Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка и свойства биологически активных веществ из медицинской пиявки (Hirudo medicinalis) и ее симбионта Aeromonas hydrophila

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Федоров, Тарас Владимирович

1. ВВЕДЕНИЕ.6

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.11

• 2.1.1. История гирудотерапии.

2.1.2. Использование гирудотерапии в медицинской практике.

2.1.3. Применение гирудотерапии в онкологической практике.

2.1.4. Биологически активные вещества, продуцируемые медицинской пиявкой.

2.1.5. Лекарственные средства на основе медицинских пиявок.

2.2.1. Aeromonas hydrophila - симбионт медицинской пиявки.

2.2.2. Общая характеристика рода Aeromonas.

2.2.3. Патогенные свойства A. hydrophila.

2.2.4. Биологически активные вещества продуцируемые А. hydrophila.

2.3.1. Роль системы свертывания крови в воспалительных процессах и при опухолевом росте.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.37

3.1. Выделение, очистка и хранение экстракта из головной части медицинских пиявок (ЕНМ).

3.2. Выделение и исследование культуры A. hydrophila из медицинской пиявки.

3.3. Выделение и очистка 7п2+-зависимой металлопротеиназы из культуральной жидкости А.ИускорЫк.

3.4. Определение плазмидного профиля штамма А.ЬуёгорЫ1а.

3.5. Экспериментальные животные.

3.6. Опухолевые модели и оценка опухолевого роста.

3.7. Оценка центральных эффектов.

3.8. Статистическая обработка данных.

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.47

4.1. Выделение и хранение экстракта ЕНМ полученного из медицинской пиявки.

4.2.1. Влияние экстракта ЕНМ на развитие экспериментальной мышиной опухоли РЛ-67.

4.2.2. Влияние экстракта ЕНМ на развитие экспериментальной опухоли сирийских хомяков ХОП.

4.2.3. Влияние экстракта ЕНМ на развитие экспериментального гемобластоза мышей Ьа.

4.3. Сравнительная характеристика противоопухолевой активности экстракта из медицинской пиявки с другими препаратами

4.3.1. Влияние энтеротоксина из S. aureus на развитие мышиной опухоли РЛ-67.

4.3.2. Влияние препарата "Пиявит" на развитие экспериментальной опухоли мышей РЛ-67.

4.3.3. Влияние рекомбинантных цитокинов и их производных на развитие экспериментальной опухоли мышей РЛ-67.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение, очистка и свойства биологически активных веществ из медицинской пиявки (Hirudo medicinalis) и ее симбионта Aeromonas hydrophila"

Поиск и изучение биологически активных веществ является одной из актуальных проблем современной биологии и биотехнологии. В настоящее время активно изучаются низкомолекулярные регуляторы межклеточного взаимодействия цитокины и нейропептиды, препараты которых обладают высокой противоопухолевой, иммуно- и нейромодуляторной активностями.

Одним из богатых продуцентов биологически активных веществ является медицинская пиявка.

Медицинская пиявка (Шгас1о теёюшаНз) относится к типу кольчатых червей -АппеМеэ, классу - НкисНпеа, подклассу - настоящие пиявки - ЕиЫгисИпеа, отряду -челюстные пиявки - впаНюЬсЫМа.

Пиявка - эктопаразит. Эволюционно сложившийся тип питания привел к ряду адаптационных изменений. Они проявились в специфике состава секрета слюнных желез и механизме переваривания крови. Биологически активные вещества, обеспечивающие данные механизмы, эффективно используются при лечении широкого спектра заболеваний.

К настоящему времени границы применения гирудотерапии расширились в связи с глубоким изучением медицинской пиявки. Из нее выделено множество уникальных биологически активных веществ с широким спектром действия.

В мире активно работают несколько центров по изучению медицинской пиявки. Центр в Израиле под руководством доктора Ригби, в Германии под руководством доктора Фрица. В нашей стране активно работает ряд ведущих гирудологов, входящих в ассоциацию гирудологов России.

За последние годы в Московском гирудологическом центре получены убедительные результаты по применению трудотерапии на поздних стадиях лечения онкологических больных. В связи с этим изучение механизмов этого процесса представляется весьма актуальным.

Большое значение имеет также вопрос взаимоотношений медицинской пиявки и ее микроорганизма симбионта Аеготопаз 11ус1горЫ1а. Этот микроорганизм заслуживает внимания как продуцент биологически активных веществ. Кроме того, вызывая ряд заболеваний холоднокровных и млекопитающих, его можно рассматривать как возможный источник заражения людей в ходе гирудотерапии.

Исследования по данной диссертации проводились по тематике НИР ГНЦ ИМ по линии Министерства науки и технологий РФ за 1994-1998 годы.

90% материалов представленных в диссертации выполнено лично автором. Остальные 10% выполнены совместно с соавторами которые указаны в примечаниях диссертации.

Цель и задачи исследования

Цель исследований заключается в выделении биологически активных веществ из головной части медицинских пиявок и ее микроорганизма симбионта Аеготопаз 1гус1горЫ1а, а также в сравнительном изучении свойств этих веществ с другими препаратами.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

- выделение экстракта из головной части медицинских пиявок (ЕНМ);

- исследование действия ЕНМ на экспериментальные опухоли мышей (РЛ-67, Ьа) и сирийских хомяков (ХОП);

- сравнительная оценка противоопухолевого действия ЕНМ с другими препаратами;

- исследование влияния экстракта ЕНМ на поведенческие реакции лабораторных крыс;

- выделение и классификация микроорганизма - симбионта Аеготопаэ Ьу(1горЫ1а из медицинской пиявки и изучение его плазмидного профиля;

- выделение и очистка - зависимой металлопротеиназы из культуральной жидкости Аеготопаз Ьус1горЫ1а;

- исследование фибринолитических и бактериолитических свойств Zn'~ -зависимой металлопротеиназы.

Положения, выносимые на защиту

1. Экстракт ЕНМ, полученный из головной части медицинских пиявок, обладает противоопухолевой активностью в отношении экспериментальной опухоли мышей РЛ-67 и перевиваемой опухоли сирийских хомяков ХОП.

2. Экстракт ЕНМ влияет на некоторые показатели поведенческих реакций лабораторных крыс, такие, как исследовательская активность, координация движений, выносливость и работоспособность.

3. Выделенный штамм АеготопаБ Ьус1горЫ1а содержит крупную (62 т.п.н.) внехромосомную ДНК .

4. Ъп" - зависимая металлопротеиназа, выделенная из микроорганизма симбионта медицинской пиявки Аеготопаэ 1гус1горЫ1а, не обладает бактериолитическими свойствами в отношении исследованных штаммов микроорганизмов (Micrococcus lysodeikticus и Staphylococcus aureus), но обладает in vitro фибринолитической активностью.

Новизна исследований

В ходе работы нами впервые получен экстракт из головной части медицинских пиявок, обладающий противоопухолевой активностью в отношении опухоли мышей PJI-67 и саркомы сирийских хомяков ХОП.

Дана сравнительная характеристика противоопухолевой активности экстракта ЕНМ с другими препаратами.

Впервые показано влияние ЕНМ на центральную нервную систему лабораторных крыс.

Выделен и охарактеризован новый штамм A. hydrophila, содержащий внехромосомную ДНК, размеры которой находятся в пределах 62 т.п.н.

Показано, что Zn2+ - зависимая металлопротеиназа, выделенная из А. hydrophila, не обладает бактериологическими свойствами в отношении Micrococcus lysodeikticus и Staphylococcus aureus.

Научно-практическая значимость

Экстракт из головной части медицинских пиявок обладает противоопухолевой активностью в отношении солидных экспериментальных опухолей мышей (РЛ-67) и хомяков (ХОП), а также центральной активностью, которые предстоит дополнительно исследовать.

Разработанная методика выделения и очистки Zn - зависимой металлопротеиназы из A.hydrophila может быть использована для получения сходных бактериолитических ферментов из микроорганизмов - продуцентов.

Высокомолекулярная внехромосомная ДНК, выделенная из АеготопаБ Ьус1гор1н1а, может рассматриваться как потенциальный вектор для генно-инженерных манипуляций в бактериях рода Аеготопаэ.

Полученные результаты исследований симбиотических взаимоотношений медицинской пиявки и А.Ьус1горЬ11а, а также анализ данных зарубежной литературы указывают на потенциальную опасность данного микроорганизма в ходе гирудотерапии.

2. Обзор литературы 2.1.1 История гирудотерапии

Первые упоминания о применении медицинской пиявки в лечебных целях уходят своими корнями в глубокую древность - 1500 -1300 г.г. до н.э., но все же основоположником этого метода лечения следует считать Никандра из Колофона (200-130 г.г. до н.э.) и его последователей: Темисона (123-43 г.г. до н.э.), Галена (131-200 г.г.) Аэция (354-435 г.г.), а также Ибн-Сину (980-1037 г.г.).

Наивысший пик популярности гирудотерапии возник в эпоху Возрождения. В то время медицинская пиявка считалась -незаменимым средством при всех заболеваниях. Прежде чем применять тот или иной препарат, больному делалось общее или местное кровопускание посредством пиявок. Чрезмерное увлечение гирудотерапией нередко приводило к отрицательным результатам: от местного воспаления до значительной потери крови (нередко пациенту накладывали до 100 пиявок одновременно).

Вторая половина XIX века ознаменовалась бурным развитием научной медицины. Расцвет хирургии, микробиологии, введение правил антисептики, применение новых эффективных синтетических препаратов привели к резкому сокращению применения медицинской пиявки. На смену пиявкам пришел метод кровопускания, как более простой и надежный, и к первому десятилетию XX века пиявки почти полностью исчезли из арсенала терапевтических средств.

Как ни парадоксально, но наука XX века способствовала и возобновлению интереса к медицинской пиявке.

Перед человечеством поставлены качественно новые задачи, одной из которых является предотвращение возможной экологической катастрофы. С этих I позиций понятно ослабление интереса к производству и использованию синтетических медицинских препаратов. На фоне увеличения аллергических заболеваний применение многих из них. становится невозможным. Ухудшение экологической обстановки сопровождается ослаблением общей резистентности организма человека, сбоями в иммунной системе, что проявляется в увеличении роста онкологических заболеваний и болезнях иммунной системы.

Из всех форм народной медицины, по-видимому, именно гирудотерапия призвана сыграть наиболее важную роль в терапии будущего. Для этого утверждения есть немало оснований.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Федоров, Тарас Владимирович

6. Выводы

1. Получен экстракт из головной части медицинских пиявок (ЕНМ), обладающий помимо основной антитромбиновой активности противоопухолевым действием в отношении экспериментальных солидных опухолей мышей (PJI-67) и сирийских хомяков (ХОП).

2. Определена оптимальная доза (300 мкг/кг), способ введения (подкожный) и схема введения экстракта ЕНМ.

3. Дана сравнительная оценка противоопухолевого действия ЕНМ с другими препаратами такими, как энтеротоксин из S.- aureus, "Пиявит", рекомбинантные цитокины. Показано, что противоопухолевая активность препарата ЕНМ находится на уровне слитного белка Т-ФНО и ФНО+Т.

4. Препарат из головной части медицинских пиявок, при его внутрибрюшинном введении, в дозе 100 мкг/кг, оказывает тормозное центральное действие, достоверно отмечаемое в тестах "Открытое поле" (по критерию ориентировочно - исследовательской активности), "Вращающийся стержень" (по критериям координации движений, выносливости и работоспособности).

5. Выделен и охарактеризован новый штамм симбионта медицинской пиявки A.hydrophila. При определении плазмидного профиля обнаружена крупная внехромосомная ДНК размерами около 62 т. п. н.

6. Разработан новый метод очистки Zn2+ - зависимой металлопротеиназы, секретируемой A.hydrophila, включающий высаливание, гельфильтрацию и ионообменную хроматографию.

84

7. Zn - зависимая металл опротеииаза, выделенная из симбионта медицинской пиявки A.hydropllila, не обладает бактериолитической активностью в отношении S.aureus и Micrococcus lysodeikticus.

7. Практические предложения

1. Разработанная схема выделения и очистки Zn - зависимой металлопротеиназы может быть использована для получения некоторых бактериолитических ферментов, в частности лизостафина (фермента, специфически гидролизующего глицилглициновые связи пептидогликана у клеток практически всех штаммов, в том числе антибиотикоустойчивых, рода Staphylococcus, и создания препаратов на его основе.

2. Выделенная из A. hydrophila плазмидная ДНК pPRSl может рассматриваться как потенциальный вектор для генноинженерных манипуляций в бактериях рода Aeromonas. Плазмида передана в отдел № 3 (начальник отдела доктор вет. наук, профессор Э.А.Светоч) для характеристики репликативной, сегрегационной и структурной стабильности.

3. В ходе выращивания пиявок и трудотерапии необходимо проводить контроль пиявок на носительство вирулентных штаммов A. hydrophila.

4. Экстракт из головной части медицинских пиявок обладает противоопухолевой активностью в отношении солидных экспериментальных опухолей мышей (PJI-67) и хомяков (ХОП), а также центральной активностью, которые предстоит дополнительно исследовать.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Федоров, Тарас Владимирович, Оболенск

1. Алтухов, В.И. Афанасьев, Б.А. .Башкиров и др. Краткий справочник ветеринарного врача - М.: Агропромиздат, 1990. - С. 162 - 163

2. Баскова И.П., Черкесова Д.У. Сравнительное изучение гирудина и "псевдогирудина"//. Биохимия,- 1980. Т. 45.- С. 463-467.

3. Бергквист П., Харди К. Плазмиды: Методы / Пер с англ;- Под ред. К. Харди.- М.: Мир, 1990,- 267с.

4. Брода П. Плазмиды / Пер. с англ.- М.: Мир, 1982. 224 с.

5. Вольф М., Рансбергер К. Лечение ферментами / Пер. с англ.- М.: Мир. 1976.- 231с.

6. Голькин М.Б. Послеоперационные тромбозы вен нижних конечностей. Дис. д-ра мед. наук: 03.00.04,- защищена 01.01.46,- Воронеж, 1946,- 240с.

7. Энтеробактерии: (Руководство для врачей)/ И. В. Голубева, В.А. Килессо, и др.- М.: Медицина, 1985,- 321 с.

8. Демин Ю.С. Влияние гирудотерапии на некоторые показатели свертывания крови у больных гипертонической болезнью // Труды военно мед. акад. им. Кирова. -Л.:- 1958,- С. 18-24.

9. Девени Т.,. Гергей Я,- Аминокислоты, пептиды и белки.-М.: Мир, 1976. -364с.

10. Ю.Девис Р., Ботстаин Д., Рот Дж. Генетика бактерий,- М.: Мир. 1984,- 176 с. 11.Живодеров В.М., Пинькевич Н.М. Гирудотерапия и некоторые показатели свертывания крови при гипертонической болезни. // Труды Владивост. мед. ин-та,-1962. № 1.С. 171-175.

11. Фактор некроза опухоли и лимфотоксин эндогенные противоопухолевые антибиотики. / С. А. Кетлинский, Л. А. Белова, Л. А. Селезнева, В. А. Пасечник// Усп. совр. биол,- 1989,- Т.107,- С. 79-91.

12. Козлов A.M., Софьина З.П. Частота, сроки и тип метастазирования различных перевиваемых опухолей мышей//БЭБМ.-1978.-N 12,-С. 715-718.

13. Маниатис Т. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование / Пер. с англ.- М.: Мир, 1984,- 480 с.

14. Мгалоблишвили П.И., Мирианашвили К.А., Бартадзе Т.Л. Гирудотерапия при некоторых болезнях кожи // С-Пб. науч. тр. / Тбилисский ин-т дерматологии. -1941.-С. 2-3 ,С. 66-74.

15. Лабораторные методы исследования в клинике / В.В. Меньшиков, Л.Н. Делекторская, Р.П. Золотнитская, и др.: Справочник.- М.: Медицина, 1987.-368 с.

16. Петров И.П., Лапкина Н.В. Экспериментальные и клинические исследования по трудотерапии // Вестн. хирургии им. Грекова. -1936. № 47.- С 163-179.

17. Пирцхалава Л.А., Вартаретов А.Я., Мирианашвили Н.И. Гирудотерапия при некоторых дерматозах // Вестн. венерологии и дерматологии,- 1941.- № 1,- С 51 -53.

18. Савинов В.А. Иммунокоррекция, сопутствующая гирудотерапии // Моск. Ассоциация гирудологов.- 1993.- 15 с.

19. Савинов В.А. Коррекция иммунитета у больных раком предстательной железы,- М.: Медицина, 1989. 183 с.

20. Савинов В.А. Роль гирудотерапии в лечении онкологических больных. Успехи гирудологии и гирудотерапии // Материалы четвертой научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России. С-Пб Зеленогорск,- 1994,- СЮ.

21. Савинов В.А., Гирудотерапия как патогенетический метод лечения опухолевой болезни. Успехи гирудологии и гирудотерапии // Материалы четвертой научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России- С-Пб -Зеленогорск,- 1994,- С 8.

22. Савинов В.А.Роль гирудотерапии в лечении онкобольных.- М.: Асклепейон, 1994 .- 42 с.

23. Сидорина Ф.И. Спастические изменения в бедренной артерии при тромбофлебите нижних конечностей. // Клиническая медицина. 1950.- №28.- С 12.

24. Сидорина Ф.И. Тромбофлебиты нижних конечностей. Дис. канд.наук: 05.05.04- Защищена 09.11.43; Утв. 11.05.43. ; М., 1943 153 с.

25. Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б. Определитель зоопатогенных микроорганизмов.- М.: Колос, 1995.- 319 с.

26. Талызин Ф. Ф. Гирудиноз //БЭМ. 1977. -№6,- С. 47-48.

27. Федоров П.С. Опыт лечения фурункулеза медицинской пиявкой // С-Пб. Труды. Иркутск. 1946. - С. 263-265.

28. Фроленко Е.В. Изменение протромбина, фибриногена, вязкости крови при применении пиявок. // Здравохр. Белоруссии.-1960.- № 7,- С 22 23.

29. Ю.Н. Хомяков, Т.В. Федоров, Н.В. Борисов, В.В. Гусев. "Опыт лечения экспериментальных опухолей препаратами из Hirudo medicinalis". / International journal on immunorehabilitation.- Дагомыс, 1995.- № 1.- С. 85.

30. Ю.Н. Хомяков, Т.В. Федоров, В.В. Гусев, В.А. Шмелев, С.И. Евсегнеев. "О влиянии цитокинов и их производных на развитие экспериментальной опухоли мышей / Материалы Российского Национального конгресса "Человек и лекарство".- Москва, 1995,- С. 313.

31. Щеголев Г.Г., Федорова М.С. Медицинская пиявка и ее применение // М Медгиз., 1955. 263 с.

32. Barca E., Ardanuy C., Carratala J., Sanchez A., Fernandez Sevilla A., Gracena A., Fatal myofascial necrosis due to imipenem-resistant Aeromonas hydrophila.// Scand J Infect Dis.- 1997,- Vol.29, N 1.- P. 91-92.

33. Barillo D.J., McManus A.T., Cioffi W.G., McManus W.F., Kim S.H., Pruitt B. A. Aeromonas bacteraemia in burn patients.// Burns, 1996 Feb.- Vol. 22, N 1.- P. 48-52.

34. Bonventre P.F., Weckbach L., Staneck J., Schlivert P. M. Production of staphylococcal enterotoxin F and pyrogenic exotoxin С by Staphylococcus aureus isolatesIfrom toxic shock syndrome associated sources.// Infect. Immun.- 1983, N 40,- P. 10231029.

35. Borrell N., Figueras M. J., Guarro J. Phenotypic identification of Aeromonas genomospecies from clinical and environmental sources. // Can J Microbiol.- 1998 Feb.-Vol.44, N2.-P. 103-108.

36. Brumlik M. J., Buckley T. Identification of the Catalytic Triad of the Lipase/ Acyltransferase from Aeromonas hydrophila.// Journal of Bacteriology.- 1996. Apr.- Vol. 178, N 7,-P.- 2060-2064.

37. Busing K.H., Pseudomonas hirudinis, ein bakterieller Darmsymbiont des Blutegels ( Hirudo officinalis., Zentrallblat fur bakteriologic, parasitenhunde injektionshrankhecten un of Hygiene).- 1952,-Vol. 157, N 7.- P. 478-484.

38. Chang C. Y., Thompson H., Rodman N., Bylander J., Thomas J. Pathogenic analysis of Aeromonas hydrophila septicemia.// Ann Clin Lab Sci.- 1997 Jul.- Vol. 27, N 4,-P. 254 -259.

39. Chatrenet B., Chang J. Y. The disulfide structures of scrambled hirudins. // Biol. Chem.- 1993,- Vol. 268.- P. 20988-20996 .

40. Chiang H.S., Swaim M.W., HuangTF., Characterization of platelet aggregation induced by human breast carcinoma and its inhibition by snake venom peptides, trigramin and rhodostomin. / Breast-Cancer-Res-Treat.-. 1995 Mar.- Vol. 33, N 3,- P. 225-235.

41. Chiang H. S., Swaim M. W., Huang T. F. Characterization of platelet aggregation induced by human breast carcinoma and its inhibition by snake venom peptides, trigramin and rhodostomin. // Breast. Cancer. Res.Treat.- 1995 Mar.- Vol. 33, N 3.-P. 225-235.

42. Dabb R. W., Malone J. M., Leverett L. C., The use of medicinal leeches in the salvage of flaps with venous congestion. // Ann-Plast-Surg.- 1992 Sep.- Vol. 29, N 3,- P. 250-256.

43. Di Marco S., Priestle JP., Structure of the complex of leech-derived tryptase inhibitor (LDTI) with trypsin and modeling of the LDTI-tryptase system.// Structure.-1997 Nov.- Vol 5, N 11,- P. 1465-1474.

44. Dunham N.W., Miya T.S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. // J. Am. Pharmaceut. Assoc., Scientific Edit.- 1957. -Vol. 46.-,N34.-P. 23 26.

45. Eldor A., Orevi M., Rigbi M. The role of the leech in medical therapeutics.// Blood Rev.- 1996 Dec.- Vol 10, N 4,- P. 201-209-,

46. Granum P. E., O'Sullivan K., Tom6s J. M., Ormen O. Possible virulence factors of Aeromonas spp. from food and water.// FEMS Immunol Med Microbiol.- 1998 Jun.-Vol. 21, N2.-P. 131-137.

47. Gubash SM., Evaluation of the synergistic haemolysis (CAMP-like) test in the identification of motile, mesophilic Aeromonas species.// Zentralbl Bakteriol.- 1997. Jun.-Vol. 286, N 1,- P. 41-45.

48. Hall C.S. Emotional behavior in the rat.// J. physiol. psychol. 1934. - Vol.18, N5.-P. 385-403.

49. Handfield M., Simard P., Letarte R. Differential media for quantitative recovery of waterborne Aeromonas hydrophila. 11 Appl Environ Microbiol.- 1996 Sep.- Vol. 62, N 9,-P. 3544-3547.

50. Hanninen M.L., Salmi S., Mattila L., Taipalinen R., Siitonen A., Association of Aeromonas spp. with travellers' diarrhoea in Finland.// J. Med. Microbiol.- 1995 Jan.-Vol. 42, N 1 P. 26-31.

51. Hanninen M. L., Oivanen P., Hirveld Koski V., Aeromonas species in fish, fish-eggs, shrimp and freshwater. // Int. J. Food Microbiol.- 1997 Jan.- Vol. 34, N 1.- P. 17-26.

52. Haycraft J.B. On the action of secretion obtained from the medicinal leech on the coagulation of the blood.// Proc.R.Soc.Lond.-1884.- Vol 36, N 7,- P. 478-487.

53. Howard S. P., Meiklejohn H. G., Shivak D., Jahagirdar R. TonB-like protein and a novel membrane protein containing an ATP-binding cassette function together in exotoxin secretion. // Mol Microbiol.- 1996 Nov.- Vol. 22 , N 4,- P. 595 604.

54. Ingham A.B., Pemberton J. M. A lipase of Aeromonas hydrophila showing nonhemolytic phospholipase C activity.// Curr-Microbiol.- 1995 Jul.- Vol. 31, N l.-P. 28-33.

55. Kameneva M.V.,Parfenov A.S., Chirkova L.D., Baskova I.P. Piyavit a complex preparation from Medicinal Leech improves blood rheology and decreases platelet aggregation.// Clinical Hemorheology. 1995.-Vol. 15, N 4,- P. 633-640.

56. Kessler E. Beta-lytic endopeptidases. 11 Methods-Enzymol.- 1995.- Vol. 248, N36.-P. 740-756.

57. Khomyakov, I.I. Lyubimov, T.V. Phyodorov, V.V. Gusev. "Extract out of Hirudo medicinalis possesses central effect". / European Journal of Physiology.-Maastricht, The Netherlands.- 1995,- V. 430,- № 4.-P. 39.

58. Khomyakov, T.B. Kravchenko, T.V. Fyodorov, A.N. Noskov, V.V. Gusev. " Anticancer activity of enterotoxin from Staphylococcus aureus". / Proceedings of first FIMSA Congress". Adelaide. Australia.- 1996,- P. 406.

59. Lin C. S., Cheng S. PI. Aeromonas hydrophila sepsis presenting as meningitis and necrotizing fasciitis in a man with alcoholic liver cirrhosis. // J Formos Med Assoc.-1998 Jul.- Vol. 97, N 7,- P. 498-502.

60. Lin S. H., Shieh S. D., Lin Y. F., De Brauwer E., Van Landuyt H. W., Gordts B., Boelaert J. R. Fatal Aeromonas hydrophila bacteremia in a hemodialysis patient treated with deferoxamine. // Am J Kidney Dis.- 1996 May.- Vol.27, N 5.- P. 733-735.

61. Lineaweaver W.C. Aeromonas hydrophila infections following clinical use of medicinal leeches: a review of published casesBlood-Coagul-Fibrinolysis. // 1991 Feb.-Vol. 2, N 1,-P. 201-203.

62. Loewy A. G., Santer U. V., Wieczorek M., Blodgett J. K., Jones S. W., Cheronis J.C. Purification and characterization of a novel zinc-proteinase from cultures of Aeromonas hydrophila.// J-Biol-Chem.- 1993 Apr.- Vol. 268, N 12,- P. 9071-9078.

63. Madsen C.F., Pedersen N.R., Fulminant myonecrosis and sepsis caused by Aeromonas hydrophila. Vejle Sygehus, ortopaedkirurgisk afdeling.// Ugeskr-Laeger. 1995 May 29,- Vol. 157, N 22,- P. 3204-3205.

64. Markwardt F. Hirudin as an inhibitor of thrombin. Methods in Enzymology,Acad.Press- New-York, 1970, Vol.19.-P. 924-932.

65. Marrack P., Kappler J. The stphylococcal enterotoxins and their relatives.// Science.- 1990, N 248,- P. 705-711.

66. Merino S., Rubires X., Aguilar A., Tomas J. M. The role of flagella and motility in the adherence and invasion to fish cell lines by Aeromonas hydrophila serogroup 0:34 strains.// FEMS Microbiol Lett.- 1997 Jun.- Vol.151, N 2,- P. 213-217.

67. Moniatte M., Van der Goot F.G., Buckley J. T., Pattus F., van Dorsselaer A. Characterisation of the heptameric pore-forming complex of the Aeromonas toxinaerolysin using MALDI-TOF mass spectrometry.// FEBS Lett.- 1996 Apr.- Vol. 384, N 3,-P. 269-272.

68. Monreal M, Costa J, Salva P., Pharmacological properties of hirudin and its derivatives. Potential clinical advantages over heparin.// Drugs Aging.- 1996 Mar.- Vol.8, N3.-P. 171-182.

69. Moses A.E., Leibergal M., Rahav G., Perouansky M., Or R., Shapiro M., Aeromonas hydrophila myonecrosis accompanying mucormycosis five years after bone marrow transplantation.// Eur-J-Clin-Microbiol-Infect-Dis.- 1995 Mar.- Vol. 14, N 3,- P. 237-240.

70. Murakami T., Inoue T., Kawakami H., Takahashi H., Yasunaga T. Hypercalcemia associated with Aeromonas hydrophila gastro-enteritis.// Acta-Paediatr-Jpn.- 1995 Apr.- Vol.37, N 2.-P. 192-195.

71. Nonomura H., Kato N., Ohno Y., Itokazu M., Matsunaga T., Watanabe K., Indigenous bacterial flora of medicinal leeches and their susceptibilities to 15 antimicrobial agents. // J Med Microbiol.- 1996 Dec.- Vol. 45, N 6,- P. 490-493.

72. O'Reilly Michael S., Steven Pirie-Shepherd, William S. Lane, Judah Folkman. Antiangiogenic Activity of the Cleaved Conformation of the Serpin Antithrombin. // Science. 1999 Jim.- Vol. 285, P. 1926-1928

73. Pemberton J.M., Kidd S. P., Schmidt R. Secreted enzymes of Aeromonas.// FEMS Microbiol Lett.- 1997 Jul.- Vol. 152, N 1,- P. 1-10.

74. Peterson H. J. Experimental studies in fibrinalysis in growth and spread of tumour. // Stockholm, 1968,- Vol. 3, N 1,- P 43-45.

75. Richerson J. T., Davis J. A., Meystrik R. Aeromonas, acclimation, and penicillin as complications when leeches are applied to skin flaps in rabbits.// Lab-Anim.-1990. Apr- Vol. 24, N 2,- P. 147-150.

76. Rigbi M, Orevi M, Eldor A., Platelet aggregation and coagulation inhibitors in leech saliva and their roles in leech therapy.// Semin Thromb Hemost.- 1996.- Vol. 22, N 3.-P. 273-278.

77. Rosenfeld S. A., Nadeau D., Tirado -J., Hollis G. F., Knabb R.M., Jia S. Production and purification of recombinant hirudin expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris.// Protein Expr Purif.- 1996 Dec.- Vol. 8, N 4,- P. 476-482.

78. Ross M.S. The leech of dermatologie interest.// Arch. Dermatol.- 1983.Vol. 119, N4,-P. 276 277.

79. Shchekotov G.M. Use of leeches in varicose veins.// Voen. Med. Zh.- 1980.-Vol. 3.-P. 68.

80. Skoll P. J., Hudson D. A., Simpson* J. A. Aeromonas hydrophila in burn patients.//Burns.- 1998 Jun.-Vol. 24, N4,-P. 350-353.

81. Sohmura Y., Nakata K., Yoshida H.,Kashimoto S.,matsui Y.& Furuichi H. Recombinant human tumor necrosis factor- 2. Antitumor effect on murine and human tumors transplanted in mice.//Int. J. Immunopharm.- 1986,- Vol.8, N 3-P. 357-368.

82. Son R., Rusul G., Sahilah AM., Zainuri A., Raha AR., Salmah I. Antibiotic resistance and plasmid profile of Aeromonas hydrophila isolates from cultured fish, Telapia (Telapia mossambica).// Lett Appl Microbiol.- 1997 Jun.- Vol 24, N 6. P 479482.

83. Thumm G. Getz F. Studies on prolysostaphin processing and characterization of the lysostaphin immunity factor (Lif) of Staphylococcus simulans biovar staphylolyticus. //Molecular Microbiology.- 1997,-Vol. 23,N6,-P. 1251-1265.

84. Tsai G. J., Chen T. H., Incidence and toxigenicity of Aeromonas hydrophila in seafood.//Int J Food Microbiol.- 1996 Aug.-Vol. 31, N 1-3,-P. 121-131.

85. Utsalo S.J., Eko F.O., Antia-Obong O.E., Nwaigwe C. U. Aeromonads in acute diarrhoea and asymptomatic infections in Nigerian children.// Eur. J. Epidemiol.- 1995 Apr.-Vol. 11, N2,-P. 171-175.

86. Vadivelu J; Puthucheary S. D.; Phipps M; Chee Y. W. Possible virulence factors involved in bacteraemia caused by Aeromonas hydrophila.// J-Med-Microbiol.-1995 Mar.-Vol. 42, N 3-171-174.

87. Walz D. A., Fenton J. W. The role of thrombin in tumor cell metastasis. // Invasion-Metastasis.- 1994-95,-Vol.-14, N 1-6.-P. 303-308.

88. Whitlock M.R., O'Hare P. M., Sanders R., Morrow N. C., The medicinal leech and its use in plastic surgery: a possible cause for infection. // Br-J-Plast-Surg.- 1983 Apr.- Vol. 36, N 2,- P. 240-244.

89. Wong C.Y., Heuzenroeder M.W., Flower RL. Inactivation of two haemolytic toxin genes in Aeromonas hydrophila attenuates virulence in a suckling mouse model. // Microbiology.- 1998 Feb.- Vol. 144, N 2,- P. 291-298.

90. Wong C. Y., Mayrhofer G., Heuzenroeder M. W., Atkinson H. M., Quinn D. M., Flower R. L. Measurement of virulence of aeromonads using a suckling mouse model of infection. // FEMS Immunol Med Microbiol.- 1996 Oct.- Vol. 15, N 4,- P. 233241.

91. Worthington.// Enzymes and related biochemicals.-1978.-Vol 56, N2,- P. 123124. '

92. Xu X. J., Ferguson M.R., Popov V.L., Houston C.W., Peterson J. W., Chopra A. K., Role of a cytotoxic enterotoxin in Aeromonas-mediated infections: development of transposon and isogenic mutants.// Infect Immun.- 1998 Aug.- Vol. 66, N 8.- P. 35013509.

93. От души благодарю в.н.с., д.б.н. Суровцева В.И., н.с.Чупрунова В.П., н.с. Хатюшина Ю.И. за помощь в очистке фермента AhP, с.н.с. Борисова Н. В. и с.н.с.

94. ПОДГОТОВКА К ИССЛЕДОВАНИЮ, . . 3

95. ПРОВЕДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ. .4

96. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ.,.,.,. 5

97. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ. .,.,,. . 51. МЛ 15.374-95 о. 31. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ .

98. Полученные экстракты объединяют, отбирают небольшую часть этого раствора, упаривают под вакуумом при 40°п для удаления ацетона и используют для изучения биологической активности,2 стадия.

99. Полученный продукт темно-коричневого цвета маслянистой консистенции используется в качестве препарата-сырца и его можно использовать как для исследовательских работ, так и для последующей очистки (1,2).

100. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ, в

101. При работе следуют инструкции " По охране труда при работе о кислотами и щелочами " , " По ТЕ при работе со стеклянной посудой" ," По ТЕ в биохимических и микробиологических лабораториях".