Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Высококонтрастные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Высококонтрастные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка"

российская академия наук

институт биоорганической химии им акад м м шемякина и ю а овчинникова

На правах рукописи

Суслова Екатерина Андреевна

высококонтрлстные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка

специальность - 03 00 03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2008

003446834

Работа выполнена в лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины Института биоорганической химии им акад М М Шемякина и Ю А Овчинникова Российской Академии Наук

Научный руководитель

Чудаков Дмитрий Михайлович, кандидат биологических наук Официальные оппоненты

Деев Сергей Михайлович, доктор биологических наук, член-корреспондент РАН, заведующий лабораторией молекулярной иммунологии ИБХ РАН,

Савицкий Александр Павлович, доктор химических наук, профессор, заведующий лабораторией физической биохимии института биохимии

им А Н Баха РАН Ведущая организация

Научно-исследовательский ииститут физико-химической биологии им А Н Белозерского МГУ

Защита состоится « » Имя0/)/! 2008 г в часов на заседании

диссертационного совета при Институтег биоорганической химии им М М Шемякина и 10 А Овчинникова Российской Академии Наук по адресу 117997, ГСП-7, Москва, В-437, ул Миклухо-Маклая, 16/10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биоорганической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова

Автореферат разослан «

¿о» СЮС 2008

г

Ученый секретарь

диссертационного совета, _____

доктор физико-математических нал к

В А Олейников

Актуальность проблемы. Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent Protein) медузы Aequorea Victoria в 1992 году открыло широкие возможности для прижизненной визуализации объектов и положило начало ряду исследований, связанных с GFP и другими GFP-подобными флуоресцентными белками (ФБ), обнаруженными позднее Сегодня одно из наиболее интенсивно развивающихся направлений в области применения GFP-подобных белков - это создание генетически кодируемых сенсоров (ГКС) Такие сенсоры позволяют визуализировать активность интересующих исследователя белков, а также изменения концентраций определенных молекул

По сравнению с химически синтезируемыми флуоресцентными красителями, ГКС имеют ряд преимуществ Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекции, использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить ГКС в различные органеллы живой клетки, также могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие ГКС в определенных тканях в определенный период времени Так как белки живой клетки принимают участие в абсолютном большинстве происходящих в ней событий, с использованием соответствующих белковых доменов потенциально может быть разработан ГКС практически для любой сигнальной молекулы или ферментативной активности

Достаточно широкое распространение получило создание ГКС на основе принципа FRET (Forster Resonance Energy Transfer) - безызлучательного переноса энергии возбужденного состояния флуорофора одного флуоресцентного белка (донорного) на другой (акцепторный) Альтернативный подход основан на использовании пермутированных вариантов ФБ - cpFP (circularly permuted Fluorescent Protein), т e таких вариантов, в которых нативные N- и С- концы белка соединены с помощью пептидного линкера, а новые концы образованы в другой части белка, чаще всего вблизи хромофора

Однако, несмотря на значительный потенциал ГКС в качестве инструментов для изучения различных процессов в живых клетках и тканях, разработанные ранее ГКС обладают рядом недостатков, затрудняющих их практическое применение Одной из основных проблем является низкий контраст флуоресцентного ответа ГКС на детектируемый аналит Для FRET-индикаторов контраст (выраженный в долях или %) отражает изменение отношения флуоресценции акцептора к донору после «срабатывания» сенсора Аналогичным образом проводят оценку контраста так называемых «ратиометрических» индикаторов, характеризующихся аналит-зависимым «перетеканием» пиков возбуждения флуоресценции Применительно к cpFP-еодержащим сенсорам с одним пиком возбуждения и эмиссии флуоресценции контраст соответствует степени изменения

интенсивности флуоресцентного сигнала после взаимодействия с аналитом Помимо недостаточного контраста, подавляющее большинство cpFP-ГКС обладает также недостаточной яркостью флуоресценции Никий контраст и яркость делают большинство описанных ранее сенсоров малопригодными для высокопроизводительных скринингов лекарственных препаратов и ограничивают их чувствительность во внутриклеточных экспериментах Таким образом, создание ГКС с высокой яркостью флуоресценции и высоким контрастом, как на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков, так и на основе FRET, является сегодня актуальной задачей

Цель работы Цель данной работы - разработка высококонтрастных генетически кодируемых сенсоров на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP

Структура работы Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и их обсуждения, а также выводов и списка литературы Работа изложена на ^страницах и содержит ^иллюстрации, 3 таблиц и ¡©ссылок на литературные источники

Научная новизна. Установлены ключевые позиции аминокислотных остатков, отвечающих за изменение флуоресцентных свойств ГКС на основе пермутированных (ср 147-146) вариантов флуоресцентных белков В результате подбора оптимальных комбинаций аминокислот в этих ключевых позициях впервые созданы ГКС с более чем 10-кратным контрастом - Са2+ сенсоры Casel2 и Caselô, характеризующиеся 12- и 16-кратным возрастанием яркости флуоресценции, соответственно Впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработан сенсор активности протеинкиназы А (РКА) - RePKA2, характеризующийся выраженными изменениями спектральных свойств в ответ на фосфорилирование РКА Созданы высококонтрастные FRET-пары PS-CFP/phiYFP, mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP и на их основе -генетически кодируемые сенсоры протеолитической активности

Практическая значимость работы. Разработанный Са2+ сенсор Casel2 по своим характеристикам существенно превосходит опубликованные ранее ГКС и не уступает химически синтезированным флуоресцентным индикаторам Са2+ В отличие от последних он может быть избирательно направлен в любой компартмент клетки, а также использован для исследований в трансгенных организмах Показана высокая эффективность Case 12 в качестве детектора Са2+ в различных типах эукариотических клеток Созданы митохондриально- и мембрано-локализованная версии Case 12 В настоящее время ведутся работы по созданию трансгенных мышей, несущих ген Case 12

Полученное при разработке Case 12 оптимизированное пермутированное флуоресцентное «ядро» (cpFP) может быть использовано для создания ГКС различной специфичности На его основе разработан первый cpFP-еодержащий сенсор активности РКА - RePKA2, который может быть использован в изучении внутриклеточных путей передачи сигнала и, в перспективе, в высокопроизводительных скринингах новых лекарственных препаратов

Полученная FRET-пара PS-CFP/phiYFP нашла свое применение при создании высококонтрастного FRET-индикатора активности каталитических аутоантител в дружественной лаборатории биокатализа ИБХ РАН

На примере сенсоров активности каспазы-3 (CaspeR-B/G и CaspeR-G/R) показано, что разработанные FRET-пары mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP являются хорошей основой для создания высококонтрастных ГКС Показано, что CaspeR-B/G и CaspeR-G/R могут быть использованы в качестве надежных и удобных репортеров апоптоза

Разработанные в данной работе ГКС могут быть широко использованы как в исследованиях в области молекулярной биологии клетки, так и в высокопроизводительных скринингах

Апробация работы. Основные материалы диссертации были изложены на VIII чтениях, посвященные памяти акад Ю А Овчинникова (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2006), XIX зимней молодежной научной школе (ИБХ РАН, Москва, Россия, 2007), а также международных конференциях 370м ежегодном съезде Society for Neuroscience (Сан Диего, Калифорния, США, 2007) и 10ой конференции по методам и применениям флуоресценции (MAF-10) (Зальцбург, Австрия, 2007)

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей

Содержание работы

I. Разработка высококонтрастных Са2+ сенсоров

Метод кольцевой пермутации (circular permutation), при котором на уровне гена соединяют нативные N- и С- концы белка с помощью пептидного линкера с образованием новых концов, позволяет расположить детекторные белковые домены в непосредственной близости от хромофора. Благодаря этому конформационные изменения, происходящие в детекторных доменах под влиянием аналита, могут оказывать существенное влияние на флуоресцентные свойства сенсора.

Для создания высококонтрастных Са2+ сенсоров мы использовали подход, основанный на присоединении к С- и N-концам пермутированного варианта флуоресцентного белка (cpFP 147-146) кальмодулина (СаМ) и его пептида-мишени М13 (фрагмент легкой цепи киназы миозина), соответственно (рис. 1 А). При связывании Са2+ СаМ претерпевает глубокие конформационные перестройки, что обусловливает его взаимодействие с М13 в составе химерного конструкта. Это вызывает конформационные изменения аминокислотного окружения хромофора и может повлиять на соотношение его нейтральной (протонированной) и заряженной (депротонированной) форм, а также на квантовый выход флуоресценции и коэффициент молярной экстинкции, что, в конечном итоге выражается в изменении флуоресцентных свойств сенсора.

А

Рисунок 1.

А. Схема cpFP-содержащих Са2+ сенсоров. Цифрами обозначены а.о. ФБ, используемые для пермутации (нумерация согласно A. victoria).

Б. Модель пространственной организации срРР-содержащих Са2+ сенсоров в Са2+ связанной форме. Цветом выделены ключевые а.о. cpFP (145, 148 и 203) и соседние с ними а.о. 146 и 147. Ионы Са2+ обозначены красными сферами, Са2+ связывающие сайты СаМ -зелеными сферами. Хромофор cpFP выделен зеленым.

Наиболее вероятно, что пространственное расположение чувствительных доменов и ключевых а о окружения хромофора сходно для всех разработанных ранее cpFP-содержащих Са2+ сенсоров (типа GCaMPs и Pencams), в которых «разрыв» при пермутации осуществляли между 146 и 147 а о (нумерация согласно GFP дикого типа A victoria) Мы предложили общую пространственную модель расположения доменов в Са2+ сенсорах данного типа, схематично представленную на рис 1 Б

Адаптирование а о окружения хромофора в составе Са2* сенсоров Сравнение опубликованных ранее данных по cpFP-содержащим Са2+ сенсорам показало что 145, 148 и 203 а о cpFP оказывают определяющее влияние на флуоресцентные свойства сенсоров (табл 1(А)) и участвуют в образовании сети водородных связей По данным кристаллографического анализа в непермутированном GFP дикого типа боковые радикалы этих а о направлены внутрь p-барреля и принимают участие во взаимодействии с хромофором По всей вероятности, такое пространственное расположение сохраняется и в cpFP-ядре, входящем в состав Са2+ чувствительных индикаторов

Для получения Са2+ сенсора с улучшенным контрастом мы провели оптимизацию а о в ключевых позициях 145 и 148 Важно отметить, что все полученные нами варианты Са2+ индикаторов содержали Phe203

Используя метод сайт-направленного мутагенеза, мы ввели в 145 положение cpFP в составе химерных конструктов остатки Ser, Ala или Thr в комбинации с Asp, Glu или Asn в 148 положении Полученные варианты характеризовались различным направлением и выраженностью ответа на Са2+ (табл 1(Б)) Показано, что наличие в 148 положении cpFP гидрофильных и в особенности «кислых» а о (Asp или Glu) более предпочтительно (с точки зрения контраста сенсора), по сравнению с Asnl48 Glul48- и Asnl48 - содержащие варианты конструктов характеризовались единственным пиком возбуждения (максимум при 490 нм) и эмиссии флуоресценции (максимум при 517 нм) Варианты конструктов, несущие Asnl48 (в сочетании с Thrl45 или А1а145), демонстрировали лишь незначительное падение флуоресценции в ответ на Са2+ Введение же комбинации Asnl48/Serl45 изменило ответ сенсора в сторону умеренного возрастания флуоресценции в присутствии Са2+ В то же время сочетание Glul48 с гидроксил-содержащими а о в 145 положении (Glul48/Thrl45 в spS2 и Glul48/Serl45 в cpS2(S)) обусловило рекордный контраст 14 5-кратное возрастание эмиссии зеленой флуоресценции (при возбуждении на 490 нм) в ответ на Са2+ Напротив, введение в 145 положение а о с гидрофобным боковым радикалом (Ala) в сочетании с GIul48 привело к отсутствию ответа химерного конструкта на Са2* вероятно за счет нарушения сети водородных взаимодействий

Таблица 1. Ключевые а о окружения хромофора и максимальный контраст т vitro (при рН 7 4) cpFP-содержащих Са2+ сенсоров

t - возрастание флуоресценции в присутствии Са2+Д - падение флуоресценции в присутствии Са2+, t - перетекание пиков возбуждения флуоресценции в присутствии Ca2t

*Конечные варианты Са2+ сенсоров, полученных нами в результате мутагенеза cpFP-ядра сенсора cpS2

Название сенсора Ключевые a.o. окружения хромофора Контраст m vitro, раз

148 145 203

А Разработанные ранее cpFP-еодержащие Caz+ сенсоры

Репсат His Gly Tyr Î x 3 0

Flash-pen cam His Gly His Î x 8 0

Ratiometnc-pencam Asp Gly Phe I x 10 0

Inverse-pencam Thr Gly Ala J. 5 0

G18 Glu Gly Thr f x 4 3

GCaMPl Glu Thr Thr î x 4 3

GCaMPl 6 Glu Thr Thr î x 4 9

GCaMP2 Glu Thr Thr 1 x 5 0

Б Полученные в данной работе cpFP-еодержащие Са2+ сенсоры

cpSl Asn Thr Phe |x 1 1

cpSl (А) Asn Ala Phe 1x14

cpSl (S) Asn Ser Phe îx 1 5

cpS2 Glu Thr Phe îx 14 5

cpS2 (A) Glu Ala Phe не реагирует

cpS2 (S) Glu Ser Phe îx 14 5

cpS4 Asp Thr Phe |x 1 2

cpS4 (A) Asp Ala Phe 1x72

cpS4 (S) Asp Ser Phe 1x80

Сенсоры, полученные в результате мутагенеза cpS2

* Case 12 Glu Thr Phe îx 12 0

*Casel6 Glu Ser Phe î x 16 5

Оптимизация cpFP- ядра Ca2* сенсоров Для улучшения созревания при 37°С и яркости флуоресценции cpFP-ядро сенсора cpS2 оптимизировали с использованием метода случайного мутагенеза Среди полученных мутантных вариантов был отобран наиболее яркий и быстро созревающий, получивший название Casel2 (от Calcium sensor), характеризующийся in vitro 12-кратным возрастанием эмиссии флуоресценции в ответ на Са2+ (табл ЦБ))

Путем сайт-направленного мутагенеза (замена Thrl45Ser) из Casel2 был получен конструкт, названный Case 16 Показано, что Case 16 характеризовался увеличенным (по сравнению с Case 12) контрастом in vitro - до 16 5-кратного возрастания эмиссии флуоресценции в ответ на Са2+, однако менее эффективным созреванием Оба индикатора -Casel2 и Caseló - были протестированы in vitro

Тестирование Casel2 и Caseló in vitro Спектральные свойства Case 12 и Caseló представлены на рис 2ивтабл 2 Таблица 2 Сравнение характеристик cpFP-содержащих Са2+ сенсоров

Ф - квантовый выход флуоресценции, е - молярный коэффициент поглощения, М 'см1 (при возбуждении на 490 нм), относительная яркость флуоресценции в сравнении с EGFP, Авозб - длина волны возбуждения, нм, Лэм - длина волны эмиссии флуоресценции, нм, рКа - значение pH, при котором яркость флуоресценции составляет 50% от максимальной, Kd - значение константы диссоциации для Са2+, рМ, н/о - значение не определено *Сенсоры, полученные в данной работе

Название сенсора K.JKm> HM Ф E, JVT'CM'1 Яркость флуоресценции (Ф*е), относительно EGFP рКа К* цМ

Flash -pericam 494/514 0 20 16 900 0 10 79 0 70

G-CaMPl 488/510 0 05 1 400 0 002 7 1 0 24

G-CaMPl 6 488/509 0 79 3 800 0 09 82 0 16

G-CaMP2 487/508 0 93 19 000 0 54 н/о 0 15

*Casel2 491/516 0 24 48 000 0 35 72 1

*Casel6 490/516 0 17 50 000 0 28 72 1

Показано, что Сазе12 и Сазе16 характеризуются более чем 10-кратным возрастанием интенсивности флуоресценции в ответ на Са2+ (рис 2 А,Б) Сопутствующие изменения в спектрах поглощения в ответ на Са2+ отражают перераспределение между нейтральной

(протежированной) и заряженной (депротонированной) формами хромофора в пользу последней.

и

0

0J р, а

1

u Щ trrtM Сз2

/II \ t ДЕОТАЧ^

400 500 600 Длина волны, нм

и SJ

I

I 40

5 20 о

С 0

400

500

00

а 40

и

<0 20 О.

1° в1

£ 100

В 40 о

Щ 20 f-t

ё о

1тМ Саг*

400 500 600 Р Длина волны, нм

Длина волны, ТТМ

д

0.2 ыМ Са2+

400 500

Длина волны, ттм

10 10 10 [Са2+], (М) Case 12

10 10 10 [Са2+], (М) Case 16

Рисунок 2.

Спектральные свойства Casel2 (А, В, Д, Ж) и Casel6 (Б, Г, Е, 3).

A, Б. Максимальный контраст in vitro. Спектры

флуоресценции в

присутствии 0.5 мМ EGTA (пунктир) и 1 мМ Са2+ (сплошные) при рН 7.4.

B, Г. Спектры поглощения в присутствии 0.5 мМ EGTA (пунктир) и 0.4 мМ Са2+ (сплошные) при рН 7.4.

Д, Е. Зависимость интенсивности флуоресценции от рН в присутствии 0.5 мМ EGTA (пунктир) и 0.2 мМ Са2+ (сплошные). Ж, 3. Кривые титрования Са2+ (при рН 7.4).

Значение относительной яркости флуоресценции (как произведение молярного коэффициента поглощения (s) и квантового выхода флуоресценции(Ф)) в долях от EGFP составило для Casel2 и Casel6 0.35 и 0.28, соответственно. Это существенно превышает значение яркости флуоресценции для сенсоров Flash-Pericam и GCaMP1.6 и сопоставимо с таковым для опубликованного недавно улучшенного Са2+ сенсора GCaMP2 (табл. 2).

Затем для Casel2 и Casel6 определили значение Kd связывания Са2+, которое для обоих сенсоров при рН 7.4 составило 1 дМ. Таким образом, рабочий диапазон концентраций Са2+для Case 12 и Case 16 соответствует диапазону его физиологических концентраций.

Общий недостаток cpFP-содержащих сенсоров - высокая pH-чувствительность Так например, значение рКа для Са2+ индикаторов семейства Pencams варьирует от 7 9 до 8 5 Таким образом, при физиологических значениях pH (7 2 - 7 5) они демонстрируют достаточно низкую яркость флуоресценции и низкий контраст Значение рКа (в присутствии 0 2 мМ Са2+, при pH 7 4) для Casel2 и Case 16 равно 7 2, что близко к таковому для описанного ранее Са2+ сенсора GCaMPl (табл 2) Таким образом, Case 12 и Case 16 характеризуются улучшенной pH-стабильностью по сравнению с разработанными ранее Са2+ индикаторами

Тестирование Cosel2 и Case 16 в живых клетках Клетки HeLa, трансфицированные Case 12 или Case 16, характеризовались низкой интенсивностью зеленой флуоресценции (рис 3 В) Добавление к ним 30 цМ ионофора А23187, обеспечивающего поступление Са2+ (концентрация в среде 2 мМ), приводило к 5-6-кратному возрастанию интенсивности флуоресценции Casel2 Последующее добавление 20 мМ EGTA, хелатирующего Са2+, вызывало падение флуоресценции Case 12 до фонового уровня с конечным контрастом 11-12 раз (рис 3 А) Сходные результаты были получены для Case 16, для которого наблюдалось 7-9-кратное возрастание интенсивности флуоресценции в присутствии А23187 и конечный контраст 13-15 раз (рис 3 Б) Однако Casel6 характеризовался меньшей яркостью флуоресценции и большим временем созревания при 37°С, поэтому для экспериментов в живых клетках мы отобрали сенсор Casel2

Мы протестировали Са2+ зависимый ответ Case 12 в живых клетках на ряд стимулов С помощью Case 12 были детектированы АТР-индуцируемые колебательные изменения внутриклеточной концентрации Са2+ ([Са2+]с) - Са2+ осцилляции На рис 3 Д,Е представлен осцилляторный ответ клеток линии М21 (human melanoma-derived) на добавление 100 цМ АТР Показано, что возрастание интенсивности флуоресценции Casel2 в ответ Са2+ является полностью обратимым, что является желательной характеристикой для ГКС При стимуляции клеток РС12, экспрессирующих Casel2, с помощью агониста холинергических рецепторов карбахола (ССН, 500 цМ) наблюдалось возрастание яркости зеленой флуоресценции Case 12 (по инозитол-1,4,5-трифосфат (1Рз)-зависимому механизму), что свидетельствовало об увеличении [Са2+]с (рис 3 Ж) После 10 мин отмывки к тем же клеткам был добавлен KCl (30 мМ), активирующий вольтаж-зависимые Са2+ каналы Это привело к возрастанию [Са2+]с, что детектировали по возрастанию яркости флуоресценции Casel2 (рис 3 3)

20

к ЯП

ä

о Р-, 40

0

120

80

40

В

0 50 100 150 200 250 Время, с

40

80 120 160 Время, с

R ж

О 100 200 300 400 -ч О Время, с 5, 3

20 40 60 Время, с

200 300 400

Время, с

200 300 Время, с

Рисунок 3. Тестирование Casel2 и Casel6 в живых клетках.

Максимальный контраст

Casel2 (А) и Casel6 (Б) в клетках HeLa (стрелками отмечено добавление

ионофора А23187 и начало отмывки EGTA-содержащим раствором). В, Г. Фотографии клеток HeLa, экспрессирующих Casel2, до (В) и после (Г) добавления 30 |Л А23187 (Leica SP2, фильтр FITC). Д. Ответ клеток М21 на добавление ATP. Е. Те же клетки (первые 60 сек ответа на АТР). Ж. Ответ клеток РС12 на добавление карбахола (ССН). 3. Ответ тех же клеток (после отмывки) на добавление KCl.

Получение и тестирование митохондриапъной и мембранной версий Casel2 Са2+ является универсальным мессенджером, контролирующим большое разнообразие физиологических процессов, включающих оплодотворение, транскрипцию генов, сокращение мышц, пролиферацию, дифференциацию и миграцию клеток и, наконец, клеточную смерть. В цитоплазме эукариотических клеток особую роль играют микродомены, в которых свободная концентрация Са2+ ([Са2+]0 значительно выше его цитоплазматической концентрации ([Са2+]с). К ним в первую очередь относится пространство непосредственно под плазматической мембраной. Связывание лиганда или изменение мембранного потенциала вызывает открытие мембранных Са2+ каналов, приводя к возникновению локальных объемов (микродоменов) с повышенной концентрацией Са2+ ([Ca2+]i). Измерение [Ca2+]i в микродоменах представляет собой сложную задачу. Поскольку

возможность направленной доставки в различные компартменты клетки является несомненным преимуществом ГКС по сравнению с химически синтезируемыми индикаторами, для решения этой задачи была создана мембрано-локализованная версия Case 12 (Casel2mcm).

Casel2mcm получили путем присоединения на уровне гена к N-концу Case 12 сигнала мембранной локализации нейромодулина (MLS). MLS представляет собой 20 а.о. N-концевой фрагмент нейромодулина, содержащий сигнал посттрансляционного пальмитилирования остатков Cys 3 и 4, который направляет конструкт на внутреннюю поверхность плазматической мембраны.

Рисунок 4.

Локализация Casel2mem и Casel2m¡to в клетках HeLa.

A. Фотография клеток HeLa, экспрессирующих Casel2mem.

Б. Фотография клеток HeLa, экспрессирующих Casel2mit0. (Leica SP2, фильтр FITC).

B. Максимальный контраст Casel2mem в клетках HeLa.

Г. Максимальный

контраст Casel2m]t0 в клетках HeLa

(стрелками отмечено добавление А23187 и EGTA).

Время, с

0 200 300 400 500 600 700 800

Время, с

Другим компартментом, играющим важную роль в гомеостазе [Са2+]с являются митохондрии. Они быстро и эффективно аккумулируя ионы Са2+ и служат системой забуферивания [Са2+]с. Для мониторинга митохондриальной концентрации Са2+ ([Са2+] m )к последовательности Case 12 с N-конца на уровне гена был присоединен удвоенный сигнал митохондриальной локализации (dMito) из VIII субъединицы предшественника цитохромоксидазы С, направляющий химерный конструкт (Casel2m¡l0) в матрикс митохондрий.

При экспрессии Casel2mem и Casel2mito в клетках HeLa оба сенсора избирательно локализовались в соответствующих компартментах - на внутренней стороне плазматической мембраны или матриксе митохондрий, соответственно (рис. 4 А,Б). Эксперименты показали

работоспособность и высокий конраст сенсора в составе митохондриального и мембранного конструктов(рис 4 В,Г)

Сравнение Cosel2 с GCaMP2 и с химически синтезированными индикаторами Ca2*

Для подтверждения эффективности работы Case 12 его сравнили с GCaMP2 - одним из лучших разработанных на сегодня cpFP-содержащих Са2+ ГКС При экспрессии в клетках HeLa Casel2 и GCaMP2 оба индикатора характеризовались сопоставимой яркостью флуоресценции Показано, что контраст GCaMP2 в клетках HeLa при последовательном добавлении 30 цМ А23187 и 20 мМ EGTA составил 3 раза, что примерно в 4 раза меньше, чем для Casel2 Учитывая также повышенную pH-стабильность Casel2, можно утверждать, что по своим характеристикам он превосходит все опубликованные ранее Са2+ чувствительные cpFP-еодержащие ГКС

На следующем этапе было проведено сравнение Са2+ зависимого ответа Casel2 и достаточно широко применяемого химически синтезированного Са2+ чувствительного индикатора Oregon Green 488 ВАРТА-1 Для этого ответ проинкубированных с Oregon Green (конечная концентрация 7 рМ) клеток РС12 на стимуляцию 30 мМ KCl сравнили с ответом клеток РС12, трансфицированных Casel2 Показано, что исходная яркость флуоресценции и амплитуда ответа на Са2+для обоих индикаторов сходны

FCCP

Рисунок 5. Сравнение ответов Casel2 (F490/F0, зеленый) и Fura-2FF (F34o/F38o, красный) в кортикальных нейронах при последовательной стимуляции глутаматом (Glu) и

прогонофором (FCCP) Отмывка от Glu осуществлялась бескальциевым EGTA-

содержащим раствором (-Ca+EGTA)

750 1000 1250 1X0 17X1 2000 2250

Время, с

На рис 5 представлено сравнение ответа Сазе 12 (изменение эмиссии флуоресценции в ответ на Са2+ при возбуждении на 490 нм, Р^о/То) с ответом «ратиометрического» Са2+ индикатора Рига-2РР, характеризующегося изменением соотношения пиков возбуждения флуоресценции в ответ на Са2+, Рмо/Рзко) Кортикальные нейроны, сначала

трансфецированные Case 12, а затем проинкубированные с Fura-2FF были подвергнуты стимуляции глутаматом (100 цМ) Четкие спектральные различия генетически кодируемого Case 12 и химически синтезированного Fura-2FF позволили визуализировать их флуоресценцию в одних и тех же клетках независимо друг от друга при последовательном возбуждении Отмывка от глутамата проводилась бескальциевым раствором (содержащим 100 цМ EGT А) и индуцировала замедленное восстановление [Са2+]с Последующее добавление протонофора FCCP (1 рМ) в бескальциевой среде вызвало деполяризацию митохондрий и освобождение Са2+, накопленного в них во время обработки глутаматом Оба этих процесса были визуализированы с помощью Case 12 Показано, что Case 12 не уступает химически синтезированным флуоресцентным Са2+ репортерам

II. Разработка сенсоров активности протеинкиназы А

Потенциал использования пермутированных вариантов ФБ (cpFP) в создании индикаторов различной специфичности достаточно высок Однако, на сегодняшний день, за исключением Са2+ чувствительных индикаторов, публикации по cpFP-содержащим сенсорам практически отсутствуют Востребованным инструментом исследования в области изучения внутриклеточных путей передачи сигнала являются сенсоры активности киназ сАМР-зависимая протеинкиназа А (РКА) представлена во всех клетках млекопитающих и вовлечена в многочисленные сигнальные каскады Поэтому мы выбрали ее в качестве мишени при создании cpFP-сенсоров киназной активности

Флуоресцентной основой при разработке киназа-чувствительных сенсоров, получивших общее название RePKA (Reporter of РКА activity), послужило оптимизированное cpFP-ядро, полученное нами при создании Са2+ сенсора cpS2 В качестве чувствительных доменов использовали консенсусный пептид, фосфорилируемый РКА по остатку Ser, и фосфоаминосвязывающий домен 14-З-Зт (1-232), узнающий фосфорилированную форму пептида Мы предположили, что РКА-зависимое внутримолекулярное взаимодействие между фосфорилированным пептидом и 14-З-Зт должно послужить источником конформационных перестроек, способных изменить флуоресцентные свойства cpFP в составе химерного конструкта по механизму, аналогичному таковому для описанных выше Са2+ сенсоров

Проведение пермутации позволяет расположить детекторные домены в непосредственной близости от хромофора белка В этом случае длина линкерных участков между чувствительными доменами и заключенным между ними cpFP-ядром становится одним из ключевых параметров, определяющим контраст флуоресцентных индикаторов Для получения сенсора активности РКА с высоким контрастом мы провели оптимизацию

длин обоих линкерных участков: линкера 1, соединяющего 1Ч-концевой пептид и срБР, и линкера 2, соединяющего срРР с С-концевым 14-З-Зт. Путем варьирования числа а.о. в составе каждого из двух линкеров, а также использования различных комбинаций обоих линкеров была получена библиотека ЯеРКА-индикаторов с различной чувствительностью к фосфорилированию РКА, схематичный дизайн которых представлен на рис. 6.

Рисунок 6. Схема конструктов

(ЮШтАЗИга срп> 14-5-Зт типа РеРКА. С 1Ч-конца к срРР

присоединен пептид,

фосфорилируемой РКА по

N í~~T-i 1—[

237 1 1461 остатку Ser (выделен красным),

т т На С-конце cpFP расположен

Линкер 1 Лннжер 2 Д0Мен 14-З-Зт.

Параллельно химерным конструктам RePKA были созданы соответствующие им мутантные варианты (RePKA К), содержащие в составе пептидного субстрата замену фосфорилируемого остатка Ser на Ala (Ser8Ala). Они не подвергались фосфорилированию РКА и выступали в качестве негативного контроля фосфорилирования.

Длина волны, нм

Среди полученных RePKA-конструктов был отобран вариант с максимальным контрастом in vitro 1.8 раза, названный RePKA 1. Путем замены его cpFP-ядра на оптимизированную версию, полученную нами при разработке кальциевого Casel2, был получен конструкт RePKA2, характеризующийся значительно более быстрым созреванием при 37°С. RePKA2 является первым примером cpFP-еодержащего индикатора активности РКА.

RePKA2 был подвергнут последовательному действию каталитической субъединицы протеинкиназы А (РКА), а затем Ser/Thr-фосфатазы-! (РР1) in vitro. Показано, что фосфорилирование с помощью РКА остатка Ser в составе конценсусного пептида в RePKA2 приводило к возрастанию интенсивности его флуоресценции в 2.2 раза (рис. 7). Киназа-зависимое изменение флуоресценции RePKA2 было обратимым. Для блокирования активности РКА перед дефосфорилированием использовали специфичный ингибитор РКА -Н-89. Последующая инкубация с РР1 приводила к дефосфорилированию Ser и сопровождалась падением интенсивности флуоресценции. Неполный возврат интенсивности флуоресценции к исходному уровню после дефосфорилирования может быть обусловлен жестким взаимодействием между фосфорилированной формой пептида и доменом 14-З-Зт, защищающим химерный конструкт от действия РР1.

Ножер пробы

Рисунок 8. Включение у-Р32 в 1*еРКА2 в реакции

фосфорилирования с помощью РКА. 1*еРКА2 и 1*еРКА2К до

(1.4); после фосфорилирования

(2.5) и при последующем дефосфорилировании с помощью РР1 (3,6).

Эффективность фосфорилирования RePKA2 была подтверждена путем замены АТР на его радиактивно-меченый аналог у-Р32-АТР в реакции с РКА. Показано, что при фосфорилировании происходило включение у-Р32 в состав RePKA2 (рис. 8). В то же время для конструкта RePKA2K, содержащего в составе конценсусного пептида замену фосфорюжрилируемого остатка Ser (Ser8Ala), наблюдалось лишь незначительное возрастание суммарной радиоактивности пробы. Последующая инкубация RePKA2 с фосфатазой РР1 вызывала отщепление у-Р32, что сопровождалось падением суммарной радиоактивности пробы практически до исходного уровня. Таким образом, РКА-индуцируемый ответ RePKA2 обратим, что является желательной характеристикой для физиологических экспериментов.

III. Подбор эффективных донорно-акцепторных пар ФБ и создание на их основе FRET-сенсоров протеолитической активности

Сегодня ГКС, в которых используется FRET между двумя спектральными вариантами ФБ, все более широко используются в изучении белок-белковых взаимодействий и внутриклеточных путей передачи сигнала Перенос энергии осуществляется при пространственной близости и благоприятной ориентации двух флуорофоров Кроме того, необходимо, чтобы спектр эмиссии донора перекрывался со спектром возбуждения акцептора В большинстве случаев регистрируемыми параметрами при работе с FRET - сенсорами являются интенсивности флуоресценции донорного и акцепторного ФБ при возбуждении светом оптимальной для донора длиной волны При сближении донора и акцептора в химерном конструкте эффективность переноса энергии возрастает, что приводит к возрастанию интенсивности флуоресценции акцептора и к одновременному падению интенсивности флуоресценции донора Таким образом, изменение соотношения яркости флуоресценции донора и акцептора соответствует контрасту FRET-индикатора Контраст FRET-сенсоров ограничен эффективностью переноса энергии между парой ФБ, поэтому его увеличению способствует подбор более эффективных FRET-nap

FRET-napa PS-CFP/phiYFP Нами был разработан фотопереключаемый белок PS-CFP, обладающий способностью к фотоконверсии из голубого цвета в зеленый в ответ на облучение интенсивным светом с длиной волны 405 нм При умеренных интенсивностях возбуждающего света PS-CFP не фотоактивируется и может быть использован в качестве обычного голубого флуоресцентного маркера

Рисунок 9. Спектры возбуждения (пунктир) и эмиссии флуоресценции (сплошные) РБ-СРР (голубой цвет) и рИГУТР (желтый цвет) Область перекрывания спектра эмиссии РЭ-СРР со спектром возбуждения р|1^РР показана серым

300 350 400 450 500 550 600 650 700

Длина волны, нм

Максимум его спектра возбуждения составляет 402 нм, что близко к максимуму возбуждения флуоресценции для улучшенного варианта синего флуоресцентного белка EBFP В то же время PS-CFP характеризуется большим значением Стоксова сдвига (Stokes shift), демонстрируя 468 нм пик эмиссии флуоресценции, близкий к максимуму эмиссии флуоресценции ECFP Сдвинутый в синюю область (по сравнению с другими голубыми белками) пик возбуждения флуоресценции PS-CFP способствует его лучшему спектральному разделению с желтыми ФБ Спектр эмиссии PS-CFP имеет достаточно большую область перекрывания с желтым ФБ phiYFP (рис 9) На основании этого мы предположили, что PS-CFP может послужить более эффективным (по сравнению с EBFP) FRET-донором для phiYFP

На основе пары PS-CFP/phiYFP был создан химерный конструкт PS-CFP-Xa-phiYFP, в котором два ФБ были соединены друг с другом с помощью 16-ао линкера, содержащего сайт узнавания протеазой фактор Ха (рис 10)

Рисунок 10. Нуклеотидная и аминокислотная (однобуквенный код) последовательности линкерного участка, соединяющего PS-CFP (выделен голубым) и phiYFP (выделен желтым) в химерном конструкте PS-CFP-Xa-phiYFP

PS-CFP Сайт разрезания фактором Ха phiYFP

AAGTGGAAGCTGAATTCCGGAATCGAGGGCCGCGGTACCTCAGTCGCCACCATGAGC KWKLNSGIEGRGTSVATMS

На рис 11 спектр эмиссии химерного конструкта PS-CFP-Xa-phiYFP показан до и через различные промежутки времени после начала разрезания фактором Ха При возбуждении на 400 нм неразрезанный конструкт PS-CFP-Xa-phiYFP характеризовался в основном желтой эмиссией флуоресценции, которая постепенно снижалась по мере разрезания линкерной последовательности с помощью фактора Ха

При полном разрезании фактором Ха конструкта PS-CFP-Xa-phiYFP происходило разделение двух ФБ, что сопровождалось возрастанием голубой флуоресценции лишь в 1 15 раза В то же время наблюдалось выраженное (до 7 8 раз) падение интенсивности желтой флуоресценции Эта величина является максимальной для существующих на сегодняшний день FRET-nap при измерении изменения яркости единственного цвета флуоресценции -флуоресценции акцептора Таким образом, общий квантовый выход флуоресценции при разделении донора и акцептора при возбуждении на 400 нм существенно снижался Можно предположить, что существует два или более относительно долгоживущих состояний возбужденного хромофора PS-CFP, причем одно из них характеризуется более высоким

квантовым выходом флуоресценции, а другое может служить эффективным донором для FRET

Сайг разре зания фактором Ха

О мнн

I

400

450

500

-т-1-

550

Г

ЙОО

Длина волны, нм

Рисунок 11.

Спектры эмиссии флуоресценции РБ-СРР-Ха-рЮТР (при возбуждении на 400 нм) до и после (0-30 мин)

разрезания фактором Ха

Так как флуоресценция донора (РБ-СРР) остается практически стабильной в присутствии/отсутствии акцептора, её можно использовать в качестве внутреннего контроля стабильности концентрации белка в различных системах, в том числе в высокопроизводительных скринингах Неизменность флуоресценции донора также позволяет провести вычитание вклада собственной флуоресценции Р8-СРР из общего спектра эмиссии FRET-кoнcтpyктa (при возбуждении на 400 нм) В этом случае результирующий контраст для конструкта Р8-СРР-Ха-р1иУРР до и после разрезания фактором Ха достигает 30 раз

FRET-пapa Р5-СРР/р1иУРР нашла свое применение в исследованиях, проводимых в лаборатории биокатализа ИБХ РАН при создании РКЕТ-индикатора EPeFRET, позволившего осуществить скрининг активности каталитических аутоантител (Ве1о§иго\' е! а1,2008)

Разработка высококонтрастных FRET-сенсоров активности каспазы-3 За последние несколько лет в нашей лаборатории была создана палитра мономерных ФБ семейства mTagFPs с различными цветами флуоресценции в диапазоне от синей (mTagBFP) до дальне-красной (mTagFP635) Мы провели поиск оптимальных FRET-nap среди данной группы флуоресцентных маркеров и создали на их основе высококонтрастные сенсоры активности каспазы-3

Таблица 3. Сравнение характеристик донорно-акцепторных FRET-nap

Ro - расстояние между хромофорами донора и акцептора, при котором эффективность FRET достигает 50%, нм, Е - эффективность RET, рассчитанная как разница между флуоресценцией донора в процессе FRET (FDFrct) и в результате прекращения FRET (FD), Е = 1 - FDfrrr/FD н/о -значение не определено *FRET-napbi, разработанные в данной работе

Донорно/акцепторная FRET-napa Радиус Ферстера (Ro), нм Эффективность FRET (Е)

BFP/GFP 4 50 0 52

GFP/DsRed 4 71 н/о

ECFP/EYFP 4 86 0 42

mCyPet/mYPet 4 93 051

mECFP/mVenus 5 10 0 56

♦mTagBFP/mTagGFP 5 25 0 57

♦mTagGFP/mTagRFP 5 71 0 56

Путем подбора различных донорно-акцепторных пар ФБ, а также использования различных вариантов последовательностей ФБ (N-донор-акцептор-С или N-акцептор-донор-С) был получен ряд химерных FRET-конструктов Сравнение характеристик наиболее эффективных среди полученных нами FRET-nap (mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP) с существующими донорно-акцепторными парами ФБ представлено в табл 3

Соединение двух ФБ осуществлялось посредством 17 а о линкера (GGNSGDEVDGTSVATGS), содержащего каспаза-3 узнаваемый DEVD-мотив Максимальный контраст in vitro (4 9 раза) детектировали для конструкта mTagRFP-DEVD-mTagGFP, получившего название CaspeR-G/R На рис 12 представлены спектры эмиссии флуоресценции CaspeR-G/R (при возбуждении на 490 нм) до и после разрезания каспазой-3 in vitro Разрезание химерного конструкта приводило к пространственному разделению двух ФБ, сопровождавшемуся одновременным возрастанием эмиссии mTagGFP и падением эмиссии mTagRFP, т е падением FRET

480 500 520 540 560 580 600 620 640 660

Длина волны, нм

Рисунок 12. Спектры эмиссии флуоресценции CaspeR-G/R до и после разрезания каспазой-3 in vitro (АВОЗб=490 нм).

С помощью CaspeR-G/R была детектирована активность каспазы-3 в апоптотических клетках HeLa (рис. 13). В качестве агента, индуцирующего апоптоз использовали стауроспорин (STS)- неселективный ингибитор внутриклеточных протеинкиназ. Показано, что через различные промежутки времени после добавления стауроспорина в клетках HeLa происходило выраженное (контраст до 3.8 раз) падение FRET, обусловленное разрезанием конструкта CaspeR-G/R каспазой-3, активированной при запуске апоптоза.

А

g Время, мин

Ю мнн 60 мин 100 мин 160 мин

ЕЭРЭКЭЙЯ

Рисунок 13. Тестирование CaspeR-G/R в клетках HeLa.

А. FRET-сигнал в клетках HeLa (п=1-6), экспрессирующих CaspeR-G/R после добавления 1 рМ STS. Б. Фотографии клеток HeLa (наложение зеленого (Лвга6=488 нм, Лэ„= 505-535 нм) и красного FRET-канала (Лвоз6=488 нм, Аэ„= 560-650 нм)) после добавления STS (Leica SP2).

Немногочисленные описанные ранее FRET-пары, содержащие в качестве акцептора красные ФБ, имели тенденцию к тетрамеризации и агрегации и умеренный контраст Поскольку CaspeR-G/R обладает высоким контрастом и состоит из мономерных ФБ, он представляет собой хорошо растворимый (неагрегирующий) надежный репортер активности каспазы-3, который может применяться в различных экспериментах в живых клетках и высокопроизводительных скринингах

В то время как голубые и желтые варианты ФБ обладают улучшенными флуоресцентными свойствами, существующие варианты синих ФБ (BFP) характеризуются умеренной яркостью флуоресценции и низкой фотостабильностью Мы получили мономерный синий ФБ с высокой яркостью, рН-стабильностью и скоростью созревания хромофора - mTagBFP По своим характеристикам он превосходит все существующие варианты BFP Его более узкий (по сравнению с EBFP2 - лучшим из разработанных ранее вариантов BFP) пик эмиссии флуоресценции позволяет проводить более четкое спектральное разделение mTagBFP с ФБ в соседних областях спектра, что делает его удобным маркером для многоцветного флуоресцентного мечения и эффективным FRET-донором для зеленых ФБ

Спектр эмиссии mTagBFP имеет широкую область перекрывания со спектром поглощения mTagGFP Помимо этого, mTagGFP характеризуется очень низким поглощением в области возбуждения mTagBFP, поэтому данный белок был выбран в качестве акцептора для mTagBFP Путем инсерции 20 а о линкера (EFGGSGSDEVDKLGGSGSGT), содержащего специфично узнаваемый и разрезаемый каспазой-3 DEVD-мотив между mTagBFP и mTagGFP, был получен химерный конструкт, названный CaspeR-B/G Спектр эмиссии флуоресценции CaspeR-B/G (при возбуждении на 399 нм) был измерен до и после разрезания каспазой-3 in vitro Показано, что разрезание конструкта CaspeR-B/G каспазой-3 сопровождалось падением зеленой флуоресценции и одновременным возрастанием синей флуоресценции При этом контраст для FRET-пары mTagBFP/mTagGFP составил более 3 раз (рис 14 А)

0 min 50 min 100 min 150 min

Рисунок 14. CaspeR-B/G in vitro и в клетках HeLa.

A. Флуоресценция CaspeR-B/G до и после разрезания каспазой-3 in и/&о(Ав„зб=399 нм).

Б. FRET-сигнал в клетках HeLa (п=1-4), экспрессирующих CaspeR-B/G после добавления STS.

B. Фотографии клеток HeLa, экспрессирующих CaspeR-B/G (Olympus 1X81). Верхний ряд - наложение

синего (АВОЗб=403/12 нм, Лэ„= 457/50 нм) и зеленого FRET-канала (ЛВШб=403/12 нм, Лэи= 505-535 нм), нижний ряд - изменение FRET-сигнала (псевдоцвета) после добавления STS:

Показано, что так же как и CaspeR-G/R, CaspeR-B/G является надежным репортером апоптоза и с высоким контрастом детектирует активацию каспазы-3 в живых клетках (рис. 14 Б).

Выводы

1 Установлены ключевые позиции аминокислотных остатков, отвечающих за изменение флуоресцентных свойств генетически кодируемых сенсоров на основе пермутированных (cpFP 147-146) флуоресцентных белков

2 Впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработаны генетически кодируемые сенсоры с более чем 10-кратным контрастом - Са2+ сенсоры Casel2 и Case 16, характеризующиеся 12- и 16-кратным возрастанием яркости флуоресценции, соответственно

3 Продемонстрирована высокая эффективность Casel2 в живых клетках Показано, что по совокупности характеристик (улучшенная рН-стабильность, высокая яркость, быстрое созревание при 37°С и высокий контраст) Casel2 превосходит все опубликованные ранее Са2+ чувствительные генетически кодируемые сенсоры и не уступает также химически синтезированным Са2+ индикаторам Получены версии Casel2, локализованные на мембране эукариотических клеток и в матриксе митохондрий и продемонстрирована их эффективность в живых клетках

4 Показано, что полученный при создании Casel2 оптимизированный вариант пермутированного флуоресцентного белка может быть использован для создания высококонтрастных генетически кодируемых сенсоров различной специфичности В частности, впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработан индикатор активности протеинкиназы А - сенсор RePKA2, характеризующийся выраженными изменениями спектральных свойств в ответ на специфичное фосфорилирование (контраст in vitro 2 2 раза)

5 Разработана высококонтрастная FRET-пара PS-CFP/phiYFP, характеризующаяся при разделении донора и акцептора более чем 7-кратным падением яркости флуоресценции акцептора при практически неизменной яркости донора Эта величина является максимальной для существующих на сегодняшний день FRET-nap изменением яркости флуоресценции акцептора

6 Разработаны эффективные FRET-пары mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP, на основе которых получены высококонтрастные FRET-сенсоры внутриклеточной активности каспазы-3 - CaspeR-B/G и CaspeR-G/R Высокие яркость флуоресценции, фотостабильность, рН-стабильность и контраст данных индикаторов, а также мономерность входящих в их состав флуоресцентных белков позволяют использовать их в качестве надежных и удобных репортеров апоптоза

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи

1. Chudakov D M , Verkhusha V V, Staroverov D В , Souslova E A , Lukyanov S , Lukyanov К A Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking Nat Biotechnol (2004) 22(11), 1435-1439

2. Souslova E A., Chudakov D M Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor Microsc Res Tech (2006) 69(3), 207-209

3 Суслова E.A., Чудаков ДМ Генетически кодируемые внутриклеточные сенсоры на основе флуоресцентных белков Биохимия (Москва) (2007) 72(7), 683-697

4. Souslova E А , Belousov V V , Lock J G, Stromblad S , Kasparov S , Bolshakov A P, Pinelis V G , Lukyanov S , Mayr L M , Chudakov D M Increased dynamic range for the single fluorescent protein-based Ca2+ sensors BMC Biotechnology (2007) 7, 37

5. Belogurov Jr A A, Kurkova IN , Fnboulet A , Thomas D , Misikov V К , Zakharova M Y , Suchkov S V , Kotov V , Alehin A I, Avalle В , Souslova E A , Morse III H С , Gabibov A G and Ponomarenko N A Recognition and degradation of myelin basic protein peptides by serum autoantibodies novel biomarker for multiple sclerosis J Immunol (2008) 180, 1258-1267

Тезисы докладов на конференциях

1. Белоусов В В , Чудаков Д М , Суслова Е А., Марквичева К Н, Шашкова А А , Фрадков А Ф , Лукьянов С А Новые внутриклеточные сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка VIII чтения, посвященные памяти акад Ю А Овчинникова ИБХ РАН, Россия, Москва, 2006

2. Суслова Е.А.,Чудаков Д М, Белоусов В В , Лукьянов К А Высококонтрастные генетически кодируемые кальциевые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка XIX зимняя молодежная научной школа ИБХ РАН, Россия, Москва, 2007

3. Wang S , Souslova Е А , Liu В , Chudakov D М , Lumb В М , Paton J F , Teschemacher A G, Kasparov S ANGII regulation of [Ca2+], in astroglia of Wistar and spontaneously hypersensitive rat (SHR) revealed using a novel high fidelity genetically encoded Ca2+ sensor, Casel2 37th Annual Meeting of Society for Neuroscience San Diego, USA, 2007

4 Souslova E A , Belousov V V, Lock J J , Stromblad S S , Jones M V , Bolshakov A P, Pinehs V G, Kasparov S , Lukyanov S , Mayr L M, Chudakov D M Single fluorescent protein-based Ca2+ sensors with increased dynamic range 37th Annual Meeting of Society for Neuroscience San Diego, USA, 2007

5. Souslova E A., Belousov V V, Chudakov D M Genetically encoded calcium- and hydrogen peroxide-sensitive indicators based on circularly permuted yellow fluorescent protein 10th Conference on Methods and Applications of Fluorescence Salzburg, Austria, 2007

Заказ № 30/08/2008 Подписано в печать 18 08 2008 Тираж 100 экз Уел пл 1,5

ООО "Цифровичок", тел (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 \v\vw с/г ги , е-тай т/о@с[г ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Суслова, Екатерина Андреевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I. Зеленый флуоресцентный белок GFP и его свойства

1.П. Генетически кодируемые сенсоры на основе GFP

1.П.1. Са2+ чувствительные сенсоры

1.И. 1.1. Са2+ сенсоры на основе акворина

1.П.1.2. Са2+FRET-сенсоры

1.П.1.З. Са2+ сенсоры на основе cpFP

I.II.2. Сенсоры киназной активности

1.П.2.1. FRET-сенсоры киназной активности

1.П.2.2. Сенсоры киназной активности на основе cpFP

1.П.З. FRET-сенсоры каспазной активности

Введение Диссертация по биологии, на тему "Высококонтрастные генетически кодируемые сенсоры на основе зеленого флуоресцентного белка"

Клонирование гена зеленого флуоресцентного белка GFP (Green Fluorescent protein) медузы Aequorea victoria в 1992 году [Prasher et al., 1992] открыло широкие перспективы для фундаментальных и прикладных исследований в области молекулярной и клеточной биологии. Сегодня GFP и другие GFP-подобные флуоресцентные белки (FP, fluorescent proteins) применяются в качестве репортеров генной экспрессии и для прижизненной визуализации объектов (белков, органелл, клеток и органов). Одним из наиболее интенсивно развивающихся направлений применил FP является создание на их основе флуоресцентных генетически кодируемых сенсоров (ГКС). Такие внутриклеточные индикаторы позволяют визуализировать взаимодействия и активности интересующих исследователя белков, а также изменения концентрации определенных молекул. Существующие на сегодняшний день ПСС находят свое применение в различных молекулярно-биологических исследованиях и могут быть использованы в фармакологических скринигах новых лекарственных препаратов.

По сравнению с химически синтезированными флуоресцентными красителями ГКС имеют ряд преимуществ. Они экспрессируются самой клеткой и не требуют внешнего добавления или инъекции; использование сигналов внутриклеточной локализации позволяет направить ГКС в различные органеллы живой клетки; также могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие ГКС в определенных тканях в определенный период времени. Потенциально, с использованием соответствующих белковых доменов может быть разработан ГКС практически для любого аналита или ферментативной активности.

Достаточно широкое распространение получило создание ПСС на основе эффекта FRET (Forster resonance energy transfer) - безызлучательного переноса энергии возбужденного состояния флуорофора одного FP (донорного) на другой (акцепторный). Альтернативный подход основан на использовании так называемых «пермутированных» вариантов флуоресцентных белков - cpFP (circularly permuted Fluorescent Protein), в которых на уровне гена нативные N- и С- концы белка соединены друг с другом, а новые концы образованы в другой части белка. Однако, несмотря на значительный потенциал ГКС в качестве инструментов для изучения различных процессов в живых клетках, разработанные ранее ГКС обладают рядом недостатков, затрудняющих их практическое применение. Одной из основных проблем является низкий контраст флуоресцентного ответа ГКС (т.е. степень выраженности изменений его флуоресценции в ответ на детектируемый аналит). Для FRET-индикаторов выраженный в долях или % контраст отражает изменение отношения флуоресценции акцептора к донору после «срабатывания» сенсора. Аналогичным образом проводят оценку контраста так называемых «ратиометрических» индикаторов, характеризующихся аналит-зависимым изменением соотношения пиков возбуждения флуоресценции. Применительно к cpFP-еодержащим сенсорам с одним пиком возбуждения и эмиссии флуоресценции контраст соответствует степени изменения интенсивности эмиссии флуоресценции после взаимодействия с аналитом.

Помимо невысокого контраста подавляющее большинство описанных ранее ГКС обладает также недостаточной яркостью флуоресценции, что делает их малопригодными для высокопроизводительных скринингов и ограничивает чувствительность во внутриклеточных экспериментах.

Целью данной работы стала разработка высококонтрастных ГКС на основе гомологов зеленого флуоресцентного белка GFP.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Суслова, Екатерина Андреевна

выводы

1. Установлены ключевые позиции аминокислотных остатков, отвечающих за изменение флуоресцентных свойств генетически кодируемых сенсоров на основе пермутированных (cpFP 147-146) флуоресцентных белков.

2. Впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработаны генетически кодируемые сенсоры с более чем 10-кратным контрастом -Са2+ сенсоры Casel2 и Casel6, характеризующиеся 12- и 16-кратным возрастанием яркости флуоресценции, соответственно.

3. Продемонстрирована высокая эффективность Casel2 в живых клетках. Показано, что по совокупности характеристик (улучшенная рН-стабильность, высокая яркость, быстрое созревание при 37°С и высокий контраст) Casel2 превосходит все опубликованные ранее Са2+ чувствительные генетически кодируемые сенсоры и не уступает также химически синтезированным Са2+ индикаторам. Получены версии Case 12, локализованные на мембране эукариотических клеток и в матриксе митохондрий и продемонстрирована их эффективность в живых клетках.

4. Показано, что полученный при создании Casel2 оптимизированный вариант пермутированного флуоресцентного белка может быть использован для создания высококонтрастных генетически кодируемых сенсоров различной специфичности. В частности, впервые на основе пермутированного варианта флуоресцентного белка разработан индикатор активности протеинкиназы А - сенсор RePKA2, характеризующийся выраженными изменениями спектральных свойств в ответ на специфичное фосфорилирование (контраст in vitro 2.2 раза).

5. Разработана высококонтрастная FRET-пара PS-CFP/phiYFP, характеризующаяся при разделении донора и акцептора более чем 7-кратным падением яркости флуоресценции акцептора при практически неизменной яркости донора. Это значение является максимальным для существующих на сегодняшний день FRET-nap изменением яркости флуоресценции акцептора.

6. Разработаны эффективные FRET-пары mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP, на основе которых получены высококонтрастные FRET-сенсоры внутриклеточной активности каспазы-З - CaspeR-B/G и CaspeR-G/R. Высокие яркость флуоресценции, фотостабильность, рН-стабильность и контраст данных индикаторов, а также мономерность входящих в их состав флуоресцентных белков позволяют использовать их в качестве надежных и удобных репортеров апоптоза.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе предложена модель расположения доменов в Са2+ сенсорах, созданных на основе пермутированных вариантов флуоресцентных белков. На основании предложенной модели установлены ключевые аминокислотные позиции, определяющие спектральные свойства и контраст индикаторов данного типа. Путем оптимизации а.о. по этим положениям получены высококонтрастные Са2+ сенсоры с максимальным среди всех существующих ГКС контрастом, превышающим 10 раз.

Полученные в ходе работы данные по подбору аминокислотного окружения хромофора для пермутированных вариантов флуоресцентных белков в составе сенсоров могут быть использованы для дальнейшей разработки высококонтрастных ГКС.

Разработанный в настоящей работе Са2+ сенсор Case 12 по своим характеристикам превосходит все опубликованные ранее ГКС и не уступает также химически синтезированным флуоресцентным индикаторам Са2+. В отличие от последних, он может быть избирательно направлен в любой компартмент клетки, а также использован для исследований в трансгенных организмах. Показана высокая эффективность цитозольной, митохондриальной и мембрано-локализованной версий Casel2 в качестве детектора Са2+ в различных типах эукариотических клеток. Улучшенные характеристики Case 12 делают его преспективным инструментом для мониторинга внутриклеточной концентрации Са2+, а также высокопроизводительных скринингов. В настоящее время ведутся работы по созданию трансгенных мышей, несущих ген Case 12,

Во второй части работы мы применили подход, основанный на присоединении детекторных доменов к пермутированному варианту флуоресцентного белка, для создания сенсора киназной активности. Так, с использованием специфичных киназа-чувствительных доменов и оптимизированного пермутированного флуоресцентного «ядра», полученного при разработке Casel2, был получен сенсор активности протеинкиназы А - RePKA2. RePKA2 стал первым протеинкиназа А-чувствительным индикатором на основе одного (пермутированного) флуоресцентного белка. В настоящее время проводится подбор условий для оптимального функционирования этого индикатора в живых клетках.

В работе также получены новые донорно-акцепторные пары, характеризующиеся высокой эффективностью FRET: PS-CFP/phiYFP, mTagBFP/mTagGFP и mTagGFP/mTagRFP. FRET-пара PS-CFP/phiYFP нашла свое применение при создании высококонтрастного FRET-индикатора активности каталитических аутоантител в лаборатории биокатализа ИБХ РАН. На основе двух других FRET-nap разработаны высококонтрастные сенсоры активности каспазы-3 -CaspeR-B/G и CaspeR-G/R. Показано, что оба индикатора могут быть использованы в качестве надежных и удобных репортеров апоптоза.

Высокие контраст, яркость флуоресценции, фотостабильность, достаточная рН-стабильность и быстрое созревание при 37°С разработанных в данной работе генетически кодируемых сенсоров обеспечивают их эффективное функционирование в живых клетках. Улучшенные характеристики полученных нами индикаторов позволяют надеяться, что они найдут широкое применение как инструменты для изучения внутриклеточных путей передачи сигнала, а также для высокопроизводительных скринингов новых лекарственных препаратов.

В заключение автор выражает искреннюю благодарность коллективу сотрудников лаборатории молекулярных технологий для биологии и медицины ИБХ РАН и компании «Евроген» за создание дружеской рабочей атмосферы, в особенности Всеволоду Белоусову, Дмитрию Староверову, Юрию Янушевичу, Екатерине Мерзляк, Татьяне Чепурных, Константину Лукьянову, а также заведующему лабораторией Сергею Лукьянову.

Особенную признательность хочется выразить научному руководителю Дмитрию Чудакову за обучение, внимательное и чуткое руководство, помощь в обсуждении результатов и всестороннюю поддержку в работе.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Суслова, Екатерина Андреевна, Москва

1. Ai H.W., Shaner N.C., Cheng Z., Tsien R.Y. and Campbell R.E. Exploration of new chromophore structures leads to the identification of improved blue fluorescent proteins. (2007) Biochemistry, 46, 5904-5910.

2. Ando R., Hama H., Yamamoto-Hino M., Mizuno H. and Miyawaki A. An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein. (2002) PNAS, 99, 12651-12656.

3. Araki Т., Harashi M., Watanabe N., Kanuka H., Yoshino J., Miura M. and Satura T. Down-regulation of Mcl-1 by inhi bition of the PI3-K/Akt pathway is required for cell shrinkage-dependent cell death, (2002) Biochem Biophys Res Commun, 290(4), 12751281.

4. Augustine G.J., Charlton M.P. and Smith S.J. Calcium action in synaptic transmitter release. (1987) Annu Rev Neurosci, 10, 633-693.

5. Augustine G.J. How does calcium trigger neurotransmitter release? (2001) Curr Opin Neurobiol, 11(3), 320-326.

6. Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. (1999) PNAS, 96, 11241-11246.

7. Baubet V., Le Mouellic H., Campbell A.K., Lucas-Meunier E., Fossier P. and Brulet P. Chimeric green fluorescent protein-aequorin as bioluminescent Ca2+ reporters at the single-cell level. (2000) PNAS, 97(13), 7260-7265.

8. Belousov V.V., Fradkov A.F., Lukyanov K.A., Staroverov D.B., Shakhbazov K.S., Terskikh A.V. and Lukyanov S. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. (2006) Nat Meth, 3, 281-286.

9. Berridge M.J. Neuronal calcium signaling. (1998) Neuron, 21, 13-26.

10. Bokman S.H. and Ward W.W. Renaturation of Aequorea gree-fluorescent protein. (1981) Biochem Biophys Res Commun, 101(4), 1372-1380.

11. Campbell R.E., Tour О., Palmer A.E., Steinbach P.A., Baird G.S., Zacharias D.A. and Tsien R.Y. A monomeric red fluorescent protein. (2002) PNAS, 99(12), 7877-7882.

12. Chiang J.J. and Truong K. Using co-cultures expressing fluorescence resonanse based protein biosensors to simultaneously image caspase-3 and Ca2+ signaling. (2005) Biotechnol Lett, 27(16), 1219-1227.

13. Chudakov D.M., Belousov V.V., Zaraisky A.G., Novoselov V.V., Staroverov D.B., Zorov D.B., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Kindling fluorescent proteins for precise in vivo photolabeling. (2003) Nat Biotechnol, 21, 191-194.

14. Chudakov D.M., Chepurnykh T.V., Belousov V.V., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Fast and precise protein tracking using repeated reversible photoactivation. (2006) Traffic, 7, 1304-1310.

15. Chudakov D.M., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Fluorescent proteins as a toolkit for in vivo imaging. (2005) Trends Biotechnol, 23, 605-613.

16. Chudakov D.M., Verkhusha V.V., Staroverov D.B., Souslova E.A., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Photoswitchable cyan fluorescent protein for protein tracking. (2004) Nat Biotechnol, 22, 1435-1439.

17. Clapham D.E. Calcium signaling. (1995) Cell, 80(2), 259-268.

18. Cody C.W., Prasher D.C., Westler W.M., Prendergast F.G., Ward, W.W. Chemical structure of the hexapeptide chromophore of the Aequorea green-fluorescent protein. (1993) Biochemistry, 32(5), 1212-1218.

19. Cormack B.P., Valdivia R.H., Falkow S. FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein (GFP). (1996) Gene, 173(1), 33-38.

20. Cubitt А.В., Woollenweber L.A., Heim R. Understanding structure-function relationships in the Aequorea victoria green fluorescent protein. (1995) Methods Cell Biol., 58, 19-30.

21. Darzynkiewicz Z., Bedner E., Smolewski P., Lee B.W. and Johnson G.L. Detection of caspase activation in situ by fluorochrome-labeled inhibitors of caspases (FLICA). (2002) Methods Mol Biol, 203, 289-299.

22. Davenport D. and Nicol J.A.C. Luminescence in Hydromedusae. (1955) Proc R Sol London Ser В, 144, 399-411.

23. Delagrave S., Hawtin R.E., Silva C.M., Yang M.M., Youvan D.C. Red-shifted excitation mutants of the green fluorescent protein. (1995) Biotechnology, 13(2), 151154.

24. Ellis R.E., Yuan J.Y., Horvitz H.R: Mechanisms and functions of cell death. (1991) Annu Rev Cell Biol, 7, 663-698.

25. Ericson M.G., Moon D.L. and Yue D.T. DsRed as a potential FRET partner with CFP and GFP. (2003)BiophysJ, 85, 599-611.

26. Evans J.H. and Sanderson M.J. Intracellular calcium oscillations induced by ATP in airway epithelial cells. (1999) Am J Physiol Lung cell Mol Physiol, 277, 30-41.

27. Galperin E., Verkhusha V.V. and Sorkin A. Three-chromophore FRET microscopy to analyze multiprotein interactions in living cells. (2004) Nat Methods, 1, 209-217.

28. Goedhart J., Vermeer J.E., Adjobo-Hermans M.J., van Weeren L. and Gadella T.W. Sensitive detection of p65 homodimers using red-shifted and fluorescent protein-based FRET couples. (2007) PLoS ONE, 2(10), 1011.

29. Gonzales D., Sawyer A. and Ward W.W. Spectral perturbations of mutants of recombinant Aequorea victoria green-fluorescent protein (GFP). (1997) Photochem Protobiol, 65, 218.

30. Green D. Apoptotic pathways. The roads to run. (1998) Cell, 94, 695.

31. Green H.M. and Alberola-Ila J. Development of ERK Activity Sensor, an in vitro, FRET-based sensor of Extracellular Regulated Kinase activity. (2005) BMC Che. Biol, 5, 1.

32. Griesbeck O., Baird G.S., Campbell R.E., Zacharias D.A. and Tsien, R.Y. Reducing the environmental sensitivity of yellow fluorescent protein. Mechanism and applications. (2001) J Biol Chem, 276, 29188-29194.

33. Gu Y., Di W.L., Kelsell D.P. and Zicha D. Quantitative fluorescence resonance energy transfer (FRET) measurement with acceptor photobleaching and spectral unmixing. (2004) JMicrosc, 2\5, 162-173.

34. He L., Wu X., Meylan F., Olson D.P, Simone J., Hewgill D., Siegel R. and Lipsky P.E. Monitoring Caspase Activity in Living Cells Using Fluorescent Proteins and Flow Cytometry. (2004)AJP, 164(6), 1901-1913.

35. Heim N. and Griesbeck O. Genetically encoded indicators of cellular calcium dynamics based on troponin С and green fluorescent protein. (2004) J Biol Chem, 279, 14280-14286.

36. Heim R., Cubitt A.B. and Tsien R.Y. Improved green fluorescence. (1995) Nature, 373(6516), 663-664.

37. Heim R., Prasher D.C. and Tsien R.Y. Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein. (1994) PNAS, 91(26), 12501-12504.

38. Heinemann U. and Hahn M. Circular permutation of polypeptide chains: implications for protein folding and stability. (1995) Progr Biophys Mol Biol. 64, 121-143.

39. Ho S.N., Hunt H.D., Horton R.M., Pullen J.K. and Pease L.R. Site-directed mutagenesis by overlap extension using the polymerase chain reaction. (1989) Gene, 77, 51-59.

40. Jares-Erijman E.A. and Jovin T.M. Imaging molecular interactions in living cells by FRET microscopy. (2006) Curr Opin Chem Biol. 10, 409-416.

41. Jarvis S.E and Zamponi G.W. Interactions between presynaptic Ca2+ channels, cytoplasmic messengers and proteins of the synaptic vesicle release complex. (2001) Trends Pharmacol Sci, 22(10), 519-525.

42. Jayaraman S., Haggie P., Wachter R.M., Remington S.J. and Verkman A.S. Mechanism and cellular applications of a green fluorescent protein-based halide sensor. (2000) J Biol Chem, 275(9), 6047-6050.

43. Johnson F.H., Shimomura et al. Quantitum efficiency of Cypridina luminescence, with a note of that of Aequorea. (1962) J Cell Comp Physiol, 60, 85-104.

44. Karasawa S,, Araki Т., Nagai Т., Mizuno H. and Miyawaki A. Cyan-emitting and orange-emitting fluorescent proteins as a donor/acceptor pair for fluorescence resonance energy transfer. (2004) Biochem J, 381(1), 307-312.

45. Katoch В., Sebastian S., Sahdev S., Padh H., Hasnain S.E. and Begum R. Programmed cell death and its clinical implications. (2002) Indian J Exp Biol, 40(5), 513-524.

46. Kawai Y., Sato M. and Umezawa Y. Single color fluorescent indicators of protein phosphorylation for multicolor imaging of intracellular signal flow dynamics. (2004) Analyt Chem, 76, 6144-6149.

47. Keizer J. and De Young G.W. Two roles of Ca2+ in agonist stimulated Ca2+ oscillations. (1992) Biophys J, 61(3), 649-660.

48. Kiedrowski L. and Costa E. Glutamate-induced destabilization of intracellular calcium concentration homeostasis in cultured cerebellar granule cells: role of mitochondria in calcium buffering. (1995) Mol Pharmacol, 47(1), 140-147.

49. Komoriya A., Packard B.Z., Brown M.J., Wu M.L. and Henkart P.A. Assessment of caspase activities in intact apoptotic thymocytes using cell-permeable fluorogenic caspase substrates. (2000)JExpMed, 191(11), 1819-1828.

50. Kunkel M.T., Ni Q., Tsien R.Y., Zhang J. and Newton A.C. Spatio-temporal dynamics of protein kinase B/Akt signaling revealed by a genetically encoded fluorescent reporter. (2005) J Biol Chem, 280, 5581-5587.

51. Kurokawa K., Mochizuki N., Ohba Y., Mizuno H., Miyawaki A. and Matsuda M. A pair of fluorescent resonance energy transfer-based probes for tyrosine phosphorylation of the Crkll adaptor protein in vivo. (2001) J Biol Chem, 276, 3130531310.

52. Lee T. and Luo L. Mosaic analysis with a repressible cell marker for studies of gene function in neuronal morphogenesis. (1999) Neuron, 22, 451-461.

53. Lippincott-Schwartz J., Altan-Bonnet N. and Patterson G.H. Photobleaching and photoactivation: following protein dynamics in living cells. (2003) Nat Cell Biol, Suppl:S7-14.

54. Llinas R., Sugimori M. and Silver R.B. Microdomains of high calcium concentration in a presynaptic terminal. (1992)Science\ 256(5057), 677-679.

55. Llinas R., Sugimori M. and Silver R.B. The concept of calcium concentration microdomains in synaptic transmission. (1995) Neuropharmacology, 34(11), 14431451.

56. Llopis J., McCaffery J.M., Miyawaki A., Farquhar M.J. and Tsien R.G. Measurement of cytosolic, mitohondrial, and Goldgi pH in single living cells with green fluorescent proteins. (1998) PNASi, 95, 6803-6808.

57. Lukyanov K.A., Chudakov D.M., Lukyanov S. and Verkhusha V.V. Innovation: Photoactivatable fluorescent proteins. (2005) Nat RevMol Cell Biol, 6, 885-891.

58. Mahajan N.P., Harrison-Shostak D.C., Michaux J. and Herman B. Novel mutant green fluorescent protein protease substrates reveal the activation of specific caspases during apoptosis. (1999) Chemistry & Biology, 6(6), 401-409.

59. Mank M„ Reiff D.F., Heim N., Friedrich M.W., Borst A. and Griesbeck O. A FRET-based calcium biosensor with fast signal kinetics and high fluorescence change. (2006) Biophys J, 90, 1790-1796.

60. Martin S.J. and Green D.R. Protease activation during apoptosis. Death by a thousand cuts? (1995) Cell, 82, 349-352.

61. Matsuyama S. and Reed J.C. Mitochondria-dependent apoptosis and cellular pH regulation. (2000) Cell Death Differ, 7(12), 1155-1165.

62. Matz M.V., Fradkov A.F., Labas Y.A., Savitsky A.P., Zaraisky A.G., Markelov M.L. and Lukyanov S.A. Fluorescent proteins from nonbioluminescent Anthozoa species. (1999) Nat Biotechnol, 17, 969-973.

63. Mena, M.A., Treynor, T.P., Mayo, S.L. and Daugherty, P.S. Blue fluorescent proteins with enhanced brightness and photostability from structurally targeted library. (2006) Nat Biotechnol, 24, 1569-1571.

64. Miyawaki A. Visualization of the spatial and temporal dynamics of intracellular signaling. (2003) Dev Cell, 4, 295-305.

65. Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R. and Tsien R.Y. Dynamic and quantitative Ca2+ measurements using improved cameleons. (1999) PNAS, 96, 2135-2140.

66. Miyawaki A., Llopis J., Heim R., McCaffery J.M., Adams J.A., Ikura M. and Tsien R.Y. Fluorescent indicators for Ca2+ based on green fluorescent proteins and calmodulin. (1997) Nature, 388, 882-887.

67. Mizuno H., Sawano A., Eli P., Наша H. and Miyawaki A. Red fluorescent protein from Discosoma as a fusion tag and a partner for fluorescence resonance energy transfer. (2001) Biochemistry, 40, 2502-2510.

68. Morise H., Shimomura O., Johnson F.H., Winant J. Intermolecular energy transfer in the bioluminescent system of Aequorea. (1974) Biochemistry, 13(12), 2656-2662.

69. Nagai T. and Miyawaki A. A high-throughput method for development of FRET-based indicators for proteolysis. (2004b) Biochem Biophys Research Comtnun, 319, 72-77.

70. Nagai Т., Ibata K., Park E.S., Kubota M., Mikoshiba K. and Miyawaki A. A variant of yellow fluorescent protein with fast and efficient maturation for cell-biological applications. (2002) Nat Biotechnol, 20, 87-90,

71. Nagai Т., Sawano A., Park E.S. and Miyawaki A. Circularly permuted green fluorescent proteins engineered to sense Ca2+. (2001) PNAS, 98, 3197-3202.

72. Nagai Т., Yamada S., Tominaga Т., IchikawaM. and Miyawaki A. Expanded dynamic range of fluorescent indicators for Ca(2+) by circularly permuted yellow fluorescent proteins. (2004a) PNAS, 101, 10554-10559.

73. Nagai Y., Miyazaki M., Aoki R., Zama Т., Inouye S., Hirose K., lino M. and Hagiwara M. A fluorescent indicator for visualizing cAMP-induced phosphorylation in vivo. (2000)Nat Biotechnol, 18(3), 313-316.

74. Nagata Т., Kishi H., Liu Q.L., Matsuda Т., Imanaka Т., Tsukada K., Kang D. and Muraguchi A. The regulation of DNAse activities in subcellular compartments of activated thymocytes. (2002) Immunology, 105, 399-406.

75. Nakai J., Ohkura M. and Imoto K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. (2001) Nat Biotechnol, 19, 137-141.

76. Ng Т., Squire A., Hansra G., Bornancin F., Prevostel C., Hanby A., Harris W., Barnes D., Schmidt S., Mellor H., Bastiaens P. I. and Parker P.J. Imaging protein kinase Calpha activation in cells. (1999) Science, 283, 2085-2089.

77. Nguyen A.W. and Daugherty P.S. Evolutionary optimization of fluorescent proteins for intracellular FRET. (2005) Nat Biotechnol, 23(3), 355-360.

78. Nicholson D.W: ICE/CED3-like proteases as therapeutic targets for the control of inappropriate apoptosis. (1996) Nat Biotechnol, 14(3), 297-301.

79. Niwa H., Inouye S., Hirano Т., Matsuno Т., Kojima S., Kubota M., Ohashi M. and Tsuji F.I. Chemical nature of the light emitter of the Aequorea green fluorescent protein. (1996) PNAS, 93, 13617-13622.

80. Ohashi Т., Galiacy S.D., Briscoe G. and Erickson H.P. An experimental study of GFP-based FRET, with application to intrinsically unstructured proteins. (2007) Protein Sci, 16,1429-1438.

81. Ohkura M., Matsuzaki M., Kasai H., Imoto K. and Nakai J. Genetically encoded bright Ca2+ probe applicable for dynamic Ca2+ imaging of dendritic spines. (2005) Analyt Chem, 77, 5861-5869.

82. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y. and Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. (1996) Science, 273(5280), 1392-1395.

83. Patterson G., Day R.N. and Piston D. Fluorescent protein spectra. (2001) J Cell Sci, 114, 837-838.

84. Patterson G.H. and Lippincott-Schwartz J. A photoactivatable GFP for selective photolabeling of proteins and cells. (2002) Science, 13, 1873-1877.

85. Patterson G.H., Piston D.W. and Barisas B.G. Forster distances between green fluorescent protein pairs. (2000) Anal Biochem, 284(2), 438-440.

86. Periasamy A. and Day R.N. Visualizing protein interactions in living cells using digitized GFP imaging and FRET microscopy. (1999) Methods Cell Biol, 58, 293-314.

87. Pologruto T.A., Yasuda R. and Svoboda K. Monitoring neural activity and Ca2+. with genetically encoded Ca2+ indicators. (2004) JNenrosci, 24(43), 9572-9579.

88. Porumb Т., Yau P., Harvey T.S. and Ikura M. A calmodulin-target peptide hybrid molecule with unique calcium-binding properties. (1994) Protein Eng, 7, 109-115.

89. Pozzan Т., Rizzuto R., Volpe P. and Meldolesi J. Molecular and cellular physiology of intracellular calcium stores. (1994) Physiol Rev, 74(3), 595-636.

90. Prasher D.C., Eckenrode V.K., Ward W.W., Prendergast F.G. and Cormier M.J. Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. (1992) Gene, 111(2), 229-33.

91. Rizzuto R., Brini M., Pizzo P., Murgia M. and Pozzan T. Chimeric green fluorescent protein as atool for visualizing subcellular organelles in living cells. (1995) Curr Biol, 5,635-642.

92. Sambrook J., Fritsch E.F. and Maniatis T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual.

93. Sasaki K., Sato M. and Umezawa Y. Fluorescent indicators for Akt/protein kinase В and dynamics of Akt activity visualized in living cells. (2003) J Biol Chem, 278,30945-30951.

94. Schultz C., Schleifenbaum A., Goedhart J., Gadella T.W.Jr. Multiparameter imaging for the analysis of intracellular signaling. (2005) Chembiochem, 6(8), 13231330.

95. Shaner N.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. A guide to choosing fluorescent proteins. (2005) Nat Methods, 2, 905-909.

96. Shimomura O. Structure of the chromophore of Aequorea green fluorescent protein. (1979) FEBS Lett, 104, 220-222.

97. Shimomura O., Johnson F. H. and Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. (1962) Cell Comp Physiol, 59, 223-239.

98. Shimomura O. and Johnson F.H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. (1978) PNAS, 75(6), 2611-2615.

99. Skene J.H.P. and Virag I. Posttranslational membrane attachment and dynamic fatty acylation of a neuronal growth cone protein, GAP-43. (1989) J Cell Biol, 108, 613-625.

100. Souslova E.A. and D.M. Chudakov. Photoswitchable cyan fluorescent protein as a FRET donor. (2006) MicrRes and Techn, 69, 207-209.

101. Takemoto K., Nagai Т., Miyawaki A. and Miura M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. (2003) J Cell Biology, 160(2), 235-243.

102. Tawa P., Tarn J., Cassady R., Nicholson D.W. and Xanthoudakis. Quantitative analysis of fluorescent caspase substrate cleavage in intact cells and identification of novel inhibitors of apoptosis. (2001) Cell death and Differentiation, 8, 30-37.

103. Terskikh A., Fradkov A., Ermakova G., Zaraisky A., Tan P., Kajava A. V., Zhao X., Lukyanov S., Matz M., Kim S., Weissman I. and Siebert P. "Fluorescent timer": protein that changes color with time. (2000) Science, 290(5496), 1478-1479.

104. Thornberry N.A: The caspase family of cysteine proteases. (1997b) Br Med Bull, 53, 478-490.

105. Ting A.Y., Kain K.H., Klemke R.L. and Tsien R.Y. Genetically encoded fluorescent reporters of protein tyrosine kinase activities in living cells. (2001) PNAS, 98, 15003-15008.

106. Tyas L., Brophy V.A., Pope A., Rivett A.J. and Tavare M. Rapid caspase-3 activation during apoptosis revealed using fluorescence-resonanse energy transfer. (2000) EMBO Reports, 1(3), 266-270.

107. Van Munster E.B. and Gadella T.W. Fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM). (2005) Adv Biochem Eng Biotechnol, 95, 143-175.

108. Verkhusha V.V., Chudakov D.M., Gurskaya N.G., Lukyanov S. and Lukyanov K.A. Common pathway for the red chromophore formation in fluorescent proteins and chromoproteins. (2004) Chem Biol, 11, 845-854.

109. Violin J.D., Zhang J., Tsien R.Y. and Newton A.C. A genetically encoded fluorescent reporter reveals oscillatory phosphorylation by protein kinase C. (2003) J Cell Biol, 161, 899-909.

110. Wang L., Jackson W.C., Steinbach P.A. and Tsien R.Y. Evolution of new nonantibody proteins via iterative somatic hypermutation. (2004) PNAS, 101, 1674516749.

111. Ward W.W. and Bockman S.H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein : Physical separation and characterisation of the renatured protein. (1982) Biochemistry, 21, 4535-4540.

112. Ward W.W. and Cormier M.J. An energy transfer protein in coelenterate bioluminescence. Characterization of the Renilla green-fluorescent protein. (1979) Biol Chem, 254(3), 781-788.

113. Wilson. T. and Hastings J.W. Bioluminescence. (1998) Annu Rev Cell Dev Biol, 14, 197-230.

114. Wu X., Simone J., Hewgill D., Siegel R., Lipsky P.E. and He L. Measurement of two caspase activities simultaneously in living cells by a novel dual FRET fluorescent indicator probe. (2006) Cytometry Part A69A, 477-486.

115. Xu X., Gerard A.L., Huang B.C., Anderson D.C., Payan D.G. and Luo Y. Detection of programmed cell death using fluorescence energy transfer. (1998) Nucleic Acids Res, 26(8), 2034-2045.

116. Yan D., Guo L. and Wang Y. Requirement of dendritic Akt degradation by the ubiquitin-proteasome system for neuronal polarity. (2006) J Cell Biol, 174, 415-424.

117. Yang F., Moss L.G. and Phillips G.N.Jr. The molecular structure of green fluorescent protein. (1996) Nat Biotechnol, 14(10), 1246-1251.

118. Yasuda R., Nimchinsky E.A., Scheuss V., Pologruto T.A., Oertner T.G., Sabatini B.L. and Svoboda K. Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments. (2004) Sci STKE., 219,15.

119. Zaccolo M., de Giorgi F., Cho C.Y., Feng L„ Knapp Т., Negulescu P.A., Taylor S.S., Tsien R.Y. and Pozzan T. A genetically encoded, fluorescent indicator for cyclic AMP in living cells. (2000) Nat Cell Biol, 2, 25-29.

120. Zhang J., Ma Y., Taylor S.S. and Tsien R.Y. Genetically encoded reporters of protein kinase A activity reveal impact of substrate tethering. (2001) PNAS, 98, 14997-15002.