Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной

ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной"

На правах рукописи

004605248 О

ДЬЯКОНОВА Галина Вячеславовна

ИССЛЕДОВАНИЕ НЕКОТОРЫХ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ МОЛОКОСВЕРТЫВАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ВЕШЕНКИ

ОБЫКНОВЕННОЙ

03.01.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 7 ИЮН 2919

Ростов-на-Дону 2010

004605248

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных биологического факультета Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Кубанский государственный университет».

Научный руководитель: доктор биологических наук,

Заслуженный деятель науки РФ, профессор Проскуряков Марк Тихонович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Колмакова Татьяна Сергеевна

кандидат технических наук, доцент Рыльская Лариса Анатольевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Кубанский государственный аграрный университет»

Защита состоится «23» июня 2010 г. в И) часов на заседании диссертационного совета Д.212.208.07 по биологическим наукам в ФГОУ ВПО «Южный федеральный университет» по адресу: 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Б.Садовая, 105/42, ауд. 203.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Южного федерального университета (344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Пушкинская, 148)

Автореферат разослан «_»_20_г.

Ученый секретарь диссертационного совета гМАЬг { Е.В. Асланян

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Протеолитические ферменты широко применяются в различных отраслях промышленности. Основным источником их получения является поджелудочная железа и слизистая желудка крупного рогатого скота и свиней. Данный ресурс является ограниченным. Поэтому остается актуальным поиск новых продуцентов гидролаз, а также расширение знаний о свойствах таких ферментов. Особого внимания этот вопрос заслуживает в связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности протеиназ сычужного действия. Одной из перспективных групп являются базидиальные грибы. Многочисленные исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных дереворазрушающих грибов имеются активные продуценты молокосвертывающих протеиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используемыми продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов Endothia и Aspergyllus базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоношения в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических заболеваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактериальными культурами. Установлено, что гриб Irpex lacteus Fr. способен образовывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного фермента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответствующего ферментного препарата и молочных продуктов с использованием данного ферментного препарата защищены международными патентами (United States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базидиальных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых, культивируемых в промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Китт.) обнаружены протеиназы, способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается по всему

миру, не токсичен, а его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобным сырьем для получения ферментных препаратов.

Целью нашей работы являлось выделение, очистка и исследование физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной (ПеигоШя ОБ^еаХш (Ег.) Китт.), а также изучение возможности использования ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).

3. Изучение возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна работы. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35 -40 кДа, которые находятся в состоянии проферментов и имеют точки изоэлектрофокусирования 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопротеиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором ЫаС1. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. В плодовых телах Р1еиго1ш (Бг.) Китт обнаружена высокая молокосвертывающая активность, принадлежащая трем протеолитическим ферментам, два из которых являются металлопротеиназами, а один относится к классу сериновых протеиназ.

2. Молокосвертывающие ферменты гриба находятся в состоянии проферментов, автоактивация которых происходит в течение двух часов при 35 °С и рН 6,01.

3. Молокосвертывающие ферменты вешенки обыкновенной при осаждении из экстракта 100 % раствором, насыщенным хлоридом натрия и рН 3,6 сохраняются в стабильном состоянии.

4. Молокосвертывающие ферменты из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной могут использоваться для получения сырного сгустка.

Теоретическая и практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка А§апса1ез. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов.

Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения молокосвертывающих протеиназ. Для промышленного использования разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Показана возможность использования такого препарата в сыроделии на стадии образования сгустка.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований-2007» и международной научно-практической конференции

«Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007».

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ (0,34 п.л., личный вклад 80 %), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 2 статьи и 2 патента.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 90 страницах и состоит из введения, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, заключения, выводов, библиографии (55 отечественных и 63 зарубежных источника). Диссертация содержит 7 таблиц и 18 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом к данной работе послужили плодовые тела Вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus (Fr.) Китт). Плодовые тела гомогенизировали без добавления жидкости при помощи ручного гомогенизатора, замораживали, затем размораживали однократно, отделяли экстракт путем фильтрации. Экстракт хранили при -18°С не более 30 дней.

Определение количества растворимого белка в экстракте плодовых тел вешенки проводили по методу Брэдфорда (Bradford, 1976). При проведении гельхроматографии, ионообменной хроматографии и изоэлектрического фокусирования для определения содержания белка во фракциях измеряли оптическую плотность при 280 нм (Досон и др., 1991).

Молокосвертывающую активность на всех этапах исследования определяли по модифицированной методике Пятницкого (Пятницкий, Проскуряков, 1969); активность кислых протеиназ - по модифицированному методу Ансона (Нортроп и др., 1950); активность щелочных протеиназ - по методу Кунитца (Нортроп и др., 1950).

Молекулярные массы молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной определяли с помощью гельхроматографии (Остерман, 1985) на колонке 1,9x75 см с сефадексом G-75

Superfine фирмы «Pharmacia» (Швеция), уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером, рН 5,0. Белки элюировали со скоростью 12 мл/ч, объем фракций 4 мл.

Для очистки молокосвертывающих протеиназ использовали метод ионообменной хроматографии на колонке 1,4x25 см. В качестве сорбента применяли КМ-целлюлозу. Перед нанесением образца на колонку, ее уравновешивали 0,01 М ацетатным буфером рН 4,4.

Метод изоэлектрического фокусирования (Ригетти, 1986) применяли для установления количества компонентов молокосвертывающей фракции белков экстракта вешенки обыкновенной и подбора условий для проведения ионообменной хроматографии.

Для установления типа строения активного центра использовали метод ингибиторного анализа. В ходе эксперимента применяли ФМСФ (ингибитор сериновых протеиназ), ЭДТА (ингибитор металлопротеиназ), моноиодацетат (ингибитор тиоловых ферментов) и пепстатин (ингибитор аспартильных протеиназ).

Для установления оптимумов рН активности и стабильности применяли универсальную буферную смесь (УБС) (Джорджеску, Пуэнеску, 1963) со значениями рН от 2 до 12 с интервалом в 0,5. рН доводили с помощью 1н раствора НС1 и 1 н раствора NaOH.

Статистическая обработка результатов проводилась в программе STA-TISTICA 6.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной определяли содержание белка и оценивали протеолитическую активность по природным субстратам: казеину и молочно-ацетатной смеси. Согласно полученным нами данным, на один грамм сырых плодовых тел вешенки приходилось 9,40 ± 0,66 мг белка, 12,4±1,64 усл. Е казеинолитической активности (по методу Кунитца) и 3,22±0,66 усл. Е молокосвертывающей активности.

При дополнительном экстрагировании дистиллированной водой в соотношении 1:1 (по массе) была установлена молокосвертывающая активность, составившая около 20 % от ферментативной активности первого экстракта. С тем, чтобы определить оптимальные условия дополнительного экстрагирования, нами проведено исследование экстракции молокосвертывающих ферментов при различных значениях рН экстрагирующей жидкости в диапазоне от 3 до 11 (рис. 1). Было установлено, что оптимальное значение рН экстрагирования молокосвертывающей активности находится в диапазоне от 6,8 до 7,3. Такая среда получается при экстрагировании дистиллированной водой.

1,4 1,2

9 '

^ о,в

5

>-0,6

<Г

0,4 0,2 0

Рис. 1. Зависимость молокосвертывающей активности в экстракте вешенки от рН экстрагирующей жидкости. * обозначены достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

На основании полученных данных дальнейшие исследования проводили в объединенных экстрактах плодовых тел гриба.

В соответствии с этим, при оценке содержания белка в плодовых телах вешенки обыкновенной предполагали, что в единице массы плодовых тел гриба содержится столько же растворимого белка, сколько в экстракте,

полученном из этой массы плодовых тел. Таким образом, согласно полученным нами данным, на один грамм сырой массы гриба плодовых тел вешенки обыкновенной приходилось 11,75 ± 0,66 мг белка.

При оценке общей протеолитической активности щелочных протеиназ по методу Кунитца в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной установлено, что она составляла 15,50 ± 1,64 усл. Е казеинолитической активности на грамм сырой массы гриба. Такое стандартное отклонение можно объяснить тем, что активность протеиназ изменяется в ходе дифференцировки плодовых тел, а в различных партиях спорофоров вешенки могли находится плодовые тела разных стадий, причем их процентное соотношение в выборке могло несколько изменятся от партии к партии. Кроме того, в литературе отмечается, что активность ферментов базидиомицетов зависит от состава субстрата, на котором он выращен и от времени года, в которое проводился сбор (Горшина и др., 2003 с. 45.).

Молкосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной составила 4,03 ± 0,66 усл.Е/ г.сырого гриба.

Одним из важных показателей качества молокосвертывающего ферментного препарата является соотношение молокосвертывающей и протеолитической активности, так как при относительно высокой казеинолитической активности наблюдается не только формирование сгустка, но и дальнейший его гидролиз. Это приводит к появлению горьких пептидов и делает такой ферментный препарат не пригодным для использования в сыроделии. Для экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной, содержащего 11,75 ±0,66 мг белка, это соотношение было низко и составило 0,26, что в 12 раз ниже, чем у коммерческого препарата сычужного фермента (ТУ - 9219 - 002 - 05331581 - 98). В ходе дальнейшей работы проводились исследования с целью повышения данного соотношения. Для этого изучались условия, в которых наблюдалась максимальная молокосвертывающая активность и минимальная казеинолитическая.

Условия активации протеолитических ферментов в экстракте вешенки обыкновенной изучали при инкубации экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной с УБС в течение пяти часов при температуре 35°С и значениях рН от 4,0 до 8,5 (рис.2).

-рНА.О -рН 6,28

ь-рН 5,0 — рН 7,0

-рН 6.01 • рН 8,37

Рис. 2. Зависимость молокосвертывающей активности от времени инкубации и рН среды * обозначены достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Максимальная молокосвертывающая активность в экстракте отмечалась после 2 ч. преинкубации при 35°С и рН 6,01. Эти данные позволили предположить наличие проферментов в экстракте плодовых тел гриба.

Следующий этап исследований был направлен на определение диапазона рН стабильности протеолитической активности (по методу Кунитца) молокосвертывающих протеиназ из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной (рис. 3). Для этого полностью активированный экстракт, полученный после 2 ч. инкубации при 35°С и рН 6,01, смешивали с УБС рН в диапазоне от 3,0 до 10,0 с шагом 0,5.

О в начале эксперимента Ш после 1 ч. инкубации

■ после! ч. инкубации Эпосле4 ч. инкубации

Рис.3. Зависимость протеолитической акти вности молокосвертывающих ферментов от времени инкубации (при 35°С) и рН среды. * обозначены достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Результаты этой части исследования показали, ферментативная активность экстракта незначительно изменяется в течение 3 ч инкубации при значениях рН, близких к 5,0, а наиболее резко снижается при рН 8,4 и 9,5.

Исследование стабильности молокосвертывающей активности (рис. 4) показало, что после 6 ч. инкубации в диапазоне значений рН от 3,0 до 8,0 в полностью активированном экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной сохраняется от 25 % до 30 % от исходной молокосвертывающей активности.

рН

Рис. 4. Остаточная молокосвертывающая активность при различных рН экстракта после 6,5 ч. инкубации при 35°С. * обозначены достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

По данным литературы протеиназы некоторых грибов проявляют активность при широком диапазоне рН. Так, в работе Dohmae et al. (1995) для протеиназ вешенки обыкновенной указан диапазон рН от 4 до 9. Для вида Pleurotus eringii (Wang и др., 2001) указывается диапазон стабильности от 4 до 12 единиц рН. Металлопротеиназа другого гриба Lentinus edodes (Terashita и др., 1985) стабильна в диапазоне от 4,9 до 9,5 рН. В отношении диапазона стабильности исследуемый нами фермент приближается к химозину животных, который, как и фермент вешенки обыкновенной, быстро теряет активность при рН ниже 3,5 и выше 7,5 (Methods in enzymology, 1970).

С целью исследования физико-химических свойств молокосвертываю-щих протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной мы изучили температурный оптимум ферментативной активности (рис. 5). Для этого

исследовали скорость сворачивания MAC при различной температуре инкубации реакционной смеси.

Рис.5. Температурный оптимум активности молокосвертывающих ферментов

экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной * обозначены достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Полученные данные показывают, что максимальная молокосверты-вающая активность наблюдается при температуре 35°С. Это значение несколько ниже, чем для ферментов грибов Pleurotus eringii (Wang и др., 2001) и Tricholoma saponaceum (Kim, 2001) (45°С и 55°С соответственно).

При изучении термостабильности протеиназ из экстракта плодовых тел вешенки было установлено, что молокосвертывающая активность сохраняется до 50°С при рН 5. Дальнейшее повышение температуры резко инактивирует молокосвертывающие ферменты плодовых тел изучаемого гриба. При 4 °С молокосвертывающая активность сохраняется на одном уровне в течение месяца.

В ходе выполнения работы изучали действие ФМСФ, пепстатина, моноиодацетата и ЭДТА, как ингибиторов молокосвертывающей активности. Контролем служил экстракт плодовых тел вешенки обыкновенной, инкубированный с дистиллированной водой без ингибитора (рис. 6).

СимМ/ш

Б 0 °'02 °.и СимМ/ш

О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 :СП,М1И/Ш

О 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1 С», ММ/Ш

Рис. 6. Действие ингибиторов на молокосвертывающую активность в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной. А) действие ФМСФ, Б) действие пепстатина, В) действие моноиодацетата, Г) действие ЭДТА * - достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности по сравнению с

контролем

Полученные выше данные анализа действия ингибиторов позволили предположить, что в экстракте плодовых тел вешенки содержатся сериновые и металлопротеиназы.

Дальнейшие исследования были направлены на очистку молокосвертыващих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной. Первым этапом было выбрано осаждение неорганическими солями. В качестве реагентов выбрали сульфат аммония и хлорид натрия.

При ступенчатом фракционировании сульфатом аммония получили, что максимальная молокосвертывающая активность белка проявляется при

осаждении сульфатом аммония в диапазоне от 0,3 до 0,7 степеней насыщения экстракта солью (рис. 7).

а) Степень насыокния {NN4)2 504 6) Степей нась,ш„ия (МН4)2504

Рис.7. Ферментативная активность осадка при ступенчатом фракционировании сульфатом аммония экстракта плодовых тел вешенки

обыкновенной.

а) протеолитическая активность по казеину; б) молокосвертывающая активность.

При получении ферментных препаратов для пищевой промышленности важным этапом является осаждение. В качестве реагента могут быть использованы различные неорганические соли или органические растворители. Удобным и нетоксичным реагентом считается хлорид натрия. Однако он не способствует стабильности осаждаемых протеолитических ферментов, а так же хуже осаждает белки из экстракта, чем, например, сульфат аммония.

Нами была исследована возможность выделения молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной с помощью хлорида натрия. Было установлено, что при полном насыщении раствора солью при естественном значении рН 6,01 экстракта содержание белка в надосадочной жидкости составляло 11,75 ± 0,66 мг/ г сырой массы гриба и сохраняло до 80 % исходной молокосвертывающей активности, что составило 3,22 ± 0,66 усл. Е / г сырой массы гриба. В связи с этим была предпринята попытка увеличения выхода ферментативной активности осадка при значениях рН экстракта от 1,5 до 8,0 (рис. 8).

1S.00

16,00

14,00

12,00

$ 10,00 a

¿5 s.oo 6,00 4,00 2.00 0,00

1.50 2,50 3.50 4,50 5,50 6.50 7.50 S.50 pH

Рис. 8. Выход молокосвертывающей активности при осаждении хлоридом натрия в зависимости от рН экстракта * обозначены достоверные изменения (р<0,05) молокосвертывающей активности второго экстракта вешенки обыкновенной по сравнению с предыдущей точкой исследования

Результаты исследования показали, что максимальный выход молокосвертывающей активности наблюдался при рН экстракта 3,60, что составило 18 % от начальной молокосвертывающей активности экстракта, (0,78±0,08 усл. Е MAC на один грамм сырой массы гриба по отношению к 0,56 ± 0,03 мг белка/грамм сырой массы гриба). При этом в надосадочной жидкости сохранилось 40 % от исходной молокосвертывающей активности экстракта (1,73±0,08 усл. Е MAC/ г сырой массы гриба). Полученный таким образом осадок применяли для получения сырного сгустка. В результате проведенного эксперимента получили еще два пика осажденной активности -при рН 4,75 и рН 5,70. Это позволило предположить наличие трех изоформ молокосвертывающих ферментов в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной.

Полученный при осаждении сульфатом аммония белок подвергли хроматографическому разделению на колонке с сефадексом G-75 superfine (1,9х 75 см) уравновешенной 0,01 М ацетатным буфером рН 5,0. Скорость элюции 12 мл/ч, объем фракций 4 мл (рис. 9).

—— Белок,ыг —А.усл. ЕМАС

Рис.9. Гель-хроматография на сефадексе 0-75 белков из плодовых тел ве-шенки. Скорость элюции 12 мл/ч. Объем фракции 4 мл.

В результате исследований получили 2 белковых компонента, обладавших молокосвертывающей активностью, с молекулярной массой около 30-40 к Да.

При этом ферментативная активность второго компонента была значительно выше. Она составляла 93 % от нанесенной на колонку молокосвертывающей активности и 91 % - от общей протеолитической.

Ингибиторный анализ белков, входящих в состав первого и второго пиков элюата показал, что молокосвертывающая активность компонента I не угнеталась ни одним из использованных ингибиторов. Молокосвертывающая активность компонента II угнеталась ФМСФ и ЭДТА. Это позволило

предположить, что в плодовых телах вешенки имеются три способные створаживать молоко протеиназы, относящиеся к сериновым и металлозависимым. Причем эти ферменты близки по молекулярной массе. Моноиодацетат не подавлял активность обоих компонентов, что указывало на отсутствие молокосвертывающих цистеиновых протеиназ в плодовых телах вешенки.

Для проверки предположения о наличии трех молокосвертывающих ферментов в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной было проведено изоэлектрическое фокусирование. Результаты этого исследования подтвердили наше предположение (рис.10). Было обнаружено три белковых компонента с изоточками 4,2, 6,7 и 8,8, обладающих молокосвертывающей активностью.

При этом белок с изоточкой 4,2 составил 55 % от нанесенного на колонку белка (37 мг из 65 мг) и 56 % молокосвертывающей активности (13,5 усл. Е MAC из 25 усл. Е MAC).

-------рН -белок, мг —•— А,едМАСУмл*0,1

Рис. 10. Изоэлектрическое фокусирование белков из плодовых тел вешенки обыкновенной, полученных после осаждения сульфатом аммония. Продолжительность 24 ч. Объем фракции 2,5 мл.

Ингибиторный анализ белковых компонентов, полученных методом гаоэлектрического фокусирования, показал, что молокосвертывающая активность компонента с изоточкой 4,2 полностью угнеталась ЭДТА, а ФМСФ на нее не действовал. Молокосвертывающая активность компонента с изоточкой 6,7 подавлялась ФМСФ на 50 %,а ЭДТА - на 100%. ФМСФ полностью подавлял молокосвертывающую активность компонента с изоточкой 8,8, тогда как ЭДТА не оказывал на нее действия. Таким образом, компонент с изоточкой 4,2 принадлежит к классу металлопротеиназ, компонент с изоточкой 8,8 - к классу сериновых. Можно также предположить, что компонент с изоточкой 6,7 также принадлежит к классу металлопротеиназ.

После осаждения белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной при рН 3,6 был получен ферментный препарат (выход 18 %). Его свойства сравнили с четырьмя ферментными препаратами сычужного действия (алтазим, сычужный фермент, сычужно-говяжий и курино-говяжий), а также с ацидин-пепсином и свежим экстрактом плодовых тел вешенки.

Таблица

Сравнение ферментативной активности осадка экстракта вешенки с другими

препаратами сычужного действия

Наименование ферментного препарата рН Объе м, мл Белок, Мг Активность Удельная активность МСА/ ПА

МАС Гемоглобин Казеин МАС Гемоглобин Казеин

Алтазим 4,8 10 10 26 26,5 2,6 2,65 0,98

Сычужный фермент 4,8 10 10 11 3,5 1,1 0,35 3,14

Сычужно-говяжий 4,4 10 10 12,5 6,5 1,25 0,65 1,92

Курино-говяжий 4,3 10 10 28 27,5 2,8 2,75 1,02

Ацидилпепсин 1,3 10 10 115 52,5 11,5 5,25 2,19

Осадок вешенки с№С1 3,6 10 40 2,4 1,9 0,06 0,048 1,26

Экстракт вешенки 6,9 5 75 12,5 13 0,17 0,17 0,96

Удельная молокосвертывающая активность осадка вешенки с NaCl ниже активности сычужного фермента, ацидин-пепсина и экстракта плодовых тел. Однако, соотношение молокосвертывающей и общей протеолитической активности исследуемого ферментного препарата - 1,26, являющееся важнейшей характеристикой молокосвертывающих ферментов, используемых в сыроделии, было близко к двум ферментным препаратам сычужно - говяжьему - 1,92 и курино — говяжьему - 1,02. Удельная активность полученного осадка по отношению к молокосвертывающей активности была ниже, чем у других препаратов, что объясняется более низкой степенью очистки по сравнению с другими.

Полученный молокосвертывающий ферментный препарат сравнили также с препаратами грибного происхождения, применяемыми в сыроделии (препараты Irpex lacteus и Endothia parasitica), а так же с протеиназой растительного происхождения, полученной из артишока и сычужным ферментом. Установлено, что молокосвертывающий ферментный препарат вешенки обыкновенной имеет оптимум активности несколько ниже, чем известные препараты из Irpex lacteus и Endothia parasitica, кроме того, полученный нами препарат имеет более низкий предел термостабильности. Этот факт имеет значение для применения в сыроделии, так как одной из проблем, связанных с использованием молокосвертывающих препаратов микробного и грибного происхождения является их высокая остаточная протеолитическая активность. Эта проблема ведет к появлению дополнительных технологических операций. В противоположность известным препаратам, полученный нами инактивируется при более низкой температуре. Кроме того, полученный нами препарат действует в тех же условиях кислотности среды, что и химозин (рН 3,5 - 7,0).

Одной из задач было исследование возможности получения сырного сгустка с помощью молокосвертывающих ферментов из экстракта плодовых тел вешенки. Сравнили способность полученного осадка образовывать сырный сгусток с сычужным ферментом и экстрактом вешенки. Оценка

органолептических качеств показала, что все образцы обладали нежной, однородной консистенцией, соответствующей требованиям, предъявляемым к мягким сырам. Образцы, приготовленные с использованием вешенки, имели кремовый оттенок, равномерный по всей массе, и легкий грибной аромат. Присутствие горечи в полученных образцах допустимо для мягких сыров.

Таким образом, полученный по разработанному нами способу ферментный препарат, сходен по некоторым свойствам с применяемыми в сыроделии препаратами и может быть использован после доработки в пищевой промышленности. Полученный по разработанному нами способу ферментный препарат может применяться в пищевой промышленности, например в сыроделии на стадии сычужного свертывания при производстве мягких сыров, а также на стадии созревания сыров с плесенью в качестве дополнения к грибному инокуляту.

ВЫВОДЫ

1. В плодовых телах ПеигоШ оя^еаНи (Рг.) Китт присутствуют три фермента, обладающие молокосвертывающей активностью. Ингибиторный анализ показал, что два из них являются металлопротеиназами, а один -относится к классу сериновых протеиназ, которые находятся в состоянии проферментов.

2. Интервал стабильности молокосвертывающих протеиназ находился в диапазоне рН 3,5 - 7,5. Оптимальные температурные условия активности молокосвертывающих протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной соответствуют температуре 35°С, молокосвертывающая активность ферментов сохраняется до 50 "С.

3. Молокосвертывающие ферменты плодовых тел вешенки обыкновенной с точками изоэлектрофокусирования в кислой (4,2) и слабокислой (6,7) средах являются металлопротеиназами, с изоточкой в щелочной среде (8,8) - сериновой протеиназой.

4. Фермент с изоточкой 4,2 вносит максимальный вклад в суммарную молокосвертываюшую активность экстракта плодовых тел вешенки (55 % от общей активности экстракта) и протеолитической активности (56 % от общей активности экстракта).

5. Установленно, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором ИаС1 при рН 3,6 и могут применяться в сыроделии на стадии образования сырного сгустка.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации в изданиях, рекомендованных ВАК

1. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т., Кожухова М.А. Выделение и характеристика фермента сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной// Известия ВУЗов. Пищевая технология, № 1 (302), 2008, Краснодар: Изд-во КубГТУ. С. 114-115,- 0,08п.л., личный вклад 80 %

2. Патент на полезную модель № 79100 РФ (Зс.).- Приоритет от 01.09.2008. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т., Бархатова Т.В., Кожухова М.А.Линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. - 0,12 п.л., личный вклад 80 %

3. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Очистка и характеристика молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной {Р1еигоШ о$ХгеаШ (Бг.) Китт.,)// Прикладная биохимия и микробиология, 2009, Т. 45, № 6, с. 690 - 692. - 0, 12 пл., личный вклад 80 %

4. Патент на изобретение № 2380416 РФ (6с.).- Приоритет от 04.08.2008.3арегестрирован 27.01.2010. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т., Бархатова Т.В., Кожухова М.А.Способ получения молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. -0,24 пл., личный вклад 80 %

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Протеазы сычужного действия в плодовых телах вешенки ИеигоШэ оз(геа1:из//Сбор1шк научных работ «Естествознание и гуманизм»Т.4. - Томск: 2007. - С. 45 - 46. - 0,04 п.л., личный вклад 80 %

2. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки Р1еигоШ оз1геаЫ$ //Материалы III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований - 2007» Т.8. - Днепропетровск: «Наука и образование». - 2007. - с. 34 - 35. -0,04 п.л., личный вклад 80 %

3. Лебедева Г.В. Изучение молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной // Сборник научных трудов по материалам международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007». Т.20. Биология, Сельское хозяйство, Искусствоведение и архитектура. - Одесса: Черноморье, 2007. - С. 3 - 4. - 0,04 п.л., личный вклад 100%.

4. Лебедева Г.В., Проскуряков М.Т. Очистка и характеристика молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной (ИеигоШв о.ч^еаШз) // VI Симпозиум Химия протеолитических ферментов. Тезисы докладов и стендовых сообщений. М.:. - С. 85. - 0,02 п.л., личный вклад 80 %

ПЕРЕЧЕНЬ ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

МАС - молочно-ацетатная смесь

УБС - универсальная буферная смесь

ФМСФ - фенилметилсульфонилфторид

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат.

Подписано в печать 18.05.2010 г. Формат 60*84/16. Объем 1,0 п.л. Набор компьютерный. Гарнитура Times New Roman. Бумага офсетная. Тираж 100 экз. Заказ № 121.

Отпечатано в копировально-множительном отделе Южного федерального университета 344006, г. Ростов-на-Дону, ул. Большая Садовая, 105/42, тел (863)263-82-91.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Дьяконова, Галина Вячеславовна

Оглавление.

Введение.

1.1 Протеолитические ферменты высших грибов.

1.2 Практическое применение протеиназ грибов.

1.3 Молокосвертывающие ферменты, применяемые в сыроделии.

Глава 2. Материалы и методы исследования.

2.1. Постановка эксперимента.

2.2 Получение биологического материала.

2.3.Определение количества белка в плодовых телах вешенки обыкновенной.

2.4 Методы исследования протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по природным субстратам.

2.4.1 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по молочно-ацетатной смеси.

2.4.2 Определение протеолитической активности ферментов экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по денатурированному гемоглобину.

2.4.3 Определение активности щелочных протеиназ экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной по казеину.

2.5 Методы определения физико-химических свойств.

2.5.2 Определение рН стабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной.

2.5.3 Определение термостабильности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной.

2.5.4 Определения температурного оптимума активности молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной.

2.5.5 Методика изучения действия ингибиторов на молокосвертывающие ферменты экстракта вешенки обыкновенной.

2.6 Определение оптимальных условий экстрагирования молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.7 Ступенчатое фракционирование белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной сульфатом аммония.

2.8 Осаждение белков, обладающих молокосвертывающей активностью, из экстракта плодовых тел вешенки обыкнолвенной с помощью хлорида натрия.

2.9 Гель-хроматографичекое разделение белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.10 Изоэлектрическое фокусирование белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.11 Ионообменная хроматография белков экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной.

2.12 Метод получения сырного сгустка.37"

2.13 Статистическая обработка.37"

Глава 3. Результаты и обсуждение.3^

3.1 Сравнительная оценка методов определения концентрации белка в экстракте плодовых тел вешенки обыкновенной.3 ^

3.3 Определение оптимальных условий экстрагирования белков из плодовых тел вешенки обыкновенной.4-1>

3.4 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно^ сульфатом аммония.

3.5 Осаждение белков из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенно^-хлоридом натрия.^^

3.7 Изоэлектрическое фокусирование белковой фракции плодовых тел вешенки обыкновенной, обладающей молокосвертывающей активностью.

3.8 Ионообменная хроматография молокосвертывающих белков плодовых тел вешенки обыкновенной.^НЗ»

3.9 Изучение физико-химических свойств молокосвертывающих белксу^ плодовых тел вешенки обыкновенной.

ЗЛО Сравнительный анализ физико-химических свойств молокосвертывающих протеиназ вешенки обыкновенной с протеиназам^ из грибов, животных и растений.^

3.11 Получение сырного сгустка.^^

3.12 Способ получения ферментного препарата из плодовых тел вешецЕс^ обыкновенной.^^

Введение Диссертация по биологии, на тему "Исследование некоторых физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной"

В связи с возрастающим дефицитом в пищевой промышленности Г1р0 теиназ сычужного действия остается актуальным поиск новых продуцентов таких ферментов, в том числе среди базидиальных грибов. Многочисл<&цные исследования свидетельствуют о том, что среди базидиальных дереводр азру шающих грибов имеются активные продуценты молокосвертывающизс теиназ (Бойко, Стадничук, 2001). По сравнению с широко используе;д/1Ь1МИ продуцентами молокосвертывающих протеиназ родов Endothia и базидиомицеты имеют ряд преимуществ. Например, отсутствие плодоцоше-ния в культуре, что позволяет снизить риск развития аллергических з^боле ваний, а также отсутствие загрязнения ферментных препаратов бактерИаль ными культурами. Установлено, что гриб 1грех lacteus Fr. способен о(5разо вывать протеиназы, которые могут стать заменителями сычужного Фермента (Kikuchi, Kobayashi, Kusakabe, 1985). Способы получения соответствующее ферментного препарата и молочных продуктов с использованием Данного ферментного препарата защищены международными патентами (United States Patent 3607655, 3212905, 3275453). Скрининговые исследования показали наличие молокосвертывающей активности у многих видов базидиальных грибов (Федорова, 1973), в том числе и для некоторых культивируемых промышленных масштабах. Например, в культуральном фильтрате Вещенки обыкновенной {Pleurotus ostreatus (Fr.) Kumrn.) обнаружены протеиназы способные створаживать молоко. Данный вид гриба выращивается гго всему миру, не токсичен. Его плодовые тела перспективны для всестороннего исследования, так как могут являться относительно дешевым и удобны^ сырьем для получения ферментных препаратов.

Целью нашей работы являлось выделение, очистка и изучение физико-химических свойств молокосвертывающих ферментов вешенки обыкновенной {Pleurotus ostreatus (Fr.) Китт.), а также возможность использования к ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).

3. Исследование возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35-40 кДа, которые находились в состоянии проферментов и имели точки изоэлектрофокусиро-вания 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопро-теиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором КаС1. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка А§апса1ез. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов. ферментного препарата сычужного действия из плодовых тел вешенки обыкновенной в промышленности.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. Выделение и очистка молокосвертывающих ферментов из плодовых тел вешенки обыкновенной.

2. Исследование физико-химических свойств ферментов (оптимумы активности и стабильности, изоэлектрическая точка, взаимодействие с ингибиторами).

3. Исследование возможности применения ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной для получения сырного сгустка.

Научная новизна. Установлено, что молокосвертывающая активность экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной связана с наличием трех белков-ферментов с близкими молекулярными массами 35 — 40 кДа, которые находились в состоянии проферментов и имели точки изоэлектрофокусиро-вания 4,2, 6,7 и 8,8. Ферменты с изоточками 4,2 и 6,7 являлись металлопро-теиназами, а с изоточкой 8,8 относился к классу сериновых протеиназ. Показано, что молокосвертывающие ферменты сохраняют активность при их высаливании 100% насыщенным раствором ЫаС1. Условия, при которых из экстракта плодовых тел вешенки обыкновенной в стабильном состоянии хлоридом натрия осаждаются молокосвертывающие ферменты, установлены впервые.

Разработаны научные основы применения плодовых тел вешенки обыкновенной в качестве продуцентов молокосвертывающих ферментов.

Практическая значимость работы. Настоящая работа выполнена в области фундаментальных исследований биохимии грибов порядка А§апса1ез. Установлен тип строения активных центров молокосвертывающих ферментов плодовых тел вешенки обыкновенной. Полученные результаты расширяют данные о физико-химических свойствах протеолитических ферментов грибов.

Разработаны способы получения ферментных препаратов и методы выделения молокосвертывающих протеиназ. Для промышленного использования разработана линия производства молокосвертывающего ферментного препарата из плодовых тел вешенки обыкновенной. Показана возможность использования такого препарата в сыроделии на стадии образования сгустка.

Апробация работы. Материалы работы докладывались на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов», III международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы научных исследований-2007» и международной научно-практической конференции «Современные проблемы и пути их решения в науке, транспорте, производстве и образовании 2007».

Публикации результатов исследований. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ (0,34 п.л., личный вклад 80 %), в том числе в изданиях, рекомендованных ВАК РФ - 2 статьи и 2 патента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Дьяконова, Галина Вячеславовна, Ростов-на-Дону

1. Адаме Р. Методы культуры клеток для биохимиков. - М.: Мир, 1983. -624 с.

2. Беккер З.Э. Физиология и биохимия грибов. М.: Изд-во МГУ, 1988. -227 с.

3. Белова Н.В. Базидиомицеты как источник биологически активных веществ // Растит, ресурсы. 1991. - Т. 26. - № 2. - С. 8 - 12.

4. Белова Н.В. Перспективы использования активных соединений высших базидиомицетов в России // Микология и фитопатология. 2004. - вып. 2. -С. 1-7.

5. Белова Н.В. , Псурцева Н.В., Мнухина А.Я., Алехина И.А.Современные направления экспериментального исследования базидиомицетов // Ми-кол. и фитопатология. 1997. - Т.31. - вып. 6. — С. 64 -75

6. Бойко М.И., Стадничук В.М.Дереворазрушающие грибы активные продуценты протеиназ молокосвертывающего и тромболитического действия // Успехи медицинской микологии. - 2001. - Т.1. - С. 237 - 238.

7. Бухало A.C. Высшие съедобные базидиомицеты в чистой культуре— Киев: Наук. Думка. 1988. - 144 с.

8. Гзогян Л.А. Протеолитические ферменты и их ингибиторы в высших грибах: дис. . канд. Биол. наук. Краснодар, 2005. - 111 с.

9. Горбатова К.К. Биохимия молока и молочных продуктов. М.: б.и.. -2003.-288 с.

10. Горшина Е.С., Скворцова М.М., Бирюков В.В. Технология получения биологически активной субстанции лекарственного гриба кориола опушенного// Биотехнология. 2003. - №2. - С. 45 - 53.

11. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. М: Агропромиздат — 1987-35 с.

12. Денисова Н.П. Природа и биологическая роль протеиназ базидиальных грибов // Микология и фитопатология. 1984. - Т.18 - №2. - С. 116 - 121.

13. Денисова Н.П. Протеолитические ферменты базидиальных грибов. Таксономические и экологические аспекты их изучения: автореф. дис. . докт. биол. наук 1991. — 31 с.

14. Джорджеску П., Пуэнеску Е. Биохимические методы диагноза и исследования. Бухарест: Медицинское изд-во. - 1963. - 611 с.

15. Дзигун Л.П. Особенности дереворазрушающего базидиомицета Laetiporus sulphureus (Bull.: Fr.) Murrill. в культуре // Украинский ботанический журнал. 2004. - Т.61. - № 1. - С. 100 - 105.

16. Дмитриева Т.А., Корчмарева A.B., Шамцян М.М. Изучение молокосвер-тывающих ферментов высших базидиальных грибов / Т.А. Дмитриева, //

17. Досон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.Справочник биохимика. М.: Мир,- 1991.-544 с.

18. Ершова Е.Ю., Ефременкова О.В. Метод очистки мицелиальных грибных культур от бактериального загрязнения // Микология и фитопатология. -2003. Т. 37. - вып. 4. - С. 92 - 95.

19. Кислухина О.В. Ферменты в производстве пищи и кормов. — М.: ДеЛи принт. 2002. - 236 с.

20. Климовский И.И. Биохимические и микробиологические основы производства сыра. М.: Пищевая промышленность. — 1966. - 207 с.

21. Королев С.А. Основы технической микробиологии молочного дела. М.: «Пищевая промышленность». - 1974. - 344 с.

22. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. - 1980.-282 с.

23. Лакин Г.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа. - 1990. -135 с.

24. Маттисон H.JL, Н.Н.Фалина Протеолитическая активность Афиллофоро-вых грибов в поверхностной культуре // Микология и фитопатология. — 1973. Т.7. - № 5. - С. 394 - 399.

25. Микробиологические и биохимические процессы в сыроделии и маслоделии: Сб. статей. — М.: «Пищевая промышленность». 1973. - 91 с.

26. Мосолов В.В. Протеолитические ферменты. М.: Наука. - 1971. - 414 с.

27. Нортроп Д., Кунитц М., Херриотт Р. Кристаллические ферменты. М.: Издательство иностранной литературы. - 1950. - 346 с.

28. Остерман JI.A. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. - 1985. - 536 с.

29. Охрименко О.В., Горбатова К.К., Охрименко A.B. Лабораторный практикум по химии и физике молока. СПб.: Гиорд. -2005. — 256 с.

30. Поединок Н.Л., Бисько H.A., Михайлова О.Б., Потемкина Ж.В., НегрийкоA.М.Повышение эффективности промышленного культивирования съедобного гриба вешенки обыкновенной // Биотехнология. — 2004. № 5. — С. 64-66.

31. Производство новых видов сыра / ГОСИНТИ. М: б.и.. - 1962. - 77 с.

32. Производство сыра : технология и качество. М.: ВО " Агропромиздат". — 1989.-496 с.

33. Псурцева Н.В., Мухина А .Я. Культуральная характеристика и активность экзопротеаз базидиомицетов рода Flammulina I. Поверхностное культивирование // Микология и фитопатология. 1996. - Т.30. - №1. - С. 44 — 50.

34. Пятницкий Н.П., Проскуряков М.Т. Определение активности химотрип-сина по скорости створаживания молочно-ацетатной смеси // Материалы 17 научной конференции физиологов юга РСФСР. Т.2. Ставрополь.: ставропольское книжное издательство 1969. - С. 80 - 82.

35. Ревин В.В. , Шутова В.В., Лияськина Е.В., Ибрагимова С.А., СамуиловB.Д. Морфологическая и физиолого-биозимическая характеристика бази76диомицета Panus tigrinus II Микология и фитопатология. 2003. - Т. 37. — вып. 4.-С. 72-77.

36. Ригетти П. Изоэлектрическое фокусирование: Теория, методы и применение. М.: Мир. - 1986. - 398 с.

37. Рид Дж. Ферменты в пищевой промышленности. М.: «Пищевая промышленность». — 1971.-414 с.

38. Ровбель Н.М. , Гончарова И.А., Смирнов Д.А. Оценка сорбционной активности глубинной биомассы высших базидиальных грибов по отношению к ионам меди // Микология и фитопатология. 2004. - Т.38. -вып. 4.-С. 73-77.

39. Руденская Г.Н. , Гайда A.B., Степанов В.М. Карбоксильная протеиназа из базидиального гриба Russula decolorans Fr. 0456 II Биохимия. — 1980. — T.45. вып.З.- С. 561 - 568.

40. Свириденко Ю.Я. ,. Краюшкин В.А Молокосвертывающие ферментные препараты в свете IDF стандартов // Сыроделие. - 2000. - № 3. - С. 29 -30.

41. Скоупс Р. Методы очистки белков М.: Мир. - 1985. - 375 с.

42. Справочник сыродела / под ред. Н.В. Румянцева. М.: Пищепромиздат. -1954.-520 с.

43. Справочник технолога молочного производства / под ред. Г.Г. Шилера. — С-Пб.: Гиорд. 2003. - 320 с.

44. Степанова Е.В. , Золина Е.Д., Маркович H.A., Зиновьев В.В. Протеазы нематотрофных грибов рода Arthrobotrys и Trichoihecium И Биотехнология. 2001. - № 4. - С. 46 - 52.

45. Сухомлин К.Г. , Дмитриенко С.Н. Биохимия молока и мяса. Краснодар: Издательство КГАУ. - 2005. - 402 с.

46. Теплы М, Машек Я., Гавлова Я. Молокосвертывающие ферменты животного и мкробного происхождения. М.: «Пищевая промышленность». - 1980.-270 с.

47. Федорова JI.H. Протеолитическая активность высших грибов в поверхностной и погруженной культуре // Микология и фитопатология. 1973. -Т.7. - вып. 6. - С. 542 - 544.

48. Федорова Л.Н., Шиврина А.Н.Протеазы «сычужного» действия в культурах высших грибов // Микология и фитопатология. -1974. Т.8. - №1. -С. 22-25.

49. Феофилова Е.П. Современные направления в изучении биологически активных веществ базидиальных грибов // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т. 34. - Вып. 6 - С. 597 - 608.

50. Ферментные препараты в пищевой промышленности. / под. Ред. Чл.-кор. АНСССР B.JL Кретовича и доктора техн. Наук. B.JI. Яровенко. М.: «Пищевая промышленность». - 1975. - 536 с.

51. Ферменты в медицине, пищевой промышленности и сельском хозяйстве. Киев: Наук. Думка - 1968. - 252 с.

52. Храмцов А.Г., Милошенко В.В., Оноприйко А.В., Оноприйко В.А. Молоко: производство и переработка (Учебное пособие). Ставрополь: б.и.-2001.-с.

53. Шагинян К.А., Алёхина И.А., Денисова Н.П. Сериновая протеиназа из высшего базидиомицета рода Coprinus II Биохимия. — 1990. Т. 55. — вып. 8.-С. 1387-1395.

54. Шиврина А.Н. Биологически активные вещества высших грибов. — Москва Ленинград: "Наука". - 1965. - 350 с.

55. Arima К., Iwasaki Sh., Tamura G. Milk clotting enzyme from microorganisms. Part I. Screening test and identification of the potent fungus // Agricultural and biological chemistry. 1967. - V. 32. - № 5.- P. 540 - 545.

56. Berridge N J. Some observations on the determination of the activity of rennet // The Analyst. 1952. - V. 77. - № 911.- P. 57 - 62.

57. Billon Grand G., Poussereau N., Fevre M. The extracellular proteases secreted in vitro and in planta by the phytopathogenic fungus Sclerotinia sclerotiorum //Journal of phytopathology. 2002. - V. 150. - P. 507 - 511.78

58. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein die binding // Analitical Biochemistry. - 1976. - V.72.- P. 248 - 254.

59. Brown E.D., Wynne M.G., Clarke A. J., Yade R.Y. Purification of two fungal aspartic proteinases using fast protein liquid chromatography // Agricultural and biological chemistry. 1990. - V. 54. - № 6.- P. 1563 - 1565.

60. Burton K.S., Hammond J.B.W., Minamide T. Protease activity in Agaricus bisporus during periodic fruiting (flushing) and sporophore development // Current microbiology. 1994. - V. 28. - P. 275 - 278

61. Burton K.S., Wood D.A., Thurston C.F., Barker P,J. Purification and characterization of a serine proteinase from senescent sporophores of the commercial mushroom Agaricus bisporus // Journal of general microbiology. 1993. - V. 139.-P. 1379- 1386

62. Cavalcanti M.T.H., Teixeira M.F.S., Lina Filho J.L., Porto A.L.F. Partial purification of new milk-clotting enzyme prodused by Nocardiopsis spJ/ Biore-sourse Technology. 2004. - V. 93. - P. 29 - 35

63. Dohmae N., Hayashi K., Miki K., Tsumuraya Y., Hashimoto Y. Purification and haracterization of intracellular proteinases in Pleurotus ostreatus fruiting bodies // Bioscience, biotechnology and biochemistry. 1995. - V. 59. - № 11. -P. 2074-2080

64. Esteves C.rL.C., Lucey J.A., Pires E.M.V. Mathematical modelling of the formation of rennet induced gels by plant coagulants and chymosyn // Journal of Dairy Research. - 2001. - V. 68. - P. 499 - 510

65. Fan L. , Pan H., Soccol A.T., Pandey A., Soccol C.R. Advances in mushroom research in last decade // Food technology and biotechnology. 2006. - V. 44. - № 3. - P. 303-311

66. Fujimoto Z., Fujii Y., Kaneko S., Kobayashi H., Mizuno H. Crystal structure of aspartic prteinase from Irpex lacteus in complex with inhibitor pepstatin // Journal of molecular biology. 2004. - V. 41. - P. 1227 - 1235

67. Hashem A.M. Purification and properties of a milk-clotting enzyme prodused by Penicillum oxalicum I I Bioresource technology. 2000. - V. 75. - P. 219 — 222

68. Hattory M., Isomura Sh., Yo Kogama E., Ujita M., Hara A. Extracellular tryp-sin-like proteases produced by Cordyceps militaris II Journal of Bioscience and Bioengineering. 2005. - V. 100. - № 6. - P. 631 - 636

69. Ichishima E. Unique catalytic and molecular properties of hydrolases from Aspergillus used in Japanese bioindustries // Boiscience, biotechnology and biochemistry. 2000. - V. 64. - № 4. - P. 675 - 688

70. Ikasari L., Mitchell D. Leaching and characerization of Rhizopus oligosporus acid protease from solid state fermentation // Enzyme and microbial technology. - 1996.-V. 19.-P. 171-175

71. Ilani J., Netzer A. Milk-clotting activity of proteolytic enzymes // Journal of dairy science. 1969. - V. 52. - № 1. - P. 43 - 46

72. Kawai M. Flavor enchancement of milk foodstuffs. Pat. US. 3858492. 1975

73. Kawai M. Productivity of proteolytic enzymes and distribution of its milk clotting activity among the Basidiomycetes // Nippon Nogei Kagku Kaishy. Journal of the agricultural chemical society of Japan. 1973. - V. 47. - № 8. - P. 467-472

74. Kawai M. Studies on milk clotting enzymes prodused by Basidiomycetes. Part III. Partial purification and some properties of the enzyme prodused by Irpex lacteus Fr. // Agricultural and biological chemistry. -1971.-V. 35. № 35. -P. 1517-1525

75. Kikuchi E., Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Fiber-structured cheese making with Irpex lacteus milk-clotting enzyme // Agricultural and biological chemistry. 1988. - V. 52. - № 5. - P. 1277 - 1278

76. Kikuchi E., Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K. Suitability of milk-clotting enzyme from Irpex lacteus for Gouda cheese manufacture // The journal of zootechnical science. 1988. - V. 59. - № 6. - P. 532 - 539

77. Kim J.-H., Kim Y.S. A fibrinolytic metalloprotease from the fruiting bodies of an edible mushroom Armillariella mellea II Bioscience, biotechnology and biochemistry. 1999. - V. 63. - № 12. - P. 2130 - 2136

78. Kim J.-H., Kim Y.S. Characterization of a metalloenzyme from a wild mushroom Tricholoma saponaceum II Bioscience, biotechnology and biochemistry. 2000. - V. 65. - № 2. - P. 356 - 362

79. Kobayashi H., Kasamo K., Mizuno H., Kim H., Kusakabe I., Murakamy K. Crystallization and preliminary X-ray diffraction studies of aspartic proteinase from Irpex lacteus II Journal of molecular biology. 1992. - V. 226. - P. 1291 -1293

80. Kobayashi H., Kusakabe I., Murakami K.Milk-clotting enzyme from Irpex lacteus as a calf rennet substitute for cheddar cheese manufacture // Agricultural and biologycal chemistry. 1985. - V. 49. - № 6. - P. 1605 - 1609

81. Kobayashi H., Kusakabe I., Okamura M., Murakami K. Substrate specificity of the milk-clotting enzyme from Irpex lacteus on peptide hormones // Agricultural and biologycal chemistry. 1986. - V. 50. - № 4. - P. 923 - 930

82. Kobayasy H., Kusacabe I., Muracami K. Purification and characterization of two milk-clotting enzymes from Irpex lacteus II Agricultural and biologycal chemistry. 1983. - V. 47. - № 3. - P. 551 - 558

83. Kowalchyk A.W., Olson N.F. Effekts of pH and temperature on the secondary phase of milk clotting by rennet // Journal dairy science. 1977. - V. 60. - P. 1256 -1259

84. Kumar S., Sharma N.S. , Saharan M.R., Singh R. Extracellular acid protease from Rhizopus oryzae: purification and characterization // Process Biochemistry. -2005. -V. 40.-P. 1701 1705

85. Lindahl B.D., Olsson S. Fungal translocation creating and responding to environmental heterogeneity // Mycologyst. - 2004. - V. 18. - part 2. - May. - P. 79-88

86. Lopez A., Teixeira G., Liberatio M.C., Pais M.S., demente A. New vegetal sources for milk clotting enzymes // Journal of molecular catalysis B: enzymatic. 1998.-№ 5. - P. 63-68

87. Lopez M.B., Lomholt S.B., Qvist K.B. Rheological properties and cutting time of rennet gels. Effect of pH and enzyme concentration // International dairy journal. 1998. - V. 8. - P. 289 - 293

88. Machalinski C., Pirpignani M.L., Marino C., Mantegazza A., de Jimenez Boni-no H.B. Structural aspects of the Mucor bacilliformis proteinase, a new member of the aspartyl-proteinase family // Journal of biotechnology. 2006. - V. 123.-P. 443-452

89. Methods in enzymology. Vol. 19 Proteolytic enzymes. N. Y., San Francisco, London: Academic press. 1970. 1042 p.

90. Mukai N., Kawai M. Flavor enhancement of milk foodstuffs. US Patent № 3858492. March 1968

91. Mukai N., Kawai M. Process for produsing milk clotting enzyme. US Patent № 3607655. September 1971.

92. Nerud F., Misurcova Z., Musilek V. Production of milk-clotting enzymes by Basidiomycetes // Folia microbiology. 1989. - V. 34. - P. 310 - 315

93. Newman M., Safro M., Frazao C., Khan G., Zdanov A., Tickle I.J., Blundell T.L., Andreeva N. X-ray analyses of aspartic proteinases IV // Journal of molecular biology. 1991. -V. 221. - P. 1295 - 1309

94. Ng T.B. Peptides and proteins from fungi // Peptides. 2004. - V. 25. - P. 1055-1073

95. Northrop J.H. Pepsin activity units and methods for determining peptic activity. 1932.

96. Pina D.G., Oliveira C.S., Sacramento A.C., Barros M., Pires E., Zhadan G.G., Villar E., Gavilanes F., Shnyrov V.L. Thermostability of cardosin A. from Cynara cardunculus L. // Thermochimica Acta. 2003. - V. 402. - P. 123-134

97. Poza M., de Miguel T. , Sieiro C., Villa T.G. Characterization of a broad pH range protease of Candida caseinolytica II Journal of applied microbiology. V. 91.-P. 916-921

98. Poza M., Prieto-Alcedo M. , Sieiro C., Villa T.G. Cloning and Expression of clt Genes Encoding Milk-Clotting Proteases from Myxococcus xanthus 422 // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V. 70. - No, 10. - P. 6337 - 6341

99. Psurtseva N.V., Mnukhina A.Y. Morphological, physiological and enzyme variability of Flammulina P.Karst. cultures // Микология и фитопатология. -1998. Т. 32. - № 1. - С. 49 - 54

100. Raymond M.N., Bricas Е., Salesse R., Gamier J. A proteolytic unit for chy-mosin (rennin) activity based on a reference synthetic peptide //Journal dairy science. 1973. - V. 56. - № 4. - P. 419 - 422

101. Sardinas J.L. Rennin enzyme of Endothia parasitica II Applied microbiology. 1968. - V. 16. - № 2. - P. 248 - 255

102. Shin H.-H., Choi H.-S. Purification and characterization of cystein protease from Pleurotus ostreatus II Bioscience, biotechnology and biochemistry. — 1998. V. 62. - № 7. - P. 1416 - 1418

103. Silva S.V., Allmere Т., Malcata F.X., Andren A. Comparative studies on the gelling properties of cardosins extracted from Cynara cardunculus and chymo-sin on cow's skim milk // International dairy journal. 2000. - V. 13. - P. 559 -564

104. Silva S.V., Malcata F.X. Studies pertaining о coagulant and protolitic activities of plant proteases from Cynara cardunculus И Food chemistry. 2005. -V. 89.- P. 19-26

105. Sousa M.J., Ardo Y., McSweeney P.L.H. Advances in the study of proteolysis during the cheese ripening // International dairy journal. 2001. - V. 11. -P. 327-345

106. Sternberg M.Z. Crystalline milk-clotting protease from Mucor miehei and some of its properties // Journal of dairy science. 1971. - V. 54- № 2. - P. 159-167

107. Tavaria F.K., Sousa M.J., Malcata F.X. Storage and lyophilization effects of extracts of Cynara cardunculuson the degradation of ovine and caprine caseins // Food chemistry. 2001. - V. 72. - P. 79 - 88

108. Taylor J.B. Biochemical characterization of some additional mycelial cultures of basidiomycetes // Annals of applied biology. 1977. - V. 85. - № 2. -P. 181-193

109. Terashyta T.,. Oda K, Kono M., Murao S. Purification and some properties of metal proteinases from Lentinus edodes II Agricultural and biological chemistry. 1985. - V. 49. - № 8. - P. 2293 - 2300

110. Wadekar R.V., North M.J., Watkinson S.C. Proteolytic activities in two wood-decaing basidiomycete fungi, Serpula lacrimans and Coriolus versicolor II Micobiology. 1995. - V. 41. - P. 1575 - 1583