Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes"

У^и! На правах рукописи

Русинова Татьяна Витальевна

Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами

рода Тгаше1е8

Специальность 03 00 23 - биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата технических наук

Москва -2007

003059396

Работа выполнена в Московском Государственном Университете инженерной экологии

Научный руководитель кандидат биологических наук

Е С Горшина

Официальные оппоненты доктор химических наук, профессор

АП Синицын

доктор технических наук, профессор С Е Строгов

Ведущая организация ОАО ГосНИИ биосинтеза белковых веществ, Москва

/лЗО

Защита состоится « 29 » мая 2007 г в часов на заседании диссертационного совета ДМ 212 204 13 в РХТУ им Д И Менделеева (125047 Москва, Миусская пл , д 9) в /УТУЗауд

С диссертацией можно ознакомиться в Информационно-библиотечном центре РХТУ имени Д И Менделеева

Автореферат диссертации разослан ■/1 2007 ]

Ученый секретарь диссертационного совета

ДМ 212 204 13 ^ШакирИВ

У

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Лакказа (л-дифенол кислород оксидоредукта-за, КФ 1 10 3 2) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточною продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиа-тов Лакказы из базидиальных грибов отличаются высоким окислительно-восстановительным потенциалом и широкой субстратной специфичностью, что делает возможным их широкое, совместно с медиаторами, являющимися одновременно их первичными субстратами, использование в промышленности, например, при производстве современных экологически чистых древесноволокнистых плит (в качестве биосвязующего агента, заменяющего фенол-формапьдегидные смолы), тонком органическом синтезе (например, синтезе электропроводящих полимеров), текстильной промышленности (экологически чистое отбеливание тканей), пищевой промышленности (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения), для биодеградации ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ, синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков), в биосенсорах, иммуноферментном анализе и других областях

В настоящее время промышленная технология лакказы в РФ отсутствует В связи с этим работа по созданию технологии производства лакказы является актуальной

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было создание технологии биосинтеза фермента лакказы грибами рода Тгате1е.ч Рг Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Провести скрининг коллекционных штаммов грибов рода Тгате/« в I дубинной культуре и на агаризованных средах и выбрать наиболее перспективный в качестве продуцента лакказы штамм,

2 Изучить влияние компонентов полу синтетической питательной срсды на ок-сидазную активность (ОА),

3 Сравнить ОА штамма на комплексных средах из числа возобновляемого сельскохозяйственного сырья и подобрать дополнительные компоненты питательной среды Изучить влияние индукторов на ОА штамма-продуцента,

4 Оптимизировать по ОА в качестве критерия оптимизации состав питательной срсды с применением математических методов планирования эксперимента,

5 В условиях культивирования в ферментационном аппарате изучить влияние на синтез оксидаз рН, температуры, перемешивания и аэрации и определить оптимальные режимы культивирования,

6 На основании полученных результатов разработать технологический процесс стадии культивирования процесса производства лакказы

Научная новизна работы.

• На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования впервые проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes — потенциальных продуцентов высокопотенциальных лакказ, относящихся к 4 видам Т versicolor, Тpubescens, Т ochracea, Т hirsuta Показано, что штаммовая вариабельность OA в рамках одного вида рода Trametes превышает видовые различия по этому показателю Диапазон OA составил 0,00 - 0,90 Еоа Показано, что результаты первичного отбора штаммов, проведенного на основании реакции Бавен-дамма, зависят от состава питательной среды и субстрата фермента и не совпадают с результатами, полученными в глубинной культуре

• Показано, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз являются сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза Продуктивность по OA существенно повышается в присутствии кукурузного эксгракта и дрожжевого автолизата Источники азота и фосфора в меньшей степени влияют на OA Установлено, что содержание 0,03 мМ Си2+ в пересчете на CuSOt в среде достаточно для максимального синтеза лакказы штаммом Определено сельскохозяйственное возобновляемое сырье, обеспечивающее высокую OA (пшеничная мука)

• Определен режим рН-статирования (4,0) для достижения максимальной активности и продуктивности по оксидазам Показано, что оптимальная температура для достижения высокой OA (32 °С) не соответствует наиболее благоприятной для роста и накотения биомассы (28-30 °С) Подобран режим перемешивания и аэрации, обеспечивающий достаточную массопередачу кислорода при отсутствии травмирования мицелия и определен соответствующий объемный коэффициент массопередачи кислорода Установлена критическая линейная скорость мешалки (3,0-3,2 мс"1), при превышении которой происходит механическое воздейсгвие на мицелий гриба, приводящее к снижению OA

• Показано, что основным ферментом, продуцируемым штаммом Thirmta 56 на разработанной среде является высокопотенциальная (780±20 мВ) лакказа

Практическая ценность работы. На основании проведенных исследований выбран штамм Т hirsuta 56 для промышленного использования в качестве продуцента лакказы Проведено более 70 ферментации в аппарате объемом 30 л OA штамма-продуцента за счет оптимизации среды и условий к}льтиви-рования повышена более, чем в 40 раз Разработана технология глубинного культивирования штамма-продуцента с получением высокоактивной культу-ральнои жидкости, на основании которой создан проект опытно-промышленного регламента па производство технического препарата лакказы Проведены технологические испытания на производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п Лотошино), показавшие практическую реализуемость и эффективность разработанной технологии Проведены испытания наработанных образцов и опытной парши технического ферментного препарата в качест-

ве биосвязующего в производстве древесно-волокнистых плит (ЗАО ВНИИДРЕВ) и в тонком органическом синтезе (Институте биохимии им А Н Баха РАН), которые подтвердили соответствие полученных препаратов необходимым для производства требованиям Предварительная технико-экономическая оценка с учетом стадии концентрирования показала, что при годовом объеме производства культуральной среды 4400 м3, что составляет потребность одного предприятия при переводе всего производства древесноволокнистых плит на использование биосвязующих, себестоимость получаемой продукции будет cocí ат ять 1339,2 рубля за 1 кг или 13,39 рубля за 1000 МЕ

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 1-м (14-18 октября 2002 г ) и 2-м (10-14 ноября 2003 г) Международных конгрессах «Биотехнология состояние и перспективы развития», Москва, VI (20-24 мая 2002 г) и VII (14-18 апреля 2003 г) Между;гар симпозиумах «Техника и технология экологически чистых производств», Москва, 7-ой (14-18 апреля 2003 г) и 8-ой (17-21 мая 2004 г) Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биотехнология - наука XXI века», Пущино, V междунар кон-фер «Инженерная защита окружающей среды», Москва, 14-15 апреля 2003 г , 2 Междунар конфер «Наука-Бизнес-Образование», 10-13 мая 2005, Пущино

Публикации По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ и подано 3 заявки на патен ты РФ

Структура и объем работы Диссертационная работа включает введение, обзор литературы, описание объектов, материалов и методов исследования, 5 пив, в которых изложены результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, заключение, список цитируемой литературы, содержащий/ж наименований и 8 приложений Материал изложен на^Ьтраницах, содержитйрисунков и ¿^таблиц

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы, сформулирована цель исследования, научная новизна и практическая ценность полученных результатов, указан личный вклад соискателя

1. Обзор литературы В обзоре рассмотрены возможные природные источники лакказы и показано, чго промышленно значимыми высоко потенциальными лакказами являются лакказы ксилотрофных базидиомицетов, преимущественно принадлежащих к грибам белой гнили Показано, что наиболее перспективными для обнаружения промышленного штамма-продуцента лакказы являются базидиальные грибы рода Trametes Fr, и приведены данные об особенностях культивирования грибов этого рода Проанализированы работы по влиянию на биосинтез лакказы различных компонентов питательных сред и условий культивирования На основании анализа научной и патентной литературы показаны известные способы получения лакказ и области их применения

2. Объекты и методы исследования

В работе использовали 4 вида грибов (20 коллекционных штаммов) рода Trametes Fr, традиционно относимых [А С Бондарцев, 1953] к семейству Poly-poraceae, порядку Aphyllophorales, классу Basidiomycetes Т hirsuta (Wulfen) Pilât - 3 штамма, Tochracea (Pers )Gib & Ryvarden - 6 штаммов, T pubescens (Schumach ) - 6 штаммов, T versicolor (L ) С G Loyd- 5 штаммов Чистые культуры в разные годы были получены из коллекций Ботанического института им В JI Комарова РАН, Сенежской лаборатории защиты древесины ЦНИИ механической обработки древесины, Института микробиологии АН Белоруссии, Института зоологии и ботаники АН Эстонии, Сельскохозяйственного института им В Коларова (Болгария), ГосНИИ биосинтеза белковых веществ и поддерживались на агаризованном сусле при температуре +4 °С с пересевами каждые 6 месяцев

Штаммы выращивали на агаризованном сусле в чашках Петри диаметром 90 мм и методом глубинного культивирования в колбах Эрленмейера объемом 750 мл с объемом среды 150 мл на круговой качалке при скорости вращения 200 об/мин, температуре 28 °С и исходном pH среды 5,8 - 6,0 Питательные среды инокулировали блоками (d-8 мм), вырезанными из зоны роста колонии соответствующего штамма на агаризованном сусле (1 блок на чашку Петри, 10 блоков на колбу), или глубинной культурой 2-3 пассажей в количестве 10 об% Влияние источников углерода, азота и фосфора изучали, внося их в количествах, эквивалентных по соответствующему элементу

Индукторы вносили при засеве в 3 мл 96 % этанола в концентрациях таниновая кислота 0,2 мМ, сирингалдазин 0,11 мкМ, кофейная кислота 0,2 мМ, 3,4-диметоксибензиловый спирт 0,2 мМ, 2,6-диметоксифенол 5 мкМ, этанол 20 г/л, и в 3 мл воды лигнин дубовый 2 г/л, стружки древесные 2 г/л, лузга подсолнечная 2 г/л, гребни виноградные 2 г/л

Культивирование проводили на средах следующего состава

1 Глюкозо-пептонная среда (Koroleva-Skorobogat'ko et al, 1998), г/л глюкоза -10,0, пептон - 3,0, КН2Р04 - 0,6, К2НР04- 0,4, MgS04- 0,5, CuS04-250 мг, MnS04 - 50 мг, ZnS04 -1 мг, FeS04- 0,5 мг, вода водопроводная

2 Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом, г/л глюкоза - 20,0, (NH4)2S04- 2,5, мочевина- 0,7, КН2Р04- 1,2, кукурузный экстракт- 10,0, про-пинол Б-400 - 0,5, вода водопроводная

3 Глюкозо-аммонийная среда с кукурузным экстрактом, г/л глюкоза - 20,0, NH4N03 - 4,0, мочевина - 0,7, КН2Р04 - 0,6, К2НР04 - 0,6, MgS04 - 0,5, MnS04

- 50 мг, CuS04 - 50 мг, ZnS04 - 1 мг, FeS04 - 0,5 mi , кукурузный экстракт -10,0, вода водопроводная

4 Среда с мукой, г/л мука пшеничная - 20,0, NH4N03 - 4,0, мочевина - 0,7, КН2Р04- 0,6, К2НР04 - 0,6, MgS04- 0,5, MnS04 - 50 мг, CuS04 -50 мг, ZnS04

- 1 мг, FeS04- 0,5 мг, кукурузный экстракт-10,0, вода водопроводная

5 Среда с мукой, г/л мука пшеничная - 20,0, №^N03 - 2,8, КН2Р04 - 1,2, кукурузный экстракт - 10,0, пронинол Б-400 - 0,5

6 Оптимизированная среда с мукой, г/л мука пшеничная - 29,0, кукурузный экстракт - 6,4, МН4МОз - 2,0, КН2РО4 - 1,2, вода водопроводная

7 Среда с глюкозой высокопродуктивная, г/л глюкоза - 29,0, кукурузный экстракт - 6,4, ЫНдМОз - 2,0, КН2Р04 - 1,2, вода водопроводная

Глубинное культивирование проводили также в ферментационном аппарате «МатЬ^Ы» (Япония) объемом 30 л, с рабочим объемом 20 л, в условиях (если не указано иначе) исходного рН 6,0, при температуре 26-28 "С, аэрации 1,0 л/л мин с механическим перемешиванием 250 об мин"1 двухъярусной турбинной мешалкой открытого тина (нижний ярус — ё = 120 мм, 6 лопастей, верхний ярус - (1 =100 мм, 4 лопасти)

Концентрацию биомассы определяли весовым способом в пробах по 50 мл в трех повторностях по воздушно сухой массе (ВСМ) и в пересчете на абсолютно сухую массу (АСМ)

Концентрацию растворенного кислорода (парциальное давление) определяли с использованием кислородного датчика типа Кларка в процентах от насыщения питательной среды

Объемный коэффициент массопередачи кислорода Кьа определяли сульфитным методом

Редуцирующие вещества (РВ) в культуральном фильтрате определяли методом Бертрана [Плевако, Бакушинская, 1964]

ОА штаммов по методу Бавендамма определяли в чашках Петри на агаризо-ванном сусте с галловой кислотой (0,4%) [Метод экспер микол, 1982] и на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином (0,12 %) - модифицированный нами метод Бавендамма

Определение экстрацеллюлярной ОА в глубинной культуре проводили в фильтрате культуральной жидкости спектрофотометрически при 410 нм с использованием пирокатехина (10"2 М) в качестве субсграта в 0,1 М цитратно-фосфатном буфере (рН 4,5) При проведении скрининга штаммов определение проводили на спектрофотометре СФ-26 (Ломо, Россия), в дальнейшей работе на 81нтас1ги иУгшш 1240 (Япония) За единицу оксидазной активности (Еол) принимали изменение оптической плотности реакционной смеси за 1 мин в пересчете на 1 мл культурального фильтрата

Коэффициент выхода фермента рассчитывали по формуле урх = ОА / ВСМ, где ОА - общая оксидазная активность в Е0л> ВСМ - воздушно сухая масса в мг/мл

Для статистической оценки результатов использовали усредненный по большому массиву экспериментов расчет дисперсии воспроизводимости относительного значения величины (Бирюков, 2004)

3. Выбор штамма-продуцента

3.1. Определение фенолоксидазной активности методом Бавендамма

На агаризованном сусле с 1алловой кислотой (метод Бавендамма) все штаммы за исключением Т versicolor 188 давали положительную реакцию на экстрацеллюлярные фенолоксидазы Наибольшие диаметры окрашенной зоны (более 60 мм на 4 сутки роста) отмечены у Т hirsuta 86-43, Т versicolor 80-1, 86-59 и M 78, Tochracea M 103, M 106 и y всех штаммов Tpubescens (таблица 1) Однако на агаризованной глюкозо-аммонийной среде с пирокатехином (модифицированный нами метод Бавендамма) наибольшие диаметры окрашенных зон наблюдали у других штаммов Тhirsuta 56, Tpubescens 923-3, Tpubescens 115, Т 923-1, Tpubescens 78-12

3.2. Сравнение OA штаммов в глубинной культуре

Активность экстрацеллюлярных оксидаз в условиях глубинного культивирования определяли на жидкой глюкозо-аммонийной среде № 3 (таблица 1)

Опыт показал наличие у всех видов значительной штаммовой вариабельности по этому признаку Все изученные штаммы вида Т versicolor обтадали низкой OA, вплоть до нулевой Наиболее активными были штаммы видов Т hirsuta и Т pubescens Активность различных штаммов Т pubescens отличалась в 9, а Т hirsuta - в 11 раз Наиболее высокую оксидазнуго активность имели (в порядке убывания) Тhirsuta 56, Тpubescens 78-12, Тhirsuta НГБ-2, Tochracea 92-78, Тochracea 92-83, Tochracea 239 Тpubescens 923-8 Расчет показал, что по продуктивности эти штаммы также являются лучшими

Существенной разницы в накоплении биомассы наиболее и наименее продуктивными штаммами, а также штаммами, практически не обладающими OA, не выявлено, что подтверждает, что низкая OA не связана со слабым ростом культуры Расчет коэффициента выхода фермента показал, что у высокопродуктивных штаммов этот показатель выше

3.3. Сравнение отобранных штаммов в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате. Выбор штамма-продуцента

Культивирование 5 штаммов, проведенное в ферментационном аппарате

на глюкозо-пентонной среде № 1, показало, что в этих условиях наиболее продуктивным штаммом так же является Т hirsuta 56 (OA - 0,73 Еоа) Исследование лакказ, выделенных из культуральных фильтратов, полученных в результате культивирования штаммов в ферментационном аппарате, проведенное совместно с Институтом биохимии им А H Баха РАН, показало, что основные биохимические параметры данных лакказ соответствуют характеристикам лакказ других базидиальных грибов (Baldrian, 2006) Выход гомогенного фермента по данным градиентного электрофореза составлял 25-35 мг с литра куль-туралыюй жидкости для Т hirsuta 56 и 5-7 мг с литра для Т ochracea 92-78 При выборе штамма-продуцента учитывали максимальную OA, продуктивность, стабильность в культуре, а также преимущественный синтез лакказы штаммом, редокс потенциал получаемого фермента и количество образуемых

пигментов в процессе культивирования По результирующим показателям для дальнейшей работы был выбран ппамм Т hirsuta 56

Таблица 1 - Распределение штаммов по величине ОА и накоплению биомассы в глубинной культуре и диаметру окрашенной зоны (реакция Бавендамма)

Штаммы Глюкозо-аммонийная среда, пирокатехин Сусло, галловая к-та

Глубинная культура Агаризованная среда

ОАв глубинной культуре* Накопление биомассы Диаметр окрашенной зоны Диаметр окрашенной зоны

Т hirsuta НРБ-2 3 15 - 14

Т hirsuta 86-43 13 11 5 8

Т hirsuta 56 1 1 1 16

Т pubescens 115 14 10 3 2

Tpubescens 78-12 2 4 6 10

Тpubescens НРБ-1 8 8 4 4

Тpubescens 923-2 18 6 8 3

Тpubescens 923-3 11 2 2 5

Tpubescens 923-8 7 3 7 1

Т versicolor 237 17 9 И 13

Т versicolor 188 19 14 20 20

Т versicolor 80-1 20 7 20 12

Т versicolor 86-59 10 17 4 7

Т versicolor М 78 9 19 9 11

Tochracea 92-78 6 16 - 17

Tochracea 92-83 4 13 - 19

Tochracea 117 15 12 - 18

Tochracea M 103 12 5 - 6

Tochracea M 106 16 18 10 9

Tochracea 239 5 20 | 15

на основании данных по максимальной оксидазнои активности в Ьоа

4. Подбор компонентов и оптимизация состава полусинтетической питательной среды

4.1. Изучение влияния источников углерода на ОА

На среде № 3 определено влияние на ОА источников углерода (глюкоза,

сахароза, мальтоза, фруктоза, лактоза, галактоза, манит, сорбит, этанол, глицерин, уксусная кислота, лимонная кислота) Диапазон ОЛ на средах с разными источниками углерода составил 0,16 - 1,34 Еоа Наиболее высокой ОА штамм достигал на средах с сахарозой, глюкозой, фруктозой и мальтозой Продуктивное гь по ОА составляла на этих субстратах 0,18, 0,19, 0,16, 0,15 Еол сут"1 соответственно на 7-е сутки культивирования

4.2. Изучение влияния источников азота и фосфора на ОА Определено влияние источников азота и фосфора на ОА штамма Т hirsuta 56 на среде № 3, содержащей в качестве источника углерода сахарозу Диапазон ОА на средах с разными источниками азота составил 0,18-1,4 Еоа Наиболее высокой ОА штамм достигал на средах с пептоном, мочевиной, сульфатом аммония и нитратом аммония на 4 сутки роста (продуктивность по ОА на этих источниках - 0,36, 0,35, 0,33, 0,26 Еолсут"1 соответственно) Из калийно-фосфорных солей, обычно применяемых в микробиологической промышленности, максимальную ОА наблюдали на средах с фосфатом калия двузамещен-ным Однако окончательный подбор источника фосфора следует проводить в условиях рН-статирования

5. Подбор компонентов и оптимизация состава комплексной питательной среды

5.1. Изучение влияния основного сырья на ОА Влияние комплексных субстратов из числа возобновляемого сельскохозяйственного сырья на ОА изучали на среде № 3 Показано, что диапазон ОА на средах с разными источниками углерода составил 0,3 - 1,4 Еоа Максимальную ОА наблюдали на средах с крахмалом, мелассой, пшеничной мукой, пивным суслом Продуктивность штамма на этих субстратах составляла 0,19, 0,19, 0,17, 0,29 Еоа сут"1 соответственно

Использование глюкозы, сахарозы, пивного сусла и крахмала ограничено их высокой ценой, а использование мелассы - нестабильностью качества и содержанием пигментированных веществ, которые затрудняют последующую очистку фермента В то же время пшеничная мука как сырье относительно дешева, и ее использование вписывается в общую схему переработки зерна, что удешевляет процесс производства Поэтому для дальнейших исследований в качестве основного сырья была выбрана пшеничная мука

5.2. Изучение влияния источников азота и фосфора на ОА На среде № 4 с пшеничной мукой и кукурузным экстрактом определено влияние различных форм азотного питания ((NH^SOí, NH4NO3, (NH4)2HP04, KNO3, пептон, мочевина) на ОА Для дальнейших исследований в качестве источника азота отобран ни грат аммония ОА на среде с широко распространенным в средах для получения лакказы пептоне оказалась даже несколько ниже, чем на средах с аммонийным азотом (1,3 и 1,1 Еоа соответственно) Сочетание аммонийных солсй с мочевиной не оказало положительного влияния на ОА В

результате проведенных опытов по изучению влияния на ОА источника фосфора (КН2Р04, 0Ш4)2РО4, К2НР04, ЫаН2Р04, Ыа2НР04) для дальнейших исследований был выбран 1-замещенный фосфат калия как эффективный и дешевый. 5.3. Изучение влияния ростовых факторов на ОА Определено влияние внесения в состав среды № 4 природных компонентов, содержащих ростовые факторы и микроэлементы, в том числе медь Кукурузный экстракт и дрожжевой автолизат были испытаны в концентрациях 0,25, 0,5 и 0,75 % по сухим веществам Показано, что внесение в среду ростовых факторов приводит к существенному увеличению ОА (с 0,14 до 0,67 Еоа для 0,25 % дрожжевого автолизата и 0,47 Еоа для 0,25-0,5 % кукурузного экстракта) Для использования в составе промышленной среды выбран кукурузный экстракт как более дешевый и менее дефицитный продукт

5.4. Оптимизация состава промышленной питательной среды Оптимизацию состава питательной среды проводили по методу Бокса-Уилсона на пятикомпонентной среде мука пшеничная, КН.,N03, мочевина, КН2Р04, кукурузный экстракт В качестве базового было взято соотношение основных компонентов среды № 4 Дробный факторный эксперимент проводили по двухуровневому плану На основе рассчитанных коэффициентов регрессии опредетяли программу крутого восхождения Полученные результаты позволили выбрать наиболее близкий к оптимальному состав питательной среды (среда № 6) Максимальная ОА на оптимизированной среде к 7 суткам составляет 5,4 Еоа и превышает максимальную ОА на базовой среде в 2,7 раза Соотношение С N (при учете крахмала муки в качестве источника углерода и амин-ного азота кукурузного экстракта и аммонийного азота нитрата аммония) в оптимизированной среде составило 11 1

5 5. Изучение влияния количества сульфата меди на ОА Пшеничная мука и кукурузный экстракт, входящие в состав питательной среды № 6, содержат медь в своем составе (0,82 мкМ и 0,01 мкМ в пересчете на Си804 соответственно) Однако основное количество сульфата меди (31 мкМ) попадает в питательную среду с посевным материалом Показано, что внесение Си804 в концентрации 1-250 мг/л (6,2 мкМ-1,57 мМ) не оказывает ингиби-рующего действия на рост штамма-продуцента, но и не увеличивает ОА, как при внесении при посеве, так и при внесении на 3 сутки роста Таким образом, показано, что концентрация меди 0,03 мМ в среде является достаточной для получения максимальной ОА

5.6. Изучение влияния индукторов на ОА На среде оптимизированного состава изучена возможность дополнительного увеличения ОА за счет введения в состав среды веществ, известных как индукторы синтеза лакказы Как видно из таблицы 2, максимум ОА наблюдается на среде с древесными стружками и составляет 7,3 Еоа, что превышает ОА в контрольной среде в 1,5 раза Близкий результат дают и виноградные гребни

(7,1 Еоа)

Таблица 2 - Влияние индукторов на ОА

Индукторы Продолжительность культивирования, сут

3 5 7 10

Таниновая кислота 4,4 6,9 6,3 2,0

Сирингалдазин 3,4 6,9 6,4 3,0

Кофейная кислота 5,4 7,0 5,5 1,9

Вератриловый спирт 4,7 7,3 5,0 1,2

2,6-диметоксифснол 2,9 4,5 4,8 2,5

Лигнин дубовый 5,9 6,2 4,1 2,9

Стружки древесные 7,3 6,6 3,5 1,5

Этанол 3,7 7,2 6,5 2,3

Лузга подсолнечная 6,0 6,6 4,2 2,4

Гребни виноградные 7Д 6,2 4,1 1.6

Контроль 4,9 4,5 ЗД 1,5

Доверительный интервал ±10,2%

Продуктивность по ОА на среде с древесными стружками составляет 2,4 Еоа сут"1, тогда как на среде с этанолом только 1,4 Еоа сут"1 ОА на среде с ве-ратриловым спиртом, кофейной кислотой, «грингалдазином и таниновой кислотой (6,9 Еоа) не превышает ОА на среде с этанолом, однако, учитывая, что эти компоненты вводились в том же количестве этанола, что и в варианте, где этанол был в качестве индуктора, можно сделать вывод, что внесение указанных веществ в количествах и условиях нашего опыта не приводит к увеличению ОА

6. Изучение влияния условий культивирования на ОА Т.ЫюМа 56 и оптимизация режимных параметров процесса ферментации

Важнейшими параметрами, оказывающими влияние на ферментативную активность, являются рН, температура культивирования и коэффициент массо-передачи кислорода, а для механолабильных культур, к которым относятся ба-зидиальные грибы, при использовании аппаратов с механическим перемешиванием ограничивающим фактором является также критическая линейная окружная скорость мешалки, при превышении которой происходит травмирование гиф гриба

6.1. Влияние рН на ОА штамма-продуцента

Влияние рН изучали в ферментационном аппарате в режиме автоматического поддержания рН (рН-статирования) при температуре 26°С на глюкозо-аммонийной среде № 2 и среде с мукой № 5 при 32 °С

"Концентрация биомассы, г/л ■Концентрация растворенного кислорода 0,1р02,% "Оксидазная активность, ОА, Е ОА "Редуцирующие вещества, %

На глюкозо-аммонийной среде показано, что максимальной ОА штамм достигает при рН=4,0 По сравнению с процессом при нерегулируемом рН активность повысилась в 1,5 раза рН 4,0 оказывается лучшим как по абсолютному значению ОА (2,0 Еоа), так и по продуктивности (0,03 Еоа ч"1) Коэффициент выхода фермента в точке максимума ОА составляет 0,31 Еоа мг"1 рН 4,0 обеспечивает таюке и наиболее высокую скорость роста культуры

Как видно из рисунка 1, при оптимальном рН ОА достигает максимума при исчерпании редуцирующих Сахаров в среде и переходе культуры в стационарную фазу и фазу отмирания Этому соответствует и увеличение концентрации растворенного кислорода в среде, свидетельствующее о снижении его потребления затухающей культурой Сходные зависимости получены и на среде с мукой

На рисунке 2 приведены сводные графики процессов на среде с пшеничной мукой № 5 в диапазоне рН-статирования 3,5 -5,5 Максимальная ОА наблюдалась так же как и на глюкозо-аммонийной среде при р11=4,0 Близкие значения ОА дает проведение процесса ферментации при рН=3,5

Рисунок 2 - ОА в процессах с различными значениями рН-статирования и при нерегулируемом рН на среде с мукой

Рисунок 1 - Динамика параметров синтеза окси-доредуктаз в ферментационном аппарате в условиях рН-статирования при оптимальном значении рН (4,0) на глюкозо-аммонийной среде

Рисунок 3 — Максимальная ОА при культивировании при разных температурах в ферментационном аппарате на оптимизированной среде с мукой

6.2. Влияние температуры на ОА

Влияние температуры изучали в ферментационном аппарате при pH 4,0 на оптимизированной среде с мукой № 6. На рисунке 3 приведены сводные данные по максимальной ОА в ферментациях при разных температу рах. Показано, что максимальной ОА (5,8 Еоа) штамм достигает при температуре 32 °С (продуктивность 0,085 Еоа-ч ). Максимальная ОА в изученном диапазоне температур различалась в 1,8 раза, коэффициент выхода фермента в 3 раза. Отмечено, что температура для максимальной продуктивности по биомассе несколько ниже, чем для синтеза оксидоредуктаз, а именно 28-30 "С. 6.3. Влияние интенсивности перемешивания на ОА Определено влияние скорости перемешивания на ОА штамма. Серия ферментаций, проведенных на г лкжозо-ам монийшй среде №2 при рН=4,0, температуре 26 °С и аэрации 1 Л'Л'Чнш"1 показала, что максимальной ОА штамм достигает при 250 об'мин"' (2,0 Еоа), что в 1,2 раза выше, чем при 450

об-мин"1. Продуктивность по биомассе была наибольшей при 350-450 об-мин"'. Накопление биомассы было наибольшим при 550 об-мин"1 (9,2 г/л), но при этом происходило частичное диспергирование биомассы. Коэффициент выхода фермента при 250 об-мин"1 составлял 0,26 Еоа-мг"1, что в 1,9 раза превышает выход фермента при 550 об-мин"1.

Уточняющие эксперименты по влиянию перемешивания, проведенные на среде с мукой № 5, показали (рисунок 4), что режим перемешивания 250 об мин"1 и на этой среде является оптимальным. Продук-

0 20 т во

Продолжительность кульгнвнровлння,1!

-&—350 об/ мин

-250 об/мин

-200 об/мин

Рисунок 4 - Динамика ОА в процессах при различной интенсивности перемешивания в ферментационном аппарате на среде с мукой

тивность при этом режиме в 1,5 раза выше, чем при 200 и 350 об/мин Таким образом, максимально допустимой скоростью перемешивания в использованном аппарате является скорость 450-550 об мин"1, чему соответствует критическая линейная окружная скорость мешалки 2,8-3,5 м с"' Оптимальному режиму перемешивания (250 об мин"1) при аэрации 1 л л"1 мин"1 соответствует Кг.а 175 ч"1

6.4. Влияние аэрации па рост и ОА штамма-продуцента

При оптимальном значении рН и скорости перемешивания (250 об мин')

на оптимизированной среде с мукой № 6 проведены ферментации с различными условиями аэрации Как видно из рисунка 5, значение аэрации 1 л л"1 мин"1 является оптимальным для максимального накопления фермента в культуральной жидкости Продуктивность при этом режиме составляла 0,09 Еоа ч"1, что в 1,2-1,6 раза больше, чем при режимах 0,8 и 1,2 об мин"1

При проведении ферментации в отсутствие механического перемешивания увеличение уровня аэрации приводит к увеличению О А Так, при аэрации 1,5 л л"1 мин 1 максимальная ОА составляет 4,4 Еол, что в 1,7 раза превышает ОА при аэрации 1,0 л л"1 мин1 Таким образом, аэрация без перемешивания в недостаточной степени обеспечивает условия для достижения высокой ОА

В условиях используемого аппарата оптимальным режимом следует считать аэрацию 1,0 л л"1 мин'1 при перемешивании 250 об мин"1, что соответствует Кьа 175 ч"1

6.5. Изучение ОА Т.ИтШа 56 при проведении многоциклическнх

процессов

На оптимизированной среде с мукой № 6 в оптимизированных условиях культивирования проведены две серии многоциклических процессов После достижения максимума О А культуральную среду сливали, оставляя 10 % в качестве посевного материала, и добавляли стерильную питательную среду до исходного объема Показана принципиальная возможность получения высокой ОА в таких процессах Время достижения максимума ОА составляло 42-68 часов

Рисунок 5 - Динамика ОА при различной интенсивности аэрации в ферментационном аппарате с перемешиванием 250 об мин'1

6.6. Сравнение ОЛ Т.МпМа 56 в исходных и оптимизированных средах и условиях культивирования

На рисунке 6 приведены графики ОА при культивировании штамма-продуцента в ферментационном аппарате, отражающие этапы работы Показана ОА штамма в исходных условиях (глюкозо-пептонная среда №1, условия

культивирования не оптимизированы), в процессе работы глюкозо-аммонийная среда №2, условия не оптимизированные, среда с мукой № 5, условия оптимизированы, глюкозо-аммонийная среда № 7 в оптимизированных условиях, оптимизированная среда с мукой № 6 в оптимизированных условиях В результате проведенной работы достигнуто повышение ОА более, чем в 40 раз (0,13 Еоа до 5,77 Еоа) Продуктивность по Максимальная ОА, однократ-

Рисунок 6 - Сравнение динамики ОА в фермен-тациях, проведенных на исходной среде и на разработанных средах и условиях культивирования

ОА увеличилась с 0,002 Еоа ч"' до 0,085 Еоа ч"1

но достигнутая в ферментационном аппарате составляла 17,6 Еоа

7. Разработка технологии производства лакказы, проведение опытно-промышленных испытаний и характеристика получаемого фермента

7.1. Определение критериев масштабирования, разработка промышленной технологии и опытно-промышленного регламента на производство ферментного препарата лакказы

Интенсивный процесс биосинтеза лакказы штаммом Т hirsuta 56, как показали наши исследования, происходит при обеспечении за счет аэрации и перемешивания Kta =175 ч"1 В то же время штамм-продуцент лакказы, как и все базидиальные грибы, относится к числу механолабильных культур, клетки которого повреждаются вращающимися частями механической мешалки при превышении критической скорости, равной по нашим экспериментальным данным 3,0-3,2 м с"1 Эти показатели могут служить критериями масштабирования процесса производства лакказы

На основании проведенных исследований разработана промышленная технология получения высокоактивной культуральной жидкости и стадия культивирования опытно-промышленного регламента на производство ферментного

препарата технической лакказы мощностью 20 т в год (ОПР № 02068798-0106)

7.2. Опытно-промышленные испытания технологического процесса

На производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п Лотошино, Московской обл ) проведены испытания техночогии производства ферментного препарата лакказы В ферментационных аппаратах вместимостью 0,25м3 получены 2 партии культуралыюй жидкости с активностью 12,1 и 12,3 МЕ Биомассу отделяли на рамном пресс-фильтре с использованием капроновой фильтрующей ткани и сушили в полочной конвекционной сушилке при темперагуре 65-90 °С Культуральный фильтрат подвергали концентрированию в 10 раз ба-ромембранным методом Опытно-промышленные испытания подтвердили реализуемость разработанной технологии

Наработанную опытную партию ферментного препарата лакказы передали ЗАО «ВНИИДРЕВ» для испытаний в процессе получения древесноволокнистых плит на биосвязующих и Институту биохимии им А Н Баха РАН для получения высокоочищенного препарата лакказы для ферментативного синтеза полианилина

7.3. Биохимические характеристики препарата лакказы

Работы, поведенные совместно с Институтом биохимии им АН Баха РАН, подтвердили, что основным ферментом, продуцируемым штаммом Т hirsuta 56 на разработанной среде является лакказа Фермент содержит 4 иона меди трех типов в активном центре и имеет высокий редокс потенциал (780±20 мВ) Молекулярная масса лакказы Тhirsuta 56 составляет 70±2 кДа, углеводная часть - около 12 % от молекулярной массы холофермента Изоэлектрическая точка - 4,2±0,1, рН-оптимум - 4,5 Удельная активность гомогенного по данным электрофореза препарата лакказы по пирокатехину - 220-240 МЕ/мг Эффекшв-ность катализа (ккаг/Км) 106 - 2,75 М"'с 1 по пирокатехину, 7,38 М"'с"' по гидрохинону

7.4. Технико-экономическая оценка

Технико-экономическую оценку проводили с учетом стадии концентрирования ферментного препарата при годовом объеме производства культуральной среды 4400 м3, что составляет потребность одного предприятия при переводе всего производства древесно-волокнистых плит на использование биосвязующих Расчет проводили в сопоставлении с препаратом DemLite II фирмы No-vozymes, содержащим лакказу в качестве основного компонента лакказа-медиаторной системы (медиатор - пропионово кислый фенотиазин), стоимость 1000 МЕ лакказы которого по ориентировочной оценке составляет 142 рубля Стоимость 1000 МЕ нашею концентрированного ферментного препарата лакказы составляет 27 рублей

Таким образом, концентрированный ферментный препарат лакказы, полученный по разработанной технологии стадии культивирования, в пересчете

на 1000 ME лакказы не уступает по стоимости препарату DeniLite II фирмы

Novozymes и содержит высокопотенциальную лакказу, что существенно расширяет область его применен™

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1 На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes Fr - потенциальных продуцентов лакказы Отобраны штаммы с высокой активностью экстрацеллюлярно-го оксидоредуктазного комплекса (Т hirsuta 56 и НРБ-2, Tpubescens 78-12, Tochracea 239) На основании продуктивности в условиях культивирования в ферментационном аппарате и биохимических характеристик синтезируемой лакказы для дальнейших исследований отобран штамм-продуцент Г hirsuta 56

2 Для отобранного штамма установлено, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз на потусинтетической среде являются сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза в качестве источника углерода, пептон, мочевина и (NH4)2S04 в качестве источника азота, фосфат калия двузамещенный и од-нозамещенный в качестве источника фосфора

3 Определено возобновляемое сельскохозяйственное сырье, обеспечивающее высокую оксидазную активность штамма-продуцента (крахмал, меласса, пшеничная мука, сусло) Подобраны компоненты питательной среды с пшеничной мукой в качестве основного сырья (NH4N03, КН2РО4 и кукурузный экстракт) Состав питательной среды оптимизирован с применением математических методов планирования эксперимента, что позволило увеличить ОА в 2,7 раза Показано, что наличие в составе питательной среды 0,03 мМ CuS04 достаточно для того, чтобы процесс синтеза лакказы не был лимитирован Си2' Показано, что добавление в состав среды древесных стружек виноградных гребней и этанола позволяет увеличить ОА в 1,5 раза

4 Изучено влияние режимов культивирования на ОА штамма-продуцента Определен оптимальный режим рН, температуры, перемешивания и аэрации Определены критерии масштабирования процесса биосинтеза лакказы -критическая линейная окружная скорость перемешивания и оптимальное значение KLa

5 Экспериментально подтверждено стабильное увеличение ОА в результате подбора и оптимизации состава питательной среды и условий культивирования более, чем в 40 раз (до среднего значения 5,8 Еоа) Время достижения максимальной ОА сокращено до 68 часов

6 Разработана и апробирована промышленная технология стадии культивирования, на основании которой создан опытно-промышленный регламент Показано, что основным ферментом Тhirsuta 56, получаемым по разработанной технологии, является высокопотенциальная лакказа

Список публикаций

1. Горшина ЕС, ТВ Русинова, В В Бирюков, С В Шлеев, А И Ярополов Изучение активности внеклеточных оксидоредуктаз дереворазрушающих грибов рода Conolus Quel // Биотехнология состояние и перспективы развития Матер 1-го Междунар конгресса - М ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им Д И. Менделеева, 2002 - С 448-449

2 . Горшина E С , Русинова Т В , Кулакова О А , Бирюков В В Дереворазру-шающие грибы рода Coriolus как продуценты оксидазного ферментативного комплекса для биодеградации ксенобиотиков // Техника и технология экологически чистых производств Матер VI междунар симп / Под ред Беренгартена М Г и др - М Ml УИЭ, 2002 - С 52-54

3. Русинова Т В , Горшина Е С Бирюков В В Выбор штамма-продуцента для биотехнологического получения лакказного ферментного комплекса // Биотехнология - наука XXI века Тезисы 7-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых 14-18 апретя 2003 г - Пущино, 2003 - С 127

4 . Русинова Т В Горшина E С , Бирюков В В Получение оксидазного ферментативного комплекса культивированием дереворазрушающе1 о гриба рода Trametes для биодеградации ксенобиотиков // Инженерная защита окружающей среды Докл V междунар конфер / под ред Баранова Д А , Николайкиной НЕ-М МГУИЭ, 2003 -С 172-173

5 . Русинова Т В , Горшина Е С , Бирюков В В Щеблыкин И Н Влияние состава среды и условий культивирования на оксидазную активность Trametes hirsuta // Биотехнология состояние и перспективы развития Матер II Московского междунар Конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003) - М ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им Д И Менделеева, 2003 - ч II, С 212

6. Русинова Т В Горшина E С , Бирюков В В Изучение возможности комплексного использования культуральной жидкости грибов рода Trametes для выделения фермента и получения биодобавки // Техника и технология экологически чистых производств Материалы VII междунар Симпозиума молодых ученых, аспирантов и студентов — М 2003 - С 87-89

7 . Русинова Т В Горшина Е С , Бирюков В В , Щеблыкин И Н Влияние состава среды и условий культивирования на оксидазную активность Trametes hirsuta // Биотехнология состояние и перспективы развития Матер II Московского междунар Конгресса (Москва, 10-14 ноября 2003) - М ЗАО «ПИК «Максима», РХТУ им ДИ Менделеева, 2003 - ч II, С 212

8 . Русинова Т В , Горшина Е С Крамм Э А , Бирюков В В , Ярополов А И , Шлеев С В , Щеблыкин И Н Изучение трофических потребностей и технологических характеристик продуцента лакказы Trametes hirsuta// Биотехнология -наука XXI века Тезисы 8-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004 г - Пущино, 2004 - С 277-278

9. Халунина А С , Шлеев С В , Горшина Е С , Русинова Т В , Ярополов А И Электрохимическое поведение «голубых» лакказ базидиомицетов на электродах из углеродных материалов // Биотехнология - наука XXI века Тезисы 8-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых 17-21 мая 2004 г - Пущино, 2004 - С 284

10. К И Михайлова, Т В Русинова, Е С Горшина, В В Бирюков, А И Яро-полов, И H Щеблыкин Опыт разработки технологии базидиальных лакказ // Наука-Бизнес-Образование Тезис Докл 2 Междунар Конфер 10-13 мая-Пущино-2005-С 31-32

11. Shleev S V, О V Morozova, OV Nikitina, ES Gorshma, TV Rusinova, S A Serezhenkov, D S , Burbaev, I G Gazaryan, AI Yaropolov Comparison of physico-chemical characteristics of four Iaccase from different basidiomycetes // Biochimie - 2004 -v Sep-Oct 86 (9-10) , p 693-703

12. Никитина О В , Шлеев С В , Горшина Е С Русинова Т В , Ярополов А И Роль ионов двухвалентного марганца в функционировании лигнинолитических ферментов базидиального гриба '1 rametes pubescens (2005) Вестн Моек Ун-та, Сер 2 Химия Т 46, 4, с 272-278

13. Никитина О В , С В Шлеев, Е С Горшина, Т В Русинова, В А Сережен-ков, Д Ш Бурбаев, JI В, Беловолова, А И Ярополов Выделение и очистка ферментов лигнолитического комплекса базидиального гриба Trametes pubescens (Schumach )Pilat и исследование их свойств // Биохимия - 2005 -том 70 -вып 11-С 1548-1555

14 . Горшина Е С , Т В Русинова, В В Бирюков, О В Морозова, С В Шлеев, А И Ярополов Динамика оксидазной активности в процесе культивирования базидиального гриба рода Trametes Fr // Прикладная биохимия и микробиология - 2006 -№ 6 -С 638-644

15. ЕС Горшина, 1 В Русинова, H С Марьина, НА Шкурина, В В Бирюков, И H Щеблыкин, M А Горбачева, О В Морозова, С В Шлеев, А И Ярополов Биосинтез грибной лакказы - фермента для эколо1 ически безопасных производств/ Сборник трудов МГУИЭ, 2006,116-123

Подписано в печать 26 апреля 2007 г

Формат 60x90/16

Объем 1,125 п л

Тираж 100 экз

Заказ № 26040765

Оттиражировано на ризографе в ООО «УниверПринт» ИНН/КПП 7728572912\772801001

Адрес 117292, г Москва, ул Дмитрия Ульянова, д 8, кор 2 Тел 740-76-47, 125-22-73 http //www umverprmt ru

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Русинова, Татьяна Витальевна

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Источники лакказы в природе

1.2. Базидиальные грибы как источники ферментов

1.3. Лигнолитический ферментативный комплекс грибов белой 21 гнили

1.4. Особенности роста в глубинной культуре и синтеза оксидаз 24 грибами рода Trametes

1.5. Влияние различных факторов на оксидазную активность

1.6. Области применения лакказы

Глава 2. Объекты и методы исследований

Глава 3. Выбор штамма-продуцента лаккказы

3.1. Определение фенолоксидазной активности штаммов на ага-ризованных средах по методу Бавендамма

3.2. Сравнение продуктивности штаммов-продуцентов в глубинной культуре в колбах на качалке

3.3. Сравнение отобранных штаммов в условиях глубинного культивирования в ферментационном аппарате. Выбор промышленного штамма-продуцента

Глава 4. Подбор компонентов полусинтетической питательной среды для получения высокой оксидазной активности Т. hirsuta

4.1. Изучение влияния количества сульфата меди на оксидазную активность

4.2. Изучение влияния источников углерода на оксидазную активность

4.3. Изучение влияния источников азота на оксидазную актив ность на средах с сахарозой

4.4. Изучение влияния источников фосфора на оксидазную активность на средах с сахарозой

Глава 5. Подбор компонентов и оптимизация состава комплексной питательной среды для получения высокой оксидазной активности Т. hir- 83 suta

5.1. Изучение влияния основного сырья на оксидазную активность

5.2. Изучение влияния источников азота на оксидазную активность на средах с мукой

5.3. Изучение влияния источников фосфора на оксидазную активность на средах с мукой

5.4. Изучение влияния ростовых факторов на оксидазную активность на средах с мукой

5.5. Оптимизация состава промышленной питательной среды

5.6. Изучение влияния количества сульфата меди на оксидазную активность на средах с мукой

5.7. Изучение влияния индукторов на оксидазную активность на 101 средах с мукой

Глава 6. Изучение влияния условий культивирования на оксидазную активность Т. hirsuta 56 и оптимизация режимных параметров процесса 104 ферментации

6.1. Влияние рН на оксидазную активность Т. hirsuta

6.2. Влияние температуры на оксидазную активность Т. hirsuta

6.3. Влияние интенсивности перемешивания на оксидазную активность Т. hirsuta

6.4. Влияние аэрации на оксидазную активность Т. hirsuta

6.5. Сравнение оксидазной активности Т. hirsuta 56 на исходной среде и средах после оптимизации состава и условий культивирования

6.6. Изучение оксидазной активности Т.ЫпЫа 56 при проведении многоциклических процессов

Глава 7. Разработка технологии производства лакказы, проведение опытно-промышленных испытаний и характеристика получаемого фермента

7.1. Определение критериев масштабирования, разработка промышленной технологии и опытно-промышленного регламента на производство ферментного препарата лакказы

7.2. Опытно-промышленные испытания технологического процесса

7.3. Биохимические характеристики препарата лакказы

7.4. Технико-экономическая оценка 138 ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ 143 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка технологии биосинтеза фермента лакказы базидиальными грибами рода Trametes"

Производство ферментных препаратов является одним из ведущих направлений в развитии биотехнологии во всем мире. Ферментные препараты находят широкое применение в самых различных отраслях пищевой и легкой промышленностях, в косметологии, в производстве синтетических моющих средств, в медицине, в аналитических исследованиях, сельском хозяйстве, охране окружающей среды и ряде других областей. В связи с этим возникает задача получения значительных количеств ферментных препаратов с использованием достаточно простых технологических операций.

Лакказа (я-дифенол:кислород оксидоредуктаза, КФ 1.10.3.2) относится к классу оксидаз, восстанавливающих молекулярный кислород непосредственно до воды без образования в качестве промежуточного продукта перекиси водорода или каких либо других кислородных интермедиатов. Голубые лак-казы из базидиальных грибов являются высокопотенциальными ферментами и обладают широкой субстратной специфичностью по отношению к различным органическим и неорганическим соединениям, что делает возможным их использование совместно с медиаторами, являющимися одновременно их первичными субстратами. Применение лакказы перспективно во многих областях промышленности: целлюлозо-бумажной (делигнификации бумажной пульпы); текстильной (экологически чистое отбеливание тканей); тонком органическом синтезе (например, синтез электропроводящих полимеров); пищевой (удаление следов кислорода в продуктах питания для увеличения срока хранения); косметической (краска для волос, отбеливающая зубная паста); производстве современных экологически чистых древесно-волокнистых плит (в качестве биосвязующего агента); производстве моющих средств (отбеливающий агент); для биодеградация ксенобиотиков, в том числе отравляющих веществ; энергетике (кислородный электрод биотопливного элемента); синтезе лекарственных препаратов (например, антибиотиков); в биосенсорах (например, анализ фенольных соединений, включая лигнины, в сточных водах промышленных предприятий, определение антиоксидантного статуса вин); иммуноферментном анализе (в качестве фермента-маркера). В связи с этим работа по созданию технологии производства лакказы является актуальной.

Особый интерес представляют фенолоксидазы, синтезируемые экологической группой дереворазрушающих грибов, вызывающих белую гниль древесины, относящихся к классу Basidiomycetes. Наибольшее значение из них имеют грибы рода Trame tes (Coriolus) (сем. Polyporaceaë).

В связи с этим разработка технологии производства лакказы является актуальной задачей биотехнологии. Разработка стадии культивирования является важнейшей частью биотехнологического процесса. Однако наиболее важные этапы, такие как изучение оксидазной активности различных штаммов - потенциальных продуцентов лакказы и выбор штамма-продуцента, выбор и оптимизация компонентов питательной среды, изучение влияния технологических параметров на синтез целевого продукта и выбор оптимальных режимов культивирования в настоящее время недостаточно изучены.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы была разработка технологии биосинтеза фермента лакказы грибами рода Trametes. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг коллекционных штаммов грибов рода Trametes в глубинной культуре и на агаризованных средах и выбрать наиболее перспективный в качестве продуцента лакказы штамм;

2. Изучить влияние компонентов полусинтетической питательной среды на оксидазную активность (ОА);.

3. Сравнить ОА штамма на комплексных средах из числа возобновляемого сельскохозяйственного сырья и подобрать дополнительные компоненты питательной среды. Изучить влияние индукторов на ОА штамма-продуцента;

4. Оптимизировать по ОА в качестве критерия оптимизации состав питательной среды с применением математических методов планирования эксперимента;

5. В условиях культивирования в ферментационном аппарате изучить влияние на синтез оксидаз рН, температуры, перемешивания и аэрации и определить оптимальные режимы культивирования;

6. На основании полученных результатов разработать технологический процесс стадии культивирования процесса производства лакказы.

Научная новизна работы

• На агаризованой среде и в условиях глубинного культивирования впервые проведен скрининг 20 штаммов грибов рода Trametes - потенциальных продуцентов высокопотенциальных лакказ, относящихся к 4 видам: Т.versicolor, T.pubescens, T.ochracea, Т.hirsuta. Показано, что штаммовая вариабельность OA в рамках одного вида рода Trametes превышает видовые различия по этому показателю. Диапазон OA составил 0,00 - 0,90 Еоа. Показано, что результаты первичного отбора штаммов, проведенного на основании реакции Бавендамма, зависят от состава питательной среды и субстрата фермента и не совпадают с результатами, полученными в глубинной культуре.

• Показано, что наиболее эффективными для синтеза оксидаз являются сахароза, глюкоза, фруктоза и мальтоза. Продуктивность по OA существенно повышается в присутствии кукурузного экстракта и дрожжевого ав-толизата. Источники азота и фосфора в меньшей степени влияют на OA. Установлено, что содержание 0,03 мМ Си2+ в пересчете на CuS04 в среде достаточно для максимального синтеза лакказы штаммом. Определено сельскохозяйственное возобновляемое сырье, обеспечивающее высокую OA (пшеничная мука).

• Определен режим рН-статирования (4,0) для достижения максимальной активности и продуктивности по оксидазам. Показано, что оптимальная температура для достижения высокой OA (32 °С) не соответствует наиболее благоприятной для роста и накопления биомассы (28-30 °С). Подобран режим перемешивания и аэрации, обеспечивающий достаточную массопередачу кислорода при отсутствии травмирования мицелия и определен соответствующий объемный коэффициент массопередачи кислорода.

Установлена критическая линейная скорость мешалки (3,0-3,2 м-с"1), при превышении которой происходит механическое воздействие на мицелий гриба, приводящее к снижению ОА.

• Показано, что основным ферментом, продуцируемым штаммом Т.hirsuta 56 на разработанной среде является высокопотенциальная (780±20 мВ) лакказа.

Практическая ценность работы

На основании проведенных исследований выбран штамм Т. hirsuta 56 для промышленного использования в качестве продуцента лакказы. Проведено более 70 ферментаций в аппарате объемом 30 л. ОА штамма-продуцента за счет оптимизации среды и условий культивирования повышена более, чем в 40 раз. Разработана технология глубинного культивирования штамма-продуцента с получением высокоактивной культуральной жидкости, на основании которой создан проект опытно-промышленного регламента на производство технического препарата лакказы. Проведены технологические испытания на производственной базе ООО «Фирма «Макофарм»» (п. Лотоши-но), показавшие практическую реализуемость и эффективность разработанной технологии. Проведены испытания наработанных образцов и опытной партии технического ферментного препарата в качестве биосвязующего в производстве древесно-волокнистых плит (ЗАО ВНИИДРЕВ) и в тонком органическом синтезе (Институте биохимии им А.Н. Баха РАН), которые подтвердили соответствие полученных препаратов необходимым для производства требованиям. Предварительная технико-экономическая оценка с учетом стадии концентрирования показала, что при годовом объеме производства культуральной среды 4400 м , что составляет потребность одного предприятия при переводе всего производства древесно-волокнистых плит на использование биосвязующих, себестоимость получаемой продукции будет составлять 1339,2 рубля за 1 кг или 13,39 рубля за 1000 МЕ.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы докладывались на 1-м (14-18 октября 2002 г.) и 2-м (10-14 ноября 2003 г.) Международных конгрессах «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва; VI (20-24 мая 2002 г.) и VII (14-18 апреля 2003 г.) Междунар. симпозиумах «Техника и технология экологически чистых производств», Москва; 7-ой (14-18 апреля 2003 г.) и 8-ой (17-21 мая 2004 г.) Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биотехнология - наука XXI века», Пущино; V междунар. конфер. «Инженерная защита окружающей среды», Москва, 14 - 15 апреля 2003 г.; 2 Междунар. конфер. «Наука-Бизнес-Образование», 1013 мая 2005, Пущино.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ и подано 3 заявки на патенты РФ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает: введение, обзор данных литературы, описание объектов, материалов и методов исследования, 5 глав, в которых изложены результаты экспериментов и их обсуждение, выводы, список цитируемой литературы, содержащий 198 наименований и 8 приложений. Материал изложен на 144 страницах, содержит 73 рисунка и 13 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Русинова, Татьяна Витальевна

Вывод

Предприятие «ООО «Фирма «Макофарм»» готово к проведению технологических испытаний и изготовлению опытных образцов ферментного препарата технической лакказы для предварительных испытаний и опытно-промышленной партии ферментного препарата технической лакказы в соответствии с ОПР 02068798-01-06 для предварительных испытаний в качестве компонента биосвязующего комплекса при производстве прессованных древесных материалов.

Председатель комиссии Г В.И. Крицкш

Члены комиссии ЕЕ. Николаева

О.В. Курбакова

В.В. Шумилин

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Русинова, Татьяна Витальевна, Москва

1. Афанасьева М.М. Отбор и культивирование лигноразрушающих грибов Микол. и фитопатол.- 1984.-Т. 18.- Вып. 3.- 210-

2. Бабицкая В.Г., Стахеев И.В. Изучение условий глубинного культивирования мицелиальных грибов на соломе Микол. и фитопатол.1981.-Т. 15.-ВЫП.

3. Бабицкая В.Г., Стахеев И.В. Условия биотрансформации соломы в белковый продукт мицелиальными грибами Микол. и фитопатол.-1985.- Т. 19.- №1.-С. 32-

4. Бабицкая В.Г., Щерба В.В. Образование биологически активных веществ фибами Coriolus hirsutus на гетерогенных средах Микробиология. 1987. Т. 56. Вып. 4.- 600-

5. Беккер З.Э. Физиология грибов и их практическое использование. М.: Из-во МГУ, 1963.- 168с. Белова Н.В., Яковлева П.С, Псурцева П.В., Кияшко А.А. Продукция лакказ у базидиомицетов при фепментации в различных условиях Успехи медицинской микологии.- Т.9.-М.: Национальная академия микологии. 2007.-С. 144-

6. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. М: «КолосС». 2004.-296с. Бирюков В.В., Кантере В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза-М.: Наука, 1985. -292 с. Болобова А.В., Аскадскнй А.А., Кондращенко В.И., Рабинович М.Л. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Книга П. Ферменты, модели, процессы. М.: Наука, 2002. 343 с. 145

7. Порядок Афиллофоровые.-СПб.: Наука, 1998.-390с. Бреславская О. В., Осина М. А. Амперометрический биосенсор для определения фенольных соединений Радиоэлектроника, электротехника и энергетика: 8 Международная научно-техническая конференция студентов и аспирантов, Москва 28 февр.-1 марта, 2002 Тезисы докладов. Т. 2. -М., 2002-С. 135-

8. Бухало А.С. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре Киев: Наукова думка, 1988,-144с. Бухало А.С, Пархоменко Л.П., Марченко М.Н. Влияние различных источников углерода и азота в синтетических средах на рост базидиомицетов Микол. и фитопатол. 1972.- Т. 6.- Вып. 3.-

9. Вечер А.С, Соломко Э.Ф., Скачков Е.Н., Дудка И.А.. Бухало А.С, Паромчик И.И., Пчелинцева Р.К. Концентрат картофельного сока как субстрат для культивирования мицелия высших грибов Докл. АН БССР, 1978.-23.-№9.-С 855-858. 146

10. Гаврилова В.П. Григорьева Н.К. Рост и образование окислительных ферментов дереворазрушающими грибами из рода Coriolus Микол. и фитопатол. 1983. т 17. 2. 127-

11. Гаврилова В.П., Гусарова Л.А. Биологическое окисление базидиомицетами гидролизной последрожжевой фитопатол.- 1986. т. 20. Вып. 4. 285-

12. Гаврилова В.П., Королева О.В. бражки Микол. и Перспективы промышленного катализаторов их получения специфических белков и биологических базидиомицетов Современная микология в России: Тез. докл. I Съезда микологов России. М., 2002. 293-

13. Гаврилова нетрадиционного В.П., Шамолина И.И., Белова в Н.В.Возможности кожевенном и использования базидиомицетов текстильном производстве Биотехнология. 2002. J2 5. 74-

14. Горбатова О.Н., Королёва О.В., Ландесман Е.О., Степанова Е,В., Жердев А.В. Индукция биосинтеза лакказы как способ увеличения потенциала детоксификации базидиомицетами //Прикладная биохимия и микробиология. 2006. том 42. 4. 468-

15. Грачева И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов/ И.М.Грачева, А.Ю. Кривова. 3-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во «Элевар», 2000.-512с. Гусарова Л.А., Низковская О.П., Семушкипа Т.Н., Баранова Т.И., Глущенко П.В.. Выращивание и отбор высших мицелиальных грибов, продуцентов белка на гидролизованных средах Сб. тр. ВНИИгидролиза растительных материалов, 1982.-№32.-С. 94-

16. Гусарова Л.А., Низковская О.П., Семушкина Т.Н., Баранова Т.И.. Выращивание высших базидиальных грибов продуцентов белка на гидролизных средах Мицелиальные грибы (физиология, биохимия. 147

17. Даниляк Н.И., Семичаевский В.Д., Трутнева И.А.. Ферментные системы высших базидиомицетов Киев.: Наукова думка, 1989. 279с. Дворнина А.А., Лиса И.И., Копотиенко Н. Биостимуляторы нри глубинной ферментации базидиомицетов Проблемы культивирования съедобных грибов в СССР: Тез. докл. III Всесоюзного совещания. Пущино, 1991.-C.

18. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль нротеаз базидиальных грибов Микол. и фитопатол..- 1984.- т.18.- вын. 2.- 116-

19. Денисова П.П., Алехина И.А. Фибринолитическая активность культур базидиомицетов Микол. и фитонатол.-1987.- т.21.- вын. 5.- 471-

20. Денисова Н.П., Псурцева П.В., Чаргоглян А.А., Аконян Ш.И. Тромболитические ферменты базидиальных грибов Мицелиальные грибы (физиология, биохимия, биотехнология): Тез. докл. Всесоюзной конференции.-Пущино, 1983.-С. 137-

21. Денисова Н.П., Псурцева П.В., Чарчоглян А.А., Ероян А.Г. Культуры высших съедобных грибов перснективные нродуценты тромболитических ферментов и пищевого белка Производство высших съедобных грибов в СССР.-Киев: Наукова думка. 1985.-С. 29-

22. Джафарова А. И., Скоробогатько О. В., Степанова Е. В., Яронолов А. И.. Иммуноферментный анализ на основе лакказных конъюгатов с флуориметрической детекцией продукта ферментативной реакции// Прикладная биохимия и микробиология. -1995. -том 31. N 1 -С.128-

23. Дудченко Л.Г. Трутнева I. А., Опанасенко Т.В. Пектолитична aKTHBHicTb гриб{в роду Coriolus Quel. в культур! Укр. ботан. журн..- 1978.т. 3 5 M l С 66-70. 148

24. Дудченко Л.Г., Семичаевский В.Д., Мельничук Г.Г. Влияние рН среды на продуцирование внеклеточных ферментов дереворазрушающими базидиомицетами Микол. и фитонатол.- 1988.- т.22.- вып. 2- 135-

25. Дудченко Л.Г., Трутнева И.А.. Съедобные агарикальные грибы источник внеклеточных пектолитических ферментов Микол. и фитопатол.1985.-С. 25-

26. Емельянова Е.В. Глубинное культивирование высших грибов на пентозном гидролизате древесины /Автореф. дис... канд. техн. наук.- Л, 1989.-20 с. Заварзина А.Г., Заварзин А.А. Активность лакказы и тирозиназы в лишайниках //Микробиология. -2

28. Залашко М.В., Залашко Л.С. Микробный синтез на молочной сыворотке.- Минск: Наука и техника, 1976.- 127с. Землянухина О.А., Евдокимова О.А., Польских СВ. Лигнолитические ферменты базидиомицетов вешенки, шиитаке и кольцевика Современная микология в России: Тезисы докладов I Съезда микологов России. М., 2002.-С. 280-

29. Золотарев Ф.Н., Головина Г.И., Сивочуб О.А.. Деградация лигнина базидиомицетами Микол. и фитопатол. 1990.-т. 24.-вып. 1.- 38-

30. Иванушкина Н.Е., Мирчинк Т.Г. Влияние концентрации источников углерода на степень дифференциации грибного мицелия. Микробиология и фитопатология/- 1983. -17, -№5, 367-

31. Кадималиев Д.А., Ревин В.В., Атыкян Н.А. Особенности ферментов лигнолитического комплекса гриба Panus tigrinus ВКМ F-3616 D Современная микология в России: Тезисы докладов I Съезда микологов России.- М., 2002.- 298. 149

32. Капич А.Н. Изучение физиологических потребностей съедобного дереворазрушающего гриба Panus tigrinus (Fr.) Sing. ИБК-131 при глубинном культивировании на полусинтетических средах Микроорганизмы продуценты биологически активных веществ: Тез. докл. молодю ученых.Рига, 1981.-С. 60-

33. Капич А.Н., Стахеев И.В. на Выращивание молочной мицелия дереворазрушающих базидиомицетов сыворотке Мицелиалъные грибы (физиология, биохимия, биотехнология): Тез. докл. Всесоюзная конференция.-Пущино, 1983.- 98-

34. Капич А.Н., Стахеев И.В., Важинская И.С. Рост мицелия Panus tigrinus (Bull.:Fr.)Sing. ИБК-131 в глубинной культуре на полусинтетической среде Производство высших съедобных грибов в СССР.- Киев: Паукова думка, 1985.-С. 128-

35. Капич А.Н., Бабицкая В.Г., Стахеев И.В. Возможность накопления биомассы базидиомицетами на отходах промышленности в глубинной культуре Becцi АН БССР.- Сер. Биолог.-1980.- 1.-С. 88-

36. Капич А.Н., Бухало А.С., Стахеев И.В. Изучение роста и синтеза протеина съедобным грибом Panus tigrinus (Fr.)Sing. ИБК-131 на средах с с\х отходами Микробиологическая нромышленность: Паучн.-технич. реферат. сборник..-1983.-вып. 1.-С.2-

37. Капич А.Н., Романовец Е.С., Войт СП. Содержание

38. Капич А.Н., Щерба В.В., Стахеев И.В. Утилизация углеводов и органических кислот молочной сыворотки базидиомицетом Daedaleopsis 150

39. Капустин А.В., Тарасевич М.Р., Чирков Ю.Г., Богдановская В.А. Активный слой кислородного электрода на основе панокомпозитного материала: дисперсный углеродный носитель лакказа// Электрохимия. 2004.-т. 4 0 9 1049-1

40. Кириленко Т.е., Захарченко В.А. Рост и спороношение видов рода Penicillium Link ex Fr. при различной концентрации водородных ионов в среде Микол. и фитопатол.- 1983.- т. 17.- вып. 4.- 310-

41. Королева О.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П., Яковлева Н.С., Ландесман Е.О., Ярополов А.И. Оптимизация условий глубинного культивирования базидиомицета Coriolus hirsutus продуцента внеклеточной лакказы// Прикладная биохимия и микробиология. -2000. т. 36. Х» 1.- 30-

42. Королева О.В., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Баронина Т.С., Чеканова А., Телегин Ю.А., Сенькина З.Е., Гаевский В.Ф., Смалько П.Л. Ферментативный метод определения. В сборнике докладов семинара "Современные проблемы виноделия" на VI Международном профессиональном конкурсе вин "Лучшее шампанское, вино и коньяк года". Москва, 18-22 ноября 2002 г. 25-

43. Королева О.В., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Васильченко Л.Г., Хромоныгина В.В., Жердев А.В., Рабинович М.Л. Иммуноферментный анализ разложения гербицида почвенными и древоразрушающими грибами// Прикладная биохимия и микробиология. 2002. Т. 38, JVb4. 413-

44. Леонтьевский, А. А. Лигниназы базидиомицетов/Дис. докт. биол. наук: Пущино, 2002. -266 с. Лир X. Исследование ингибирующего действия некоторых эндоэнзимов дереворазрушающих грибов Энзимология.- 1961.- Т. 23.- 231-248. 151

45. Маслова Р.А. Влияние различных источников азота на рост дереворазрушающих грибов в кулыуре Микол. и фитопатол.-1969. т.З. вып. 5.-С. 452-

46. Маслова Р.А. Рост и развитие некоторых афиллофоровых грибов на различных питательных средах /Дис... канд.биол.наук.-Л., 1972 Маттисон Н.А., Фалина Н.Н., Якимов П. А.. Об активности протеолитических ферментов глубинных культур некоторых базидиальных грибов Продукты биосинтеза высших грибов и их использование.- М.-Л., Наука, 1966а.-С. 31-

47. Маттисон Н.Л., Низковская О.П., Милова Н.М. Влияние некоторых условий роста на активность лакказы в культуре гриба Inonotus obliquus (Fr.) Pil. Кормовые белки и физиологически животноводства.-М.-Л.: Наука, 1965 Маттисон Н.Л., Фалина Н.Н., Насскель. Активность активные вещества для целлюлолитических ферментов культуральных фильтратов Fomitopsis annosa (Fr.) Karst. в зависимости от состава питательной среды Продукты биосинтеза высших грибов и их использование.- М.-Л.: Наука, 1966.- 1

48. Мельничук Г.Г., Даниляк Н.И., Яковенко В.В. Влияние глюкозы на индуцированный биосинтез целлюлаз у Coriolus versicolor (Fr.) Quel. штамм Б-5 Тез. докл. 7 Делегат, съезда Всесоюзн. ботан. о-ва.- Донецк, 1983.-

49. Методы экспериментальной микологии. Киев: Наукова думка, 1982. -579с. Морозова Г.Р., Поправко А., Макарова М.А., Спицина Д.П., Горшина Е.С., Кинареевская Т.В., Соколова А. Биоконверсия углеводов грибами для 152

50. Морозова Г.Р., Спицина Д.Н., Макарова М.А., Прокудина Т,А,, Аксенова А.А, Получение грибной биомассы пищевого достоинства на основе молочной сыворотки Передовой производственный опыт в медицинской промышленности, рекомендуемый для внедрения: Сборник статей.- М.: ВНИИСЭНТИ, 1990.- вып. 8.- 15-

51. Низковская О. П. и Милова Н.М. К сравнительно-физиологической характеристике грибов из порядков афиллофоровых и агариковых в культуре Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства.- М.-Л.: Наука, 1965 (а).- 6-

52. Низковская О. П. Рост высших грибов в глубинной культуре Микол. и фитопатол.-1972.- т. 6.- вып. 4.- 306-

53. Низковская О.П., Милова Н.М. Особенности роста иразвития штаммов трутового гриба Inonotus obliquus (Fr.) Pil. в культуре Микол, и фитопатол.-1965.-С. 12-

54. Низковская О.П., Панькова И.М., Кочеткова Г.И., Мануковский Н.С. Окисление лигнина пшеничной соломы базидиомицетами// Микол. и фитопатол. -1984. т 18. -Вып. 2. 133-

55. Низковская, О.П., Федорова Л.М., Дроздова Т.Н.. Протеолитическая активность базидиомицетов из порядка Aphyllophorales. Молокосвертывающая активность Микол. и фитопатол.- 1980.- т. 14.- вып. 1.-С. 36-

56. Никитина В.Е., Цивилев О.М., Сорокин А.В. Лакказная и пероксидазная активности некоторых штаммов Lentinus edodes в зависимости от условия выращивания Современная микология в России: Тезисы докладов I Сьезда микологов России. М., 2002.- 284. 153

57. Паромчик И.И., Е.Н. Скачков, Е.П. Повстяная. Питательная ценность мицелия высших грибов, выращенных на картофельном сырье Производство высших съедобных грибов в СССР: Тезисы докл. II Всесоюзного совещания. Киев: Наукова думка, 1985.- 19-

58. Патент №2021371, БИ№ 19, 1

60. Патент РФ. 2002. 2000119782 Патент РФ. 2003. Ш 22005

75. ПатентРФ. 1998. J b 103031. V Патент РФ. 1994. Х» 2021371 Патент США. 2002. М 6395534. 154

77. Патент США. 2003. 6592867 Патент США. 2003. 6610

78. Патент США. 2004. 6805718 Патент США. 2004. 6815

79. Патент Франции. 2002. 2112

80. Семичаевский В.Д., И.А. Трутнева, Л.В. Нортнова. Культивирование высших дереворазрушающих базидиомицетов на лигноцеллюлозных отходах Нревращение древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях.-Рига: Зинатне, 1985.-С. 167-

81. Семичаевский В.Д., Касьянова Л.Н. Ферментативные системы высших базидиомицетов, разлагающих целлюлозу и лигнин Нревращение древесины при энзиматическом и микробиологическом воздействиях.- Рига: Зинатне, 1988.-С. 100-

82. Семичаевський В.Д. Вплыв оксиду кремню на динам1ку активностей целлюлаз та пол1галактуронидазы Coriolus versicolor (Fr.) Quel. Укр. 6oTaHi4. ж.- 1985.- т. 42.- Х» 1.- 50-52. 156

83. Скоробогатько О.В., Гиндилис А.Л., Троицкая Е.Н., Шустер A.M., Ярополов А, И.. Лакказа Coriolus hirsutus новый фермент-маркер для иммуноферментного анализа// Прикладная биохимия и микробиология. 1993.-т. 29.-N3.-С. 354-

84. Скоробогатько О.В., Джафарова А.И., Ярополов А.И. Влияние условий синтеза иммунолакказных конъюгатов на характеристики и состав получаемых соединений// Прикладная биохимия и микробиология. -1994. т. 30.-N3.-С. 477-

85. Скоробогатько О.В., Степанова Е. В., Джафарова А. И., Ярополов А. И.. Подбор оптимальных условий синтеза конъюгатов белок А-лакказа и их использование в различпых вариантах иммуноферментного анализа// Прикладная биохимия и микробиология. -1995. т. 31. -N 6. 625-

86. Скоробогатько О.В., Степанова Е.В., Гаврилова В.П., Джафарова А.П., Любимова Н.В., Ярополов А.И. Выделение, очистка и некоторые физикохимические характеристики лакказы из базидиомицета Coriolus zonatusll Прикладная биохимия и микробиология. 1998. т. 34. N 5. 490-

87. Скоробогатько О.В., Тиндилис А.Л., Шустер A.M., Троицкая Е.П., Ярополов А.И. Лакказа Coriolus hirsutus Прикладная биохимия и микробиология.- 1993.-29.-№3.-С. 354-

88. Скрябин Г.К., Головлева Л.А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе.-М.: Наука, 1976.-336с. Смирнов А., Королева О.В., Гаврилова В.П., Белова А.Б., Клячко Н.Л. Лакказы из базидиомицетов: физико-химические характеристики и субстратная специфичность по отношению к метоксифенольным соединениям// Биохимия, -2001. т. 66. Х2 7. 11А-119. 157

89. Соломко Э.Ф., Федоров О.А. Влияние рН среды на кинетику роста Pleurotus ostreatus в глубинной кулыуре Микология и фитопатология.1988,-22.-6.-С. 537-

90. Таратунина Л.В., Тарасова П.В. Глубинное культивирование высших грибов Биотехнология и промышленная экология: Труды МХТИ им. Д.И. Менделеева.-М., 1985.-вып.135.-С. 29-

91. Таратунина Л.В., Тарасова Н.В., Манаков М.П., Пехлюдов А.Д., Цибанов В.В., Ларкин A.M. Ассимиляция углерод- и азотсодержащих компонентов молочной сыворотки грибом Pleurotus ostreatus Биотехнология.- 1988.- 4.- 2.- 221-

92. Тихонова Н.А., В.П. Леванова, B.C. Борзаковская, И.А. Кузубова, Т.Н. Копытова. Глубинное культивирование высших дереворазрушающих грибов на растительных гидролизатах Превращение древесины при 158

93. Фалина Н.Н. Маслова Р.А., Якимов П.А., Андреева СМ., Алексеева Е.В. Некоторые итоги изучения базидиальных грибов как источника нолучения кормового белка и дефицитных аминокислот Растит, ресурсы.19656.-1.-№1.-С. 122-

94. Фалина Н.Н., Маслова Р.А., Якимов П.А. Сравнительные данные но аминокислотному составу мицелия глубинной культуры дереворазрушающих грибов Кормовые белки и физиологически активные вещества для животноводства.- М.-Л.: Наука, 1965а.- 39-

95. Федоренко Б.Н. Ферменты и мембраны: научные основы взаимодействия. Монография.- М.: МГУНН, 2002. 195с. Федорова Л.Н., Шиврина А.Н. Протеазы сычужного действия в культурах высших грибов Микол. и фитонатол.- 1974.- т. 8.- Ж 1.- 2

96. Черных A.M., Леонтьевский А.А., Головлёва Л.А. Новые нриемы новышения выхода лакказы гриба Panus tigrinus II Нрикладная биохимия и микробиология. 2005. том 41. 5. 578-

97. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов. -М.Л.: Наука, 1965.-198с. Шкурихин И.М. Разработка технологии крашения текстильных материалов из природных волокон с иснользованием ферментов /Дис... канд. техн. наук. М., 2003. 112с. Шлегель Г. Общая микробиология. Пер. с нем. М.: Мир, 1987. 567с. Явметдинов И.С. Лакказа и Мп-перосидаза базидиомицета Coriolus hirsutus; характеристика и роль в биосинтезе гумиподобных веществ/ Дис. канд. биол. наук. М., 2003. 138 с. 159

98. Alves AM, Record Е, Lomascolo А, Scholtmeijer К, Asther М, Wessels JG, Wosten HA. Highly efficient production of laccase by the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus Appl Environ Microbiol. -2004. Nov. -0(11) p. 6379-

99. Anderson AJ, Kwon SI, Camicero A, Falcon MA. Two isolates of Fusarium proliferatum from different habitats and global locations have similar abilities to degrade lignin FEMS Microbiol Lett. 2005. Aug 1. 249(1). p.149-

100. Arora D.S., Sandhu D.K. Laccasa production and wood degradation by Trametes hirsute// Folia microbiol. (CSSR). 1984. 29. 4. p 310-

101. Arora DS, Rampal P. Laccase production by some Phlebia species J Basic Microbiol. 2002. 42(5). -p.295-

102. Atacador-Ramos M., Palo M.A., Villadolid D.V., Cruz D.S. Study on submerged culture production of banana mushroom (Volvariella volvaceae). Mycelium as a source of protein, B-vitamins and food flavour Philipp. J. Sci.1967.- 9 6 1 P 191-

103. Baldrian P. Fungal laccase occurrens and properties FEMS Microbiol Rev 30-2006. -p.215-

104. Bauer C.G., Kuhn A., Gajovic N., Skorobogatko (Koroleva) O., Holt P.-J., Bruce N.C., Makower A., Lowe C.R., Scheller F.W. New enzyme sensors for morphine and codeine based on morphine dehydrogenase and laccase// Fresenius J. Anal. Chem., -1999. Vol. 364. P. 179-

105. Bavendamm W. *Uber Vorkommen und den Nachweiss von Oxigen Bei holz st*jrenden Pilzen// Z. Pfl. Krankh. 1928. Bd 38. s. 18-

106. Birkinshaw J.H. and Findlay W.P.K. Biochemistry of wood-rotting fungi.

107. Metabolic products of Lentinus lepideus Fr. Biochem. J. 1940.- 34.- P. 82-88. 160

108. Burkholder P.R., Sionnott E.W. Morphogenesis of fungus colonies in submerged shaken cultures.- Amer. J. Bot. -1945. -32, -№7, -p. 424-

109. Cabana H, Jiwan JL, Rozenberg R, Elisashvili V, Penninckx M, Agathos SN, Jones JP. Elimination of endocrine disrupting chemicals nonylphenol and bisphenol A and personal care product ingredient triclosan using enzyme preparation from the white rot fungus Coriolopsis polyzona Chemosphere. 2007. Mar.- 67(4). p.770-

111. Carbajo JM, Junca H, Terron MC, Gonzalez T, Yague S, Zapico E, Gonzalez AE. Tannic acid induces transcription of laccase gene cglccl in the white-rot fungus Coriolopsis gallica. Can J Microbiol. 2002. Dec- 48(12). p. 1041-

112. Chairattanamanokom P, Imai T, Kondo R, Ukita M, Prasertsan P. Screening thermotolerant white-rot fungi for decolorization of wastewaters. //Appl Biochem Biotechnol. -2006. -Mar.-128(3). -p.195-

113. Claus H. Laccases and their occurrence in prokaryotes//Arch Microbiol. 2003.-Mar.-179(3).-145-

114. Cohen Martin S., Gabriele Peter D. Degradation of by the fungi Polyporus versicolor and Poria monticola// Appl. and Environ. Microbiol. 1982.- 44.- N2 1.-p. 23-

115. Cooper СМ., Femstrom G.A., Millis S.A. Ind. Eng. Chem., 1944. V 36. p. 504. Das Arati, M. Chatterjee and Anjali Roy. Enzymes of Higher Fungi Mycol.. 1979. vol. 71.- Ш 3.- p. 530-

116. Dias AA, Bezerra RM, Pereira AN. Activity and elution profile of laccase during biological decolorization and dephenolization of olive mill wastewater// Bioresour Technol. -2004. Mar. -92(1). p.7-13. 161

117. Eddy B.P. Production of mushroom mycelium by submerged culture J. Scince of Food and Agriculture. 1958. -9. 10. p. 644-

118. Eggert C, LaFayette P.R., Temp U., Eriksson K.-E.L., Dean J.F.D. Molecular Analysis of a Laccase Gene from the White Rot Fungus Pycnoporus cinnabarinusll Appl. Environ. Microbiol. -1998. -V. 64. 5. p. 1766-1

119. Eggert C, Temp U., Eriksson KE. The ligninolytic sistem of the white rot fungus Pycnoporus cinnabarinus: purification and characterization of the laccase// Appl Environ Microbiol. 1996. 62.-p.l 151-1

120. Eichlerova I, Homolka L, Lisa L, Nerud F. The influence of extracellular H2O2 production on decolorization ability in Fungi J Basic Microbiol. -2006. 46(6).-p. 449-

121. Evans C.S., Palmer J.M. Extracellular oxidases purified from Coriolus versicolor Appl. Biochem. and Biotechnol.- 1974.- 9.- }k A, -p. 353-

122. Evans Christine S., Palmer John M., Lygnolitic activity of Coriolus versicolor J. Gen. Microbiol.- 1983.- 129.- Ш 7- p. 2103- 2

123. Fahr K, Wetzstein HG, Grey R, Schlosser D. Degradation of 2,4dichlorophenol and pentachlorophenol by two brown rot fungi// FEMS Microbiol Lett. -1999. -Jun 1. -175(1). p 127-

124. Fenice M, Giovannozzi Sermanni G, Federici F, DAnnibale A. Submerged and solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panus tigrinus on olive mill wastewater-based media. //J Biotechnol. 2003. Jan 9. 100(1). p. 77-

125. Ferapontova E.E., Shleev S., Ruzgas Т., Stoica L., Christenson A., Tkac J., Yaropolov A.L, Gorton L.. Direct electrochemistry of proteins and enzymes.An: Electrochemistry of nucleic acid and proteins: towards electrochemical sensors for 162

126. Fries N. Studies in the physiology of Coprinus.

127. Growth substance, nitrogen and carbon requirements Sven. bot. tidskr.- 1955.- 49.- 4, -p. 475

128. Gabriel M. Resherches sur la physiologic du mycelium des Basidiomicetes en aerobiose et anaerobiose Second Thesis: Universite de Lyon. 1967. p.

129. Galhaup C, Haltrich D. Enhanced formation of laccase activity by the whiterot fungus Trametes pubescens in the presence of copper// Appl Microbiol Biotechnol. 2001. Jul. -56(1-2). p. 225-32. Gao DW, Wen XH, Qian Y. Effect of nitrogen concentration in culture mediums on growth and enzyme production of Phanerochaete chrysosporium //J Environ Sci (China). 2005. -17(2). p. 190-

130. Garzillo A.M., Colao M.C., Buonocore V., Oliva R., Falcigno L., Saviano M., Santoro A.M., Zappala R., Bonomo R.P., Bianco C, Giardina P., Palmieri G., Sannia G. Structural and kinetic characterization of native laccases from Pleurotus ostreatus, Rigidoporus lignosus, and Trametes trogii II. J. Protein Chem. -2001. V 2 0 3 p. 191-

131. Ghosh A.R., S. Sengupta. Studies on biochemistry of higher fungi. I. Submerged growth of Volvariella volvalla in synthetic medium J. Food Sci. and Technol.- 1977.- 14.-№1.-p. 6-

132. Ginterova A. Nitrogen fixation by higher fungi Biologia, Bratislava. 1973.-28.-p. 199-202. Hao J, Song F, Huang F, Yang C, Zhang Z, Zheng Y, Tian X. Production of laccase by a newly isolated deuteromycete fungus Pestalotiopsis sp. and its decolorization of azo dye //J Ind Microbiol Biotechnol. -2007. Mar.-34(3). p. 233-

134. Herpoel I, Moukha S, Lesage-Meessen L, Sigoillot J, Asther M. Selection of Pycnoporus cinnabarinus strains for laccase production FEMS Microbiol Lett. 2000.-Feb 15.-183(2).-p.301-

135. Hess J, Leitner C, Galhaup C, Kulbe KD, Hinterstoisser B, Steinwender M, Haltrich D. Enhanced formation of extracellular laccase activity by the white-rot fiingus Trametes multicolor// Appl Biochem Biotechnol. 2

137. Janusz G, Rogalski J, Barwinska M, Szczodrak J. Effects of culture conditions on production of extracellular laccase by Rhizoctonia praticola. Pol J Microbiol. -2006. -55(4). -p.309-

138. Kahraman S, Yesilada O. Industrial and agricultural wastes as substrates for laccase production by white-rot fungi Folia Microbiol (Praha). 2001. -46(2). p.133-

139. Kamaya Yasushi, Higuchi Takayoshi. Metabolism of 3,4- dimethoxycinnamyl alcogol and derivatives by Coriolus versicolor Ibid. -1984. 2 4 3 p 225-

140. Kamaya Yasushi, Higuchi Takayoshi. Metabolism of non-phenolic diarylpropane lignin substructure model compound by Coriolus versicolor FEMS Microbiol Lett. 1984a. 22. 2.- p. 89-

141. Kawai M. Productivity of proteolitic enzymes and distrilution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes J. Agr. Chem. Soc. Japan. 1973. V. 47.-no 8.-p. 467-

142. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes, produced by Basidiomycetes//Agr. Biol. Chem.- 1970. -v. 34.-2 2.-p. 159-163. 164

143. Kent, Kirk T. Toward elucidating the mechanism of action of the lignolytic systems in Basidiomycetes Trends Biol. Ferment. Fuels and Chem. Proc. Symp. -Upton,-1981.-p. 131-

144. Koroleva (Skorobogatkd) O.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P., Biniukov V.L, Jaropolov A.I., Varfolomeyev S.D., Scheller F., Makower A., Otto A. Laccase of Coriolus zonatus. Isolation, Purification and some physico-chemical Properties// J. of Applied Biochemistry and Biotechnology. -1999. vol. 76. p. 115-

145. Koroleva O.V., Gavrilova V.P., Stepanova E.V., Lebedeva V.I., Sverdlova N.I., Landesman E.O., Yavmetdinov I.S., Yaropolov A.I. Production of lignin modifying enzymes by co-cultivated White-rot fungi Cerrena maxima and Coriolus hirsutus and characterization of laccase from Cerrena maximalI Enzyme and Microbial Technology. -2002. vol. 30. Xo 4. p. 573-

146. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Binukov V.I., Timofeev V.P., Pfeil W. Temperature-induced changes in copper centers and protein conformation of two fungal laccases from Coriolus hirsutus and Coriolus zonatus// Biochimica et Biophysica Acta (BBA) Protein Structure and Molecular Enzymology. -2001. vol. 1547.-0 2.-p. 397-

147. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Gavrilova V.P., Yakovleva N.S., Landesman E.O., Yavmetdinov I.S., Yaropolov A.I. Laccase and Mn-Peroxidase Production by Coriolus hirsutus strain 075 in a Jar Fermenter// Journal of Bioscience and Bioengineering. -2002. -vol. 93.- N 5. p. 449-

148. Koroleva O.V., Stepanova E.V., Landesman E.O., Vasilchenko L.G., Khromonygina V.V., Zherdev A.V., Rabinovich M.L. In vitro degradation of the herbicide atrazine by soil and wood decay fungi controlled through ELISA 165

149. Koroleva OV, Stepanova EV, Gavrilova VP, Iakovleva NS, Landesman EO, Iaropolov Al.Optimization of conditions for cultivation of the basidiomicete Coriolus hirsutus-producer of extracellular laccase Prikl Biokhim Microbiol. 2000.-№36.-c.30-

150. Koroleva O.V., Rebrikov D.V., Stephanova E.V., Pegasova T.V., Landesman E.O., and Gavrilova V.P., Molecular Analysis of a Laccase Gene from the White Rot Fungus Coriolus hirsutus. 2002, GenBank Accession number AAL89

151. Koroleva-Skorobogaf ко О., Stepanova E., Gavrilova V., Morozova O,, Lubimova N., Dzchafarova A., Jaropolov A., Makower A. Purification and Characterization of the Constitutive form of Laccase from the Basidiomycete Coriolus hirsutus and effect of Inducers on Laccase Synthesis/ J. of Biotechnology and Applied Biochemistry. -1998, -v. 28, pp. 47-

152. Koroljova (Skorobogatko)O., Stepanova E., Gavrilova V., Morozova O., Lubimova N., Dzchafarova A., Jaropolov A., Makower A.. Purification and Characterization of the Constitutive form of Laccase from the Basidiomycete Coriolus hirsutus and effect of Inducers on Laccase Synthesis// J. of Biotechnology and Applied Biochemistry. -1998. v. 28.- p. 47-

153. Kossen N.W.F., Metz B. Growth and Activity of Mycelial Pellets Abstr. 5 th Intern, ferment, symp. -Berlin, 1976. p.

154. Kiiskinen L.-L., Ratto M. and Kruus K. Screening for novel laccaseproducing microbes// Journal of Applied Microbiology. -2004. V 97. p

155. Kuznetsov B.A., Shumakovich G.P., Koroleva O.V., Yaropolov A.I. On applicability of laccase as label in the mediated and mediatorless electroimmunoassay: effect of distance on the direct electron transfer between laccase and electrode// Biosensors and Bioelectronics. -2001. vol. 16. 1-2. p. 73 84. 166

156. Leatham Gary F,, Kirk T, Kent, Regulation of lignolytic activity by nutrient nitrogen in white-rot basidiomycetes FEMS Microbiol, Lett, 1983. 16, X" 1,-p, 65-

157. Leonowicz A., Edgehill R.U., Bolag J, -M. The effect of syringic and vanilic acids by the laccases of Rhizoctonia praticola and Trametes versicolor Arch. Microbiol, 1984. 137, 2, p. 89-96, Leontievsky A,A., Myasoedova NM, Baskunov BP, Evans CS, Golovleva LA. Transformation of 2,4,6-trichlorophenol by the white-rot fungi Panus tigrinus and Coriolus versicolor Biodegradation. -2000, -N2 11, p, 331-

158. Levemoche D,, Jurasek L., Derochers M., Dorica J,, Veliky LA, Removal of color fromkraft mill wastewaters with cultures of white-rot fungi and with immobilized mycelium of Coriolus versicolor Biotechnol, and Bioeng.- 1983,25,-№ 8,-p, 2055-2

159. Lorenzo M, Moldes D, Rodriguez Couto S, Sanroman MA. Inhibition of laccase activity from Trametes versicolor by heavy metals and organic compounds// Chemosphere. -2005. Aug. -60(8). p. 1124-

160. Marco-Urrea E, Gabarrell X, Sarra M, Caminal G, Vicent T, Reddy CA. Novel aerobic perchloroethylene degradation by the white-rot fungus Trametes versicolor//Environ Sci Technol. -2006. -Dec 15. 0(24). p 7796-

161. Marques De Souza CG, Zilly A, Peralta RM. Production of laccase as the sole phenoloxidase by a Brazilian strain of Pleurotus pulmonarius in solid state fermentation J Basic Microbiol. -2002. 2(2). p. 83-

162. Mattinen ML, Hellman M, Permi P, Autio K, Kalkkinen N, Buchert J. Effect of protein structure on laccase-catalyzed protein oligomerization Chem.-2006.-Nov 15.-54(23). p 8883-

163. Madzak C, Otterbein L, Chamkha M, Moukha S, Asther M, Gaillardin C, Beckerich JM. Heterologous production of a laccase from the basidiomycete Pycnoporus cinnabarinus in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica// FEMS Yeast Res. -2005. Apr. -5(6-7). p.635-

164. Mikiashvili N, Elisashvili V, Wasser S, Nevo E. Carbon and nitrogen sources influence the ligninolytic enzyme activity of Trametes versicolor// Biotechnol Lett. -2005. Jul. 27(13). p. 955-9. MuUer H.W., Trosch W. Screening of white-rot fungi for biological pretreament ofwheat straw for biogas prodaction// Appl. Microbiol. and //J Agric Food Biotechnol. 1986. -24. №2. p 180-

165. Nyanhongo GS, Gomes J, Gubitz G, Zvauya R, Read JS, Steiner W. Production of laccase by a newly isolated strain of Trametes modesta// Bioresour Technol. 2002. Sep. 84(3). -p. 259-63. 168

166. Orsler R.J., Holland G.E. Degradation of tributiltin oxide by fungal culture filtrates Int. Biodeterior Bull. 1982, -18, 4, p. 95-

167. Pozdnyakova N.N., Rodakiewicz-Nowak J., Turkovskaya O.V. Catalytic properties of yellow laccase from Pleurotus ostreatus Dl J. Molec. Catal. 2004.-Vol. 30.-p. 19-

168. Record E, Punt PJ, Chamkha M, Labat M, van Den Hondel CA, Asther M. Expression of the Pycnoporus cinnabarinus laccase gene in Aspergillus niger and characterization of the recombinant enzyme. Eur J Biochem. -2002. Jan. 269(2).-p. 602-

169. Reinhammar B.R.M. Oxidation-reduction potentials of the electron acceptors in laccases and stellacyanin// Biochim. Biophys. Acta. -1972. -V. 275, Xo 2 p 245-259. 169

170. Rodriguez S, Fernandez M, Bermudez RC, Morris H. Treatment of coloured industrial effluents with Pleurotus spp Rev Iberoam Micol. -2003. Dec.-20(4).-p. 164-

171. Rosenberg S.L. Pattern of diffusibility of lignin and carbohydrate degrading systems wood-rotting fungi// Mycologia, -1980. 72 (4). p. 798-

172. Ryan D, Leukes W, Burton S. Improving the bioremediation of phenolic wastewaters by Trametes versicolor Bioresour Technol. -2007. Feb. 98(3). p. 579-

173. Salony, Mishra S, Bisaria VS. Production and characterization of laccase from Cyathus bulleri and its use in decolourization of recalcitrant textile dyes Appl Microbiol Biotechnol. -2006. Aug. 71(5). p. 646-53 Sandru D.K., Arora D.S. Laccase production by polyporus versicolor on different substrates Acta biotechnol. 1984. 4. -№1. p.

174. Shin KS, Lee YJ. Purificanion and characterization of a new member of the laccase famili from the white-rot basidiomicete Coriolus hirsutus// Arch Biochem Biophys. -2000. -№384. p. 109-

175. Shleev S., Christenson A., Serezhenkov V., Burbaev D., Yaropolov A., Gorton L., Ruzgas T. Electrochemical redox transformations of Tl and T2 copper sites in native Trametes hirsuta laccase at gold electrode//Biochemical J. -2005a. V. 385.-Pt3.-p. 745-754 Shleev S., Tkac J., Christenson A., Ruzgas Т., Yaropolov A.I., Whittaker J.W., Gorton L. Direct electron transfer between copper-containing proteins and electrodes// Biosens. Bioelectron..- 2005b. -V. 20. 12. P. 2517-2554. 170

177. Skorobogatko O.V., Gindilis A.L., Troitskaya E.N., Shuster A.M., Yaropolov A.I.. Laccase as a new enzymatic label for enzyme immunoassay// Anal, letters. -1994. -V.27. -N

178. Starka J. Sumbersni pestovani vyssych hub Ceska mycologia. 1955.- 9.№3.-s. 97-

179. Starka J., Schanel L. The effect of extracellular enzymes of wood-rotting fungi on wood Folia Microbiol. 1962. 7. p. 155-

180. Tamagawa Y, Hirai H, Kawai S, Nishida T. Removal of estrogenic activity of endocrine-disrupting genistein by ligninolytic enzymes from white rot fungi FEMS Microbiol Lett. -2005. Mar. -244(1). p. 93-

181. Tamagawa Y, Yamaki R, Hirai H, Kawai S, Nishida T. Removal of estrogenic activity of natural steroidal hormone estrone by ligninolytic enzymes from white rot fungi// Chemosphere. -2006. Sep. -65(1). p 97-

182. Epub 2006 АргЗ. Targonski Zdzislaw. Uzdolnienia niektorych szczepow grzybow z klasy basidiomycetes do biodegradacji cellulozy i substratow lignocellulozowych// Acta mycol., 1983. (1985). 19. 2. p. 323-

183. Tavares AP, Coelho MA, Agapito MS, Coutinho JA, Xavier AM. Optimization and modeling of laccase production by Trametes versicolor in a bioreactor using statistical experimental design// Appl Biochem Biotechnol. -2006. -Sep.-134(3).-p. 233-

184. Tekere M, Zvauya R, Read JS. Ligninolytic enzyme production in selected sub-tropical white rot fungi under different culture conditions// J Basic Microbiol. -2001.-41(2).-p. 115-29. 171

185. Tong P, Hong Y, Xiao Y, Zhang M, Tu X, Cui T. High production of laccase by a new basidiomycete, Trametes sp.// Biotechnol Lett. -2007. Feb. 29(2).-p. 295-

186. Trupkin S, Levin L, Forchiassin F, Viale A. Optimization of a culture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology J Ind Microbiol Biotechnol. 2003. -Dec. 30(12).-p. 682-

187. Verma P, Madamwar D. Production of ligninolytic enzymes for dye decolorization by cocultivation of white-rot fungi Pleurotus ostreatus and phanerochaete chrysosporium under solid-state fermentation Appl Biochem Biotechnol. 2002. Jul-Dec. 102-103(1-6). p. 109-

188. Wang JW, Wu JH, Huang WY, Tan RX. Laccase production by Monotospora sp., an endophytic fungus in Cynodon dactylon// Bioresour Technol. -2006. Mar. 97(5). p. 786-

189. Xiao YZ, Wang J, Wang YP, Pu CL, Shi YY. Studies on production, purification and partial characteristics of the extracellular laccase from Armilliria mellea Sheng Wu Gong Cheng Xue Bao. -2002. Jul. 18(4). p. 457-

190. Yaver DS., Xu F, Golightly EJ, Brown KM, Brown SH, Rey MW, Schneider P, Halkier T, Mondorf K, Dalboge H. Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa Appl Environ Microbiol. 1996. 62. p. 834-

191. Yoshida Т., Shimizu Т., Taguchi H., Teramoto S. Studies on submerged cukture of Basidiomycetes. 3. The oxygen transfer within the pellets of Lentinus edodes J. Ferment. Technol. 1967. 45. 12. p. 1119-1

192. Zhang H, Hong YZ, Xiao YZ, Yuan J, Tu XM, Zhang XQ. Efficient production of laccases by Trametes sp. AH28-2 in cocultivation with a Trichoderma strain. //Appl Microbiol Biotechnol. -2006. Nov. 73(1). p. 8994. 173