Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Высшие базидиомицеты - продуценты тромболитических ферментов

ВАК РФ 03.00.24, Микология

Автореферат диссертации по теме "Высшие базидиомицеты - продуценты тромболитических ферментов"

НАЦЮНАЛЬНА АКАДЕМШ НАУК УКРА1НИ Гнститут боташки ¡м. М.Г.Холодного

На правах рукопису

АГУЖЕН Яна Геннадивна

ВИЩ1 БАЗИДЮМ1ЦЕТИ - ПРОДУЦЕНТИ ТРОМБОЛ1ТИЧНИХ ФЕРМЕНТ1В

03.00.24 - мжолопя

АВТОРЕФЕРАТ диссртацп на здобуття паукового стуменя кандидата бюлопчних наук

КиТв - 1997

Дисерташею е руконис.

Робота викоиана на кафедр1 ф1зюлогй' рослин Донецького державног о университету.

HayKOBi i<epiBHHKH - доктор бшлопчних наук,

нрофесор Негруцький Серий Федорович; кандидат бюлопчних наук, доцент Бойко Михайло Гванович.

ОфшпЬм опонснти - Лауреат державно! иреми,

--дикшр iMVKHVIhhx паук '

Солом ко Ельв1ра Федор1вна

доктор б'юлопчних паук,

профсеор Харченко Свгглана МиколаТвна.

Пров1дна оргашзацш - 1нститут мшробюлоги i BipycojioriT ¡м. Д.К.Заболотного HAH Укра'ши Захист в'1дбудсться "" /С6/ -ivi-n-c)' р. рЛ'' год, па зааданш спе1пал1зованоТ вченоТ ради Д 50.06.01 в IcTuryTi богат ки iM М.Г.Холодиого HAH УкраТни за адресою: 252601, КиТв - 4, вул. Терещенювська, 2.

3 дисертащею можна ознайомитися в б1блютещ 1нституту бо-ташки ¡м. М.Г.Холодиого HAH Укра'ши за адресою :252025, КиТв-25, вул. В.Житомирська, 28.

Автореферат розюланий " ¡.-С<-С'_ 1997р.

Вчсний секретар спешал1зованоТ вченоТ ради

кандидат бюлопчних наук ^—/¿^ 1льшська А.Г1.

3

ВСТУП

Актуалыпсть теми. Охорона та рацюнальне використашгя природ-них ресурсов, збережеиня генофонду та бюлопчноТ рьзпомаштпосп, пошук нових об'екпв бютехнолот для одержаиня харчових про-дуклв та цшних медичних препаратов - це найактуальнпш проблсми сучасноТ б'юлопТ, вирпиенпя яких мае сприяти прогрссивному ро-зиигку в!тчизняноТ науки. Гриби, I зокрема макромщети, як складо-[!,'! часпша природних бюлопчних систем, постають зараз важливим обЧ-ктом тсорстичних та прикладних д0сл1джепь. Вивчення фер-ментпих систем нищих базидюмшепв, що в1;играготь важливу роль у пропесах бюдсструкип рослипних матер1ал1в, ведеться у двох оспов-них нанрямках. Перший - тзнаппя фундамептальних процеав псрс-творення речовин у природ 1 та розробка хемотаксоном1чних систем ¡дептиф1кацп'грибов (Дудка, Вассер, 1980; Денисова, 1991; Даниляк и др., 1989); другий - використання вищих гриб1в у бютехнолопч-пих нроцесах як продуцента р1зноманшшх метаболтв (Соломко, Дудка, 1985; Бухало, 1988; Денисова, 1991; Белова, 1991; Псурце-ва и др., 1994; ЬатшБоп, 1976; Ка\уа1, 1973; М^Пек, 1981).

Виб1р бази/иалышх гриб1в як джерела протеТназ тромбол1тич-по1 дп пов'язаний з запитом практично! охорони здоров'я. Незва-жаючи на те, що сучасна медицина мае велию можливост1 щодо за-ноб^гання та лпсування тромбоз1в, ¡снуе щс досить багато невирше-пих проблем (Чазов, Лакин, 1977; Бокарев, 1992; Братчик, 1993). Внасл1ДОК активного пошуку тромболшнив серед р1зних груп органами? зараз активно використовуються продукта микробного синтезу, препарата, що отримують з донорсысоУ кров!, з медичних п'я-вок (Шатаева, Заикина, 1975; Демина, Лысенко, 1991; Баскова, 1995; Ма15исс1а, 1985; СЬепс1а1, 1985). За останш роки помшю ш-тенсифшувалося вивчення для цих щлей протеолп'нчних фермештв

гриСИв (Денисова, 1981, 1982, 1987, 1991; Фалина, 1980; Петрищев, Денисова, 1992). Однак, даннми дослщжениями охоплена хоч i численна, ало досить вузька груна оргатз\ив.

Мета i завдання досл1дження. Метою роботи було дослщжсппя иротсол'1Тич11их ферменпв базидшмщепв ф1брииолпично1, гс-мол'нично!, казеТнолт1чноТ та тромболшгаю'Г дм; вивчення закопо-Mipiiocreii успадкування ф1бришштичноТ активиосп, особливостей синтезу нроте'шаз тромболтгчноТ л»V та можлпиосп i'x використання для отримання лпсарських препаратов. При цьому були поставлен! таю завдання:

- встановити наявшеть ф1бринолт1чно1'. гомолЬншт" к-.ч-зс1Пол1тично1 та тромСкштичпоТ активное^ у бази/пальних гриб'ш з рКзннх систематичних груп;

- виявити особливосп успадкування фгбринолггпчноУ актив-'

nocTi;

- з'ясувати вилив умов культивуваиия на бшеинтез тром-(хштичннх фермептш;

- досл1дити особливосп динампш синтезу тромболтгчних ферментов;

- отримати ферментш препарат» найбьчьш активпих мродуцен-Г1В та вивчити Тх ф1зико-х1м1чш властивостк

Основш положения, що виносяться на захист:

- в рамках окремих систематичних груп гриб1в (pi/i, вид) В1Д-М1чено великий д'ишазон коливань фибринолтгаюТ, гемолипчноТ, казешолгшчноТ та тромболш1чно1 активностей;

- на ф1бриполпичну активность M0H0Kapi0iiiB Coriolus versicolor (L.ex Fr.) Quid, та Flammulina velulipes (Curt.:Fr.) Sing, адитивно впливають генетичш фактори сумюносп, причому, до Mi ну с нижчий показиик активносп;

- иезалежно вод умов культивупаипя (t°C, pli, склад ;кипильного ссредовища) максимальна тромболточна активность спо-стср!гаеться в пср10Д ексооопепопалыоого росту культур;

- висока тромболотичпа актпвшсгь та вщсутпость токсично'о дп визначають псрспектнвшсть ои/пбранпх культур Amyloporia tenis (Karst.) Bond, et Sing, та Tyromyces revolutus (fíres.) Bond, et Sing, як продуцентов тромболггичних фсрмептш.

Наукова новизна. Проведено поршняльне дослщжении ф1бропоол0тичноо, гемолшочпоо, казешолпичоюо, тромболотичноТ активное^ у 191 штаму 80 видов вищих базидюмщелв з порядоав Tricholomatales, Agaricales, Aphyllophorales, Aporpiales, серед яких 80% складаооть малопиогееом афЬ'оофоралып гриби - ксилотрофи штучпих i природннх иасаджень Допбасу. Впергае под час вивчення залежное^ рпшя фобринолотичнох' актипносл вод генстпчного статусу культурн встановлепо, оцо фактори cyMiciiocTi адоотивно впливають на показошк aicniBoiocTi. Отримаш водсутно panioiic дано про розподйо протеолточноо акгиrhoctí вшцих базидюмщетш у bí;uooooichhí до p¡3-поман'п'них болкових субстрат!в с нсрснсктивнимц для хемогаксо-iiomí'í гриб'ш дослоджених порядшв. У ряду найактивнпппх вид1в вперше дослщжена залежн'ость м1ж ровооем сноотезу тромболггичних ферменпв, накопиченням бюмасп та умовами культивува1шя. Вста-новлено, що соштез тромбол'отичпих фермепт1в мае два шки, i оцо основна маса тромбол'отичного ферментного комплексу видыясться в культуральне середовиоце. Вперше з культуральноТ р1дюни гриб1в Ceriporia subpudorina (PU.) Rond., Tyromyces revolutus (Bres.) Bond, et Sing., Amyloporia lenis (Karst.) Bond, el Sing., Irpex foliaceo-dentalus Nic., Hapalopilus nidulans (Fr.) Karst., Corticium roseum Pers., Phellinus igniarius (L. ex Fr. ) Quel, вп/илеоп фер-MeioTioi препарата тромболтншо'о дп, яко маооть декипжа оптимум'ю

рН-дп та вщпосяться до числа тсрмолабьчышх. Визначсна наявшсть под1биих 6'uiKODiix фракнш для ферментних iipcnapariB, одержаних з культуральних фьчыратш вказаних продуцеппв.

Практична цшшсть роботи. Вдабрано ряд персиективних культур як активиих продуцент) тромболпичиих фермеппв, серед яких Corticium roseum шт.М-20, Tyromyces revolutus шт.ВТ-92, ¡грех foliáceo- dentatus шт.Т-31 та in. Для прспара'пв, отриманих :¡ rpn6iB Amyloporia lenis та Tyromyces revolutus, встановлепа в1дсут-iricTb токсичности що створюе можлив!сть подальшого íx викори-стання у мсдицшп. Дснопований у колекцно чистих культур Ihcth-

■i-уту fir.T-.iinT/-n iv. HrY„,n11,nm 1ТЛТТ Л Г irp „У.,.. ■■■■■■■ ■ ■ ТГПП'1 | С

Amyloporia lenis е псрспективпнм для отриманпя нового тром-6ол1тичного препарату.

Лпробащя роботи та публжацн. Ochobhí положения дисерта-niihioi' роботи викладались па копференцп молодих вчених "Актуалып цроблеми фЫологп рослин та генетики" (Kh'ib, 1996), паукових конферешцях ДонДУ (Доисцьк, 1993-1995); Все-украТнських студентських коцферсифях (Допецыс, 1992-1995).

У завершеному uapiairri дисертафя догювщалась на засщапнях кафедри ф1зюлоги рослин ДонДУ та вщдшу мжологи 1нституту бо-TauiKn ím. М. Г. Холодного IIAfí У крап ш.

За матер1алами дисертацп опублпеовано 13 po6ir.

Структура ¡ обсяг робота. Диссрпиня викладена на 176 CTopiiiKax та складаеться ¡з вступу, 5 роздЫв, обговорення результат'! в, bhciiobkíb, списку Л1тератури, додатку; ¡люстрована 26 табли-цями та 51 малюнком. Б1блюграф1чний покажчик тстить 304 дже-рела, в тому числ! 110 - жоземних автор1в.

Роздьт 1. ПРОТЕОЛ1ТИЧН1 ФЕРМЕНТИ ВИЩИХ БАЗИДЮМ1ЦЕТ1В (Огляд л!тератури)

За останш роки зпачно розширилися дослщження культур ви-щих 6азид1алы1их rpufiíB для бютехполопчних щлей (Дудка, Вас-сср, Бухало, 1978; Соломко, 1985; Соломко, Дудка, 1985; Бсккср, 1988; Бухало, 1988; Даниляк и др, 1989; Безбородом, 1991; Псурце-ва и др., 1994; Lamaison, 1976; Musilec, 1981). Основпа сфера Vx використання - одержапня харчових та кормових продуюпв (Бухало, 1988; Rajarathnam, 1992). Поряд з ним, воло/иючи потужними фер-ментиими комплексами (целюлаза, ксиланаза, пектиназа, протсаза, декарбоксилаза, лпчпшаза та in.), здатними до розкладу bcíx комио-iiciiTiii рослинного субстрату, дереворуйшвш базидюмщети викри-вають iiobí перспективи для Тх використання. Так, щ гриби дозволяют!) отримувати рЬномантп niiiiii rexniMui та очшцеш ферментш препарати для потреб альського господарства, харчовоТ га легкоТ промисловослч, медиципи (Денисова, 1982, 1990; Семичаевский и др., 1984; Бойко, Ыегруцкий, 1985, 1989; Соломко, Дудка, 1985; Гапдбаров и др., 1986; Musilec, 1981). Особливу увагу дослиниюв привертають протешази базидюмщет!в, як! у tropiBHJiiiní з про-теолггичпими ферментами пижчих rpiióin внвчеш недостатньо. Одною з найважливпипх кагсторш прогеолпичних ферменпв у зв'язку з Vx медичним призпачеиням е ф1бринолпичн1 ензими. Bci шдом! в наш час мнеробш протеази прямоТ тромбол'ггичноТ ди, яю bh/iüichí i дослужен! in vivo, руйнують не лише ф1брин, а й inuii бшки нлазми KpoBi. Вони TOKCH4HÍ, бо, розщеплюючн ф1брин, утворюють речови-ни, що мають нподливий пилив на oprani3M людини. Це обумовило подалыпнй пошук нових нерспективних oprani3MÍB, що виробляють ферментн тромболт1ЧноТ та ф1бринолпично1 дй' для медичних шлей, зокрема, серед нищих базид1алышх грибов (Фалина, 1970;

Фалина и др., 1978; Денисова и др., 1980; Петрищев, Денисова, 1994; Elo et al., 1953; Veselsky, 1960).

Роздш 2. ОБ'еКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛ1ДЖЕННЯ

Объектами дослщжешш був 191 пггам 80 вид1в базидюмщелв з порядшв TricholomaLales, Agaricales, Aphyllophoralcs та Aporpiales. Гриби з порядюв Tricholomatales та Agaricales розташоваш »¡дпо-в'|дно до класифпсацшпоТ схеми, приииятоТ у "Визначнику rpn6iis Укра'ши" (Зерова, 1979). Аф|лофоралып гриби розташоваш вщпо-вщпо до системи трутових гриб1в М.А.БопдарцевоУ (1983) та В.Юл1ха (Jülich, 1984). У робов використовувались чисп культури, Dii/íi/iciu з нлодових tí л на кафедр! ф!зюлогй" рослин ДонДУ.

4hctí культури базидшмщеттв вирощували поверхпсво при температур! 26°С на сусло-arapi, сусло-псптонному ссредовини, се-редовивп Норкранс (Бухало, 1988), на глюкозо-пептонному середо-вшщ (Маттисоп,Фалина, 1973).

Ф^риполпичну актившсть (ФА) визначали за методом Астру-па i Мюллертца (Astrup, Mullerts, 1952), гемол1тичну актившсть (ГА) - за ступеней проантленпя кров'яного агару (Егоров и др., 1971; Методы..., 1982), казе'шолгшчну актившсть (КА) - за ступеней нросв1тлеппя молочного агару гид час росту гриб'т (Касаткина и др., 1969; Егоров и др., 1971; Методы..., 1982; Venables, Watkinson, 1989; Klan, Baudisova, 1990), громболпичну актившсть (ТА) визначали за методом 1мшенецького i БроцькоТ (1969). Bmíct бш-су визначали за методом Бредфорда (Bredford, 1976). Фсрментш препарата отримували фракщонуваниям сульфатом амонно (Броновицкая, Горстов, 1967). Електрофоретичний розд1Л б1лк1в проводили в пара-лельних пластинках у пол'1акрилам'1дному гсл'1 (Сафонов, Сафонова,

1969; Сафонов, Сафонова, 1971; Маурер, 1971) у прилад1 кон-струкцп К.А.Трувеллера та Г.Н.Нефедова (1974). Отримаш результат» статнстично оброблеш за загалыюприйнятими методиками (Адлер, Маркова, 1976; Лисенков, 1979; Лакин, 1980; Максимов, 1980; Методические указания, 1992).

Роз/Мл 3. НОШУ К МОЖЛИВИХ ПРОДУЦЕНТ1В IIPOTEÍHA3 МЕДИЧНОГО ПРИЗНЛЧЕННЯ СЕРЕД ВИЩИХ БАЗИДЮМ1ЦЕТ1В ГПд час дослЬчження 191 штаму 80 ни/ив бази/иалышх rpnöiß штучпих i природних насаджень Донбасу встановлет ноказники ф1бриполп-ичпоТ, гемолтг-шоТ, казеУнолггичноТ активностей при культивуванш на агаризованих середовищах. Pi.3ni piüni ФА вщ-тчет у нереважноУ ú'uibiuocTi культур дерепоруйшвпих базпдю-míhctíb (99%). Причому, iiaiiaiaTiBHiini штамп (ФА бьтьше 900 мм2) становлять 16.2% в1д числа досл'щжуванмх культур. Серед гриб'т лорядкш Tricholomatales та Agaricales, що належать до групп по-рядк1в пластинчастих rpnóin, пайбьтын активш иродуцентн належать до biwíb Pamts t.igrinus, Lentiniis vulpinus, Flammulina velutipes, Oudetnansiella macida, Tricholoma porlentosum, Agaricus campestris, Pholiota adiposa. Серед афьтофоралышх rpnóÍB активними продуцентами ф1бр1Шолпичних ферм cutí в е штамп гриб'ш Cnrticium roseunu Schizophyllum commune, Hapalopilus albo-luteus, Irpex lad cus, Amyloporia lenis, Lenzites betulina, Hirschioporus alba, ll.vaginala, Piptoporus bctulinus, Sparassis laminosa, Aporpium can-cscens. Гриби 3 високими значениями ФА знаходились в родинах Schizophyllaceae, Polyporaceae (шдродина Tyromycetoideac i Trametoidcae).

ГПд час дослцрксння залежносп ФА bí/i генетичиого статусу на приклад1 штама МН-10 гриба Oudcmansiella mucida (Schrad.:Fr.) Hochn.; штама KT гриба Flammulina vclulipcs (Curt.:Fr.) Sing.; штама ЗБ-З гриба Coriolus versicolor (L. ex Fr.) Quel.; штама D-118 гриба Sparassis laminosa Fr. остановлена значна внутрнитамова дис-nepcin показ'ник1в ФА. Дисперсшинй анал*13 рсзультатш показав на-HBiiicTb в'фопдних шдм'ш м i ж монокарштичппми культурами, що ог-pjtMaHi В1д одного батьювського штаму. Ашипз ФА монокарютв тетраполярних вид1в Flammulina vclutipcs i Coriolus versicolor, об'еднаних в групп з однаковими алелями сумкносп (рис. 1-2) показав иаявшсть в1ропдних вшмш лише .\пж AjB) та А9В9 генотипами. Иор1вня1шя груп MOHüKapioHÍB, об'едшших за ознакою загального А чп В фактору виявило, що не iciiyc. Bipori/iinix bí/imíh шодо ФА mí>k Afra A-¿, а також млж В)Та В2 трупами, що св^дчить про адитивний вплпв фактор'ш cyMiciiocTi на дану ознаку. Причому в цих виггадках домшуе нижчий показник. Шляхом схрешеппя MOHüKapioHÍB вказа-них rpn6¡B отримаш дпеарттичш культури. Пор1Внялышй ашшз ФА моно- та дпеарютичпих культур показав В1дсутшсть шропдних в'1д-мin mí>k середшми показпиками монокарютв та дпеарюшв. Мопо-Kapioiin можна вважати вщправною базою для проведения селекцш-Hoí роботи, а визпачеиня алельноТ конституцп гриба за факторами cyMicHocri с нажлшшм для втримання культур, стабишних за ознакою високоТ ФА.

Дослщжеиня гемол'|тичних властивостей базидюмщет^в з'ясувало значш коливання piBim ГА. При нор1внянш отриманих значень з ГА нижчих rpnóiB (Егоров и др., 1971; 1979) встановлено, що базидюмщети меиш з дат ni розчиняти еритроцити. Вщсутшсть кореляца М1ж ФА i ГА дозволяе говорити про перспектившсть ви-щих 6азидюмщет1в як продуцент) ферментних комплекав медичио-

ФА, мм2

600 т Л] Hi {

500

300

200

Л, В 2

л2в, л2в2

1 2 5

3 4 10 11 12

7 8 13

6 9 К

монокарюни

Рис. 1. ФШринсш'гичпа актившсть монокарнмпв гриба Coriolus versicolor, К - ФА батыивеького штаму ЗБ-З

ФЛ, мм2 1000 т Л, В,

900 800 700 600 500 400 300 200 100 ..

0

л,в

,и2

л2в,

i

8 10 11

2 7 12 13

мопок.'фюни

Рис. 2. Ф)бринолгшчна актившсть M0H0i<api0iiiB гриба Flammulina vclutipcs, К - ФА батыавського штаму КТ

I

го призначення. Винчен ня казсТнолгшчпих власти воете й rpn6iB до-сльтжуваних порядков тдтвердило здатшеть nie'í групп ор-raiii3MÍB синтсзувати протеТнази, активш щодо казсТну молока. Причому, також bí;im¡4chí значш коливания ршня КА в межах окре-мих систематичних одиниць.

ГПд час дослщження ТА у 109 штам'ш 69 ви/ив встановле-но, що здатшеть синтсзувати протеТнази тромболтгаюТ дп характерна для вищцх бази/иалышх rpn6in. Лише 14.7% екснерименталь-них культур не виявнли ТА. Пор1внииня ТА у представишь в pi3nnx систематичних груп з'ясувало, що серед гриб1в порядк'н! Т richolomatales i Agaricales особливии ¡птерес викликас родина Trícholomataceae великою юльюстго активних nnaMiu та високим piBiieM ТА. 3 афшофоралышх гриб'1в винбраш культури Phellinus igniarius iiit.B-050, Steccherinum ochraccum шт.ВР-92, hionotus obliquus шг.Н-172, Corticium roseum шт.М-20, Tyromyces revolutus шт.ВТ-92, Irpex lacieus шт.М-253, I. foliaceo-dentalus lht.T-31, Hapalopilus nidulans шт.ТЧ-02, Piptoporus belulinus шт.ББК-93, FomiLopsis pinícola шт.Лип-2, Amyloporia lenis шт. KB-92, Ceriporia subpudorina шт.СВ-09 як aKxiiBui продуцента тромболгшчпих фер-MeiiTÍB.

Розд1л 4. ВПЛИВ ДЕЯКИХ ФАКТОР1В НА БЮСИНТЕЗ ТРОМБОЛ1ТИЧНИХ ФЕРМЕНТ1В I PICT ПРОДУЦЕНТ1В

Шд час вивчепня динампси синтезу тромболточних фер-mchtíb (рис. 3) з'ясовано, що для б0лыносто культур характерно два niKii aKTHBHOCTi. Встановлено, що осповна маса протеТназ тром-болточноТ дп видшяеться в культуральну р1дину тд час активного росту rpiióiB. Визначення максимально! швидкост1 росту та синтезу фермент0в у експопенщалыпй фаз1 росту показало, що для

Рис. 3. Динамжа ТЛ (A) i накопичення бкжаси (■) штамйв: а - ТЧ-02 (Hapalopilus nidulans); 6 - Т-31 (Irpcx foliaceo-dcntatus); в - Лип-2 (Fomitopsis pinícola); г - К-201 (Panus tigrinus)

¡lapalopilus niditlans максимальна швидккть синтезу тромболпич-ннх фс-pMeiiTÍB pmax ТА дор1внк>е 0.011 год."1, а час подвоепня иоказ-ника ТА й=7.38год.; для накоппчсння бтмаси ртах=0.0938 год."1 а g=63 год. У Irpex foliaceo-dentat.us цтах 0.0742 год.1, g=9.336 год., для росту ртах=0.0128 год.1, a g=54.14год. У Fomitopsis pinícola Иша.ч ТА дор'тнюе 0.01ГОД."1, g=69.3 год., для росту рш;1Х^0.03 год.1, a g=23.1 год. У Panus iigrinus pmax росту - 0.047 год."1, g=14.74 год., для ТА ртах=0.067 год. "1, g=10.34rofl.Ilifl час шшчешш впливу умов культнвування на синтез тромболггичних фермента i picT активпих продуцентов Panus iigrinus. Corticium roseum, Tyromyces revolutus, Steccherinum achracrum Irpnv /^^-„о-Л^../,,;,,,^ n...'„

subpudorina, Hapalopilus nidulans, Phellinus igniarius, Amyloporia lenis встановлено, що найактивнмпий picr i найвища TA crto-стер1гаеться при температур! 28 32 °C i ночаткових значениях pH у межах 3.5-4.5.

Випробування придатност1 трьох живильних середовищ для синтезу тромболтшпих фермигпв з'ясувало, то найпридатннними е .середовшца, що мютять оргашчнс джерело азоту (пептон). Винчения ¡ндукцн протеолпично! активносп гриба Amyloporia lenis шт.КВ-92 джсрелами азоту, вуглсцю та cipKii виявило, що синтез нротеТназ йде ■пльки за наявносп оргашчпого азоту. СтимулюючоТ дй' джсрел вуглсцю та cipKH на бюсиитез не встановлено. При використанш pi3HOMaHÍTHiix джерел вуглецю з'ясовано, що досл1Джуваш гриби добре ростуть та сиптезують тромбол!тич1п фсрмснти pisHoí актив-iioctí па bcíx досл1джепих сполуках.

Розддл 5. ОТРИМАННЯ I ХАРАКТЕРИСТИКА ФЕРМЕНТНИХ ПРЕПАРАТ1В ТР0МБ0Л1ТИЧП01 ДП Фермснтш препарата семи иайактивнипих rpnöin Ceriporia subpudorina СВ-09, Tyromyces revolutus BT-92, Amyloporia lenis KB-92, Irpex foliacco-dentatus T-31, Ilapalopilus nidulans ТЧ-02, Corticium roseutn M-20, Phellinus igniarius B-050 отримаш шляхом фракцшного осадження бшав сульфатом aMoniio. Вопи мають добру розчиншсь у вод1, забарвлення в1д свггло-кремового до коричневого залежио в1д продуцента. Для них ферментних upenapaTiB ТА, ню виявлена у фракшях, яю [йдповщають 40-80% пасичеиня, при в1дпов1дних коннентрашях (>0.5%) иеревищуе активтсть лжарського препарату ф1бршгол1зину. Макеималып значения ТА в1дм1чеш у npenapariB, одержаних при 60-80% иасиченш культу-ральних ф1льтрат!В арчанокислим амотем.

Встановлсно, то отримаш тромбол1тичш нрепарати виявляюгь активтсть плазмпювоУ, а не активаторноУ дй". Вопи по термоста-бЬтып i Тх терм1чна денагуратя наступав вже при 50-70 °С залежпо в'1Д препарату. Iii нрепарати е комплексами фермснпв з piaiiiiMii оп-тимумами рН-дп. Дистильована вода або фшюдопчний розчии по-pi3iioMy впливають на активтсть ферментних прснара'пв залежно шд продуцента, що можпа гтояспити inriöyroworo /иего юшв хлору чи naTpiio па бшки.

Методом електрофорезу в п о л i а к р и л а м i д i г о м у гел i встановлсно наявтсть у Bcix отриманих препаратах бьткт з одпаковою електро-форетичною рухлшистю. При nopißiuinni фракшй, одержаних при pi3HOMy насичешп сульфатом амотю кульгуралыюУ pi/uiiin гриба Amyloporia lenis КВ-92 пайбшьше число сшлышх бшав вщм'тено для фракцш 50 i 60%, для 60% i 70%. А найбыыпа кишюсть сшль-них фракций з ф!брин<шзином вщм1чена у ферментних препаратов,

яш були огримаш при 50% 1 60% пасиченш (рис. 4). Пор1внялышй анал¡я даних електрофорезу препаратов,отриманнх з р1зних продуцентов (рис. 5) показав наявшсть зпачноУ кшькослО стлышх фрак-цш. Для всОх прспарат1в, за вннятком ферментного комплексу СогИсипп гоаеит М-20, встановлеш спшып фракщУ з ф!бринол13и-ном, що може аидчити про наявшсть но плысп стлышх функц'ю-налышх рис, а й схожостО в побудов! бшсових молекул гриб1в '1 тва-рин.

Ферментш препарати з Ату1орог'ш 1егт, Туготусе& revoli.ilих пройшли токсиколопчш випробуваипя. Встановлено, що нрсиарати-фермеппв, вщповшю до класнфп<ацп пдролтнших фермеитпих препаратов мпфобюлопчного синтезу, належать до малонсбезпсчних (4 клас), або до таких, що не викликають будь-яких ознак штокси-кац'и. Це дозволяе иродовжити дослщжсння назваиих фермеитпих комплекс!]!, вивчення Ух властивостей, вцшрацюванпя технолопУ одержання цих препаратов з високим стуценем очищения.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТЮ

Таким чином, проведеш дослщження показують иерснектишнсть пошуку активних продуцента! тромболпичних фсрмснпв серед вищих 6а-зид!альшгх гриб1в. Вшбраш штамп з високою протеолгеичною актившстю можуть бути використаш в фотсхпологн, тому що дереворуйшвш ба-зидюмщети к непатоген ними для людипи, характеризуються в1дсутшстю спороношення в культур'1 '1 здатшетю досить швидко зростати на дешевих та доступних живильних середовищах. Огримаш результата дозволяють рекомендувати дослщй культури вищих афшофоралышх гриб!в як про-дуценпв тромбол'1тичних фермеитпих комплексов для широкомасштабного вивчення I офимання медичпих прспарат'1 в.

0.18

0.31 0.40

0.56 0.73

0.18 0.30

0.23

0.45

0.65 0.80 0.90

20%

30%

40%

50%

60%

70%

80%

90%

100%

Рис. А. и Схема електрофорсграм фракцш тромболтпшого препарату гриба Лту!оропа 1етз КВ- 92. отриманих при р1зному насичемш сульфатом ачожю

0.08

0.21

0 28

0.37 0 45

0.59 0.73

0.88 0.95

0.08 0.08

0.17

0.23

0.28 0.44

»3 0.35 ш

ю

0.55

0.59 0.64

0.64

щ

0.85 0.82

0.92

0.95

0.07 0.17

0.28 0.36 0.43

0.601

0.80 0.92

0.07 0.17 0.23

0.32 0.42 0.53 0.64

0.76 0.88

0.07 0 01 г.тпт

0.17 0.17

0.23

ЯП 0.32 0.37 0.32 0.40

шш

0.49 0.53

0.60

0.64

0.71

0.73

- 0.80

0.91

Рис. 5 Схема електрофореграм тромболпичних мреиарапн, отриманих з нищих базидюмщепи при 80% насичеиосп сульфатом амошго:

1 СогШлшп гояешп М-20, А Сепропа 5иЬри<1огта СВ-09,

2 НараЬрПиэ П1с1и1ап8 ТЧ-02, 5 РЬеНтив 1йП1аг1\15 В-050,

3 1грсх ГоНассонЛег^аЫз Т-31, 6 Tyromyc.es геуо1и1и$ ВТ-92,

К - ф1бр1ШОл13Ш1

ВИСНОВКИ

1. Проведено пор1вняльнс вивчення синтезу протеол^тичних ферменпв pi3iioro спектру дп у 191 штаму 80 вид1в нищих базидю-мщепв з поря/иов Trichalomalales, Agaricalcs, Aphyllophorales, Aporpiales. Встановлено, що в межах окремих систематичних труп rpii6iB (р1д,"вид) cnocTepiracTbcfl великий д1апазон коливапь ф1бри-нолггичноТ, гемолггичпоТ, казепиъ'нтичпоТ та тромболггичноТ активность

2. 8'ясовано адитивний вплив фактор'1в cvmíchoctí на ф1бри-иолгшчну актнвтеть монокарюшв тетраполярних вид!в.

Шд час скршпнгу b¡/ü6paiio ряд активних продуцец-пв екзо-

проте'шаз тромбол'гшчпоТ дП' для можливого використанпя в медицин!, в тому числ1 Coriicium roscum М-20, Tyromyces revolutus ВТ-92, Irpex foliaeeo-dentatus Т-31та in., здатннх л1зувати тромби KpoBi людини i зберп^ати стабишшсть nie! ознаки при численпих пасажах.

4. Вперпге визпачепа максимальна швидккть синтезу тром-болп'ичпих фермент'ш цюах, що дор[вшое -для Panus tigrinus К-201 0.047 год."1, для Hapalopilus nidulans - 0.011 год."1, для ¡грех foliacco-deniatwi - 0.074 год."1, для Fomitopsis pinícola - 0.010 год."'. Максимальна тромболтипа актившеть мае Miene в перюд скспо-ненщального росту культур, для 6шылос.т1 яких притамапно два niKn бюсинтстичноУ активность

5. Для активних продуцмтв: Ceriporia subpudorina, Hapalopilus nidulans, Phellinus igniarius та in. оптималып ф'юико-XÍMÍ4HÍ умови культивування для синтезу ферменпв тромбол'ггичноТ дп становлять: температура 28-32 °С i початков1 значепня pH в межах 3.5-4.5 залежно в1д виду гриба.

6. Встановлено, що дос.л1джуваш культури а дани використову-вати pi3iii сполуки вуглецсвого живлепня: глюкозу, ксилозу, фрук-

тозу, лактозу, мальтозу та ш. для синтезу тромболпичних фермспт1В 1 накопичення маси мщслпо. Мспш прндапшми були ¡нозит 1 машт. 3 ус1х випробуваних джерел азотного живлспня найбишш придатиий був пептон в копцентраци 5-10 г/л.

7. Вперше з афьчофоралышх грнб!в Ату1оропа 1етз КВ-92, СогИсгит гохеит М-20, Туготусе,ч геиоШт ВТ-92, Иара1орИия пгНикгт ТЧ-02, Сспропа тЬрийогта СВ-09, ¡грех [о1 ¡ассо-(1сп 1а1. их Т-31, РкеШпи-ч гдтапи$ В-050 отримаш комплекан ферментт препарата тромболтггиоУ дп, яга пиявили зиачний р1вснь тромбол1тич-ноУ активносп, що при деяких концснтращях псревшцуе актившсть ф1бршюл1зину - единого промислового тромболпика, що вироб-ляеться в Укра'пп.

8. Комплексне дослщжеипя ф1зико-х1м1чних властивостей препарапв показало Ух термолабшипсть (втрата властивостей при нагршанш до 50-70 °С); наявшсть деюлысох оитимум1В рН у кислому 1 нейтральному середовищах. Для вах препара-пв встаповлемо паявп'|сть сшлышх бшсових фракции

9. Як псрспсктивш для иодалыного вивчення ф1зико-х1м1чних особливостей 1 отримання гомогенного тромбол'|тичного ферменту рекомендован! культури нищих базид1альних гриб1в АтуЬропа ¡етт, СогИсгит го$вит, Туготусез гегхЛиЫя, Нара1орИш ггШи1ап.ч, Сспропа $иЬри<1огта, ¡грех /оИасео-(1сп1а1и$, РЬсШпт гдтаггиз. Отримання ферменту у кристал1чному сташ вщкривае перспсктиви для розробки бютехполопУ виробництва пових иромислових тром-болтпив.

Голопш нублжацн за темою дисертацп:

1. Негруцкий С.Ф., Бойко М.И., Агужеп Я.Г., Агаркова И.В. Тромболитическая активность кульгуральпых фильтратов некото-

рых базидиомицетов // Философские и естественно-научные аспекты антропологии,- Санкт-Петербург-Донецк, 1992,- С. 113-116.

2. Сухомлип М.Н., Нсгруцкий С.Ф., Лгужеп Я.Г. Некоторые физиологические особенности гриба Flammulina vclutipcs (Curt.: Fr.) Sing. // Успехи физиологии и биохимии растений: Межвуз. сб.- Днепропетровск: Изд. ДГУ.- 1996.-Вып. 1. - С. 25-31.

3. Сухомлип М.М., Агужеи Я.Г. Деяю ф1зюлопчж особли-BocTi моно- та дикарюшв rpi6a Coriolus vcrsivcolor (L.:Fr.) Quel. // Украшський боташчний журнал,- 1996.-N 6,- С. 727-733.

4. Агужеи Я.Г. Тромболитическая активность базидиомицетов из порядка Aphyllophorales // Устойчивость растений к стрессовым явлениям / Донец.ун-т.- Донецк, 1995.- С. 160-164.- Деп. в ГНТБ Украины 03.01.96, N 21-Ук96.

5. Агужен Я.Г., Стадничук В.М. О тромболигической активности гриба Partus tiyrinus // Устойчивость растений к стрессовым явлениям / Донец.ун-т.- Донецк, 1995.- С. 154-159,- Дсп. в ГНТБ Украины 03.01.96, N 21- Ук96.

6. Агужеи Я.Г. Получение ферментов тромболптического действия из дереворазрушающих грибов //6 Коиференцш молодих вчених "Актуалым нроблеми ф1зюлогп рослин i генетики" (КиТв, жовтеиь 1996): Тез. доп. - КиТв, 1996. - С. 121-123.

7. Негруцкий С.Ф., Бойко М.И., Агужен Я.Г. Фибринолити-ческая активность культуральных фильтратов базидиальных грибов // Вузовская научная конференция профессорско-преподавательского состава по итогам научно-исследовательской работы: естественные дисциплины (Донецк, ДонГУ,апрель 1993): Тез. докл.- Донецк, 1993.- С.73.

8. Агужен Я.Г. Гемолитическая активность грибов-базидиомицетов //Вузовская научная конференция профессора«)-

преподавательского состава по итогам научно-исследовательской работы: естественные дисциплины (Донецк, апрель 1993): Тез. докл.-Допецк, ДонГУ, 1993.- С.77.

9 Агужеп Я.Г. Культура Hapalopilus nidulans ТЧ-02 - продуцент тромболичсских ферментов // Вузовская конференция профессорско-преподавательского состава по итогам научно-исследовательской и методической работы: химия, биология (Донецк, апрель 1995 ): Тез. докл.- Донецк, 1995.- С. 93.

Лгужен Я.Г. Высшие базидиомицегы - продуценты тромболи-тичсских ферментов. Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологичеких наук но специальности 03.00.24 - микология. Рукопись. Институт ботаники им. Н.Г.Холодного, Национальная академия наук Украины, Киев, 1997.

Изучена фибриполитическая, гемолитическая, казсииолитиче-ская и тромболнтическая активность у 191 штамма 80 видов бази-диомицетов из порядков Tricholomaiales, Agaricales,

Aphyllophorales, Aporpiales. В пределах отдельных систематических единиц (род, вид) наблюдаются широкие колебания уровня изучаемых активностей. Установлено, что факторы совместимости аддитивно влияют па фибринолитическую активность монокариопов тстраполярпых видов. В ходе скрининга отобран ряд культур, перспективных для получения тромболитических ферментов среди которых Corticium roseum, Ту готу ces revolutus, Irpex foliacco-dentaLus и др. Для них определена зависимость между синтезом тромболитических ферментов, накоплением биомассы н условиями культивирования. Из культуральной жидкости семи наиболее активных штаммов афиллофоральных грибов получены препараты тромболитиче-ского действия. Определены их некоторые физико-химические

свойства. Для тромболитичсских ферментов, полученных из грибов Amyloporia lenis и Tyromyces revolutus показано отсутствие токсичности, что открывает широкие перспективы их применения в медицине.

Ahuzhen Y.G. Hagher Basidiomycete - producers of trombolytic enzymes. Pli. D. Thesis. Speciality 03.00.24 - mycology. M.G.Kholodny Institute of Botany. National Academy of Sciences of Ukraine, Kiev, 1997.

The research of the fibrinolytic, haemolytic, caseinolytic and trombolytic activity of the 191 strains of the 80 genera of the orders: Tricholomatales, Agaricales, Aphyllophorales, Aporpiales are tultilled.ilie wide lluctuation ot tlie investigated activity level within the separate systematic units (genus, species) arc observed. It is established that the factors of compatibility influences additively on the fibrinolytic activity of the monocarions of the tetrapolar species. Ill screening a number of cultures, perspective for receiving the trombolytic enzymes is selected. Among them there are Corticium roseum, Tyromyces revolutus, Irpex foliaceo-dentatus and others. The dependence between the synthesis of the trombolytic enzymes, the accumulation of bioweight and condition of the cultivation is determined for them. The trombolytic preparations from the culture liquid of the most active seven strains are received. Some of their physic-chemical properties are determined. The tocsic absence for the trombolytic enzymes received from fungi - Amyloporia lenis and Tyromyces revolutus is shown. It opens wide perspectives for applying them in medicine.

ICniQ40Bi слова: винц базщпальж гриби, ксилотрофи, ферментш системи, протеолтиш ферменти, тромбол1тичш ферменти.