования мутаций в гетерозиготном состоянии.

3. Разработка методов для выявления полиморфных сайтов рестрикции в кластере г?-глобиновых генов на основе ПЦР.

4. Определение при помощи разработанных методов гаплотипов, характерных для Азербайджанской популяции, • и оценка их сцепленности. с гэ-талассемическими .«утациями.

Научная__новизна^ С помощью модифицированного метода

СшЬера прямым секвенированием амшшфицированных в ПЦР фрагментов ^-глобиновых генов больных /з-талассемией из Азербайджана, выявлено 6 новых для данного региона мутаций

(р8сз/9, гзс14, сог)15, сойг-о. 1ув1_-5, 120^22/23/24),

две из которых ранее в мировой популяции не встречались (инсерция нуклеотида Т в 14 кодоне (рьс14 ), делеция семи нуклеотдов -ааштш в кодонах 22-24). Кроме того, прямым-секвенированием доказано существование еще трех мутаций (гу51-1. найденных ранее гибридизацией с

АСО-зондами. Обнаружено 6 новых гаплотипов, характерных для Азербайджана.

_Практическая_ценндсть. Осуществленная в данной работе характеристика р-талассемических мутаций позволяет проводить пренатальную ДНК-диагностику у 4/5 семей в Азербайджане.

АпроОация_диссертации. Материалы диссертации

опубликованы в 7 научных работах и докладывались на II съезде гематологов Азербайджана в 1990г., на II съезде медицинских генетиков в 1990г.и на Всесоюзной конференции "Геном человека" в 1990г.

Работа была апробирована на заседании проблемной комиссии "Экспериментальная гематология и биотехнология" ВГНЦ АМН РСФСР 26 сентября 1991 г.

диссертации опубликованы в 7

научных работах.

25ъ0м_и_структща_£иссвртации. Диссертация изложена на во страницах машинописного текста, состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, выводы. Указатель литературы включает 7 отечественных и IX иностранных источника. Диссертация иллюстрирована рисунками и ¿3 таблицами.

Работа начата в лаборатории генной инженерш (зав. -доктор химических наук, профессор Н.И.Гринева), завершена в лаборатории генных диагностикумов (зав. - кандидат биологических наук Г.Я.Соловьев) НИИ экспериментальной гематологии и' биотехнологии ВГЩ. Исследование выполнено при консультативной помощи ст.н.с. лаборатории генных диагностикумов В.Л.Сурина.

Соавторами по публикациям были Г.Я.Соловьев, В.Л.Сурин, А.В.Лукьянэнко, А.А.Гольцов.

СОДЕРЖАНИЕ РАбОТЫ

_Материащ_и_мето®_иссле5ования. Исследование проведено на образцах ДНК (?4 образца), выделенных из крови больных »»-талвссемавй и членов их семей.

Выделение высокомолекулярной ДНК из крови проводили по стандартному методу фенольной экстракции.

Амплификацию фрагментов /з-глоСинового кластера, включающих в себя полиморфные сайты рестрикции и фрагментов /э-глоОинового гена, предназначенных для дальнейшего секвенирования, проводили, модифицируя состав реакционной смеси, температурный и временной режимы реакции для каждой системы , ПЦР-анализа. : После амплификации * проба, ' предназначенные для выявления полиморфных сайтов рестрикции (5-10ыкл), инкубировали с соответствующей рестриктазой (2- е.а) в условиях, рекомендованных изготовителем, и анализировали методом электрофореза. Амтпфвсаты, предназначенные для секвенирования, после влектрофореза вотировали из геля,

переосакдали и растворяли в воде.

Нуклеотидную последовательность фрагментов ^-глобинового гена определяли методом Сэнгера и ого 1 модификацией с применением термостабильных ДНК-полимераз.

Использованные в работе олигонуклеотидные праймэры, синтезированнае метокси-фосфоамиднкм методом, были любезно предоставлены профессором Н.И.Гриневой (ВГНЦ АМН РСФСР) и д.х.н. Ю.А.Берлиным (ИБХ АН СССР).

Взятие крови проводили в детском гематологическом отделении республиканской больницы в городе Баку.

Амплификация участков кластера _п-глобиновых генов для выявления полиморфизма алин ресщжтшх фрагментов Опыт выявления Р-талассемических мутаций показывает, что между мутациями и хромосомными гаплотипами существует корреляция. В каждой конкретной популяции различные гаплотипы в большей или меньшей степени связаны с определенными мутациями в (Э-глобиновом гене. Обнардаение таких связей между гаплотипами и мутациями весьма важно, так как это во многих случаях позволяет предположительно установить регионы возникновения мутаций и проследить путь их передачи в различные этнические группы. Кроме того, гаплотипирование ДНК имеет самостоятельное диагностическое значение, поскольку очень часто семейного ПДРФ-анализа бывает достаточно для' установления носительства и пренатальной ДНК-даагностики различных наследственных заболеваний, в том- числе, /э-талассемий. Для выявления гаплотипов в азербайджанской популяции мы анализировали пять полиморфных сайтов рестрикции вдоль г»-глобинового кластера. С этой целью были синтезированы пять пар праймеров на следующие полиморфеые сайты рестрикции; Hind ni в Gr гене, Hind m в гене, Hinc Ii в vfl гене, Hinc Ii в 3 v/í гене и Ava Ii "во гене.

Для выявления сайтов Hir,d in в фетальных *V я вг генах и сайта ovaп в /э-глобиновом гене использовали методологию, ранее описанную в/зш-in . v.l. et ai., 1ччо/, по которой праймеры для амплификации выбираются так, чтобы в анализируемом фрагменте присутствовали одновременно . как константный, так ■ и полиморфный сайты рестрикции. В этом

' Рис.1 . Выявление полиморфных р^стрштшх сойтсв шкши в феталышх г'г и к>- глобшювых генах.

I. Схема амплификации фрагментов феталышх 'V и кг глобшоьых _

генов и их гидролиза рестркктаьой нь-к-шт

Нтс/Ш №пс/Щ Нмт*

и У Лслкм. Т »

» ! 6Э*

-1<|--—

ч

-в»

ш ........_

Л 6 8 680 402-

8^8

95Ъ

П. Вияьлеше ткшморфш сайтов нтенп б (шпли^щиромгошх

Лунки: I - маркерная ДНК, 2, 3- иех'ланкй ДНК агг, 4, 5,

6, 7 - доходный фрагмент, пиролизованннй Шгеаш I 4, 5 -

гетерозиготы по сайту, 6 (- -), 7 (+'.+) - гомозиготы по сайту.

случае имеется внутренний контроль на полноту расщепления амплифицировашюго фрагмента ДНК соответствующей рестриктазой, что исключает возможность ошибки. На рис.1 в качестве примера приведено определение Hmd in полиморфных сайтов в фетальных генах.

Амплифицируедае фрагменты фетальных вг и 'V-генов имеют длину 935 и 950 п.о. соответственно. После рестрикции при отсутствии полиморфных сайтов выявляются два фрагмента длиной 787 и 148 п.о. для г> и 848 и 102 п.о. для fV гена. При наличии полиморфного сайта рестрикции в этих генах должны выявлятся три фрагмента длиной 692-, 143, 90 п.о. для вг и 680, 168, 102 п.о. для 'Y-reHd (рис. I). Для Ava и сайта в /э-глобиновом гене исходный амллификат имел длину 329 п.о. После рестрикции при отсутствии полиморфного сайта выявляются фрагмента 266 и 63 п.о., при наличии сайта -фрагменты 214, 63, 52 п.о.

Участок wJ-гена и его 3 -область, включающие полиморфные сайты Hinc и, амплифицировали, используя праймеры, описанные ранее в /ми i íc«n*. з. ¡at ai., r-w/. Амплифицируемые участки имели длину 700 и 590 п.о. соответственно для у/э и 3 vp и не' включали в себя константные сайты рестрикции. После рестрикции получали по два фрагмента 360, 340 п.о. в случае wß и соответственно 470, 120 п.о. в случае 3 w?.

Изучение распределения некоторых полиморфйга сайтов ' рестрикции вдоль . кластера г?-глобиновых генов (частичных гаплотипов) преследовало две цели. Во-первых, выявлениэ сцепленных с мутациями гаплотипов, во-вторых, изучение возможности идентификации определенных Полиморфных сайтов рестрикции с использованием полимеразной цепной реакция для практической пренатальной ДНН-диагносгики /э-талассемий в Азербайджане.

Мы провели определение гаплотипов для 94 образцов ДНК больных и членов их семей и выявили в тех случаях, когда это можно сделать точно (71 хромосома), 16 различных гаплотипов, из которых 6 ранее в .изучаемой популяции не встречались (гаплотилы 5, 10, II, 12, 16, 17. Табл.1).

Обобщенные данные, полученные.нами и в работе /Лукьяненко A.B. 1990/ (Табл.1.), показывают, что первые пять гаплотипов

Таблица I. Распределение гаплотипов в взербайдаансхой популяции. <последовательность полиморфных сайтов рестрикции:

Hindl ll ГЬ, Hindi II ГА, HincII у/?, HincII \fr>3 , ftvall ß) .

Данные по 71 хромосоме получены в этой работе. Звездочками отмечены гаплотяпы обнаруженные впервые.

м Гашютшш Кол-во Кол-во Всего Классификация нормальных таласс. {%)

ХРОМОСОМ ' ХрОМОСОМ ПО Ork in

I. - _ _ _ + 27 26 53(39,8%) I или V

2 • + - + - 0 18 18(13,5%) IV

3. 9 4 13(9,75%) VH

4. + - + + + 6 6 11(8,25%) III или IX

Б*. + + + 3 4 7(5,25%)

6. + „ - - + I 4 5(3,75%)

7. + + - + - 2 2 4(3,0:?) Н (Индия)

•В. + + - + + I 2 3(2,25%) 11

9. + - - Г 0 3 3

10*. - - - + + I I 2(1,5%)

II*. - - - + - 0 2 2 4'(черноко2:.

12*. - + - ¥ I 1 2

13.' - - + - г 0 2

14. + + - _ - I I 2 vi

16. ' + - - - - а 2 2

16*. + - + I 0 1(0,75%)

17*. - + + + 0 I I

18. - - + + - 0 I I

19. - *- 4- + 0 I I

Всего: 133 (Ш)

являются наиболее частыми в азербайджанской популяции из 19 выявленных к сегодняшнему дню. Анализ гаплотипов обнаруживает три важные особенности: во-первых, гаплотип I доминирует по частоте встречаемости (39,8%), во-вторых, гагогагип 2 ассоциирован только с талассемическими хромосомами и в третьих, найдено Вольтов разнообразие гаплотипов, что мокет быть связано с гетерогенностью исследуемой популяции.

Данные по изучению гаплотипов в полных семьях позволяют сделать вывод, что проведете пренатальной диагностики по полиморфному сайту (или сайтам) возможно в 7 семьях из 1,4, _ в 6-и семьях полиморфные сайты полуинформативны, а в одной

семье предполагается ложное отцовство. Проведете пренатальной ДНК-диагностики по полиморфным сайтам в ПЦР-вариантах намного эффективнее и быстрее, чем пренатальпая диагностика с использованием других методов. В случае о неполными семьями (21 семья) проведение пренатальной ДНК-диагностики по полиморфным сайтам не представляется возможным из-за отсутствия ДНК одного из родителей, так как нет достаточной информации для дискриминации нормальных и мутантных аллелей.

Определение 2;талассемических здтощй прямым секвенированием по Сэнгеру с применением термостабильной ЩС^полимеразы. , Для определения нуклеотидной последовательности /з-глобинового гена и выявления возможных мутаций мы использовали метод Сэнгера с применением термостабильной ДНК-полимеразы. Этот подход обладает несколькими преимуществами перед двумя другими (метод Сэнгера с использованием ДНК-полимеразы фага Т7 и химический метод Максама-Гилберта). Во-первых, использование термостабильной ДНК-полимеразы позволяет проводить реакцию в цикловом режиме, что приводит к повышению утилизации праймера и к увеличению конечного сигнала на авторадиограмме. Во-вторых, данный метод позволяет обнаружить мутации у гетерозигот и компаундов в отличие от метода Максама-Гилберта где, из-за альтернативного чтения нуклеотидов трудно определить такие замены, как л-в и 1 Кроме того, высокотемпературный режим синтеза уменьшает

помехи, обусловленные образованием шпилечных структур.

Используя этот метод, мы выявили 4 мутации (уьс^/у, соснь, сосг>>. IV31-5), ранее не описанные в азербайджанской популяции, и две мутации (Fbint. ms22/л/24>, ранее не описанные в мировой популяции (см. табл. 2). Кроме того, Прямым секвенированием подтверждено существование мутаций, обнаруженных гибридизацией с АСО-зондами /Гольцов A.A. 1990/. В ходе работы найдены также молекулярные нарушения, ужа известные для азербайджанской популяции /doiovyev ь.Уа.

1940/.

Инсерция одного нуклеотвда между 8-м и 9-м кодонами приводит к сдвигу рамки считывания и образованию терминирующего кодона в районе 21-22-го триплета. Мутация fsc в/ч i+e\ впервые была описана в Индии, где она занимает 3 место по частоте встречаемости. В Мндаш данная мутация сцеплена преимущественно с i гаплотипом. В нашей выборке эту мутацию мы обнаружили у 13 больных в гетерозиготном состоянии. В четырех случаях эта мутация сцеплена с i гаплотипом, как и в Индии, а в остальных девяти случаях определение гаплотипов затруднено. Несмотря на то, что данная мутация занимает второе место по частоте встречаемости в Азербайджане, она ни разу не была выявлена в гомозиготном состоянии.

Мутации со.115 ( ü-a ! та. ivs i-s <g-a> впервые были обнаружены нами в азербайджанской популяции при проведении пренатальной ДНК-диагностики. Замена о-а в кодоне 15 превращает его в терминирующий и приводит к /з°-талассемии, в то время как аналогичная замена в 5 положении нитрона I связана с нарушением сплайсинга и вызывает /?+-талассемию. Эти мутации, как и мутация rsca/v, впервые были описаны в Индии. В Индии мутация ivüi-ü занимает первое место по частоте встречаемости и в основном сцеплена с гаплотипом viт (по urkin). Мутация codis в Индии встречается намного реже, чем ' две предыдущие, и сцеплена с гаплотипами i, п, vi 1 (го orkin). Мутацию ivs i-'o мы обнаружили три раза. В одном случае она как и в Индии сцеплена с гаполотипом vu, а в двух других выделить гаплотип, сцепленный . с этой , мутацией, затруднительно. Мутация в 15 кодоне встретиласьф трижды, в

Таблица 2. Частоты встречаемости различных /з-талассемических мутаций в азербайджанской популяции. Мутации, отмеченные звездочками, в исследуемой популяции найдены впервые.

Мутации Количество Количество Тип

хромосом(Ж) гомозигот талассемии

РБС 3 (-АА) . 35(33%) II /3°

8/9 (+0) 13(12,2%) — п°

14 <+Т) 1.(0,94«) — (Р

1 5 ( Гз-А) 3(2,82%) —

*шз 22/23/24 . I — /3°

* Сой 30 (В-С) I —

1УЗ 1-1 (3-й) 5(4,7%). 2 "

1-5 (В-С) 3 - —

1-6 (Т-С) I —

I 1—11и-(Ь-Й: 1 5 —

РБС 36/37 (-Т) I — <

Сой .39 (С-Т) 4(3,76%) • I П

РЭС 44 (-С) 3 I Р°

РБС 82/8 3 (-0) 3 • I Р°

1УЗ 2-1 (0*-А) 8(7,5%) 2

Не определенных 20(18,8»)

Всего: 106(100«)

одном случав достоверно и еще в одном предположительно она сцеплена с гаплотипом I.

В одном случае при определении молекулярных дефектов в /?-глобиновом гене, приведших к проявлению большой талассемии, в одном из аллелей была найдена мутация ksc а/9 t+ü>. В другом аллеле в канонической нуклеотидной последовательности на стыке I экзона и I интрона во втором нуклеотиде 30 кодона или в положении -I ivs i была обнаруиена замена в-с, которая с одной стороны превращает кодон agg (Arg) в acü (ihr), а с другой меняет структуру консенсусной последовательности 5 -нь gt сайта сплайсинга на ас gt.

Такой молекулярный дефект был впервые описан у больного /з-талассемивй из Туниса /смьаш i^wf. При более подробном изучении/ionzales-Redonto 198в/ аНОМаЛЬНЫЙ ГбМОГЛОбШ 30(S12)Arq- Ihr получил название Hb Monroe.

В ходе наших исследований были найдены две мутации, ранее не описанные в мире. Первая, это иксерция одного нуклеотида (Т) в 14 кодонэ, которая приводил к сдвигу рамки считывания и образованию терминирующего триплета в районе 21-22 кодонов, как и в случае с мутацией t-йь н/ч> (+ö). Это молекулярное нарушение встретилось один раз в гетерозиготном состоянии у больного большой ^з-талассешей. Идентифицировать молекулярное нарушение в другом аллеле не удалось. Вторая мутация, соз22/23/24, представляет собой делецию 7 нуклеотидов в районе кодонов 22-24 и при условии сохранения нормального сплайсинга долина приводить к образованию стоп-сигнала в области кодонов'60-61.

Прямым секвэнированием также были подтверждены мутации,, обнаруженные ранее гибридизацией с АСО-зондами /Гольцов A.A. 1990/. К числу таких мутаций относятся; >\,ч i-i, и»* i-ь. iv» u-i. Мутация гуз(-1 в мировой популяции встречается в двух формах: первая, это замена нуклеотида ь на н, характерная для Средиземноморья и вторая, это замена нуклеотида н на Т, характерная для Индии и Китая /. un-чг а. i--n,-,/. у больных из Азербайджана эта мутация относится к восточному типу. Наши исследования выявили двух носителей этой .мутации, одного гомозиготного больного и одного гетерозиготного, у которых эта мутация была сцеплена с тремя разными гаплотипами ( X 8.

10). Мутацию ivs i-6 удалось выявить только в одном случае, в гетерозиготном состоянии в сочетании с мутацией t-su о <-»>о). В дашюм случае обе мутации были сцеплены с гаплотипом 2. У четырех больных в гетерозиготном и у двух больных в гомозиготном состоянии идентифицировали мутацию tvs n-i. И только у одного гомозиготного больного можно выявить гашкшшы, сцепленные с этой мутацией (гаплотип 4, 5). В турецкой популяции эта мутация сцеплена с гаплотипом 4.

Деления двух А в 8-ом кодоне наряду о двумя другими мутациями (ud:-9 (с-т), fsc вг/вз (del ci) была списана в азербайджанской популяции ранее /saiovypv n.va. 1990/. В напем случае эту мутацию ми обнаружили II раз в гетерозиготном и 7 раз гомозиготном состоянии. К сожалению, пвм не удалось выявить все гашгатипы, сцепленные с этой иутацией. Однако полученные данные позволяют заключить, что преимущественно это нарушение .ассоциировано с гаплотипом по orí m (+ - + 4- -). в.З случаях (12%) найдено сцепление с гсплотшюм + — +■ - (азия Н). В двух случаях мы обнаружили сцепление к^оз с гаплотипом - - - - - . Последний вариант описан для турецкой популяции /опрг r. two/. ■

Нам впервые удалось описать ассоциацию руса<-А«) с гвплотипами + + - + - (один случай -4%) и + - + + + (один случай -4%).

В процентном отноиении доля мутации fs>cs в Азербайджане максимальна и составляет, по нашей выборке, 33'/. от всех мутаций.

Одна из наиболее частых в Средиземноморье ^з-талассемическгос мутаций, замена С на Т в 39-м кодоне, приводящая к образованию терминирующего триплета гas, обнаружена нами дважды в гетерозиготном состоянии. Ранее эта мутация была выявлена у больного большой /з-талассэмией из Азербайджана в Гомозиготном состоянии и была сцеплена с 9 гаплотипом. Одна из мутаций в 39-ом кодоне, обнаруженных нами, сцеплена с гаплотипом 9, а другая - с гаплотипом 8 (гаплотипом II по ori:in). Сцепленность мутации codс гаплотипом 8 характерна для Греции Дагагып н.н. 19ы4/ и Турции /üeaz-Chico .J. С. 17Ш/, а С ГЭПЛОТИПОМ 9 - ДЛЯ Туниса /Chiban i J. IVS9/ И Ливана /Chohab F.F. 1989/.

Мутация îvsI-IIO - ■ первая мутация, найденная в азербайджанской популяции в 1987 г. Лимборской С.А. с ооав. Среди наших больных четверо являются носителями этой мутации в гетерозиготном состоянии. В двух случаях из четырех она сцеплена с гаплотипом I.

H числу мутаций, которые били найдены в азэрбайджанской популяции ранее /Гольцов A.A. 1990/, относится и делеция одного нуклеотида (С) в 44-ом кодоне. Данную мутацию мы обнаружили у одного больного в гетерозиготном состоянии, у другого - в гомозиготном состоянии. В обоих случаях она сцеплена с гаплотипом X. Впервые зта мутация была обнаружена у курдских евреев в ассоциации с тем же гаплотипом Дт: м.

19П.у.

Молекулярные нарушения в /э-глобиновом гене, приводящие к /з-талассемиям у кителей Азербайджана, ■ суммированы в таблице 2, где сведены данные по выявлению мутаций в образцах ДНК, собранных А.В.Лукьяненко и А.Ф.Тагиевым /настоящая работа/. Некоторые молекулярные дефекты, выявленные ранее А.А.Гольцовым по гибридизации с АСО-зондами, подтверждены нами при прямом секввнировании амшшфлцированных фрагментов ДНК модифицированным методом Сэнгера.

Из представленных данных видно, что использованная стратегия позволила выявить более 80% всех мутаций, характерных для кителей Азербайджана. Можно предположить, что остальные мутации локализованы либо в третьем экзоне и прилегающих к нему областях, либо в более дальней Б -промоторной области, либо ассоциированы с так называемыми молчащими аллелями /Jonq ь.г. хчвч/. Ответить на этот вопрос должны дальнейшие исследования.

Полученные результаты свидетельствуют о явном преобладании в Азербайджане двух /?°-талассемических мутаций, fôi.oî-йа) и Fbca/9 (33% . я 12,2% соответственно). Среди мутаций, встречающихся с умеренной частотой, следует отметить ivbv-t, [vsi-i, iV0i-iu> и e.jrf.vi (от 3,76 до 7,5%). Остальные /э-талассемические нарушения в азербайджанской популяции весьма редки и встречаются в единичных случаях.

Интересно отметить два странных факта, связанных с мажорными мутациями; I) гаапотип 2 и- по un с которым

преимущественно сцеплена мутация fscs, ни разу не был обнаружен в нормальных аллелях, 2) ■ вторая по встречаемости мутация Fsca/^(+G). ни разу не встретилась в гомозиготною состоянии. Однако, для окончательных выводов необходимо значительно увеличить выборку больных и доноров.

Если проанализировать встречаемость ri-талассемических мутаций в Азербайджане по сравнению с Индией и Турцией то очевидно, что в индийской и турецкой популяциях есть только 2 общие мутации ivsi-i и ivsi-s, в то время как в Азербайджане встречаются мутации, характерные как для Турции, так и для Индии, причем некоторые из них доминируют (fscb, гы.в/9). Такая ситуация позволяет предположить, либо в Азербайджане имеется сильное этническое влияние обоих народов, либо были условия для сохранения этих мутаций в отдельных регионах.

Поскольку в Азербайджане всречаются мутации, характерные как для Средиземноморья так и.для Индии, моаио предположить, что в среднеазиатском регионе, по мере отдаления от

Средиземноморья, будут преобладать восточные мутации.

#

Пренатальная___даагностика____в____семье____с_____больным

&1§лассемией. Семья, обратившаяся по поводу пренаталыюй ДНК-диагностики, сначала была протестирована по пяти полиморфным сайтам, из которых только «va и сайг в /í-глобиновом гене был информативен на 60-/.. Результаты показали, что у больного ребенка и у отца этот сайт находится в гетерозиготном состоянии, а у плода и матери в гомозиготном состоянии. Исходя из этого, мокно было заключить, что плод является или гетерозиготным по одной из мут&ций, или здоровым. В дальнейшем ДНК чл'ейов семьи и плода секвенировали и обнаружили мутации coie¡'<g-a) и ivs i-s у больного ребенка, cois <G-A) У матери ребенка, ivs 1-5 си-а) у отца ребенка. Так как вышеназванные мутации у ДНК плода не выявялисьи, мы одели вывод, что плод полностю здоров й рекомендовали сохранить беременность. Гематологические обследование родившейся девочки подтвердило правильность.диагноза.

Рис.13. Пренатальная дианостика с помощью прямого секвенирования мутаций. Стрелками указаны точки мутаций.

•* " —

& т А С 6-Т

пяте ** . я»

■ £ м _

* Ш «к «„г"

РАЙОН с<*М5 РМ\0* 'ХУ^А-И

ВЫВОДЫ

1. О помощью праймер-зависимой амплификации ДНК m vitro проанализированы гаплотипы в семьях и у пробандов с /з-талассемией из Азербайджана. Выявлено S новых гаплотипов.

2. Успешно апробирован модифицированный метод Сэнгера о использованием термостабилышх полимераз. Секвенированы ДНК от 52 больных гз-талассемией.

3. Прямым секвенированием идентифицировано 14 различных мутаций, приводящих к /»-талассемиям в Азербайджане.

4. Мутации Fsce/9, Codis, Codso, ivsi-5 обнаружены в Азербайджане впервые, причем fscb/"? является второй по частоте встречаемости. •

5. Инсерция. нуклеотида Г в кодоне 14 (Fsci4), а также делеция 7 нуклеотидов (-aasttgg) в кодонах 22-24 (cos22/23/24) являются новыми, ранее на описанными в мире мутациями.

6. Анализ /?-талассемических хромосом кителей Азербайджана выявил преобладание /з°-талассемичэских мутаций. Найдено большое 'тело компаундов по мутациям (65%), что свидетельствуем о значительной гетерогенности данной популяции.

7. О помощью прямого секвенирования проведена практическая пренатальная ДНК-диагностика (З-талассемии. Правильность диагноза подтвервдена рождением здорового, ребенка.

Научные результаты отражены в опубликованных работах.

1. Гольцов A.A., Сурин В.Л., Тагиев А.Ф., Соловьев Г.Я., Мазурова О.Л., Кулиев A.M., Берлин Ю.А., Шварц Е.И. "Характер мутационных повреждений о-глобиного гена у больных /э-талассемией в Азербайджане". Тезисы 2-го Всесоюзного съезда медицинских генетиков, М., I990.CT.I0I-I02.

2. Лукьяненко A.B., Тагиев А.Ф., Соловьев Г.Я. "Спектр гаплотипов у больных /?-талассемией в Азерб.сср. Использование для пренатальной ДНК-диагностики" Тезисы 2-го Всесоюзного съезда медицинских генетиков. М. 1990.с. 268..

3. Соловьев Г.Я., Лукьяненко A.B., Тагиев А.Ф., Дадашева Т.е.. Рустамов Р.Ш. "ДНК-диагностика /?-талассемий. Использование ДЦРФ в семьях С пораженным ребенком". "Гематология и трансфузиология" 1990.10. ст.3-6.

4. Соловьев Г.Я., Сурин В.Л., Тагиев А.Ф., Лукьяненко A.B., Лебеденко Е.И., Плутвлов О.В., Берлин Ю.А., Гольцов A.A., Шварц Е.И. "Выявление tf-талассемических мутаций в Азербайджанской ССР". Тезисы I Всесоюзной конференции "Геном человека". М, 1990. с. 182.

5.Тагиев А.Ф., Лукьяненко A.B., А.А.Крутов, Г.Я.Соловьев. "Быстрое выявление полиморфных сайтов рестрикции в районе /J-глобиного гена методом полимеразной . цепной реакции для пренатальной ДНК-даагностики /J-талассемий' в Азербайджанской ССР".Тезисы доклада 2-го съезда гематологов и трансфузиологов Азербайджана, Баку, 1990, с.61-62.

Подписано в печать 27.01.92. Заказ 519

Формат 60x84/16 Тарах 100