Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов

Дмитриева, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов"

ДМИТРИЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

Лл-и? д ¿Я.

ИЗУЧЕНИЕ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ТЕХНИЧЕСКИХ НАУК

4844300

4844365

ДМИТРИЕВА ТАТЬЯНА АЛЕКСАНДРОВНА

ИЗУЧЕНИЕ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩЕЙ АКТИВНОСТИ ВЫСШИХ БАЗИДИОМИЦЕТОВ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА ТЕХНИЧЕСКИХ НАУК

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский

государственный технологический институт (технический университет)»

Научный руководитель -

Кандидат технических наук, доцент Шамцян

Марк Маркович

Официальные оппоненты -Доктор биологических наук,

профессор Блинов

Николай Петрович

Доктор технических наук,

доцент Куприна

Елена Эдуардовна

Ведущая организация - Государственная химико-фармацевтическая академия, г.Санкт-Петербург. ~ л

Защита состоится «¿рС(Г » Я/мС**^_2011 года в ' часов,

ауд. на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.230.04 при государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)»

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке института

Отзывы на автореферат в одном экземпляре, заверенные печатью, просим направлять по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., д.26, Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет).

Ученый совет; тел. 494-93-75, факс 712-77-91, Email: dissovet@lti-gti.ru.

Автореферат разослан

2011 г.

Ученый секретарь совета, кандидат технических наук, доцент

Шамцян М.М.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Процесс получения сырно-творожных продуктов из молока был знаком человеку более восьми тысяч лет назад. Но только в XX веке были завершены детальные исследования на молекулярном уровне, позволившие прояснить сложный механизм сычужного свертывания молока. И, тем не менее, процесс ферментативного створаживания молока продолжает оставаться одним из сложных и тонких технологических процессов современного пищевого производства. Связано это с тем, что технология створаживания молока, например, в сыроделии, включает в себя несколько тесно взаимозависимых факторов физической, химической и биологической природы, существенно влияющих на качество и выход целевого продукта. При этом биологическая компонента процесса является наиболее важной, т.к. качество исходного молочного сырья и биологические особенности разных продуцентов часто сильно варьируют и амплитуда этих изменений не всегда может быть своевременно выявлена и учтена производителями. Ключевым моментом любого сырного производства является выбор молокосвертывающего фермента (МСФ), именно этим фактором определяются вкусовые качества готового продукта. При выборе соответствующих препаратов протеиназ определяющим аргументом является соотношение уровней молокосвёртывающей активности (МСА) и общей протеолитической активности (ПА).

Тысячелетиями в сыроделии для свертывания молока использовали сычужный фермент, образующийся в одном из отделов желудка молодняка жвачных животных. Однако, в последние десятилетия во многих странах мира возник острый дефицит животного сырья, который, естественно, повлёк за собой и дефицит сычужных ферментов. Сложившаяся ситуация привела к тому, что в сыроделии стали применять препараты-заменители относительно близкие к сычужному ферменту по действию на молочный субстрат, например, комплексы пепсинов с другими протеазами, продуцируемыми микроорганизмами. Замена дорогостоящего сычужного фермента (по-прежнему являющегося общепризнанным стандартом) бактериальными или грибными протеиназами узкого протеолитического действия, продолжает оставаться важной задачей современной биотехнологии, поскольку способствует решению актуальной и экономически важной проблемы, существующей в сыродельной отрасли.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось выделение, характеристика свойств и оценка перспективы использования штаммов высших базидиомицетов в технологии створаживания молока

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи: -провести отбор продуцентов с выраженным биосинтезом протеиназ молокосвертывающего действия среди культур 11 видов базидиомицетов, выращенных в глубинных условиях;

-подобрать для выявленных культур оптимальные условия роста и биосинтеза молокосвёртывающих ферментов в условиях глубинного культивирования; -провести анализ культуральной жидкости продуцентов на содержание ферментов молокосвертывающего действия и оценить в них соотношение уровней

специфической молокосвёртывающей активности и общей протеолитической активности;

-подобрать условия и методы концентрирования, а также выделения и очистки ферментных молокосвёртывающих препаратов из культуральной жидкости продуцентов;

-оценить молекулярную массу полученных ферментов (методом гель-фильтрации);

-определить кинетические параметры выделенных ферментов;

-сравнить характеристики «базидиальных» молокосвёртывающих препаратов с

аналогичными стандартными препаратами животного происхождения.

Научная новизна работы. Представленная работа является первым исследованием протеиназ молокосвёртывающего действия из культур базидиальных грибов, характерных для лесной зоны Северо-западного региона России и хранящихся в Коллекции кафедры микробиологического синтеза Технологического института. Из 24 видов макромицетов, представленных в коллекции, в динамике глубинного роста изучено 11 видов базидиомицетов, из них для шести видов грибов биосинтез молокосвёртывающих ферментов изучен впервые.

Впервые показано, что соотношение в среде основных источников питания (C:N) регулирует не только уровень молокосвёртывающей активности культур, но и оказывает значительное влияние на весь спектр субстратной специфичности протеиназ, синтезируемых продуцентами.

Впервые установлено, что зависимость синтеза молокосвёртывающих ферментов с узкой или широкой субстратной специфичностью (МСА и ПА) и их соотношение, регулируется в глубинных условиях не только соотношением источников углерода и азота, но и существенно зависит от природных трофических особенностей, характерных для данного вида макромицета.

Практическая значимость работы. В условиях глубинного культивирования проведён выбор высших базидиальных грибов - продуцентов протеиназ молокосвёртывающего действия.

Подобраны составы питательных сред и условия культивирования отобранных видов базидиомицетов.

Разработаны методы выделения и очистки молокосвёртывающих препаратов из культурального фильтрата (КФ) продуцентов.

Разработанные способы получения молокосвёртывающих препаратов из культур базидиальных грибов позволяют получать ферментные препараты с высоким уровнем молокосвёртывающей активности на фоне низкого уровня общей протеолитической активности.

Проведена сравнительная характеристика ферментативных и физико-химических свойств полученных из базидиомицетов молокосвёртывающих препаратов и коммерческого сычужного препарата, используемого в практике сыроделия. Показано, что по уровню и специфичности молокосвёртывающей активности препараты из культур базидиомицетов сопоставимы с образцами сычужного препарата животного происхождения.

Предлагаемые в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов культуры высших базидиальных грибов, в отличие от культур микромицетов, в ходе биотехнологического процесса не имеют стадии спороношения, что исключает опасность соответствующих профзаболеваний персонала (кандидозы, микозы, аллергические реакции и т.п.) и способствует экологической чистоте рабочих помещений.

Реализация результатов. Материалы диссертации реализованы в учебном процессе кафедры технологии микробиологического синтеза Санкт-Петербургского Государственного Технологического Института ( Технического Университета): при выполнении научно исследовательских работ по следующим темам «Биологически активные вещества высших грибов, получаемые при их глубинном культивировании» и «Биомедицинский и пищевой потенциал высших базидиомицетов».

Апробация работы. Результаты исследований были доложены: на 2-ом Центральном европейском пищевом конгрессе (Будапешт,2004), 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), "ВЮСАТ-2004"(НатЬи^, 2004), Ш-ем Международным Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийском конкурсе инновационных проектов «Живые системы» (Киров, 2005), 3-ем Центральном европейском пищевом конгрессе (Болгария, 2006), XI Международном конгрессе по микробиологии (Болгария, 2006), 5-ом Международном конгрессе по пищевой биотехнологии (Греция, 2007), 13-ом международном симпозиуме по биотехнологии (Китай, 2008), 14-ом международном конгрессе по пищевой науке и технологии (Китай, 2008).

Положение, выносимое на защиту.

• Культуры базидиальных микромицетов - продуцентов протеиназ молокосвертывающего действия, депонированные в Коллекции кафедры микробиологического синтеза Санкт-Петербургского Государственного Технологического Института.

• Схема выделения и очистки ферментативных препаратов, обладающих молокосвертывающей активностью.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 22 работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора, двух глав по результатам экспериментальной работы и их обсуждению, выводов, списка использованных литературных источников, включающих 117 наименований. Работа изложена на 167 страницах машинописного текста, включает 37 рисунков и 40 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Аналитический обзор. Изложены современные представления о молокосвертывающих ферментах различного происхождения, их физико-химических свойствах, механизме действия. Особое внимание уделено существующим в практике сыроделия заменителям сычужного фермента, отмечены их достоинства и недостатки. Обсуждается актуальность проблемы

замены природного сычужного фермента более экономически выгодными препаратами бактериального и грибного происхождения. Представлены и обсуждены научно-методические основы биосинтеза молокосвертывающих ферментов различными продуцентами, способы концентрирования и очистки этих ферментов, методы получения физико-химических характеристик.

Глава 2. Материалы и методы исследований. Объектами настоящего исследования служили культуры высших базидиальных грибов, хранящиеся на косяках сусло-агара (сусло 4%, агар 2%) при 4-6°С в Коллекции кафедры микробиологического синтеза Технологического института (Технического университета) г. Санкт-Петербурга. В результате предварительного скрининга культур (по характеру и скорости роста на твердой среде) в качестве объектов исследования были выбраны следующие виды базидиомицетов: Trámeles snaveolens (L.:Fr.) Fr., Trámeles ochracea (Pers.)Gilb.et Ryvarden, Forties fomentarius (L.:Fr.) Fr., Ganoderma lucidum (Leyss.: Fr.) P.Karst., Cerrena sp. (Fr.) Murr., Bjerkandera adusta (Fr.) Karst., Grifóla frondosa (Dicks.: Fr.) Gray, Flammulina velutipes (Fr.) P.Karst., Partus conchatus (Bull.: Fr.) Fr., Coprinus lagopides P.Karst., Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Quel. Основные физиолого-биохимические и культурально-морфологические характеристики указанных видов были изучены в динамике глубинного роста. Культивирование проводили в колбах Эрленмейера объемом 0,75 л с 250 мл питательной среды на роторной качалке (230 об/мин) при 26-28°С (Flammulina velutipes при 20- 220С) на глюкозо-пептонной (контрольной) среде следующего состава (г/л): глюкоза - 10; пептон - 2.5; КН2Р04 - 0.6; К2НР04 -0.4; СаС12 - 0.05; NaCl - 0.5; дрожжевой экстракт - 2.0 (по сухому весу); pH среды до стерилизации 5.8-6.0.

Прирост биомассы определяли по абсолютно сухому весу, содержание белка стандартным методом Лоури, расход Сахаров - о-толуидиновым методом. Уровень МСА определяли по методу Каваи-Мукаи, за величину МСА принимали время (мин), затраченное на образование молочного сгустка. За единицу МСА принимали количество фермента, которое свёртывает 100 мл молока за 40 мин при 35°С. Расчёт МСА вели по Типографу и Петиной:

МСА =-ед./мл,

П*2

где К - коэффициент разведения КФ или препарата фермента, Я - время (мин), в течение которого из молока при добавлении КФ или раствора фермента образуется плотный сгусток,

40 - среднее время (мин), за которое при производстве сыра происходит створаживание 100 мл молока,

2 - количество (мл) вносимого фермента (или КФ).

Уровень общей ПА оценивали по стандартному методу ГОСТ «20264.2 -88», основанному на гидролизе казеиновых белков.

Для выделения и изучения ферментных препаратов из КФ продуцентов использованы разнообразные методы концентрирования - вакуум-выпаривание (роторная установка, 50°С), ультрафильтрация (ячейка непроточного типа «ФК 01-1000», мембрана «МИФИЛ-ПА-20» с пределом номинального молекулярно-

массового задерживания 20 кОа), а также методы фракционирования - дробное низкотемпературное (-20°С) осаждение этанолом, диализ (целлюлозные пленки) с последующей лиофильной сушкой в щадящем режиме.

Молекулярную массу полученных ферментных препаратов оценивали методом гель-фильтрации на колонках с Сефадексом 0-75 и Биогелем-300 (откалиброваны стандартными белками с ММ в диапазоне 14-70 кОа).

Кинетику ферментативной активности полученных молокосвертывающих препаратов характеризовали через максимальную скорость протеолитической реакции и константу Михаэлиса. Данные кинетические параметры определяли на основе линеаризации уравнения Михаэлиса-Ментен в обратных величинах:

1/у={Кп/Утах*[8]} + 1/Утах> где V - скорость реакции, Ути - максимальная скорость реакции, Кт - константа Михаэлиса, Бо - концентрация субстрата.

Глава 3. Результаты и обсуждение. Выбор продуцентов проводили среди культур грибов класса Ва.ч1сИотусе1е5 из порядков АрИуИорИогакя и А^апсаШ б.!.

Молокосвертывающая активность культур 7-и видов афиллофоровых и 4-х видов агариковых базидиомицетов представлена в табл.1.

Таблица 1 - Молокосвертывающая активность в КФ исследованных видов грибов

Виды базидиомицетов Время коагуляции молока, мин Молокосвертывающая активность, Е/мл

Trametes suaveolens 57.00±0.20 3.50±0.01

Grifóla frondosa 64.00±0.20 3.13±0.01

Flammulina velutipes 48.00±0.25 4.20±0.02

Coprinus lagopides 15.00±0.15 13.3Ш.13

Trametes ochracea 35.00±0.13 5.70±0.02

Fomes fomentarius 68.00±0.20 2.94±0.02

Ganoderma lucidum 53.00±0.20 3.77±0.01

Cerrena sp. 10.40±0.15 19.23±0.02

Bjerkandera adusta 82.00±0.20 2.44±0.01

Panus conchatus 74.20±0.20 2.70±0.02

Pleurotus ostreatus 62.20±0.20 3.20±0.02

Афиллофоровые базидиомицеты по эколого-трофическим свойствам относятся к ксилотрофам, вызывающим в природе разрушение древесины по типу белой или бурой гнили. Их ферментный аппарат включает широкий спектр гидролаз и оксидаз, что позволяет им разрушать сложные лигно-целлюлозные компоненты древесины. Эта экологическая группа легко адаптируется к

искусственным условиям культивирования и является объектом широкого биотехнологического изучения.

Указанные виды грибов в динамике глубинного роста на контрольной среде демонстрируют широкий диапазон МСА - время коагуляции молока варьировало от 10 до 80 мин. Представленные виды по степени убывания МСА располагались в следующем порядке - Cerrería sp.>Coprinus lagopides > Trámeles ochracea >Flammuiina velutipes>Ganoderma lucidum>Trametes suaveolerts >Pleurotus ostreatus > Grifóla frondosa > Fomes fomentarius > Partus conchatus>Bjerkandera adusta., Следует отметить, что в практике сыроделия, малоактивными принято считать МСФ, не створаживающие молоко в течение 60 мин. На основании полученных результатов, культуры Coprinus lagopides и Cerrería sp. (время коагуляции 15 и 10 мин, соответственно) были отобраны для дальнейшего изучения в качестве потенциальных продуцентов молокосвёртывающих ферментов. В ходе работы были изучены культурально-морфологические признаки выбранных продуцентов, подтверждающие надежность их видовой идентификации.

Гифальная система продуцента Coprinus laeopides мономитическая. В культуре гифы двух типов - недифференцированные длинноклетные и дифференцировавшиеся из них мешковидные гифы.Характерным признаком культуры является обильное образование склероциев (плотно упакованных генеративных гиф) буроватого цвета, волокновидных, иногда содержащих вздутые запасающие клетки (10-20 мкм в диаметре).

В глубинных условиях культура продуцента развивается, как и большинство культур базидиальных макромицетов, в виде пушистых пеллет (шариков), средний диаметр пеллет Coprinus lagopides 5-7 мм. Изменения цвета культуральной жидкости в процессе ферментации не происходит.

Гифальная система культуры Cerrena sp. характеризуется двумя типами гиф: тонкостенными генеративными (1.5-2.0 мкм) с пряжками, и толстостенными, (2.0-3.0 мкм). В поверхностной культуре встречаются слабоизогнутые пальцевидные пряжки. Такая форма пряжек, а также образование палочковидных артроконидий могут служить отличительным морфологическим признаком культуры Cerrena sp.

В глубинных условиях образует главным образом мелкие, пушистые пеллеты диаметром 3-5 мм, а также более крупные с полым центром. Во время роста культуры происходит некоторое осветление культуральной жидкости.

Подбор условий для культивирования и биосинтеза молокосвёртывающих ферментов потенциальными продуцентами проводили в условиях глубинного роста культур на натуральной и полусинтетической средах. В состав натуральной среды включали пивное сусло (сахара 4%) и соевую муку (10%), рН среды до стерилизации 5.8-6.0. В качестве полусинтетической среды исследовали 10 вариантов с разным соотношением основных компонентов питания (табл.2).

Таблица 2- Состав различных вариантов глюкозо-пептонной питательной среды

Состав, № среды г/тт 1 2 3 4 S 6 7 8 9 10

Глюкоза 5 5 5 10 10 10 15 15 15 40

Пептон 1 2.5 4 1 2.5 4 1 2.5 4 10

дрожжевой экстракт 2 2 2 2 2 2 2 2 2 2

C:N 12:1 5:1 3:1 25:1 10:1 6:1 40:1 15:1 9:1 10:1

Примечание, в состав каждой среды входили минеральные соли, в концентрациях (г/л): ЫаС1 -0.5; КН2Р04 -1; Мё804-0.5; СаС12 -0.05; Ре804*7Н20 -0.005; 2п804*7Н20-0.001.

Ниже представлена сравнительная характеристика роста и биосинтеза молокосвёртывающих ферментов отобранными продуцентами на средах, которые различались двумя важными факторами - источниками основных компонентов питания «С» и «N» (варианты - полусинтетическая и натуральная среды) и количественным содержанием компонентов питания при одинаковом их соотношении (варианты №5 и №10 глюкозо-пептонной среды).

В табл.3 представлен характер роста продуцента Coprimis lagopides на таких вариантах сред. Можно видеть, что максимальный синтез биомассы (9.3 г/л) культурой С. lagopides происходит на натуральной среде с «богатым составом» источников питания. На глюкозо-пептонной среде в контрольном варианте (№ 5) максимум биомассы был значительно ниже - 6.4 г/л. Однако, если увеличить абсолютные значения основных компонентов (вариант №10), то культура продуцента в те же сроки достигает максимума, сравнимого с ростом на натуральной среде (8.9 г/л). Но при этом значительная часть углеводов не будет израсходована, что делает такой вариант среды экономически не выгодным.

Таблица 3 - Динамика накопления биомассы и потребления источника углерода культурой Соргтш \azopides на полусинтетической и натуральной средах_

Сроки культиви рования, сутки Полусинтетическая среда (г/л) : глюкоза 10, пептон 2.5, C/N= 10:1 Полусинтетическая среда (г/л): глюкоза 40, пептон 10, C/N = 10 : 1 Натуральная среда (сусло 4% по Б, соевая мука 1%)

Биомасса, г/л Глюкоза, мг/мл биомасса, г/л глюкоза, мг/мл биомасса, г/л глюкоза, мг/мл

4 3.2+0.2 6.80±0.05 4.5+0.2 33.20+0.05 5.1+0.2 3.40+0.04

5 3.8±0.2 6.30±0.10 6.0+0.2 29.50+0.10 5.4+0.2 2.80+0.02

6 4.6±0.2 4.40+0.02 7.5+0.2 26.10+0.10 7.8+0.2 1.95+0.05

7 5.4+0.2 2.64+0.10 8.0+0.2 25.8+0.05 8.9+0.2 1.03+0.05

8 6.4±0.2 0.83+0.05 8.9+0.2 24.3+0.06 9.3+0.2 0.86+0.05

Динамика изменения молокосвёртывающей активности в КФ С. ^¿ор'^ея при росте на указанных вариантах питательных сред представлена на рис.1.

5 6 7

время культивирования, сут

-полусинтетическая среда (C:N -10:1) -полусинтетическая среда (C:N -10:1,глюкоза -40г/л) - Натуральная среда

У культуры C.lagopides биосинтез молокосвертывающих ферментов на указанных средах носит симбатный характер, при этом натуральная среда обеспечивает в 2 раза более высокий уровень МСА, чем варианты глюкозо-пептонной среды. Поэтому, для выделения ферментных препаратов из КФ этого продуцента целесообразно использовать натуральную среду, тем более, что на ней наблюдается и максимальный уровень Рис.1 - Молокосвертывающая активность биомассы Coprinus lagopides в динамике роста культуры на разных питательных средах

Динамика накопления биомассы и потребления Сахаров культурами продуцентов Cerrena sp. и Coprinus lagopides на указанных вариантах сред практически не отличалась. Однако синтез ферментов с молокосвёртывающей активностью у этих продуцентов существенно различался своей зависимостью от природы используемых основных источников питания. Динамика МСА при культивировании Cerrena sp. на указанных вариантах питательных средах представлена на рис. 2.

20 Уровень МСА Cerrena sp.

при культивировании на полусинтетической среде был в обоих вариантах выше в 3 раза , чем при росте на натуральной среде, т.е. диаметрально противоположно культуре

Coprinus lagopides. В связи с этим дальнейшее изучение биосинтеза молокосвёртывающих протеиназ продуцентом Cerrena

Рис.2 - Молокосвертывающая активность в вр.продолжили на других разных КФ Cerrena sp. при росте на натуральной и вариантах глюкозо-пептонной полусинтетической средах среды.

Поиск оптимального состава сред для направленного биосинтеза МСФ отобранными продуцентами изучали на 10 вариантах полусинтетической среды с разным соотношением в ней источников С и N. В динамике роста, на 4-7 день, когда наблюдался активный биосинтез молокосвертывающих ферментов, оценивали содержание биомассы, аммонийного азота и потребление глюкозы.

время культивирования, сут

-полусинтетическая среда (C:N -10:1) - полусинтетическая среда (C'.N -10:1, глюкоза -40г/л) -Натуральная среда

Сравнение физиологического состояния Cerrena sp. представлено в табл.4. Таблица 4- Характеристика физиологического состояния культуры Cerrería sp. в

разных трофических условиях

К* шпате ль ной среды Исходное содержание глюкозы, г/л Исходное содержание пептона, г/л C:N Содержание биомассы, г/л <7сут) Потребление источника «С», % (7 сут) Потреблени е источника «N», % (7 сут) МСА, Е/мг

i 5 1 12:1 2.3±0.1 93 88 21.10±0.15

2 5 2.5 5:1 3.3±0.1 79 52 7.43±0.03

3 5 4 3:1 3.5±0.1 94 72 6.14±0.05

4 10 1 25:1 3,8±0.1 92 11 25.70±0.20

5 10 2.5 10:1 4.0±0.2 98 29 19.00±0.10

б 10 4 6:1 4.3±0.1 98 44 5.25±0.05

7 15 1 40:1 3.9±0.1 96 49 33.42±0.20

8 15 2.5 15:1 5.0±0.2 94 40 9.50±0.05

9_ 15 4 9:1 5.6±0.2 78 58 27.70±0.20

10 40 10 10:1 6.0±0.2 13 52 12.53±0.20

Данные свидетельствуют, что синтез биомассы не зависит от соотношения в среде источников углерода и азота, а определяется их абсолютными значениями (аналогично, как и у Coprirtus lagopides). Источник углерода Cerrena sp. активно потребляет на всех вариантах сред и к моменту достижения максимального уровня МСА (7 сут) вся глюкоза уже практически утилизирована (80-98%), исключение составил лишь вариант среды №10, в котором заведомо было задано высокое содержание глюкозы. В то же время источник N потреблялся с разной степенью интенсивности. На самой «бедной» среде (№1) аммонийный азот израсходован практически полностью (-90%). В остальных вариантах наблюдалась достаточно сходная динамика потребления азота (40-70%), за исключением среды №4. В этом варианте культура Cerrena sp. активно синтезировала молокосвёртывающие протеиназы на фоне очень экономного расхода источника азота - за период с 4 по 7 сутки культура израсходовала всего лишь 11% аммонийного азота.

Сравнительное изучение уровня МСА и общей неспецифической ПА проводили в отобранных для продуцентов условиях - на полусинтетической и натуральной средах для культуры Coprinus lagopides и на различных вариантах полусинтетической среды для культуры Cerrena sp.

Как известно, по технологическим требованиям сыроделия желательно, чтобы молокосвёртывающие ферменты, предназначенные для выработки высококачественных сыров, имели соотношение МСА/ПА в пределах 800-1000.

Характеры изменения МСА и ПА в динамике роста культур представлены на рис. 3-5.

5 6 7 8 врвмя культивирования, сут

^молокоевартывающвя активность КФ —*—протволктичвская активность КФ

Рис. 3 - Динамика МСА и ПА культуры Coprinus lagopides при росте на полусинтетической среде

i 30

—i—

— —к

ПА, Вил

5 8 7 8 время культивирования, сут

—^-ыолокосввртыввклцвя активность КФ —*—протволитичвсквя активность КФ

Рис.4 - Динамика МСА и ПА в культуральном фильтрате Coprinus lagopides при росте на натуральной среде

Видно, что культура C.lagopides при росте на полусинтетической среде сохраняет симбатный характер изменения МСА и ПА -продуцент параллельно достигает максимальных значений этих активностей.

Совершенно другой характер изменения молокосвёртывающей и протеолитической активности наблюдается у этой культуры в процессе роста на оптимальной для неё натуральной среде (рис.4.).

В указанных условиях увеличение молокосвёртывающей активности культуры Сорита lagopides не сопровождается повышением уровня общей ПА. Эти результаты позволяют предположить, что протеиназы с выраженной МСА и ПА, синтезируемые этим продуцентом, по-видимому, являются разными белками.

5 В 7 время культивирования, сут

■ыолокосавртывающая активность КФ ■"протвотпмчвская активность КФ

Рис. 5 - Динамика МСА и ПА в культуральном фильтрате Cerrena sp. при росте на полусинтетической среде № 9.

У продуцента Cerrena sp. нарастание МСА и ПА идёт в параллельной динамике.

Симбатный характер биосинтеза этих протеиназ сохранялся не только при культивировании на питательной среде № 9, где уровень МСА был максимальным, но и во всех остальных исследованных вариантах глюкозо-пептонной среды.

Все полученные в этом разделе данные аккумулированы в табл.5.

Таблица 5 - Соотношение удельных МСА и ПА при культивировании

продуцентов на разных вариантах питательных сред.

Вид продуцента Основные компоненты среды, г/л C:N МСА, Е/мг П ротеол итичес кия активность, Е/мг Содержание белка, мг/мл МСА/ПА

Coprinus lagopides Пи&ное сусло 4% Б, соевая мука 1% 24.42±0.20 0.041±0.002 1.26±0.05 596:1

Coprinus lagopides глюкоза-10, пептон - 2.5 10:1 16.02±0.15 0.062±0.004 0.83±0.01 258:1

Coprinus lagopides глюкоза - 40г/л, пептон - 10г/л 10:1 5.40±0.10 0.068±0.003 1.13±0.02 79:1

Cerrena sp. глюкоза - 15 г/л, пептон - 1г/л 40:1 33.42±0.20 0.095±0.003 0.57±0.02 352:1

Cerrena sp. глюкоза - Юг/л, пептон - 1г/л 25:1 25.6±0.20 0.080±0.003 0.75±0.03 320:1

Cerrena sp. глюкоза - Юг/л, пептон- 2.5г/л 10:1 19.7±0.20 0.069±0.004 0.75±0.03 285:1

Cerrena sp. глюкоза - 40г/л, пептон - Юг/л 10:1 12.3±0.20 0.051±0.002 1.05±0.03 246:1

Cerrena sp. глюкоза - 5г/л, пептон - 1г/л 12:1 21.10±0.15 0.120±0.004 0.37±0,01 176:1

Cerrena sp. глюкоза - 15г/л, пептон - 4г/л 9:1 27.7±0.20 0.158±0.03 0.76±0.02 175:1

Cerrena sp. глюкоза - 15г/л, пептон - 2.5г/л 15:1 9.6±0.05 0.076±0,005 0.73±0,02 164:1

Результаты позволяют судить, насколько исследованные культуры удовлетворяют основному критерию для продуцентов МСФ - наличию высокой МСА на низком фоне общей протеолиза.

Наиболее высокое удельное соотношение МСА к ПА (600:1) наблюдается в КФ продуцента Coprinus lagopides при росте на натуральной среде, у продуцента Cerrería sp. максимальное соотношение МСА к ПА (350:1) обнаружено на глюкозо-пептонной среде №7. Питательные среды для биосинтеза МСФ этими культурами, существенно различаются по химическому составу.

Так, для продуцента С.lagopides оптимальной была среда, содержащая в качестве источника N соевую муку, в качестве источника С - пивное сусло. Оба этих продукта являются богатыми и комплексными источниками питания. Грибы рода Coprinus, включая вид Coprinus lagopides являются сапротрофами, в природных условиях обитают на различных богатых органикой смешанных субстратах - лесная подстилка, удобренные или унавоженные почвы, газонная земля, полуразрушенные пни, гниющая древесина и т.п. Поэтому понятно, что этот вид характеризовался высокой скоростью роста и высокой ферментативной активностью при культивировании на натуральной питательной среде, имеющей богатый органический состав.

Другой продуцент - Cerrena sp., напротив, в условиях культуры имел более высокую активность на полусинтетической среде (глюкоза-пептон, минеральный фон). Вид Cerrena sp., в отличие от вида Coprinus lagopides, является строгим лигнотрофом, в природных условиях занимает узкую и

определённую трофическую нишу - обитает на твёрдой древесине лиственных пород, активно разрушает её по типу белой гнили, расщепляя сложнейшие компоненты древесных субстратов - лигнин-целлюлозные комплексы. Известно, что древесина содержит ничтожные количества азота (<1%), в связи с чем, соотношение в ней C:N очень высокое (300-1000:1). Тот факт, что МСА этого продуцента в 3 раза выше на более бедной (полусинтетической) среде, позволяет предположить, что в условиях среды, богатой по азоту, эта культура может испытывать давление по типу катаболитной азотной репрессии. Обращает на себя внимание тот факт, что максимальный уровень МСА и её соотношение к ПА наблюдались у Cerrena sp. на тех вариантах глюкозо-пептонной среды, в которых было максимально высокое соотношение углерода к азоту (40:1 и 25:1).

Полученные результаты определили условия дальнейшей работы по выделению, очистке и характеристике ферментных препаратов из КФ: для продуцента Cerrena sp. использовали полусинтетическую среду с максимальным соотношением C:N - 40:1, для продуцента Coprinus lagopides - натуральную среду.

Анализ схем концентрирования, выделения и очистки ферментных препаратов из КФ продуцентов Coprinus lagopides и Cerrena sp. Использованные схемы выделения молокосвёртывающих ферментов включали различные сочетания способов концентрирования и фракционирование белковых смесей, применяемые в лабораторных и полупромышленных условиях - мягкое вакуум-выпаривание, фракционная ультрафильтрация, фракционирование органическим растворителем, мембранный диализ, сушка сублимационным испарением. На каждой из этих стадий оценивали содержание белка, уровни МСА и общей ПА, по полученным результатам рассчитывали материальный баланс. Органолетически оценивали вкус молочного сгустка, образующегося при оценке МСА.

Таблица 6 - Материальный баланс выделения молокосвертывающего фермента из КФ Coprinus lagopides по схеме №1____

Стадии схемы №1 Объем (V), мл Белок, мг/мл МСА ПА МСА/ ПА Выход по МСА,%

Е/мл У*Е/мл ЕУмг Е/мл Е/мг

исходный КФ 315 1.26±0.02 30.77 9692 24.42 0.083 0.067 365:1 100

вакуум-выпаривание 75 4.93±0.05 117.60 8820 23.90 0.316 0.064 373:1 91*'

Диализ 76 4.38±0.03 111.00 8432 25.30 0.191 0.051 506:1 87**'

' - молочный сгусток имеет горьковатый привкус, не имеет горечи.

Ферментный препарат, полученный по первой схеме, сохранял высокий выход МСА (в пределах 90%), имел достаточно высокое соотношение МСА/ПА (500:1) и имел плотный молочный сгусток без признаков горечи.

Следующая схема выделения (№2) включала дополнительную стадию очистки этанолом (табл.7). Дробное фракционирование белков вели 96% этанолом при - минус 20°С, центрифугирование при 4-5°С. Молокосвёртывающий препарат, полученный по этой схеме, имел значительно более высокое

соотношение МСА/ПА (выше 800) и хорошие органолептические свойства, однако при этом наблюдалась существенная потеря МСА (до 40%).

Таблица 7 - Материальный баланс выделения молокосвёртывающего фермента из

Стадии схемы №2 Объем У,мл Белок, мг/мл Молокосвертывающая Активность Протеолигаческая активность МСА/ ПА Выход по МСА, %

Е/мл У»Е/мл Е/мг Е/мл Е/мг

Исходный КФ 1000 1.26 30.77 30770 24.42 0.085 0.067 365:1 100

вакуум-выпаривание 125 10.12 167.48 20935 16.55 0.637 0.063 263:1 68

Диализ 134 9.41 148.9 19952.6 15.82 0.514 0.054 293:1 64.8

осаждение этанолом 120 4.67 156.4 18770 33.50 0.189 0.040 838:1 61"»

В следующей схеме (№3) апробировали вариант, в котором исключили стадию диализа, что привело к резкому снижению соотношения МСА/ПА (до 140) и появлению горечи в молочном сгустке (табл.8).

Таблица 8 - Материальный баланс выделения молокосвёртывающего фермента из КФ Сорг 'тш 1а%ор1с1е$ по схеме №3

Стадии схемы №3 Объем V, мл Белок, мг/мл Молокосвертывающая активность Протеолигаческая акшвность МСА/ПА Выход по МСА,%

Е/мл У*Е/мл Е/мг Имл Е/мг

культу ральиый фильтрат 830 1.2&Ю.02 30,77 25539 24.42 0.083 0.067i0.002 365:1 100

вакуум-выпаривание 224 4.7М.03 103,4 23164 21.60 0.306 0.0СкШШО4 338:1 90.7

осаждение этанолом 100 5.4=ь0.06 163.4 16345 31.80 1.160 0.226*0003 141:1 64*'

В последующей схеме (№4) поменяли методический подход и в схему очистки и концентрирования молокосвёртывающего препарата включили сочетание метода ультрафильтрации с последующей сушкой ультрафильтрата методом сублимационной возгонки (табл.9). Концентрирование проводили на установке непроточного типа ФК 01-1000 с мембраной «МИФИЛ ПА - 20».

Таблица 9 - Материальный баланс выделения молокосвёртывающего фермента из КФ Сорг'тги 1аеор1с1ез по схеме №4

Стадии схемы №4 Объем V, мл Белок, мг/мл Молокосвертывающая активность МСА/ПА Выход МСА, %

Е/мл V'E/мл Е/мг

исходный КФ 600 1.26±0.05 30.8±0.5 18462 24.4±0.3 610:1 100

ультрафильтрат 210 0.90±0.04 76.0±0.5 15960 84.4±0.4 910:1 86.4"'

сухой ультрафильтрат 100 1.60±0.05 121.6±0.5 12160 76.0±0.4 840:1 76"'

- молочный сгусток без признаков горечи Эта схема представляется наиболее целесообразной, т.к. позволяет выделить молокосвёртывающий препарат с высоким соотношением МСА к ПА

(840), при этом сохраняется высокий выход МСА (в пределах 80%) и возникает возможность всего за две стадии получить активный препарат в сухой форме.

Учитывая полученные результаты, мы сочли целесообразным использовать этот опыт, и при выделении ферментного препарата из культуры Cerrería sp. применить схему №4, как наиболее эффективную среди всех исследованных вариантов схем. Использовали КФ, полученный при культивировании Cerrería sp.

1- пробирка (хранение исходной культуры), 2 - плоскодонная колба с бусами (подготовка посевного материала), 3- колбы Эрленмейера на роторной качалке (ферментация), 4- вакуум - фильтр, 5- ультрафильтрационная установка, 6-лиофильная сушилка, 7- упаковка.

Рис.6 - Аппарагурно-технологическая схема производства молокосвертывающего

препарата

Таблица 10 - Материальный баланс выделения молокосвертывающего препарата

Стадии схемы №4 Объем V, мл Белок, мг/мл Молокосвертывающая активность МСА/ПА Выход МСА, %

ti/мл У*Е/мл Е/мг

нативный КФ 600 0.57±0.02 19.5±0.2 11430 33.4±0.3 350:1 100

ультрафильтрат 185 0.76±0.02 60.8±0.2 12160 80.0±0.4 800:1 98.4"'

сухой ультрафильтрат 100 0.81±0.03 96.0±0.4 9600 78.2±0.3 782:1 79">

из КФ Cerrería sp. по схеме №4

- молочный сгусток без признаков горечи

Таким образом, использование схемы №4 позволило получить высокоактивный ферментный препарат и из культуры продуцента Cerrería sp. Препарат обладал высоким соотношением МСА/ПА (~800) и сохранял высокий выход МСА (-80%). Молочные сгустки, полученные при его проверке, имели плотную и эластичную консистенцию, не имеющую каких-либо признаков горечи.

Физико-химическая характеристика молокосвертывающих ферментов. полученных из КФ культур Coprinus lagopides и Cerrería sp. (молекулярная масса, кинетические константы, состав активного центра).

Для определения молекулярной массы ферментного препарата из культуры Coprinus lagopides использовали калибровочную кривую по следующим стандартным белкам: сывороточный альбумин (68 кОа), гемоглобин (64 кБа), лактоальбумин (36 кБа), дезоксирибонуклеаза (31 KDa), трипсин (23.8кГ>а), рибонуклеаза (13.7 кОа). Результаты фракционирования представлены на рис.7.

Ve, мл

-С бепка (метод Лоури)

-С белка (спекгрофотометрический метод)

~Ауд(Удельная молокосвертывающая активность)

Рис.7 - Гель-фильтрация препарата из Coprínus lagopides на Сефадексе G-75(l)

Пик с максимальной удельной МСА, равной 44.7 Е/мг, имел чёткий объём элюции (Ve), равный 22.2 мл, что соответствовало молекулярной массе иследуемого фермента 39±0.5 кЕ)а. Дополнительно провели гель-фильтрацию препарата через Биогель-300. В этих условиях пик с максимальной МСА вышел объемом 38 мл, что соответствовало ММ равной 39 ± 0.5 JcDa.

Оценку ММ молокосвертывающего препарата из культуры Cerrena sp. проводили гель-фильтрацией через Сефадекс G-75 (2), используя калибровочную кривую по следующим стандартным белкам: декстран «голубой» (2000 кЕ)а), сывороточный альбумин (68 кОа), яичный альбумин (45 KÜa), пепсин (35 кОа), трипсин (23.8 KDa) и цианокобаламин (витамин BJ2, 1.4 кОа).

Исследуемый образец с максимальной удельной МСА, равной 105 Е/мг вышел с объемом элюции 75 мл. На основании калибровочных данных можно судить, что ММ ферментного препарата из культуры Cerrena sp. составляет 35 ± 0.5 KÜa.

Известно, что ММ молокосвертывающих сычужных препаратов в среднем лежит в пределах 33 - 38 кЕ)а. Таким образом, ферменты молокосвертывающего действия, выделенные из базидиальных грибов, имеют молекулярную массу одного порядка с аналогичными коммерческими препаратами животного происхождения.

Кинетические характеристики молокосвертывающих ферментов из культур Coprínus lagopides и Cerrena sp. получены на основе графически определённых зависимостей. Значения константы Михаэлиса и максимальной скорости ферментативной реакции препарата из Coprinus lagopides составили :

Кга=(0.70±0.01)*10"3 моль/л, Vmax== (0.251±0.006)*10"6 моль/(мин*мг). Аналогично определены кинетические характеристики молокосвертывающего фермента из культуры Cerrena sp. Константа Михаэлиса и максимальная скорость реакции были следующими:

Km = (9.50±0.05)* 10"4 моль/л , Vmax = (1.70±0.006)*10_б моль/(мин*мг).

Полученные первичные физико-химические характеристики грибных ферментных препаратов могут быть сравнимы с аналогичными характеристиками существующих молокосвёртывающих ферментов (табл.11).

Таблица 11- Сравнительная первичная физико-химическая характеристика молокосвёртывающих протеиназ грибного и животного происхождения_

Молокосвертывающие ферменты Молекулярная масса, kDa Константа Михаэлиса, Кт, моль/л

«Реннин» (химозин) 33-36 7*10"6-5*10"4

Молокосвёртывающий фермент из культуры Cerrería sp. 35 9.5*10^

Молокосвёртывающий фермент из культуры Coprinus lagopides 39 7* Ю-4

Представленные экспериментальные данные подтверждают, что выделенные из культур базидиомицетов молокосвёртывающие ферменты и сычужный фермент «Реннин», близки не только по величине ММ, но и имеют значения константы Михаэлиса одного плана. Указанные характеристики этих ферментов сравниваются впервые.

Одним из видов кинетической харктеристики ферментных препаратов является константа ионизации, позволяющая ориентировочно судить о составе активного центра фермента. Для наиболее перспективного продуцента (Coprinus lagopides) определено значение константы ионизации фермента на основе линеаризации уравнения Михаэлиса при различных рН субстрата (рис.8).

Величина рК, полученная из рН-зависимости максимальной скорости, характеризует рК аминокислотного остатка, ионизация или деионизация которого необходима для превращения субстрата. Исходя из представленных данных, значение рК было определено как 6.221. По данным справочных таблиц эта константа ионизации соответствует аминокислотному

остатку гистидина. Таким образом, полученные значения рК для фермента из культуры Coprinus lagopides позволяют предположить, что в состав его активного центра входит гистидин.

Сравнительный анализ полученных грибных препаратов с отраслевым препаратом животного происхождения по основным показателям, принятым в сыроделии. Проведен сравнительный анализ ферментативной активности и органолептичесих свойств молокосвёртывающих препаратов из культур высших грибов (лиофильно высушенные ультрафильтраты) и препарата аналогичного действия из животного сырья (табл.12). В качестве стандарта использовали

Рис. 8 - Зависимость кинетических параметров ферментативных реакций (lg Vmax) от рН субстрата (препарат из Coprinus lagopides).

отраслевой препарат из ВНИИ маслоделия и сыроделия, г.Углич, испытания которого проведены строго по ГОСТ-9225 - 84.

Таблица 12 - Сравнительная характеристика молокосвертывающих препаратов

Ферментные препараты Удельная молокосвертываю щая активность, Е/МГбсда, Удельная протеолнтаческая активность, Е/МГ бели Соотношение МСА к ПА Характеристика молочного сгустка

Препарат из Cerrena sp. 78.2±0.3 0.100±0.004 782 Плотный, эластичный, белого цвета, без привкуса горечи

Препарат из Coprinus lagopides 7б.0±0.4 0.091±0.004 836 Плотный, эластичный, желтоватого цвета, без привкуса горечи

Стандартный сычужный препарат ГОСТ 9225-84 72.8±0.4 0.082±0.004 887 Плотный, эластичный, белого цвета, без привкуса горечи

Представленные в табл.12 результаты свидетельствуют, что экспериментальные образцы молокосвертывающих препаратов из Coprinus lagopides и Cerrena sp., по уровню МСА, соотношению МСАУПА и органолептическим характеристикам молочного сгустка не уступают коммерческому сычужному препарату.

ВЫВОДЫ

1. Отобраны в качестве продуцентов молокосвёртывающих ферментов культуры двух видов нетоксичных базидиальных грибов - Coprinus lagopides (съедобен) и Cerrena sp., обладающие наиболее высоким уровнем МСА среди культур 11 видов макромицетов, исследованных в динамике глубинного роста.

2. Изучены культурально-морфологические и физологические признаки культур продуцентов, подтверждающие надёжность их видовой идентификации.

3. Установлено, что указанные продуценты требуют разных трофических условий для активного биосинтеза протеиназ молокосвёртывающего действия. Среди изученных вариантов (свыше 10) питательных сред, имеющих различные источники углерода и азота и разные соотношения C:N, подобраны условия для синтеза МСФ - для продуцента Coprinus lagopides это натуральная среда (сусло-соя), для продуцента Cerrena sp.- глюкозо-пептонная среда №7.

4. Установлено, что уровень МСА продуцентов в условиях культуры существенно зависит от соотношения в среде C:N, что отражает трофические особенности этих грибов в природных условиях.

5. Изучены различные варианты схем выделения и очистки ферментных препаратов из КФ исследуемых продуцентов. Предложена схема выделения молокосвёртывающих ферментов, позволяющая получать препараты, соответствующие требованиям практического сыроделия - высокий уровень специфической МСА и низкий уровень общего протеолиза.

6. Оценены молекулярные массы грибных молокосвёртывающих ферментов. У обоих продуцентов - C.lagopides и Cerrería sp. ММ этих ферментов была практически одинакова и оставляла 35±0.5 KDa.

7. На основе линеаризации уравнения Михаэлиса определены кинетические характеристики полученных грибных ферментов - константы Михаэлиса и максимальные скорости реакций.

8. На основе кинетических параметров (при различных pH субстрата) определена константа ионизации (рК), позволяющая предположить наличие в активном центре молокосвёртывающей протеиназы из Coprinus lagopides аминокислотного остатка гистидина.

9. Сравнительный анализ ферментативных свойств молокосвёртывающих препаратов из базидиальных культур и стандартного коммерческого образца животного происхождения показал, что новые грибные ферменты не уступают стандартному образцу по основным требованиям, предъявляемым к МСФ, и могут быть рекомендованы для апробации их в практике сыроделия наравне с существующими сычужными препаратами.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Т. Dmytrieva, A. Korchmaryova, N. Denisova, М. Shamtsyan. Study of Milk-Clotting Activity From Hygher Basidiomycetes // Proceedings of 5th International Congress on Food Technology "Consumer Protechtion through Food Process Improvement & Innovation in the Real World" - Thessaloniki, Greece.- 2007. -V.l,-P.265-271.

2. Дмитриева T.A., Корчмарева A.B., Шамцян М.М., Денисова Н.П. Молокосвертывающие ферменты высших грибов//Естественные и технические науки. - 2008.-№ 2,- С. 197-200.

3. Т. Dmitriyeva, A. Korchmaryova, N. Denisova, М. Shamtsyan. Milk-Clotting Enzymes of Higher Basidiomycetes // In: Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development. Ed. G.E. Zaikov. Nova Science Publishers. New-York. 2008. - Chapter 7, - P.49-57.

4. Дмитриева T.A., Колесников Б.А., Шамцян M.M. Скрининг продуцентов молокосвёртывающих ферментов среди культур высших базидиомицетов//Естественные и технические науки. - 2009.-№ 3,- С. 145-147.

5. Патент №2354698 C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего фермента (1Ш)/Дмитриева Т.А., Шамцян М.М., Денисова Н.П., Змитрович И.В., Корчмарева A.B.- Заявл. 12.09.2006; Опубл. 10.05.09., Бюл.№13. - 7с.

Отпечатано с оригинал макета. Формат 60x90 '/is Печ.л.1,5. Тираж 80 экз., зак.№51

Государственное образовательное учреждение Высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный технологический институт _(технический университет)»_

190013, Типография издательства СПбГТИ(ТУ), тел.49-49-365, Санкт-Петербург, Московский пр., 26

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Дмитриева, Татьяна Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Высшие базидиомицеты - продуценты протеолитических ферментов и других ценных биологически активных соединений.

1.2 Основные технологические стадии производства сыра.

1.3 Молокосвертывающие ферменты в сыроделии

1.3.1 Свойства молокосвертывающих ферментов и механизм их действия.

1.3.2 Основные продуценты молокосвертывающих ферментов и коммерческие препараты на их основе.

1.3.3 Биосинтез молокосвертывающих ферментов различными продуцентами

1.4 Методы выделения и очистки ферментных препаратов.

1.5 Кинетика ферментативных реакций

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Объекты исследования.

2.2 Условия культивирования объектов исследования

2.3 Изучение динамики роста культур базидиальных грибов

2.4 Определение молокосвертывающей и протеолитической активности.

2.5 Концентрирование и фракционная очистка ферментных препаратов.

2.6 Определение молекулярной массы исследуемых ферментов.

2.7 Изучение кинетических констант и состава активного центра исследуемых ферментов.

ГЛАВА 3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Сравнительная характеристика различных видов базидиомицетов по уровню молокосвертывающей активности в динамике глубинного культивирования.

3.2 Культурально-морфологические признаки базидиомицетов, отобранных в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

3.2.1 Культурально-морфологические признаки вида Coprinus lagopides.

3.2.2 Культурально-морфологические признаки вида Cerrería sp.

3.3 Характеристика молокосвертывающей активности культуры Coprinus lagopides в динамике роста на разичных питательных средах.

3.4 Характеристика молокосвертывающей активности культуры Cerrería sp. в динамике роста на различных вариантах питательных сред.

3.5 Сравнительный анализ молокосвертывающей и протеолитической активности у видов Coprinus lagopides и Cerrena sp.

3.6 Анализ различных схем выделения молокосвертывающего препарата из культурального фильтрата Coprinus lagopides.

3.7 Разработка метода получения молокосвертывающего препарата из культурального фильтрата Cerrena sp.

3.8 Физико-химическая характеристика молокосвертывающих ферментов базидиамицетов Coprinus lagopides и Cerrena sp. (молекулярная масса, кинетические константы, состав активного центра)

3.9 Сравнительный анализ полученных грибных ферментов с отраслевым препаратом животного происхождения по основным показателям, принятым в сыроделии.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов"

Актуальность проблемы.

Сыроделие появилось в жизни человека не менее 8 тысяч лет назад. Существует легенда, что арабские кочевники, путешествуя по жаре и перевозя молоко в мешках, сделанных из желудков животных, получали молочный сгусток наподобие сыра. В те времена путешественники не догадывались о той роли, которую выполнял сычужный фермент, содержащийся в стенках мешков. И только в XX веке были завершены детальные, на высоком молекулярном уровне исследования, позволившие понять тонкий механизм сычужного свертывания молока.

Однако, несмотря на столь большую историю и очевидный технический прогресс, этот процесс продолжает оставаться одним из наиболее сложных разделов современного пищевого производства. Связано это с тем, что технология сыроварения включает в себя несколько взаимосвязанных и взаимозависимых факторов различной природы (физической, химической, биологической), существенно влияющих на качество и выход целевого продукта. При этом биологическая компонента является наиболее важной в технологии сыроделия т.к. качество используемого молочного сырья, качество молокосвертывающих препаратов, а также природа и биологические особенности продуцентов ферментов часто сильно варьируют и амплитуда этих изменений не всегда может быть своевременно выявлена и учтена сыроделами. При производстве любых сортов сыра ключевым моментом является именно выбор молокосвертывающего фермента, потому что практически этим фактором определяются и выход и вкусовые характеристики готового продукта. При этом важнейшей характеристикой выбираемого фермента является его субстратная специфичность и уровень общей протеолитической активности.

Основополагающей операцией в производстве сычужных сыров является энзиматическое свертывание молока, в результате которого образуется сгусток, содержащий большую часть казеинов и жиров молока. Тысячелетиями для свертывания молока в сыроделии использовали сычужный фермент, образующийся в сычуге - четвертом отделе желудка молодняка жвачных. В последние десятилетия, в связи с дефицитом сычужного фермента, а также его высокой себестоимостью, широко практикуют ферменты, близкие по своему действию к сычужному — комплексы пепсинов и других энзимов, продуцируемых различными микроорганизмами. Поэтому исследования, связанные с получением заменителей сычужного фермента, являются актуальной проблемой современной биотехнологии. Замена общепризнанного, но дорогостоящего сычужного фермента микробными или грибными протеазами узкого специфического действия, представляется экономически выгодной и перспективной задачей сыроделия [18,33,65,68].

Цели и задачи исследования. Основная цель данных исследований -поиск и изучение продуцентов молокосвертывающих ферментов среди культур высших базидиальных грибов.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:

• провести отбор продуцентов с выраженным биосинтезом протеиназ молокосвёртывающего действия среди культур 11 видов базидиомицетов, выращенных в глубинных условиях;

• подобрать для отобранных продуцентов оптимальные условия роста и биосинтеза молокосвертывающих ферментов;

• провести анализ культуральной жидкости продуцентов па содержание ферментов молокосвертывающего действия и оценить соотношение уровня специфической молокосвёртывающей активности (МСА) и общей протеолитической активности (ПА);

• подобрать условия и методы концентрирования, выделения и очистки ферментных молокосвёртывающих препаратов из кульгурального фильтрата продуцентов;

• оценить ориентировочно (методом гель-фильтрации) молекулярную массу полученных ферментов;

• определить кинетические параметры выделенных ферментов;

• сравнить ферментативные характеристики молокосвёртывающих препаратов из базидиомицетов со стандартным коммерческим образцом животного происхождения.

Научная новизна работы

Представленная работа является первым исследованием протеиназ молокосвёртывающего действия культур базидиальных грибов, характерных для лесной зоны Северо-западного региона России и хранящихся в коллекции кафедры микробиологического синтеза Технологического института. Из 24 видов, представленных в коллекции, в динамике глубинного роста изучено 11 видов базидиомицетов, из них для шести видов биосинтез молокосвёртывающих ферментов изучен впервые.

Впервые показано, что соотношение основных источников питания (C:N) регулирует не только уровень молокосвёртывающей активности культур базидиомицетов, но и оказывает значительное влияние на весь спектр субстратной специфичности протеаз, синтезируемых продуцентами.

Впервые установлено, что биосинтез молокосвёртывающих ферментов с узкой или широкой субстратной специфичностью (МСА и ПА) и их соотношение, регулируются не только соотношением источников углерода и азота в искусственной среде выращивания культур, но и существенно зависят от трофических свойств, характерных для вида-продуцента в природных условиях.

Впервые показано, что учёт природных трофических особенностей продуцента способствует выбору таких условий культивирования, которые позволяют без больших технических затрат получать ферментные препараты с высоким уровнем молокосвёртывающей активности и низким уровнем общего неспецифического протеолиза.

Практическая значимость работы

В условиях глубинной культуры проведён отбор высших базидиальных грибов - продуцентов протеиназ молокосвёртывающего действия.

Оптимизированы составы питательных сред и условия культивирования избранных видов базидиомицетов.

Разработанные методы выделения и очистки молокосвёртывающих ферментных препаратов из культу ральных фильтратов культур базидиомицетовых грибов служат базой для получения энзимных комплексов с высоким уровнем молокосвёртывающей активности на фоне низкого уровня общей протеолитической активности.

Дана сравнительная оценка ферментативных и физико-химических свойств полученных молокосвёртывающих препаратов и сычужного коммерческого препарата, используемого в практике сыроделия. Показано, что по уровню и специфичности молокосвёртывающей активности вышеназванные препараты сопоставимы между собой.

Предлагаемые в качестве продуцентов молокосвёртывающих ферментов культуры высших базидиомицетовых грибов не проходят стадии спороношения в ходе биотехнологического процесса, соответственно исключается опасность контаминации спорами рабочих помещений и каких-либо профзаболеваний у персонала на производстве.

Апробация работы.

Результаты исследований доложены на 2-ом Центральном европейском пищевом конгрессе (Будапешт,2004), 8-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2004), "ВЮСАТ-2004"(НатЬиг§, 2004), Ш-ем Международным Конгрессе "Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), Всероссийском конкурсе инновационных проектов «Живые системы» (Киров, 2005), 3-ем Центральном европейском пищевом конгрессе (Болгария,2006), XI Международном конгрессе по микробиологии (Болгария, 2006), 5-ом Международном конгрессе по пищевой биотехнологии (Греция, 2007), 13-ом международном симпозиуме по биотехнологии (Китай, 2008), 14-ом международном конгрессе по пищевой науке и технологии (Китай, 2008).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)", Дмитриева, Татьяна Александровна

ВЫВОДЫ

3. Установлено, что указанные продуценты нуждаются в разных трофических условиях для активного биосинтеза протеиназ молокосвёртывающего действия. Среди изученных вариантов (свыше 10) питательных сред, имеющих различные источники углерода и азота и разные соотношения C:N, подобраны условия для синтеза МСФ - для продуцента Coprinus lagopides это натуральная среда (сусло с соей), для продуцента Cerrena sp.- глюкозо-пептонная среда №7.

5. Изучены различные варианты схем выделения и очистки ферментных препаратов из КФ исследуемых продуцентов. Предложена схема выделения молокосвёртывающих ферментов, обеспечивающая получение препаратов, соответствующих требованиям практического сыроделия - высокий уровень специфической МСА и низкий уровень общего протеолиза.

6. Оценены молекулярные массы грибных молокосвёртывающих ферментов. У обоих продуцентов - C.lagopides и Cerrena sp. ММ этих ферментов была практически одинакова и оставляла 35±0.5 icDa.

8. На основе кинетических параметров (при различных рН субстрата) определена константа ионизации (рК), позволяющая предположить наличие в активном центре молокосвёртывающей протеиназы из Coprinus lagopides аминокислотного остатка гистидина.

9. Сравнительным анализом ферментативных свойств молокосвёртывающих препаратов из базидиальных культур и стандартного коммерческого образца животного происхождения показано, что новые грибные ферменты не уступают стандартному образцу по основным требованиям, предъявляемым к МСФ, и могут быть рекомендованы для апробации их в практике сыроделия наравне с существующими сычужными препаратами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При производстве любых сортов сыра ключевым моментом успешного решения технологического процесса является именно выбор молокосвертывающего фермента, так как практически этим фактом определяются и выход и вкусовые характеристики готового продукта. При этом важнейжей характеристикой выбираемого фермента является его специфичность и уровень общей протеолитической активности. Замена общепризнанного, дорогостоящего сычужного фермента животного происхождения бактериальными или грибными протеазами узкого специфического действия представляется экономически выгодной и перспективной задачей сыроделия.

Объектами нашего исследования служили культуры высших базидиальных грибов из основных наиболее крупных порядков класса Basidiomycetes— Aphyllophorales и Agaricales.

В данной работе мы исследовали культуры семи видов афиллофоровых грибов и четыре вида агариковых. Все штаммы этих видов были выделены в чистую культуру из плодовых тел, собранных преимущественно в пригородной лесной зоне Санкт-Петербурга, и хранятся в коллекции культур базидиомицетов кафедры микробиологического синтеза технологического института.

Практически все виды афиллофоровых грибов являются нетоксичными, в том числе и объекты нашего исследования: Trametes suaveolens (L.:Fr.) Fr., Trametes ochracea (Pers.)Gilb.et Ryvarden, Fomes fomentarius (L.:Fr.) Fr., Ganoderma lucidum (Leyss.: Fr.) P.Karst., Cerrería sp. , Bjerkandera adusta (Fr.) Karst., Grifóla frondosa (Dicks.: Fr.) Gray.

Из агариковых (пластинчатых) грибов в качестве объектов исследования использованы культуры четырёх видов съедобных грибов:

Flammulina velutipes (Fr.) P.Karst, Panus conchatus (Bull.: Fr.) Fr., Coprinus lagopides P.Karst., Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Quel.

В качестве объекта сравнения ферментативных свойств препаратов, полученных из базидиомицетов, с существующими в практике молочной промышленности молокосвёртывающими препаратами был использован стандартный сычужный препарат — «отраслевой стандартный образец сычужного порошка ГОСТ 9225 - 84» , ВНИИМС, г.Углич.

Уровень молокосвертывающей активности определяли по методу Kawai. Метод основан на определении времени, за которое происходит образование молочного сгустка. В качестве субстрата использовали свежее стандартное натуральное молоко.

На основании полученных данных (в первую очередь скорость роста и уровень ферментативной активности — МСА и ПА) для дальнейших исследований были отобраны культуры видов Coprinus lagopides и Cerrena sp., как наиболее перспективные продуценты молокосвертывающих ферментов.

Агариковый макромицет Coprinus lagopides в природе имеет независимый сапротрофный тип питания. Важной биологической особенностью этого вида, которую мы наблюдали при работе с культурой, является способность образовывать в условиях in vitro небольшие плодовые тела, и это служит полной гарантией отнесения культуры к указанному виду. Достоверная таксономическая идентификация вида обеспечивает надёжность микроскопического контроля всего биотехнологического процесса.

Кроме того, из литературных источников известно, что биомасса Coprinus lagopides проявляет гиполипидемический эффект в опытах на животных. Есть патентные данные, что культура Coprinus domesticus - вид очень близкий к Coprinus lagopides, обладает выраженным биосинтезом внеклеточных протеиназ фибрино- и тромболитического действия.

Аналогичные данные имеются и по культуре вида Cerrena sp. Эти обстоятельства служили дополнительным обоснованием биотехнологической целесообразности выбора именно этих продуцентов в качестве исследуемых.

Подбор питательных сред с целью получения наиболее высокой молокосвертывающей активности у отобранных продуцентов проводили на средах с различными источниками углерода и азота, варьируя их соотношение. Таким образом, по изучению характера роста и биосинтеза молокосвёртывающих ферментов культурами Coprinus lagopides и Cerrena sp. в различных трофических условиях, можно констатировать, что оба исследованных вида характеризуются активным биосинтезом протеиназ молокосвёртывающего действия. Однако, максимальные уровни молокосвёртывающей активности и её соотношение к общей ПА наблюдаются у этих видов при культивировании на питательных средах существенно различающихся по химической природе основных источников питания.

Так, для продуцента Coprinus lagopides, исследованного на натуральной среде и двух вариантах полусинтетической среды, оптимальной была натуральная среда, где источником азота служила соевая мука, а источником углеводов - пивное сусло. Известно, что и соя и сусло являются богатыми и комплексными источниками питания. Так, соевая мука может содержать до 30-40% белка, близкого по аминокислотному составу к животному белку, до 30% общих углеводов (из которых до 15% растворимых моно- и олигосахаров и до 10-13 % полисахапидов), до 15% жиров, 1-2% лецитина (основного компонента фосфолипидов). Основным углеводным компонентом пивного сусла является мальтоза (до 50-60% от общего состава Сахаров), кроме того сусло содержит глюкозу, пентозы, дисахариды, минеральные вещества, например фосфаты, а также свободные аминокислоты - пролин, лейцин, фенилаланин, валин и др. соединения. В природных условиях грибы из рода Coprinus, включая вид Coprinus lagopides, обитают на различных и богатых органикими веществами смешанных (комплексных) субстратах — лесная подстилка (обычно перемешана с землёй, включает продукты распада растительных остатков), удобренные или унавоженные почвы, газонная земля, полуразрушенные пни, гниющая древесина и т.п. Поэтому понятно, что в условиях культуры этот вид «предпочёл» натуральную питательную среду, имеющую более богатый органический состав.

Другой исследованный продуцент - Cerrería sp., предпочитал в условиях культуры более строгий по питательному составу вариант среды -полу синтетическую, где источником углеводов является глюкоза (15 г/л), источник азота - бактериальный пептон (1г/л) на фоне минеральных солей. В природных условиях вид Cerrería sp., в отличие от вида Coprinus lagopides, занимает более узкую и определённую нишу обитания. Он является типичным представителем ксилотрофных базидиомицетов, обитает на твёрдой древесине лиственных пород, которую активно разрушает по типу белой гнили, т.е. расщепляет основные компоненты древесного субстрата — сложные лигнин-целлюлозные комплексы. Известно, что древесина содержит ничтожные количества азота (< 1%), в связи с чем соотношение C:N в ней очень высокое. Тот факт, что МСА продуцента более, чем в 3 раза выше на «бедной» (условно) среде, чем на «богатой», то можно предположить, что культура лигнотрофного вида Cerrena sp. в условиях среды богатой по азоту, может испытывать давление по типу катаболитной репрессии.

Поскольку многие фермены содержат коферменты, в качестве которых могут выступать ионы металлов, то в ходе работы изучали влияние различных микроэлементов на уровень биосинтеза молокосвертывающих ферментов. Установлено, что уровень молокосвертывающей активности обоих продуцентов может быть повышен на 10-14% при внесении в питательную среду солей Zn2+, Cu2+, Fe2+ в концентрации 1мг/л и СоСЬ в концентрации 5мг/л.

Как уже указано, важнейшим аргументом использования молокосвертывающего препарата в практике сыроделия является соотношение в нём молокосвёртывающей и протеолитической активности. В динамике роста исследуемых культур, наряду с определением динамики МСА по стандартному молочному субстрату проводили оценку уровня общей протеолитической активности по стандартному образцу препаратов казеина. Установлено, что на оптимальной для Coprinus lagopides натуральной среде нарастание молокосвёртывающей активности идёт не сцепленно с уровнем общей ПА т.е. биосинтез протеиназ с узким и широким спектром протеолитческой активностью идут независимо друг от друга, что позволяет получать ферментные препараты с высоким уровнем молокосвёртывающей активности на фоне низкого общего неспецифического протеолиза.

В ходе дальнейшей работы были экспериментально изучены различные способы концентрирования и очистки молокосвертывающих ферментов. В итоге пришли к выводу, что наиболее оптимальной схемой их выделения из КФ продуцента является концентрирование и очистка методом ультрафильтрации с последующей лиофильной сушкой препарата.

Удельная молокосвертывающая активность фермента, полученного из культуральной жидкости гриба Cerrería sp. составила 78.2 Е/мг. Для ферментного препарата из Coprinus lagopides удельная молокосвертывающая активность была 76.0 Е/мг. Для стандартного образца сычужного препарата — 72.8 Е/мг. При этом, соотношение молокосвёртывающей и протеолитической активности у стандартного сычужного препарата было 910, у препаратов из базидиомицетовых культур Coprinus lagopides и Cerrena sp.- 835 и 782 соответственно.

По технологическим требованиям, предъявляемым в сыроделии к молокосвёртывающим препаратам, предназначенным для получения высококачественных сыров, соотношение молокосвертывающей и протеолитической активности желательно иметь в пределах 1000. Для сыров низкого или невысокого качества допускают использование ферментных препаратов с соотношением МСА к ПА в пределах 300.

Изучены физико-химические характеристики полученных молокосвертывающих препаратов из базидиомицетов Coprinus lagopides и Cerrena sp. (молекулярная масса, кинетические константы, состав активного центра).

Молекулярная масса ферментов, ориентировочно оцененная методом гель-фильтрации (Сефадекс G-75 и Биогель-300), составляет для молокосвертывающего фермента из Coprinus lagopides 39±0.5 кОа, для молокосвёртывающего фермента из культуры Cerrena sp. — в пределах 35±0.5 KDa. Молекулярная масса используемых в практике сыроделия ферментов животного происхождения варьирует в пределах 33 KDa - 38 KDa.

Полученные грибные молокосвертывающие ферменты были также изучены применяя линеаризацию уравнения Михаэлиса-Ментен в обратных величинах по кинетическим характеристикам, определяя константы Михаэлиса и максимальную скорость реакции. Получены следующие характеристики:

Для фермента из культуры Coprinus lagopides

Km = (70±0.01 )* 10"4 моль/л

Vmax = (0.251±0.006)*10"6 моль/(мин*мг).

Для фермента из культуры Cerrena sp.

Km = (9.5±0.01)*10~4 моль/л

Vmax =(1.70±0.06)*10"6 моль/(мин*мг).

Константа Михаэлиса для реннина составляет от 7*10"6 до 5*10"4 моль/л.

На основе линеаризации уравнения Михаэлиса были также определены кинетические характеристики молокосвертывающего фермента из Coprinus lagopides при различных рН субстрата. По полученному значению константы ионизации, ориентируясь на таблицы справочных данных, можно предположить, что в состав активного центра исследуемого молокосвёртывающего фермента из базидиальной культуры Coprinus lagopides входит гистидин.

Полученные экспериментальные данные подтверждают, что выделенные из культур базидиомицетов молокосвёртывающие ферменты и сычужный фермент «Реннин», близки не только по величине молекулярного веса, но и имеют значения константы Михаэлиса одного плана. Эти характеристики указанных ферментов сравниваются впервые.

Таким образом, в результате проведённых исследований, впервые обнаружено наличие высокой молокосвертывающей активности у культур базидиальных грибов Coprinus lagopides и Cerrena sp., предложены схемы получения ферментных препаратов с высокой молоксвертывающей и низкой общей протеолитической активностью, получены физико-химические характеристики новых грибных ферментов.

Сравнительный анализ ферментативной активности препаратов из культур Coprinus lagopides и Cerrena sp. и стандартного образца сычужного препарата показал, что препараты грибного происхождения по своим свойствам практически не уступают популярному коммерческому аналогу. Молочные сгустки, полученные с использованием исследуемых грибных ферментных препаратов, имели плотную и эластичную консистенцию и не имели привкуса горечи.

Это свидетельствует о перспективности и целесообразности использования препаратов из культур Coprinus lagopides и Cerrena sp. в качестве заменителей дорогостоящих и дефицитных сычужных препаратов.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Дмитриева, Татьяна Александровна, Санкт-Петербург

1. Антонов В.К. Химия протеолиза. М.: Наука, 1983. - 363 с.

2. Артюхов В.Г., Ковалева Т.А, Шмелев В.П. Биофизика, Воронеж: Изд-во ВГУ, 1994. 336 с.

3. Бегунов В.Л. Книга о сыре. — Пищевая промышленность, 1974. 216с.

4. Белки, ферменты и стерины базидиальных грибов. Методы исследования, под ред. канд. биол. наук О. П. Низковской, Л.: Наука. 1979.- 72 с.

5. Биотехнология: Учеб. Пособие для вузов В 8 кн. / под ред. Н. С. Егорова, В. Д. Самуилова. Кн 8: Инженерная Энзимология / И. В. Березин, А. А. Клесов, В. К. Швядис и др. -М.: высш. Шк., 1987.-143с.

6. Бисько H.A., Бухало A.C., Вассер С.П. и др. Высшие съедобные базидиомицеты в поверхностной и глубинной культуре, Киев: Наукова думка. 1983. -312 с.

7. Бич Г., Мелвин М., Таггарт Дж. Пищевые продукты напитки и биотехнология // Биотехнология. Принципы и применение: пер с англ. /под редакцией И Хиггинсаи др. -М. : Мир, 1988. 91-131.

8. Бредихина С.А. Юрин В.Н. Техника и технология производства сливочного масла и сыра. М.: КолосС. 2007. — 319с.

9. Бухало A.C. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре. -: Наукова думка, 1988. 144 с.

10. Бухало A.C., Билай T.I., Бесараб Б.Н. Протеолггична актившсть деяких вищих базидюмицетов // Мисробюлог. ж. 1971. - Т. 33, N 5. - С.663-665.

11. Бэккер 3. Э. Физиология грибов и их практическое применение. — М.: Издательство МГУ, 1963. -268 с.

12. Бэст Д. Химия и технология // Биотехнология. Принципы и применение перевод с англ / под редакцией И Хиггинса и др. — М Мир, 1988. с. 132-189.

13. Венн Д. Сыр. Краткий курс знатока. Эксмо, 2005. - 64с.

14. Галыкин В.А., Розенталь А.Д. Методы фракционирования белков. Методические указания/ЛТИ им. Ленсовета, Л., 1988. — 18с.

15. ГОСТ 20264.2 88 Препараты ферментные. Методы определения протеолитической активности, М.: Изд-во стандартов. 1988.

16. Горленко М.В., Бондарцева М.А., Тарибова Л.В. и др. Грибы СССР, М.: Мысль. 1980. -303с.

17. Грачева И. М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов, М.: Из-во «Элевар». 2000. 512с.

18. Гудков А. В. Сыроделие: Технологические, биологические и физико-химические аспекты, М. Дели принт, 2004.- 804с.

19. Даниляк Н.И., Семичаевский В.Д., Дудченко Л.Г., Трутнева И. А. Ферментные системы высших базидиомицетов, Киев: Наукова думка. 1989. -280 с.

20. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов, таксономические и экологические аспекты их изучения: Дисс.докт. биол.наук, Л., 1991

21. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. -М., 1962. 390с.

22. Дмитриева Т.А., Колесников Б.А., Шамцян М.М. Скрининг продуцентов молокосвертывающих ферментов среди культур высших базидиомицетов//Естественные и технические науки. № 3, 2009. с.145-147.

23. Дмитриева Т.А., Корчмарёва A.B., Шамцян М.М., Денисова Н.П. Молокосвертывающие ферменты высших грибов. Естественные и технические науки. № 2(34), 2008. С. 197-200.

24. Дмитриева Т.А., Соколова C.B., Фейст И.В., Шамцян М.М., Корчмарёва A.B. Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов. II Межд. конф. «Химия, структура и функции биомолекул». Октябрь 2006, Минск, Беларусь. С.46.

25. Дытнерский Ю.И. Барометрические процессы. М.: Химия, 1986. - 272с

26. Жданова Е.А., Дьяченко П.Ф., Ферментные препараты в молочной промышленности, М.: Пищ. пром., 1962. — 63с.

27. Заикина H.A., Коваленко А.Е., Галынкин В.А., Дьяков Ю.Т., Тишенков А.Д. Основы биотехнологии высших грибов, СПб.:Проспект Науки, 2007. — 336с.

28. Иммобилизованные клетки и ферменты, под ред. Дж. Вудворда, М.: Мир, 1988.-215 с.

29. Калек К. Сыр. Иллюстрированная энциклопедия, М. Лабиринт Пресс, 2003. -256с.

30. Краюшкин В.А., Свириденко Ю.Я., Бузов И.П., О молокосвертывающих препаратах, "Молочная промышленность", №2, 1997.С.37-39.

31. Кретович В.Л. Введение в энзимологию. 3-е изд., доп., перераб., исправл. -М.: Наука, 1986. 336 с.

32. Лабораторный практикум по технологии ферментных препаратов/ И.М. Грачева, Ю.П. Грачер, М.С. Мосичев. // "Легкая пищевая промышленность", 1982-240 с.

33. Маттисон Н.Л., Фалина Н.П. Протеолитическая активность афилофоровых грибов в поверхностной культуре // Микол. и фитопатол. 7, N5. — С.394-399.

34. Зб.Машанский В.Ф., Конев Ю.Е., Жилина З.А., Аравийская C.B., Терешин И.М. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата. A.c. СССР №854983, 1981. Бюлл. № 30 от 15.08.81

35. Микеш О. Н. Лабораторное руководство по хроматографическим и смежным методам. М. : Мир, 1982.С.56-62.

36. Низковская О.П., Маттисон Н.Л. Протеолитическая активность агариковых грибов в культуре. // Высшие грибы и их физиологически активные соединения. Л.: Наука, 1973. - С. 13-19.

37. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Милова Н.М. Характеристика культур агариковых грибов по протеолитической активности //Микол. и фитопатол. -1975.-Т. 9, N6.-С. 488-489.

38. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Дроздова Т.Н. протеолитическая активность базидиомицетов из пор. Aphyllophorales, И. Казеиназа // Микол. и фитопатол. 1979. - Т. 13, N 3. - С. 217-220.

39. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Дроздова Т.Н. протеолитическая активность базидиомицетов из пор. Aphyllophorales // I. Молокосвертывающая активность // Микол. и фитопатол. 1980. - Т. 14, N 1.-С. 36-40.

40. Низковская О.П., Федорова Л.Н., Шиврина А.Н., Чеботарев А.И. Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата. A.c. СССР №522230, 1973. Бюлл. № 27 от 25.07.76

41. Панфилова Н.Е. Молоко и здоровье, Минск: Ураджай, 1998, с.24-26.

42. Паронян А.Х., Куимова Т.Ф., Красильников H.A. Сравнительная характеристика способности свертывать молоко у различных представителей пор. Actinomycetales // Микробиология. 1975. - Т. 64, N 3. - С. 538-541.

43. Патент №2192137, Россия, МПК7А23С19/02. Способ производства сыра / В. Н. Лебедьков, А. М. Русинова , С. П. Нигматзянова (Россия). № 2000121189/13; Заявлено 07.08.00; Опубл. 10.11.02

44. Патент №2354698 C12N 9/58. Способ получения молокосвертывающего фермента (RU).Дмитриева Т.А., Шамцян М.М., Денисова Н.П., Змитрович И.В., Корчмарева А.В. Заявл. 12.09.2006; Опубл. 10.05.09; Бюл.№13. 7с.

45. Пономарева Т., Беленький Г. Масло, сыр и все из молока, М. Феникс, 2000. -352с.

46. Руденская Г.Н., Гайда JI.B., Степанов В.М. Протеиназы из базидиального гриба Russula decolorans // Мат. II Всес. Симпозиума по химии протеолит. ферментов. Углич, 1979. - С. 54-55.

47. Руденская Г.Н., Гайда А.В., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из базидиального гриба Russula decolorans Fr. шт. 0456 // Биохимия. 1980. - Т. 45, N3.-С. 561-568.

48. Скотт Р. Рбинсон Р., Уилби Р. Производство сыра: сырье, технология, рецептуры, СПб: Профессия, 464с.

49. Теплы М., Машек Я., Гавлова Я., Молокосвертывающие ферменты животного и микробного происхождения, М: Пищевая промышленность, 1980.-268с.

50. Типограф Д.Я., Петина Т.А. Условия культивирования Aspergillus candidus, шт. 111 и его ферментативные комплексы // Приклад, биохим. и микробиол. -1966.-Т. 2,N4.-С. 417-424.

51. Уонг Д., Кооней Ч., Демайн А. и др. Ферментация и технология ферментов. М.: Легкая и пищевая промышленность. 1983. 335с.

52. Усанова Т.И., Логунова Г.И., Розенталь А.Д. Лабораторно-практические работы по биотехнологии для подготовки рабочих по учебной группе профессий «Оператор биотехнологических производств в профтехучилищах». Л.:ВНИИ профтехобразование, 1989. — 40с.

53. Успехи медицинской микологии/ Под общей редакцией Ю. В. Сергеева. — М. : Национальная академия микологии, 1994 — 680 с.

54. Фалина H.H. Выращивание зимнего опенка Flammuna velutipes (Fr) Sing 1 для получения мицелия и протеолитических ферментов // Производство высших съедобных грибов в СССР. — Киев: Наукова думка, 1978, c.l 11-114.

55. Фалина H.H. Тромболитическая активность в культурах штаммов Flammulina velutipes (Fr.) Karst. // Микол. и фитопатол. 1980. - Т. 14, N 1. -С. 40-42.

56. Фалина H.H., Морозова Э.Н., Денисова Н.П. и др. Препарат фибринолитического действия из зимнего опенка ( Flammulina velutipes ) // Прикл. биохим. и микробиол. 1978. - Т. 14, N 5. - С. 699-702.

57. Федорова JI.H., Шиврина А.Н. Протеазы сычужного действия в культурах высших грибов // Микол. и фитопатол. 1974.- Т.8, N 1. т -С. 22-25.

58. Федорова JLH., Дроздова Т.Н., Гаврилова В.П. Биосинтез молокосвертывающего фермента базидиальным грибом Russula decolorans шт. О456.//Микол. и фитопатол. 1981. - Т. 15, N 6.- С.496-500.

59. Фейст И.В., Дмитриева ТА., Шамцян М.М. Молокосвертывающие ферменты высших грибов. Сборник конкурсных работ Всероссийского смотра-конкурса научно-техн. творчества студентов ВУЗов «Эврика-2006». Ноябрь 2006, Новочеркасск. С. 210-212.

60. Химия протеолитических ферментов // Мат. II Всес. симпозиума по химии протеолитических ферментов. Углич, 1979. - 158 с.

61. Шалапутина Э.П., Краюшкин И.В., Шалапутина Н.В. Лабораторный практикум по технологии молочных консервов и сыра. — СПб: Гиорд, 2008. — 228с.

62. Экспертиза качества сыров: Метод, руководство. МВШЭ.МР-013-2002. Авт.-сост. Суханова М.:ДеЛи, 2002.-.84с.

63. Югова Л.В., Дорохов В.В., Производство и применение продуктов микробиологических производств. Микробные заменители сычужного фермента, М., 1988. 19с.

64. Яковлев В.И., Технология микробиологического синтеза, Л.: Химия, 1987. — 272с.

65. Яковлева Е. П. Совместное культивирование продуцентов биологически активных веществ с другими микроорганизмами (обзор) // прикладная биохимия и микробиология -1983. —т. 19, N3. —с. 330-346

66. Якуницкая Л.М.,Самарцев М.А. Тенденция развития производства молокосвертывающих ферментов // Биотехнология. 1987.- Т.З, N 5. - С. 586591.

67. Chang S.-T., «Mushroom Biology: The Impact on Mushroom Production and Mushroom Products», Hong-Kong, 1993. 35P.

68. Chang S.-T. Global impact of edible and medicinal mushrooms on humanwelfare in the 21st century: nongreen revolution// International Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, V.I.-P.l-7

69. Das A., Chatterjee M., Roy A. Enzymes of some fungi // Mycologia. -1979.-Vol. 71,N3.-P. 530-536.

70. Denisova N.P. Traditions of using medicinal mushrooms among the nations of the world //ibid, 2001, V.3.- P.98

71. Dmitriyeva Т., Denisova N., Shamtsyan M. Milk-Clotting Activity of Native Liquid of Submerge Cultures of Higher Basidiomycetes. 14th World Congress of Food Science and Technology. Shanghai, October 19-23, 2008. P. 255.

72. Dmytrieva Т., Korchmaryova A., Denisova N., Shamtsyan M. Study of Milk-Clotting Activity From Hygher Basidiomycetes. Proceedings of 5th International

73. Congress on Food Technology "Consumer Protechtion through Food Process Improvement & Innovation in the Real World" Thessaloniki, Greece, 2007. V.l. -p.265-271.

74. Dmitrieva T., Gavrilenko K., Sapronova E., Popov A., Ernazarov A., Shamtsyan M., Denisova N. Milk Clotting Enzymes From Higher Basidiomycetes. 2nd Central European Congress on Food . Budapest, 2004. P.64

75. Dmitriyeva T., Korchmaryova A., Denisova N., Shamtsyan M. Chapter 7 Milk-Clotting Enzymes of Higher Basidiomycetes; In: Biotechnology: State of the Art and Prospects for Development. Ed. G.E. Zaikov. Nova Science Publishers, New-York. 2008. P.49-57.

76. Dmitrieva T., Shamtsyan M., Korchmaryova A. Milk-Clotting Enzymes From Submerge Cultivated Higher Basidiomycetes. 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, May, 2006. P.218.

77. Enzyme Nomenklature, Recomendations(1978) of the Nomenklature Committeeof IUB. N4.-L.: Acad. Press, 1979.-606p. Suppl. 2//Europ. J. Biochem. -1981.-Vol. 116.-P. 423-435.

78. Foltmann B. Mammalian milk-clotting proteases: structure, function, evolution and development//Neth. MilkDairyJ. -1981. -Vol. 35,N3-4.-P. 223-231.

79. Fries L. Studies in the physiology of Coprinus. Cultivation experiment with running media // Bot. Notiser. 1956. V.I 09. №1. P. 12-20.

80. Ichishima E., Kumagai H., Tomoda K. Substrate specificity of protease from Pycnoporus coccineus, a wood-deteriorating fungus// Curr. Microbiol. -I980.-Vol. 3,N6.-P. 333-337.

81. Ichishima E., Yashimura K., Tomoda K. Acidcarboxypeptidase from wood-deteriorating Basidiomycete Pycnoporus sanguineus!/ Phytochemistry. -1983.-Vol. 22,N4.-P. 825-831.

82. Kawai M. Studies on milk-clotting enzymes produced by Basidiomycete. II. Some properties of Basidiomycete milk-clotting enzymes//Agr. Biol. Chem. -1970a. -Vol. 34,N2.-P. 164-169.

83. Kawai M. Mycolytic enzymes produced by some strains of Coprinus. IT Some characteristics of crude enzymes produced by Coprinus macrorhizusf. Microsporus Hongo and Coprinus radians (Desm.) Fr. //J. Ferment. Technol. -1970b. -Vol. 48,N7.- P. 397-404.

84. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes. III. Partial purification and some properties of the enzyme produced by Irpex lacteus Fr. //Agr. Biol. Chem. -1971. -Vol. 35.-P. 1517-1525.

85. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymes and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes!/J. Arg. Chem. Soc. Jpn. -1973 a. -Vol. 47,N8.-P. 467-472.

86. Kawai M. Productivity of pectolytic and racematic enzymes among Basidiomycetes II Ibid. -1973c. -Vol. 47,N9.-P. 523-527.

87. Kawai M. Productivity of amilolytic, celulolytic and xylolytic enzymes among the Basidiomycetes!/Ibid. -1973d. -Vol. 47,N9.-P. 529-534.

88. Kawai M., Otsuka Y. Screening test of Basidiomycetes for the production of proteolytic enzymes and some characteristics of crude enzymes//Trans. Mycol. Soc. Jpn. -1969.-Vol. 10,N1.-P. 29-34.

89. Kawai M., Mukai N. Studies on milk clotting enzymes produced by Basidiomycetes.I. Screening test of Basidiomycetes for the production of milk clotting enzymes//Agr. Biol. Chem. -1970. -Vol. 34,N2.-P. 159-163.

90. Kikuchi E., Kobajashi H., Kusakabe J., Murakami K. Fiber structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme //Agric. Biol. Chem. -1988.-Vol. 52,N5.-P. 1277-1278.

91. Kobayashi H., Kusakabe L., Murakami K. Purification and characterization of two milk-clotting enzymes from Irpex lacteus //Agr, Biol. Chem. -1983a. -Vol. 47,N3.-P. 551-558.

92. Kobayashi H., Kusakabe I, Murakami K. Substrate specificity of a carboxyproteinase from Irpex lacteus!/Ibid. -1983b. -Vol. 47,N8.-P. 1921-1923.

93. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Milk-clotting enzyme from Irpexlacteus as a calf rennet substrate for cheddar manufacture//Ibid. -1985a. -Vol. 49,N6.-P. 1605-1609.

94. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Subatrate specificity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on-casein // 323 - Ibid. - 1985b. - Vol. 49, N 6.-P. 1611-1619.

95. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Substrate specifity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on k-and -casein IIIbid. 1985c. - Vol. 49, N 6. - P. 1621-1631.

96. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Purification and characterization of a pepstatin-insensitive carboxyl proteinase from Polyporus tulipiferae {Irpex lacteus) II Ibid. 1985d. - Vol. 49, N 8. - P. 2393-2398.

97. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Substrate specificity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on peptide hormones // Ibid. 1986. - Vol. 50, N 4. - P. 923-930.

98. Koltyga I, Shamtsyan M., Dmitrieva T. Intensification of Yeast Biomass Accumulation And Ethanol Fermentation Process. 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, May, 2006. P.205.

99. Lowri, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Rendell, R. J., 1951, Protein measurement with the holinphenol reagent. J. Biol.chem.193

100. Misurcova Z., Nerud F. et al. Extra cellular acid proteases from Basidiomycetes/ICeskaMycol. -1986.-Vol. 40,N2.-P. 110-115.

101. Misurcova Z., Nerud F., Musilek V. Screening of Basidiomycetes for the production of milk-clotting enzymes//Ibid. 1987.-Vol. 41,N1.-P. 50-53.

102. Pachlewski R., Chrusciak E. Aktywnosc enzymatic znagrzy bow mikoryzowych//Actamycol. -1979.-Vol. 15,N1.-P. 3-9.

103. Pat. 1177054, GB. 1970. The milk-clotting enzymes from Fomitopsis pinícola, Irpex lacteus, Lenzites saepiaria, Coriolns hirsutus, Coriolus consors.

104. Shamtsyan M., Panchenko A., Spiridonova V., Dmitrieva T., Popov A., Koltyga I., Chistova O., Petrischev N., Denisova N. Bioactive Compounds From Higher Basidiomycetes. 3rd Central European Congress on Food, Sofia, Bulgaria, May, 2006. P. 100.

105. M. Shamtsyan, V. Spiridonova, T. Dmitriyeva, A. Popov, N. Petrischev, N. Denisova. Mushroom bioactive substances for food industry. Abstr. 4th Central

106. European Congress on Food "CEFood-2008" Cavtat, Croatia, 15-17 May, 2008. P.63.

107. Wasser S.P., Weis A.L. Medicinal properties of substances occurring in higher basidiomycetes mushrooms: current perspectives (review)// International Journal of Medicinal Mushrooms, 1999, V.l, p.31-62

108. West S. L. Food proteins: sources and properties // J. Chem. Tech. Biotechnol 1984.- Vol. 34 B, N 3.- P. 176-181

109. WhitakerJ. R. Protease of Endothia parasiticalMethodsin Enzymology. -N. Y.: Acad. Press, I970.-Vol. 19.-P. 436-445.

Информация о работе

Дмитриева, Татьяна Александровна
кандидата технических наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Изучение молокосвертывающей активности высших базидиомицетов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы