Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Ресурсы медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.) в акваториях Западного Предкавказья и их рациональное использование

ВАК РФ 03.00.32, Биологические ресурсы

Автореферат диссертации по теме "Ресурсы медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.) в акваториях Западного Предкавказья и их рациональное использование"

.г

На правах рукописи (

0030542ЭЭ

Каменев Олег Юрьевич

РЕСУРСЫ МЕДИЦИНСКОЙ ПИЯВКИ (Шгис1о тесНсшаНв Ь.) В АКВАТОРИЯХ ЗАПАДНОГО ПРЕДКАВКАЗЬЯ II ИХ РАЦИОНАЛЬНОЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ

Специальность 03.00.32 - биологические ресурсы

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Краснодар, 2007

003054299

Работа выполнена на кафедре прикладной экологии Кубанского государственного аграрного университета и на Санкт-Петербургской биофабрике медицинской пиявки.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Стрельников Виктор Владимирович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Криворотов Сергей Борисович

Ведущая организациия: Кубанский государственный

университет

Защита диссертации состоится 1В февраля 2007 г. в •/V часов на заседании диссертационного совета Д 220.038.09 в Кубанском государственном аграрном университете по адресу: 3540044, г. Краснодар, ул. КалининаЛЗ

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Кубанского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан 16 января 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, Афанасьев Дмитрий Федорович

кандидат биологических наук

Чернышева Н.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из значимых биологических ресурсов является пиявка Н\гис1п тесИстаШ Ь. Эти гидробионты особенно важны для медицинской практики. Медицинская пиявка свыше 35 веков активно используется как лечебное средство. До середины 80-х годов XX века пиявка входила в перечень обязательного аптечного ассортимента, и сегодня она все шире используется как сырье для получения лекарственных препаратов, пищевых биологических добавок, косметических средств и др. Потенциальными источниками ресурсов пиявок являются лов дикой пиявки и искусственное ее разведение на биофабриках, в связи с чем важную задачу представляет совершенствование технологии искусственного разведения пиявок.

Для промышленного использования природной пиявки требуются знания о величине ее ресурсов и возможности ее вылова без нанесения вреда природным биоценозам. Без этих данных невозможно научно обоснованное природопользование. Однако систематических работ по количественной оценке ресурсов пиявки в СССР и Российской Федерации в последние тридцать лет практически не проводилось. Приведенные в литературе данные по численности пиявок требуют проверки, так как стандартных методов оценки ресурсов медицинской пиявки не было разработано.

Изучение механизмов действия пиявки на организм человека способствовало официальному признанию и развитию трудотерапии (лечения пиявками) в медицинской практике России. Главной особенностью воздействия медицинской пиявки на человека является то, что лечебные эффекты развиваются в результате введения в организм человека секрета ее слюнных желез. Однако динамика выделения компонентов секрета в процессе питания пиявок не исследовалась.

Традиционно основным источником дикой пиявки в России являются водоемы Западного Предкавказья. К сожалению, запасы медицинской пиявки могут истощаться в результате неправильного или чрезмерного ее вылова, резкого сокращения

кормовой базы, падения уровня воды и эвтрофикации водоемов. Однако влияние токсичных веществ, в том числе пестицидов и солей тяжелых металлов на жизнеспособность пиявки практически не изучалась. Сохранение ресурсов пиявки и ее рациональное использование на сегодняшний день является одной из наиболее актуальных проблем природопользования.

Цель работы заключалась в оценке ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья и разработке путей ее сохранения и рационального использования.

Для выполнения поставленной цели были определены и решены следующие основные задачи:

1. Научное обоснование и разработка методики количественного определения запасов медицинской пиявки в различных водоемах.

2. Оценка величины ресурсов медицинской пиявки в основных акваториях Западного Предкавказья.

3.' Выяснение влияния на медицинскую пиявку токсичных веществ и изучение' возможности ее использования в качестве биоиндикатора загрязнений водной среды.

4. Разработка способов рационального практического использования и сохранения ресурсов медицинской пиявки.

5. Совершенствование технологии искусственного разведения медицинской пиявки.

6. Разработка рекомендаций по рациональному применению пиявки в медицинской практике в связи с особенностями физиологии ее питания.

Научная новизна. Разработана научно обоснованная методика количественной оценки биологических ресурсов медицинской пиявки в водоемах открытого и закрытого типа. Впервые с использованием предложенной методики определены величина и динамика ресурсов медицинской пиявки в основных акваториях Западного Предкавказья в 2001-2006 годах.

На водных модельных системах определены концентрации пестицидов (фосфорорганических, хлорорганических и др.) и солей тяжёлых металлов (Н§, Сё, Си, и др.), приводящие к гибели

50% пиявок при 24-часовой инкубации (ЛК50). Научно обосновано использование пиявки в качестве биологического тест-объекта.

Разработаны технологические параметры водного режима при содержании пиявок в условиях искусственного разведения; определена оптимальная плотность поселения медицинской пиявки, обеспечивающая максимальный выход молоди.

Предложена биологически активная добавка для косметических и лечебных средств и способ ее получения из тканей медицинской пиявки. Новизна способа подтверждена патентом на изобретение № 2225196 (Бюллетень изобретений №7 от 10.03.2004).

Впервые установлен состав последовательно выделяемых фракций секрета слюнных желез пиявки в процессе ее питания, и на этой основе предложены рекомендации по особенностям применения медицинской пиявки в практике гирудотерапии.

Практическая ценность. Разработаны рекомендации по рациональному использованию природной популяции для промышленного производства медицинской пиявки. Усовершенствованная технология разведения пиявки в искусственных условиях внедрена на Санкт-Петербургской биофабрике и позволяет успешно решать задачу обеспечения пиявкой аптек и лечебных учреждений. По результатам совместных исследований с кафедрой зоологии беспозвоночных и энтомологии впервые был поставлен вопрос о необходимости сохранения медицинской пиявки в Краснодарском крае, что впоследствии легло в основу рекомендаций для подготовки Постановления губернатора Краснодарского края № 955 от 19 августа 2002 г. « Об изучении и сохранении медицинской пиявки на территории Краснодарского края».

Проведенные исследования используются при повышении квалификации врачей на курсах по гирудотерапии Санкт-Петербургской медицинской академии последипломного образования, а также в Кубанском государственном университете при чтении курсов лекций по дисциплинам «Зоология беспозвоночных», «Сравнительная анатомия беспозвоночных», «Экология беспозвоночных».

Материалы диссертации послужили основой монографии Каменева О.Ю. в соавторстве с Барановским А.Ю. «Теория и практика трудотерапии: лечение пиявками», рекомендованной УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию ВУЗов России в качестве учебного пособия для послевузовского профессионального образования врачей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ресурсы медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья (реки Кагальник, Куго-Ея, Челбас, Кирпили, Егор-лык) в 2006 г, составили 1193,7 тысяч половозрелых особей. В среднем, запасы медицинской пиявки по изученным рекам с 2001 по 2006 год снизились в 3,2 раза.

2. Методика количественной оценки ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья, предусматривающая стандартное воздействие для привлечения пиявок, оптимальные величины продолжительности и протяжённости участка лова, а также учитывающая физиологическое состояние особей в различные сезоны года.

3. Основными путями сохранения ресурсов медицинской пиявки и ее рационального использования следует считать регламентированный вылов особей из естественных водоемов, совершенствование технологии искусственного воспроизводства, а также экономичное использование пиявок в практике гирудоте-рапии (в свете особенностей ее питания и динамики последовательно выделяемых фракций слюны).

4. Медицинская пиявка может служить для биоиндикации загрязнений водоемов солями тяжелых металлов и пестицидами.

Апробация работы и публикации.

Материалы и основные положения диссертации доложены на 10 конференциях: Ассоциации гирудологов России и стран СНГ (СПб - Зеленогорск, 1997; Пятигорск, 1999; Люберцы, 2001; Москва, 2003: Балаково, 2006); IV конференции по гирудологии (СПб, 2000); Международном конгрессе по проблемам окружающей среды (Никосия, Северный Кипр, 2002); международной конференции по экологии больших рек (Йонсю, Финляндия,

2003); Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий, (Краснодар, 2005; 2006). Всего автором опубликовано 20 работ в данном направлении, из них 14 работ по теме диссертации, в том числе 2 монографии и 1 патент.

Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, 3-х глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследований и результатов собственных исследований с их обсуждением), выводов, списка литературы и приложения (два документа о внедрении). Работа изложена на 156 машинописных страницах текста, содержит 24 таблицы и 11 рисунков. Список литературы включает 135 наименований, в том числе 47 зарубежных источников.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность темы, определена цель и поставлены задачи исследований. В главе 1 приведен аналитический обзор литературы.

Глава 2 Материалы и методы исследований Материалом для написания диссертационной работы послужили исследования вопросов распространения, жизнедеятельности, размножения и применения медицинской пиявки, проводимые с 1998 г. по настоящее время.

В качестве исследуемых акваторий было выбрано несколько крупных рек в различных зонах Западного Предкавказья. В северной части региона - реки Кагальник и Куго-Ея, в западной - бассейн р. Егорлык, в восточной, центральной и южной - бассейны рек Челбас и Кирпили. За весь период работы на изучаемой территории с 1998 по 2006 гг. было выполнено более 1000 обловов. Статистическая интерпретация полученных количественных данных осуществлялась с помощью компьютерной программы 5ТАТ15Т1СА. В главе 2 приводится описание методик получения чистого секрета слюнных желез медицинской пиявки и изучения его фракционного состава, а также методика изучения влияния токсичных веществ на медицинскую пиявку.

Разработка методики оценки запасов медицинской пиявки. Для разработки методики оценки ресурсов медицинской

пиявки были поставлены и решены следующие задачи: 1. Выбор оптимального способа привлечения пиявок; 2. Оценка продолжительности лова на одном участке; 3. Установление оптимальной площади участка лова; 4. Определение месяца года наиболее благоприятного для вылова.

Выбор оптимального способа привлечения пиявок. Объективная и результативная оценка запасов медицинской пиявки на основании данных по ее вылову возможна лишь при создании стандартного метода ее привлечения к месту лова. До сих пор не было попыток создания такого метода. В данной работе впервые предложен стандартный ударный способ привлечения пиявок. При ударном способе ловец производит 5 сильных ударов по воде 1-метровой палкой с интервалом в 2 секунды. Затем в течение 3-х минут привлеченные пиявки вылавливаются, а также собираются руками со всех предметов, находящихся вблизи. Вышеописанный цикл в течение 10 минут повторяется трижды: 5 ударов палкой, затем 3-х минутный лов. После окончания лова пиявка подсчиты-вается и вновь выпускается в водоем. Особенностью ударного способа является обеспечение стандартного раздражения пиявки. Удары палкой обеспечивают образование волн определенной частоты (0,5-1 Гц) на поверхности воды и их распространение в толще воды. Такие колебания способствуют движению пиявок в направлении источника вибраций, т.к. они моделирует сигналы, исходящие от перемещающихся в воде животных. Результаты апробации ударного метода показали его высокую эффективность-Ударный способ обеспечивал достаточно хорошую воспроизводимость опытов; величина коэффициента вариации не превышала 7%, а разница результатов, достигнутых различными ловцами этим методом, не превышала 5%.

Оценка продолжительности лова. Исследования показали, что основная часть активной (голодной) медицинской пиявки (88 %), вылавливалась за первые 30 минут; при этом за 10 минут -50 % особей, а за 1 час отлавливалась практически вся пиявка (« 100%), обитающая на изучаемой части акватории. Это позволило ввести временной коэффициент лова, обозначенный К,. С помощью К, можно оценить численность медицинской пиявки экс-

пресс-методом за 10 минут лова (при этом К, = 2). Таким образом, для экономии времени исследований при оценке численности медицинской пиявки в акваториях, рекомендуется применять 10-минутные сборы в каждом месте исследований и полученные количественные данные при этом умножать на величину К,=2.

Установление оптимальной площади участка лова. Основным фактором, определяющим эту площадь, является максимальное расстояние, на котором пиявка способна реагировать на всплеск воды, производимый ударным способом. С учётом особенностей жизнедеятельности пиявок в качестве меры величины участка лова выбрана длина береговой линии водоема. Определено, что оптимальное расстояние между точками обловов равно 20м. При этом один ловец обрабатывает 100-метровый участок (5 точек лова, отстоящих друг от друга на 20м).

Определение меся11а года, наиболее благоприятного для лова пиявки. Исследования показали, что оценку запасов медицинской пиявки оптимально следует проводить в мае месяце. Именно в этот период большинство особей медицинской пиявки с повышением температуры воды начинают проявлять активность после длительного (4-5 месяцев) периода зимнего покоя и голодания. Такие особи активно наплывают на ловца при применении ударного способа их привлечения. При лове в другое время года необходимо делать поправки, учитывающие наличие сытых особей, которые, находясь в состоянии покоя, при ловле на шум и всплеск не учитываются. Поэтому при проведении оценки ресурсов пиявки в летний и осенний периоды необходимо использовать физиологический коэффициент лова (К,-). Если лов осуществляется в мае месяце, К^ = 1; во всех остальных случаях величина Кгбольше1.

На основании вышеизложенного была предложена следующая формула для расчета ресурсов медгщинской пиявки (УГ<):

Ук 100-п ^

где хь х2. ... х„ - количество медицинской пиявки на 1, 2 ... п-ом 100-метровом участке акватории; п - количество 100-метровых

участков; К( - значение временного коэффициента лова (К, = 2 при ] 0-минутных обловах); К^ - значение физиологического коэффициента лова; N - коэффициент ширины реки, учитывающий 2 берега реки (если расстояние между ними более Юм N = 2, если менее 10 м (канал, коллектор), N = 1); Ь - общая длина реки (в метрах).

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Оценка и динамика ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья

Исследования, проводимые в течение 6 лет (2001-2006 гг.), позволили выявить не только численность медицинской пиявки в отдельно взятых участках рек, но и проследить динамику ее изменения. Обловы (выборки) производились в акваториях рек Кагальник, Куго-Ея, Челбас, Кирпили, Егорлык. Общее количество произведенных обловов за время исследований превысило 1000. Для расчета ресурсов медицинской пиявки в исследуемых реках нами использовались результаты обловов, проводимых ежегодно в мае месяце. Полученные результаты расчетов представлены в табл. 1.

Таблица 1. - Ресурсы медицинской пиявки в основных ре ках Западного Предкавказья (количество тысяч особей)_

Место исследований Годы исследований

2001 2002 2003 2004 2005 2006

Кагальник 451,2 ±7,7 405,6 ± 12,4 235,2 ±7,4 172,8 ±6,2 112,8 ±4.1 105,6 ±5,6

Куго-Ея 450,9 ±9.2 295,7 ±7,3 277,7 ±8,1 75,0 ±2,6 58,1 ±1,2 82,4 ±4,3

Челбас 1172,7 ±33,1 794,9 ±23,7 716,5 ±19,7 417,0 ± 13,9 249,9 ± 10,0 474,6 ±12.6

Кирпили 875,9 ±30,3 759,5 ±30,3 496,1 ±19,7 502,6 ±18,3 357,1 ±17,5 355,5 ±22,3

Егорлык 921,1 ±8,4 620,0 ±4,7 369,2 ±6,3 276,0 ±11,8 46,6 ±2,1 175,6 ±7,3

При проведении оценки ресурсов пиявки учитывались только половозрелые особи массой более 1,3 г. Ресурсы медицин-

ской пиявки в 2001-2006 гг. были рассчитаны нами для каждой из изучаемых рек. Максимальным объемом ресурсов медицинской пиявки в 2006 г. характеризуется р. Челбас - 474,6 тыс. особей. Для реки Кирпили этот показатель составляет 355,5 тыс. особей. Наименьшими ресурсами отличается р. Куго-Ея - 82.4 тыс. особей. По состоянию на 2006 г. суммарные запасы медицинской пиявки в р. Кагальник, Куго-Ея, Челбас, Кирпили, Егорлык составляют 1 193.7 тыс. половозрелых особей, т.е. около 1,84 тонны (приведенные данные показаны из расчета содержания в I кг 650 шт. медицинских пиявок). Распределение запасов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья представлено в виде диаграммы на рис, 1.

□ Кагальник ■ Куго-Ея ЭЧелбас ИЕгорпык ШКирпили

Рис. 1. Распределение запасов медицинской пиявки в акваториях основных рек Западного Предкавказья в 2006 г.

Наиболее значительными запасами медицинской пиявки в настоящее время характеризуется акватория р. Челбас. Среди пяти основных обследованных нами рек Азово-Кубанской низменности, в ней сосредоточено 39% медицинской пиявки. Несколько уступает по запасам пиявки акватория р. Кирпили - 30 %. I ¡изки-ми запасами медицинской пиявки характеризуются реки Егорлык {15 %). Кагальник (9 %), Куго-Ея (7 %).

На рис. 1 представлены данные динамики ресурсов медицинской пиявки в изученных акваториях Западного Предкавказья в 2001-2006 гг. В результате установлено резкое снижение числа особей медицинской пиявки в акваториях практически всех изу-

чаемых водоемов. Наиболее значительное снижение величины ресурсов медицинской пиявки отмечено для р. Куго-Ея, где в 2006 г. по сравнению с 2001 г. ресурсы снизились в 5,5 раз.

Рис. 2. Динамика ресурсов медицинской пиявки основных рек Западного Предкавказья (Кагальник, Куго-Ея, Челбас, Кирпи-ли, Егорлык) в 2001-2006 гг.

Меньшее, но весьма ощутимое снижение запасов пиявки произошло в р. Егорлык - в 5,2 раза; в р. Кагальник - в 4,3 раза; примерно в 2,5 раза произошло снижение в р. Кирпили и Челбас. . В среднем, запасы медицинской пиявки по исследуемым рекам за 6 лет снизились в 3,2 раза. Следует отметить, что данные исследования ни в какой степени не могли повлиять на снижение численности пиявки, т.к. вся пойманная пиявка после подсчетов выпускалась в то же место акваторий исследуемых рек. Снижение численности пиявок может быть вызвано ростом объемов браконьерского вылова, а также возможным загрязнением водоемов токсичными веществами.

3.2 Влияние токсичных веществ на выживание медицинской пиявки.

Изучалась токсичность наиболее опасных загрязнителей -фосфорорганических веществ (хлорофос, дихлофос), карбаматов (аминостигмин, галантамин, эзерин), хлорогранических веществ (дильдрин, альдрин), пиретроидов (фенвалерат, аллетрин, фенот-рин, нонборнан) и тяжелых металлов (ртуть, кадмий, медь и др.). Для анализа холинергической системы пиявок использовались также м-холиномиметик ареколин и н-холиномиметик никотин.

Токсичность ряда изучаемых соединений для пиявок сравнивали с аналогичными показателями для Daphnia magna,, являющейся классическим тест-объектом для определения фосфорорганических соединений (ФОС) в водной среде. Пиявки в 2530 раз более чувствительны к токсическому действию ФОС, чем теплокровные животные, но в 100 раз менее чувствительны чем дафнии. Карбаматы отличаются гораздо меньшей токсичностью (в 10 раз) для пиявок, чем для дафний. Токсичность никотина для пиявок и дафний имеет более близкие значения по сравнению с другими вредными веществами. Установлено, что ареколин не оказывает токсического действия на пиявок даже при очень высоких концентрациях (больше 1000 мг/л), в то время как токсичность никотина достаточно велика и сравнима с токсичностью для дафний.

Взрослые пиявки наиболее чувствительны к фосфорорга-ническим пестицидам и пестицидам из класса пиретроидов, сред-нелетальные концентрации которых составляли от 1 до 3 мг/л. Токсичность хлорорганических пестицидов оказалась ниже в 1015 раз по сравнению с ФОС. Наибольшую устойчивость пиявки проявляли к обратимым ингибиторам холинестераз (галантамину, пиридостигмину), цианистому калию и ряду судорожных агентов (нонборнану, апоморфину), среднелетальные концентрации которых колебались от 100 до 200 мг/л.

Результаты сравнительного исследования токсичности изученных соединений для взрослых и новорожденных пиявок в табл. 2, свидетельствуют о том, что чувствительность молоди и

взрослых пиявок мало отличалась при отравлении карбаматами, никотином, цианидом калия, апоморфином и хлорорганическими пестицидами.

Таблица 2 - Сравнительная токсичность ряда соединений

для взрослых и новорожденных пиявок (ЛК50 мг/л)

Соединения Взрослые Молодь Взрослые/молодь

Хлорофос 2,25+0,49 0,84+0,19 2,68

Аминостигмин 11,5±4,06 8,9+3,2 1,3

Талантами н 138,0+37,0 82,6+24,8 1,7

Пйридостигмин 176,0+59,1 127,4+32,5 1,4

Никотин 10,47+1,02 7,95+1,96 1,3

• КСЫ 71,2+15,6 63,2+15,5 1,12

Дильдрин 26,4+8,3 29,3+9,1 0,97

Альдрин 35,7+7,9 34,2+9,3 1,0

Фенвалерат 2,75+0,73 0,31 ±0,06 8,9

Аллетрин 17,2+4,6 7,5+0,52 2,3

Фенотрин 1,79+0,4 0,23+0,07 7,8

Нонборнан 91,6+33,5 33,1+3,7 2,8

Стрихнин 65,6+20,0 25,4+4,2 2,6

Апоморфин 111,1+37,1 69,0+18,5 1,6

В то же время, судорожные агенты - стрихнин и нонбор-нан были в 2,6-2,8 раза токсичнее для новорожденных пиявок, чем для взрослых особей. Наиболее выражены были эти различия при отравлении пиявок пестицидами из группы синтетических пиретроидов. В частности, фенвалерат и фенотрин оказались в 9 и 8 раз соответственно токсичнее для молоди, чем для половозрелых осрбей. Учитывая, что пиретроиды в настоящее время являются самым распространенным в сельском хозяйстве классом пестицидов, можно прогнозировать их особую потенциальную опасность для популяции медицинской пиявки при поступлении в водную среду с сельскохозяйственными сточными водами.

Действие тяжелых металлов. Основным механизмом токсического действия тяжелых металлов на живые организмы является подавление активности ферментов. Чувствительность

пиявок к действию солей тяжелых металлов уменьшается в ряду: Ь^»Сс1>С11»Мк Так, если среднелетальная концентрация ртути (Ж5П) составляла для пиявок 0,29 мг/л, то ЛК50 никеля - более 1000 мг/л. ). В отдельной серии опытов сравнивали токсичность тяжёлых металлов для половозрелых и новорожденных пиявок, однако, различий в чувствительности молоди и взрослых пиявок к токсическому действию солей указанных тяжёлых металлов обнаружено не было.

Вещества, содержащие тиоловые группы и другие серосодержащие соединения, являются специфическими антидотами для тяжелых металлов. Вещества - антагонисты образуют более прочные малорастворимые биологически неактивные комплексы с ионами тяжелых металлов. К ним относятся фармакологический препарат унитиол и тиосульфат натрия. Среди комплексообра-зующих соединений (хелатов) широко известны соли этилендиа-минтетрауксусной кислоты (ЭДТА). Комплексообразующая способность характерна также для карбаматов, аминокислот и ряда природных соединений таких, как гуминовые кислоты, фитин и др. Исследование антагонистов (ЭДТА, унитиола, тиосульфата натрия, гуминовой кислоты) солей тяжелых металлов (кадмия, меди и ртути) показало, что наибольшим защитным эффектом при интоксикации ими пиявок обладает комплексон унитиол. Коэффициент защиты его при интоксикации пиявок солями ртути К3=94, в случае солей кадмия К3=12. Эффективность защитного действия этих антагонистов от солей ртути убывает в ряду: уни-тиол>карбамат>тиосульфат натрия>ЭДТА>гуминовая кислота. Наличие защитного действия определенных соединений может использоваться при проведении биотестирования.

3.3 Пути сохранения ресурсов пиявки и ее рационального использования.

3,3.1 Рекомендации по сохранению и использованию ресурсов медицинской пиявки. При организации заготовки медицинской пиявки в Западном Предкавказье необходимо учитывать: 1) возраст вылавливаемых особей; 2) время года, в которое возможно проведение вылова без ощутимого вреда для популяции

при оптимальном физиологическом состоянии добытых особей; 3) способы привлечения и вылова пиявки; 4) количество особей, допустимое к вылову в данной акватории в конкретное время года; 5) целесообразность проведения работ по воспроизводству родительского стада в конкретных водоемах. В диссертации приводится подробное обоснование указанных позиций для изучаемого региона.

3.3.2 Совершенствование технологии искусственного разведения пиявки с целью сохранения ее запасов. Одним из важнейших аспектов при размножении медицинской пиявки в искусственных условиях являются плотность поселения особей и параметры водного режима.

Плотность поселения. Нами была поставлена задача выяснить оптимальную плотность поселения маток во время спаривания и откладки коконов, при которых достигается их максимальная плодовитость. Постановка эксперимента осуществлялась в Кубанском питомнике медицинской пиявки (ст. Ладожская). В результате проведенного анализа установлено, что наиболее продуктивным является совместное содержание 5 особей в период спаривания и 2-х или 3-х особей в период откладки коконов (5:2 или 5:3). При варианте(5:3) общее число задействованных емкостей (3-литровых баллонов) было равно 533 единицам на каждые 1000 маток, а выход потомства составил в среднем 32 особи на матку. Вариант (5:2), потребовал значительно больше емкостей -700 на каждые 1000 маток при среднем выходе потомства 43-44 особи. Наиболее экономичным является вариант (5:3).

Водный режим.

При содержании взрослых пиявок смена воды может вызывать стресс и влиять на процессы роста животных. В опытах для выяснения данного обстоятельства было задействовано 2000 особей медицинской пиявки, совместно содержавшихся в течение 60 дней. Было образовано 5 групп: каждая включала 400 особей, содержащихся по 100 штук в 3-литровых баллонах. В опытах были задействованы пиявки массой 1,5-1,7 г. В разных вариантах (рис.3) смена воды производилась с различной частотой: каждые

24, 48, 72, 96 и 120 часов. Выяснено, что в том варианте, где смену воды производили 1 раз в 72 часа, смертность составила 1,25% за период исследований, что сходно с показателем смертности в варианте, где смена воды производилась 1 раз в 48 часов (1%).

4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1

0,5 0

V

24

2

-за

48

72

96

120

частота смены воды, час.

Рис. 3. Смертность пиявки (% особей) в зависимости от частоты смены воды в емкостях.

Как видно из рис.3, более экономично производить смену воды 1раз в 72часа.

3.3.3 Использование медицинской пиявки как тест-объекта загрязнения водной среды. Детальное наблюдение за поведением молоди медицинской пиявки в широком диапазоне концентраций токсичных органических соединений и солей тяжёлых металлов позволило выявить простой и достаточно чувствительный показатель присутствия в воде этих веществ. Таковым служит время пребывания пиявки в покое (статичное состояние). Для удобства биотестирования регистрируют смену статичного состояния на динамичное (СССД) у многих особей одновременно. Токсикологическая значимость этой реакции подтверждается тем, что смена статичного состояния на динамичное наступает при таких концентрациях, которые при продлении экспозиции представляют реальную опасность для молоди пиявок, то есть являются токсичными. Таким образом, благодаря наличию характер-

ных симптомокомплексов отравлений, пиявка может использоваться в качестве биологического тест-объекта для идентификации данных загрязнителей в воде.

3.3.4 Рекомендации к применению Шгис1о тесИсшаИх в медицине в связи с особенностями физиологии ее питания.

Значительный интерес к медицинской пиявке, как было сказано выше, обусловлен, прежде всего, ее способностью облегчать течение многих заболеваний. Известно, что действие медицинской пиявки на организм человека во многом связано с веществами, содержащимися в секрете её слюнных желёз, которые вводятся животным в ранку в процессе питания. Однако в настоящее время многогранный механизм действия различных компонентов ССЖ (секрета слюнных желез) пиявки остается слабо изученным. Полностью не ясен вопрос о последовательности выделения различных компонентов слюны с точки зрения биологической целесообразности для самого животного и возможности использования этих данных в практике трудотерапии.

Проведенный анализ динамики выделения гликолротеи-дов, полисахаридов, гирудина, бделлинов, дестабилазы и гиалу-ронидазы в секрете показал, что в процессе питания животное выделяет секрет различного состава. Целесообразно объединить известные к настоящему времени биологически активные компоненты секрета слюны медицинских пиявок в четыре группы: 1) компоненты, обладающие литическими свойствами; 2) компоненты, обладающие антигемостатической активностью; 3) компоненты, нейтрализующие защитные реакции организма; 4) вспомогательные вещества, способствующие проникновению, а также фиксации в ранке других компонентов секрета.

Для выяснения последовательности выделения компонентов секрета слюнных желез медицинской пиявки нами были выбраны следующие вещества: из группы литических соединений -гиалуронидаза и пептидаза; из группы антигемостатиков - гирудин; из группы блокаторов защитных реакций - низкомолекулярные ингибиторы протеаз; из группы вспомогательных веществ -

мукоиды и полисахариды. Результаты проведенных исследований приведены в таблице 3.

Таблица 3. Содержание различных ферментов и метаболитов в секрете слюнных желез медицинской пиявки, выделяемых в различные периоды питания

Время, мин. Кол-во раствора, мл Вещества и их молярные массы (кДа)

Полипептиды (ингибиторы протеаз) ч к Ы, Протеаза Протеаза Гиалурдаза Гиалурдаза Полисахариды Мукоиды

5 7 8 17 20 6465 150 240 340 380 420 400 750 800

1 0,4 - +

2 0,4 - + + + + + +

3 0,5 - - - - - + + + + -

4 0,5 + + - + + + + + + + + -

5 0,4 + + + + + + + + + - -

6 0,7 + + + + + + + + + + + -

7 0,6 + + + + + - + + + + > 7 -

8 0,7 + + + + + - -к - -

9 0,6 + + + + + - - - - + -

10 0,8 + "И + + + + - - - - - -

11 0,8 + + + + + + - - - - - -

Серым цветом выделены случаи, когда данное вещество было обнаружено менее, чем в 70 % проб. Из таблицы 3 видно, что состав слюны в процессе питания пиявки меняется. Результаты данного исследования доказали неоднородность состава секрета, выделяющегося на разных этапах питания пиявки. Неодновременность появления в секрете слюнных желез ее отдельных компонентов, предполагает наличие у каждого из них своей системы регуляции выделения. Полученные данные имеют непо-

средственное значение для рационального и грамотного использования пиявок в лечебных целях. В тех случаях, когда целью лечения является растворение спаек или послеоперационных рубцов и т.п., целесообразно использовать большее количество пиявок, которых следует снимать до полного их насыщения. Это уменьшит излишнюю кровопотерю и в то же время обеспечит достаточный лечебный эффект. В случаях же использования пиявок с противовоспалительной целью, их не следует снимать преждевременно. Именно последние порции секрета наиболее богаты ингибиторами протеаз, обладающими противовоспалительным действием. В данном случае лечебный эффект может быть достигнут при использовании меньшего количества медицинских пиявок, чем это принято в обычной практике трудотерапии. Разработанные рекомендации позволяют не только экономить ее ресурсы, но и грамотно лечить больных.

3.3.5 Рациональное использование пиявок в процессе получения биологически активной добавки (БАД) для косметических и лечебных средств. Предложенный новый способ получения БАД, включающий замораживание пиявки, ее измельчение, экстракцию и фильтрацию, отличается тем, что экстракцию проводят водно-масляной эмульсией с добавкой фосфолипидов. Комбинация водно-масляной фазы и фосфолипидов приводит к образованию высокодисперсной стабильной эмульсии, обеспечивающей значительно более глубокое извлечение из тканей пиявки биологически активных компонентов (гирудина, полипептидов, фосфолипидов и др.). Получение продуктов с высокой концентраций биологически активных соединений позволяет значительно экономить ресурсы медицинской пиявки, получая при этом продукцию высокого качества.

Выводы

1. Оценка биологических ресурсов медицинской пиявки в основных реках Западного Предкавказья (Кагальник, Куго-Ея. Челбас, Кирпили, Егорлык) показала, что в 2006 г. они составили 1193.7 тысяч половозрелых особей, т.е. около 1,84 тонн. Наиболее

значительные ресурсы сосредоточены в реках Челбас - 474.7 тысяч и Кнрпили - 355,5 тысяч особей.

2. Впервые разработана и апробирована методика количественной оценки ресурсов медицинской пиявки, предусматривающая стандартное воздействие для их привлечения (ударный способ, обеспечивающий низкочастотные колебания в воде); оптимальные величины продолжительности (10 минут) и протяженности участка лова (20-метровое расстояние между точками обловов), а также учитывающая наиболее благоприятные для лова месяцы года. Предложена формула для расчета ресурсов медицинской пиявки в реках Западного Предкавказья.

3. Исследование динамики ресурсов медицинской пиявки в 2001-2006 гг. позволило установить повсеместное сокращение ее запасов. Наиболее значительное (в 5,5 раз) снижение величины ресурсов отмечено для р. Куго-Ея. В среднем, запасы медицинской пиявки по исследуемым рекам за 6 лет снизились в 3,2 раза.

4. Сравнительное исследование токсичности фосфорорга-нических, хлорорганических веществ, карбаматов, пиретроидов и цианидов показало, что наибольшую опасность для пиявки представляют пестициды из класса пиретроидов фенотрин (ЛК50=1,79мг/л) и фенвалерат (Л1<5о=2,75мг/л), а также фосфорор-ганический пестицид хлорофос (ЛК5о=2,25мг/л).

5. Установлено токсическое действие солей тяжелых ме-тшшов, которое уменьшается в ряду: Ь^»Сс1>Си»М'|. Наибольшую опасность в сравнении со всеми изученными в работе отравляющими веществами представляют соли ртути ( ЛК50=0,29мг/л). К малотоксичным для пиявки относятся соли никеля (ЛК5о=1000мг/л). Величины ЛК50 для солей кадмия и меди находятся на уровне 8-10мг/л.

6. Показано, что токсичные соединения различных классов по-разному воздействуют на взрослую и новорожденную пиявку. Эти различия наиболее выражены для пестицидов из группы синтетических пиретроидов. которые для молоди в 9 раз токсичнее. Судорожные агенты для новорожденных пиявок токсичнее в 2,5 раза. Чувствительность молоди и взрослых пиявок мало отличается при отравлении карбаматами, хлорорганическими

пестицидами, солями тяжелых металлов, а также никотином и цианидом калия.

7. Высокая чувствительность медицинской пиявки к токсическому действию пестицидов и тяжелых металлов позволяют использовать ее в качестве биологического тест-объекта для идентификации данных ксенобиотиков в воде.

8. Совершенствование технологического процесса воспроизводства и выращивания медицинской пиявки в искусственных условиях позволило рекомендовать содержание медицинской пиявки в соотношении 5 особей на спаривание и 3 на откладку коконов, что обеспечивает выход потомства 32 особи на матку.. Смену воды при содержании пиявок целесообразно производить через 72 часа.

9. Изучение динамики последовательного выделения различных компонентов слюнных желез (гликопротеидов, мукоидов, пептидаз, гиалуронидаз, бделлинов, гирустазнна, гирудина и полисахаридов) показало, что первоначально секретируются вещества, оказывающие на ткани лизирующее действие, затем вещества блокирующие свертываемость крови, после чего вещества-ингибиторы защитных реакций организма. На основе выявленных особенностей рекомендовано рациональное применение пиявок в лечебных целях.

10. Предложен новый способ получения из пиявки биологически активной добавки для косметических и лечебных средств, позволяющий извлекать активные компоненты при минимальном расходе пиявок.

Рекомендации производству

Для эффективного воспроизводства медицинской пиявки необходимо: 1) осуществлять заготовку пиявки в строго определенные месяцы, с учетом данных о величине и распределении биоресурсов пиявки в различных акваториях; 2) с целью получения оптимального приплода учитывать предложенные плотность поселения маток при спаривании и откладке коконов, а также условия водного режима; 3) проводить работы по воспроизводству родительского стада в конкретных водоемах-донорах маток для

поставки на биофабрики, пополнения маточного стада и проведения работ по селекции. Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Каменев О.Ю. Задачи современного этапа развития гирудотерапии. В кн.: Клиническая и экспериментальная гирудо-логия на пороге нового тысячелетия. Материалы VI научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России и стран СНГ / Под ред. проф. И.П. Басковой и А.И. Крашенюка. -Пятигорск, 1999.-С. 145-147.

2. Каменев О.Ю. Дикая и искусственно выращиваемая медицинская пиявка и ее применение в лечебной практике // В кн.: Практическая и экспериментальная гирудология: итоги за десятилетие (1991-2001 гг.): Материалы VII научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России и стран СНГ / Под ред. проф. И.П. Басковой. - Люберцы, 2001. - С. 90-92.

3. Каменев О.Ю., Тонкопий В.Д., Загребин А.О. Медицинская пиявка как тест-объект для биоидентификации тяжелых металлов в водной среде. В кн.: Гирудо - 2003. Материалы VIII. научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России и стран СНГ .-М.. 2003. - С. 57-58.

4. Каменев О.Ю. Антипов А.Д. Патент на изобретение №2225196. Биологически активная добавка для косметических и лечебных средств и способ ее получения. Бюллетень изобретений №7,10.03.2004.

5. Кустов С.Ю., Каменев О.Ю., Ярошенко В.А. Медицинская пиявка в Краснодарском крае: современное состояние популяции и проблемы ее охраны // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий - Краснодар: КубГУ, 2005. - С. 118-121.

6. Каменев О.Ю., Кустов С.10. Разработка методологической базы для оценки запасов медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.) // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий. - Краснодар: КубГУ. 2006. - С. 116-118.

7. Кустов С.Ю., Каменев О.Ю., Михайлов С.В. Обоснование необходимости включения медицинской пиявки в Красную книгу Краснодарского края // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий. - Краснодар: КубГУ, 2006. - С. 118.

8. Каменев О.Ю. Исследование динамики выделения биологически активных веществ секрета слюнных желез медицинской пиявки {Hirudo medicwalis L.) при ее питании // Гирудо -2006: Материалы IX научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России и стран СНГ / Под ред. проф. И.П. Басковой. - Балаково, 2006. - С. 23-26.

9. Каменев О.Ю. Количественная оценка биоресурсов медицинской пиявки на территории Краснодарского края // Гирудо - 2006: Материалы IX научно-практической конференции Ассоциации гирудологов России и стран СНГ / Под ред. проф. И.П. Басковой. - Балаково, 2006. - С. 80-83.

10. Каменев А.Ю. Барановский А.Ю. Теория и практика гирудотерапии: лечение пиявками. Руководство для врачей.. -Санкт-Петербург, 2006. - 302 с.

И. Стрельников В.В., Каменев О.Ю. Оценка и динамика ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья // Труды Кубанского государственного аграрного университета, выпуск 1 (5) - Краснодар, изд-во «Экоинвест», 2007. - 0,44 п.л.

12. Tonkopii V., Kamenev О., Zagrebin A. A new principles of xenobiotics bioidentification in fresh water // Proceedings of International Congress on Environmental Problems of Mideterranean Region, 2002. - Nicosia, North Cyprus. - P. 178-181.

13. Tonkopii V., Sherstneva L„ Kamenev O. Bioidentification of pesticides in water // Proceedings of the Workshop on Monitoring, Typology, Ecological Classification and assessment of the State of Large Lakes. - Joensuu, Finland, 2003,- P.36-41

14. Tonkopii V., Zagrebin A, Kamenev 0., lofina I. Ecotoxi-cological monitoring of surface water // Proceedings of the Workshop on Sustainable Use, Management and Development of Lake Ladoga Basin. - Joensuu, Finland, 200^. - P. 30-35.

Подписано в печать 12.01.2007 г. Формат 60x84 fó

Бумага офсетная Офсетная печать

Печ. л. 1 Заказ №10 Тираж 100 экз.

Отпечатано в типографии КубГАУ 350044, г. Краснодар, ул. Калинина, 13

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Каменев, Олег Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Распространение медицинской пиявки и методы ее количественной оценки.

1.1.1 Распространение медицинской пиявки.

1.1.2 Методы оценки численности медицинской пиявки.

1.2 Некоторые аспекты физиологии медицинской пиявки значимые для ее использования.

1.3 Применение медицинской пиявки человеком.

Глава 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1 Характеристика исследуемой формы медицинской пиявки {Hirudo medicinalis officinalis).

2.2 Природно-климатическая характеристика Западного Предкавказья.

2.3 Разработка методики оценки запасов медицинской пиявки.

2.4 Метод изучения химического состава секрета слюнных желез медицинской пиявки.

2.5 Метод изучения влияния токсичных веществ на медицинскую пиявку.

Глава 3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1 Оценка и динамика ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья.

3.2 Влияние токсичных веществ на выживание медицинской пиявки.

3.3 .Пути сохранения ресурсов медицинской пиявки и ее рационального использования.

3.3.1 Рекомендации по сохранению и использованию ресурсов медицинской пиявки.

3.3.2 Совершенствование технологии искусственного разведения пиявки с целью сохранения её запасов.

3.3.3 Использование медицинской пиявки как тест-объекта загрязнения водной среды.

3.3.4 Рекомендации к применению Hirudo medicinalis в медицине в связи с особенностями физиологии ее питания. ^

3.3.5 Рациональное использование пиявок в процессе получения биологически активной добавки для косметических и лечебных средств.

ВЫВОДЫ.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Ресурсы медицинской пиявки (Hirudo medicinalis L.) в акваториях Западного Предкавказья и их рациональное использование"

Одним из значимых биологических ресурсов является пиявка медицинская Hirudo medicinalis L. Эти гидробионты особенно важны для медицинской практики, пиявка свыше 35 веков активно используется человеком как лечебное средство.

В последние три десятилетия наблюдается неуклонный рост интереса к методам традиционной медицины. Особенно велик он в отношении лечения пиявками (трудотерапии). В последние годы проводятся исследования различных полученных из тканей пиявок веществ, которые влияют на свертываемость крови и обменные процессы в организме человека. Пиявки также представляют большой интерес как сырье для получения лекарственных препаратов, пищевых биологических добавок (БАД) и косметических средств. Потенциальным источником ресурсов пиявок являются лов дикой пиявки и искусственное ее разведение на биофабриках или фермах. Искусственно выращенная пиявка отличается от дикой, то есть выловленной в естественных водоемах, физиологическими (меньшей агрессивностью, подвижностью), биохимическими (более высоким содержанием липидов, антиоксидантов и др. веществ), микробиологическими (бактериальная обсемененность) показателями. Указанные особенности пиявок могут определять качественные показатели производимых из них лекарственных препаратов. Искусственно выращенная пиявка может быть использована в промышленной переработке, в медицинских целях, а также для восполнения природной популяции путем замены выловленных особей. В связи с этим совершенствование технологии искусственного разведения пиявок представляет собой важную задачу.

Сохранение ресурсов пиявки и ее рациональное использование на сегодняшний день является одной из актуальных проблем природопользования. Без данных о величине ресурсов медицинской пиявки невозможно ее научно обоснованное использование. Однако систематических работ по количественной оценке ресурсов пиявки в СССР и Российской Федерации практически не проводилось. Только в последние годы возросший интерес медицины к пиявке побудил ученых начать исследование распространения ее в природных водоемах. Так в 2006 г. С.В.Михайловым впервые обобщены данные по распространению медицинской пиявки в реках Краснодарского края. Вместе с тем, эта информация приблизительная, она не дает объективных количественных данных по величине ресурсов медицинской пиявки. Приведенные в литературе данные по численности пиявок требуют проверки, так как не было разработано стандартных методов оценки ее ресурсов.

Традиционно основным источником дикой пиявки в России являются водоемы Западного Предкавказья. С разной интенсивностью лов пиявки здесь осуществлялся в течение двух веков, хотя количественных данных, а тем более динамики запасов пиявки в этом регионе, как и в других, не было. К сожалению, запасы медицинской пиявки могут истощаться в результате неправильного или чрезмерного ее вылова, резкого сокращения кормовой базы, падения уровня воды и ее цветения, а также загрязнения водоемов химическими веществами, в том числе используемыми в сельском хозяйстве средствами защиты растений и удобрениями. Влияние токсичных веществ, в том числе различных классов пестицидов и солей тяжелых металлов, на жизнеспособность взрослых и новорожденных особей пиявки не изучалось. Медицинская пиявка является факультативным паразитом-гематофагом: она преимущественно питается кровыо теплокровных животных, хотя может паразитировать на земноводных, рыбах и даже беспозвоночных. При питании пиявка в ранку, образуемую ее хитиновыми зубцами, вводит секрет слюнных желез, который образован комплексом более чем из 20 различных соединений, обладающих противовоспалительным, иммуногенным и антикоагулянтным эффектами. Главной особенностью воздействия медицинской пиявки на человека является то, что лечебные эффекты развиваются в процессе воздействия одного живого организма на другой. Однако практически нет данных о динамике выделения в процессе питания различных компонентов секрета слюнных желез и в целом о механизме питания пиявок.

Учитывая вышеизложенное, цель работы заключалась в оценке ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья и разработке путей ее сохранения и рационального использования.

Для выполнения поставленной цели были определены и решены следующие основные задачи:

1. Научное обоснование и разработка методики количественного определения ресурсов медицинской пиявки в различных водоемах.

2. Оценка величины ресурсов медицинской пиявки в основных акваториях Западного Предкавказья.

3. Выяснение влияния на медицинскую пиявку токсичных веществ и изучение возможности ее использования в качестве биоиндикатора загрязнений водной среды.

4. Разработка способов рационального использования и сохранения ресурсов медицинской пиявки.

5. Совершенствование технологии искусственного разведения медицинской пиявки.

6. Разработка рекомендаций по рациональному применению пиявки в медицинской практике в связи с особенностями физиологии ее питания.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Ресурсы медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья (реки Кагальник, Куго-Ея, Челбас, Кирпили, Егорлык) в 2006 г. составили 1193,7 ± 52,1 тысяч половозрелых особей. В среднем, запасы медицинской пиявки по изученным рекам с 2001 по 2006 гг. снизились в 3,2 раза.

2. Методика количественной оценки ресурсов медицинской пиявки в акваториях Западного Предкавказья, предусматривающая стандартное воздействие для привлечения пиявок, оптимальные величины продолжительности и величины участка лова, а также учитывающая физиологическое состояние особей в различные сезоны года.

3. Основными путями сохранения ресурсов медицинской пиявки и ее рационального использования следует считать регламентированный вылов особей из естественных водоемов, совершенствование технологии искусственного воспроизводства, а также экономичное использование пиявок в практике трудотерапии (в свете особенностей ее питания и динамики последовательно выделяемых фракций слюны).

4. Медицинская пиявка может служить для биоиндикации загрязнений водоемов солями тяжелых металлов и пестицидами.

Научная новизна. Разработана научно обоснованная методика количественной оценки биологических ресурсов медицинской пиявки в водоемах открытого и закрытого типа. Впервые с использованием предложенной методики, определены величина и динамика ресурсов медицинской пиявки в основных акваториях Западного Предкавказья в 20012006 годах.

На водных модельных системах определены концентрации пестицидов (фосфорорганических, хлорорганических и др. ) и солей тяжёлых металлов (Hg, Cd, Си, и др.), приводящие к гибели 50% пиявок при 24-часовой инкубации (JIK50). Научно обосновано использование пиявки в качестве биологического тест-объекта.

Разработаны технологические параметры водного режима при содержании пиявок в условиях искусственного разведения: определена оптимальная плотность поселения медицинской пиявки, обеспечивающая максимальный выход молоди.

Предложена биологически активная добавка для косметических и лечебных средств и способ ее получения из тканей медицинской пиявки. Новизна способа подтверждена патентом на изобретение № 2225196 (Бюллетень изобретений №7 от 10.03.2004).

Впервые установлен состав последовательно выделяемых фракций секрета слюнных желез пиявки в процессе ее питания и на этой основе предложены рекомендации по особенностям применения медицинской пиявки в практике трудотерапии.

Практическая ценность. Разработаны рекомендации по рациональному использованию природной популяции для промышленного производства медицинской пиявки. Усовершенствованная технология разведения пиявки в искусственных условиях внедрена на Санкт-Петербургской биофабрике и позволяет успешно решать задачу обеспечения пиявкой аптек и лечебных учреждений. По результатам совместных исследований с кафедрой зоологии беспозвоночных и энтомологии Кубанского государственного университета, впервые был поставлен вопрос о необходимости сохранения медицинской пиявки в Краснодарском крае, что впоследствии легло в основу рекомендаций для подготовки Постановления губернатора Краснодарского края № 955 от 19 августа 2002 г. «Об изучении и сохранении медицинской пиявки на территории Краснодарского края».

Проведенные исследования используются при повышении квалификации врачей на курсах по гирудотерапии Санкт-Петербургской медицинской Академии последипломного образования, а также в Кубанском государственном университете при чтении курсов лекций по дисциплинам «Зоология беспозвоночных», «Сравнительная анатомия беспозвоночных», «Экология беспозвоночных».

Материалы диссертации послужили основой монографии Каменева O.IO. в соавторстве с Барановским А.Ю. «Теория и практика гирудотерапии: лечение пиявками», рекомендованной УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию ВУЗов России в качестве учебного пособия для системы послевузовского профессионального образования врачей.

Структура и объем работы.

Диссертация состоит из введения и 3-х глав (обзора литературы, описания материалов и методов исследований и результатов исследований с их обсуждением), выводов, списка литературы и приложения (с 2-мя актами внедрения). Работа изложена на 156 машинописных страницах текста, содержит 24 таблицы и 11 рисунков. Список литературы включает 135 наименований, в том числе 47 зарубежных источников.

Заключение Диссертация по теме "Биологические ресурсы", Каменев, Олег Юрьевич

выводы

1. Оценка биологических ресурсов медицинской пиявки в основных реках Западного Предкавказья (Кагальник, Куго-Ея, Челбас, Кирпили, Егорлык) показала, что в 2006 г. они составили 1193,7 тысяч половозрелых особей, т.е. около 1,84 тонн. Наиболее значительные ресурсы сосредоточены в реках Челбас - 474,7 тысяч и Кирпили - 355,5 тысяч особей.

2. Впервые разработана и апробирована методика количественной оценки ресурсов медицинской пиявки, предусматривающая стандартное воздействие для их привлечения (ударный способ, обеспечивающий низкочастотные колебания в воде); оптимальные величины продолжительности (10 минут) и протяженности участка лова (20-метровое расстояние между точками обловов), а также учитывающая наиболее благоприятные для лова месяцы года. Предложена формула для расчета ресурсов медицинской пиявки в реках Западного Предкавказья.

3. Исследование динамики ресурсов медицинской пиявки в 2001 -2006 гг. позволило установить повсеместное сокращение ее запасов. Наиболее значительное (в 5,5 раз) снижение величины ресурсов отмечено для р. Куго-Ея. В среднем, запасы медицинской пиявки по исследуемым рекам за 6 лет снизились в 3,2 раза.

4. Сравнительное исследование токсичности фосфорорганических и хлорорганических веществ, карбаматов, пиретроидов и цианидов показало, что наибольшую опасность для пиявки представляют пестициды из класса пиретроидов фенотрин (ЛК50=1,79мг/л) и фенвалерат (ЛК50=2,75мг/л), а также фосфорорганический пестицид хлорофос (ЛК50=2,25мг/л).

5. Установлено токсическое действие солей тяжелых металлов, которое уменьшается в ряду: Hg»Cd>Cu»Ni. Наибольшую опасность в сравнении со всеми изученными в работе отравляющими веществами представляют соли ртути ЛК50=0,29мг/л. К малотоксичным для пиявки относятся соли никеля ЛК5о=1000мг/л. Величины ЛК50 для солей кадмия и меди находятся на уровне 8-10мг/л.

6. Показано, что токсичные соединения различных классов по-разному воздействуют на взрослую и новорожденную пиявку. Эти различия наиболее выражены для пестицидов из группы синтетических пиретроидов, которые для молоди в 9 раз токсичнее. Судорожные агенты для новорожденных пиявок токсичнее в 2,5 раза. Чувствительность молоди и взрослых пиявок мало отличается при отравлении карбаматами, хлорорганическими пестицидами, тяжелыми металлами, а также никотином и цианидом калия.

7. Высокая чувствительность медицинской пиявки к токсическому действию пестицидов и тяжелых металлов позволяют использовать ее в качестве биологического тест-объекта для идентификации данных ксенобиотиков в воде.

8. Совершенствование технологического процесса воспроизводства и выращивания медицинской пиявки в искусственных условиях позволило рекомендовать содержание медицинской пиявки в соотношении 5 особей на спаривание и 3 на откладку коконов, что обеспечивает выход потомства 32 особи на матку. Смену воды при содержании пиявок целесообразно производить через 72 часа.

9. Изучение динамики последовательного выделения различных компонентов слюнных желез (гликопротеидов, мукоидов, пептидаз, гиалуронидаз, бделлинов, гирустазина, калина и полисахаридов) показало, что первоначально секретируются вещества, оказывающие на ткани лизирующее действие, затем вещества блокирующие свертываемость крови, после чего вещества-ингибиторы защитных реакций организма. На основе выявленных особенностей рекомендовано рациональное применение пиявок в лечебных целях.

10. Предложен новый способ получения из пиявки биологически активной добавки для косметических и лечебных средств, позволяющий извлекать активные композиции при минимальном расходе пиявок.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПРОИЗВОДСТВУ

Для эффективного воспроизводства медицинской пиявки необходимо: 1) осуществлять заготовку пиявки в строго определенные месяцы, с учетом данных о величине и распределении биоресурсов пиявки в различных акваториях; 2) с целью получения оптимального приплода учитывать предложенные плотность поселения маток при спаривании и откладке коконов, а также условия водного режима; 3) проводить работы по воспроизводству родительского стада в конкретных водоемах-донорах маток для поставки на биофабрики, пополнения маточного стада и проведения работ по селекции.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Каменев, Олег Юрьевич, Краснодар

1. Андреев П.Н. О сохраняемости микроорганизмов и иммунных тел в пищеварительном канале пиявок и о роли последних в распространении заразных болезней //Арх. научн. и практ. ветеринарии, 1923. 1. - 1. - С. 3845.

2. Баскова И.П., Бородин В.Г., Селезнев К.Г. и др. Гирудотерапия. Методические рекомендации для практикующих врачей. М, 1990. - 23 с.

3. Баскова И.П., Завалова Л.Л. Ингибиторы протеолитических ферментов медицинской пиявки (Hirudo medicinalis). Обзор // Биохимия. -2001.-66, 7.-С. 869-883.

4. Баскова И.П., Исханян Г.С. Гирудотерапия. М.: 2004. - 507 с.

5. Баскова И.П., Никонов Г.И. Дестабилаза фермент секрета слюнных желез медицинских пиявок гидролизирует изопептидные связи в стабилизированном фибрине // Биохимия. - 1985. - № 50. - С. 424-431.

6. Брыков И. Руководство к разведению и сохранению пиявок. СПб.,1852.

7. Гвоздецкий Н.А. Физическая география Кавказа. Вып. 1. М.: Изд-во МГУ.- 1954.-208 с.

8. Гвоздецкий Н.А. Физическая география Кавказа. Вып. 2. М.: Изд-во МГУ.- 1958.-265 с.

9. П.Голькин М.Б. Послеоперационные тромбозы вен нижних конечностей / Дисс . канд. мед. н. Саратов, 1947. - 24 с.

10. Догель В.А. Зоология беспозвоночных: Учебник для ун-тов / Под ред. проф. Полянского Ю.И. -М.: Высш. школа, 1981. 606 с.

11. Думитрашенко Н.В. Кавказ // Горные страны Европейской части СССР и.Кавказ (под ред. Думитрашко Н. В.). М.: Наука, 1974. - С. 90-226.

12. Жизнь животных (в 6 тт.) / Под ред. JI.A. Зенкевича. М.: Просвещение, 1968-69. - 580 с.

13. Запкувене Д.В., Синявичене Д.П. Гистофизиологический анализ развития слюнных желез медицинской пиявки. В кн.: Актуальные вопросы обмена веществ // Матер, конф. по вопросам физиологии обмена веществ человека и животных. Вильнюс, 1976. - С. 77-79.

14. Запкувене Д.В. Разведение и выращивание медицинских пиявок в лабораторных условиях // Тр. АН Литовской ССР. 1972. - В. - 3 (59). - С. 71-84.

15. Исаханян Г.С. Гирудотерапия в клинике внутренних болезней. -Ереван: Айастан, 1991.

16. Каменев 0.10. Комплексная регенерация (омоложение) кожи на основе косметической программы Гирулайн // Гирудо 2003: Матер. . 8-й науч.-практ. конф. Ассоциации гирудологов России и стран СНГ / Под ред. проф. И.П. Басковой. - М., 2003. - С. 52-54.

17. Каменев 0.10. Количественная оценка биоресурсов медицинской пиявки на территории Краснодарского края // Гирудо 2006: Матер. . 9-й науч.-практ. конф. Ассоциации гирудологов России и стран СНГ / Под ред. проф. И.П. Басковой. - Балаково, 2006. - С. 80-83.

18. Каменев 0.10. Антипов А.Д. Патент на изобретение №2225196 Биологически активная добавка для косметических и лечебных средств и способ ее получения. Бюллетень изобретений №7 10.03.2004

19. Каменев О.Ю., Барановский АЛО. Теория и практика гирудотерапии: лечение пиявками. Руководство для врачей. СПб, 2006. -302 с.

20. Каменев О.Ю., Май В.Н. Реакция организма на приставку медицинских пиявок, ее оценка и способы ведения. В кн.: Матер. VI науч.-практ. конф. по гирудотерапии / Под ред. О.Ю. Каменева. СПб, 2000. - С. 10-17.

21. Каменев Ю.Я., Каменев О.Ю. Вам поможет пиявка (практическое руководство по гирудотерапии). СПб, 2000. - 252 с.

22. Канонников A.M. Природа Кубани и Причерноморья. -Краснодар, 1977. 112 с.

23. Канонников A.M. Географические комплексы Кубани: Природа и мы. Краснодар: Краснодарское книжное издательство, 1984. - 75 с.

24. Кобахидзе Д.Н. К выяснению местообитаний медицинской пиявки в природных условиях Грузии // Сообщения АН Грузинской ССР. 1942. - 3. - 1.-69-72.

25. Кобахидзе Д.Н. К изучению гидростойкости медицинской пиявки // Сообщения АН Грузинской ССР. Тбилиси, 1944. - 5 - 4. - С. 423-429.

26. Кобахидзе Д.Н. Материалы к инвентаризации гидрофауны Грузии // Труды Зоол. ин-та АН Грузинской ССР. 1946. - 6. - 291-297.

27. Косенко И.С. Определитель высших растений Северо-Западного Кавказа и Предкавказья. -М.: Колос, 1970. 613 с.

28. Кузнецова О.Н. Распределение гирудина в теле медицинской пиявки // Зоол. журн. 1953. - Т. 32, вып. 5. - С. 833-839.

29. Кузнецова О.Н. Научное пиявководство в Советском Союзе // Труды Московской ветеринарной академии. 1961. - 33. - С. 149-152.

30. Лагутенко Ю.П. Структурная организация туловищного мозга аннелид. JL: Наука, 1981.

31. Лакин Б.Ф. Биометрия. М.: Высшая школа, 1980. - 295 с.

32. Лапкина Л.Н., Флеров Б.А. Исследование острого отравления пиявок некоторыми токсическими веществами // Физиология и паразитология пресноводных животных. Л., 1979. - С. 50-59.

33. Лапкина Л.Н., Флеров Б.А. Использование пиявок для идентификации пестицидов в воде. // Гидробиологический журнал. 1980. -Т. 16, №3.-С. 113-119.

34. Ливанов Н.А. Класс Пиявок (Hirudinea). Руководство по зоологии 2.-М.-Л., 1940.-С. 205-257.

35. Лукин Е.И. К вопросу о распространении медицинской пиявки в СССР // Зоол. журн.- 1957. 36. - 5. - С. 658-669.

36. Лукин Е.И. Географическое распространение пресноводных пиявок на территории СССР // Проблемы зоогеографии суши. Львов, 1958. - С. 144-149.

37. Лукин Е.И. К фауне пиявок реки Волги // Ученые записки Куйбышевского гос. педагогического института им. В.В. Куйбышева. Естествознание. Куйбышев, 1959. - 22. - С. 32-38.

38. Лукин Е.И. К фауне пиявок Северного Кавказа. Итоги северокавказской гидробиологической экспедиции // Труды ЗИН АН СССР.- 1959.-26.-С. 355-359.

39. Лукин Е.И. Пиявки // Жизнь животных. Т. 1. - М., 1968. - С. 509526.

40. Лукин Е.И. Пиявки пресных и солоноватых водоемов // Фауна СССР: Пиявки. 1976.-Т. 1.

41. Михайлов С.В. Распространение и биология медицинской пиявки в Краснодарском крае / Автореф . канд. биол. наук. Ставрополь, 2006. -20с.

42. Михайлов С.В., Ярошенко В.А. Особенности биологии, экологии и распространения кубанской медицинской пиявки // Актуальные вопросы экологии и охраны природы экосистем южных регионов России и сопредельных территорий. Краснодар, 2005. - С. 136-138.

43. Нагалевский Ю.Я., Чистяков В.И. Физическая география Краснодарского края. Краснодар, 2001. - 256 с.

44. Никонов Г.И. Медицинская пиявка. Основы гирудотерапии. СПб.: Изд-во СДС, 1998.-294 с.

45. Определитель пресноводных беспозвоночных России и сопредельных территорий: Низшие беспозвоночные / Под общ. ред. С.Я. Цалолихина. СПб.: 1999. - Т. 1. - 400 с.

46. Плотников В. Glossosiphonidae, Hirudinidae, Herpobdellidae Зоологического музея Академии наук // Ежегодн. Зоол. музея Академии наук. 1907.- 10.- 133-158.

47. Прозоровский В.Б., Чурносов Е.В., Лесников Л.А. Методические указания по ускоренному определению эффективных доз и концентраций биологически активных веществ. Л., 1991. - 23 с.

48. Селезнев Л.Г. Лечение пиявками в домашних условиях. СПб.: Изд. дом Нева, 2003.- 119с.

49. Сергеева С.С., Антипов А.Д., Каменев О.Ю. Определение содержания сиаловых кислот в нервной системе медицинской пиявки // Колосовские чтения: IV Международная конференция по функциональной нейроморфологии. СПб, 2002. - С. 260.

50. Синева М.В. Наблюдения над выращиванием медицинских пиявок // Зоол. журн. 1944. - 23. - 6. - 293-303.

51. Синева М.В. Биологические наблюдения над размножением медицинской пиявки // Зоол. журн. 1949. - 28. - 3. - 213-224.

52. Синева М.В. Зависимость роста медицинской пиявки от приемов пищи //-Бюллетень московского общ-ва испытателей природы, отд. биол. -1950.-55.-6.-С. 55-56.

53. Сокол Е.Г. Лечение пиявками септических тромбофлебитов // Акушерство и гинекология.- 1939.- 11.-С. 61-64.

54. Спицина В.И. Новый метод лечения стомалгии медицинскими пиявками // Стоматология. 1987. - 66. - 1. - С. 34-36.

55. Степанов А.Д. Лечение пиявками при сотрясении мозга // Межобластная научная конференция практических врачей: Тез. научн. докл. -Рязань, 1954.-С. 51-53.

56. Тер-Григоряи М.А. Некоторые наблюдения над распространением медицинской пиявки в Армении //Зоол. сб. 1950. - 7. - С. 122-126.

57. Тонкопий В.Д., Загребин А.О., Куценко С.А. Обоснование новых подходов к биоидентификации антихолинестеразных соединений в водной среде с использованием медицинской пиявки // Журнал экологической химии. 1993.-№4-С. 261-265.

58. Устинова З.Г. Лечение больных с сердечно-сосудистой недостаточностью пиявками // Сборник науч. трудов клинической больницы неотложной помощи (МЗ УзССР). Ташкент, 1969. - 3. - 43-47.

59. Фарбер Ф.М. Применение медицинских пиявок патогенетический метод терапии периферического паралича лицевого нерва // Заболевания центральной нервной системы. - Новосибирск, 1985. - С. 26-28.

60. Федоров П.С. Опыт лечения фурункула медицинской пиявкой // Сборник научных трудов, посвященных памяти проф. Р.И. Березниговского.- Иркутск, 1946. С. 263-265.

61. Флеров Б.А. Эколого-физиологические аспекты токсикологии пресноводных животных. Л.: Наука, 1989. - 139 с.

62. Хомякова Т.И., Савинов В.А., Хомяков Ю.Н. Aeromonas hydrophila- бактерия-симбионт медицинской пиявки. -М.: Асклепейон, 1998. -С.73-78.

63. Чернух A.M., Фролов Е.П. Кожа. (Строение, функция, общая патология и терапия). М.: Медицина, 1982. - 336 с.

64. Чалисова Н.И., Журавский С.Г., Пеннияйнен В.А. и др. Стимулирующее влияние дестабилазы, компонента слюнных желез медицинской пиявки, на рост нейритов чувствительных нейронов в органитипической культуре // Цитология. 1999. - 41. - С. 48-52.

65. Шполянский Г.М. Гирудотерапия в гинекологии // Сборник работ по военно-полевой и общей хирургии, посвященный 30-летию научной деятельности А.В. Смирнова. Л., 1944. - С. 162-164.

66. Шумкина О.Б. Развитие и метаморфоз личинки медицинской пиявки // Доклады АН СССР. 1951. - 77.-4.-С. 761-765.

67. Шумкина О.Б. Эмбриональное развитие медицинской пиявки // Труды ин-та морфологии животных им. А.Н. Северцова. 1953. - 8. - С. 216279.

68. Щеголев Г.Г. О величине, достигаемой медицинскими пиявками. К вопросу о частоте кормлений // Зоол. журн. 1945. - 24. - 5. - С. 273-276.

69. Щеголев Г.Г. Наблюдения над многократной откладкой коконов медицинскими пиявками// Зоол. журн. 1948.-27. - 1.- С. 13-16.

70. Щеголев Г.Г. Пиявки (Hirudinea) // Жизнь пресных вод СССР. М,-Л., 1949.-2.-С. 131-145.

71. Щеголев Г.Г. Наблюдения над подвижностью медицинских пиявок в водоемах // Зоол. журн. 1951. - 30. - 5. - С. 430-439.

72. Щеголев Г.Г., Щеголева З.А. Пиявки Туркменистана // Тр. Мургабской гидробиологической станции. 1951. - 1. - С. 77-102.

73. Щеголев Г.Г. Федорова М.С. Медицинская пиявка и ее применение. -М„ 1955.-67 с.

74. Щекотов Г.М. Применение пиявок при варикозном расширении вен // Военно-медицинский журнал. 1980. - 3. - С. 68.

75. Autrum Н. Hirudinea // Die Tierwelt Mitteleuropas. Leipzig, 1958. -1. - 7b. - S. 1-30.

76. Baskova I.P., Khalil S., Nartikova V.F., Paskhina T.S. Inhibition of plasma kallikrein. Kininase and kinin-like activities of preparations from the medicinal leeches// Thromb. Res. 1992. -V.15,N.67. -P.721-730.

77. Bazyluk W. Przyczynek do znajomosci fauny pijawek (Hirudinea) Podlasia // Fragm. faun. Mus. Zool. Polonici. 1957. - 6. - 6. - S. 129-133.

78. Bennike S.A. Contribution to the ecology of Danish freshwater leeches (Hirudinea).-Kobenhavvn, 1943.-P. 1-109.

79. Busing H.K., Doll W., Freytag K. Die Bakterienflora der medizinischen Blutegel// Arch.Microbiol. -1953. -V. 19 P. 52-86.

80. Dathe H. Beitrag zum Vorkommen von Hirudo medicinalis in Mitteldeutschland // Zool. Anz. 1934. - 106. - S. 94.

81. Eldor A., Orevi M., Rigbi M. The role of the leech in medical therapeutics // Blood Rev. 1996. - 10 (4). - P. 201-209.

82. Franz F. Uber den die Blutgerinnung aufhebenden Bestandteil des medizinischen Blutegels // Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol Pharmak, 1903.- 49. -S. 342-357.

83. Fields W.S. The history of leeches and hirudin // Haemostasis, 1991. -21 (S 1).-P. 3-10.

84. Fritz H., Oppitz R-H., Gebhardt M., Oppitz I., Werle I., and Marx R. Hoppe-Seyler Z. Phisiol. Chem. 1969. - V. 350. - P. 91-92.

85. Graf J. The symbiosis of Aeromonas veronii biovar sobria and H.medicinalis, the medicinal leech: a novel model for digestive tract associations// Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P. 1-7.

86. Harding W.A. A revision of the british leeches // Parasitology. -1910.-7.-P. 130-201.

87. Haycraft J.B. On the action of a secretion obtained from the medicinal leech on the coagulation of the blood // Proc Roy Soc London, 1884. 36. - P. 478-487.

88. Haycraft J.B. Uber die Einwirkung eines Sekretes des officinellen Blutegels auf die Gerinnbarkeit des Bluts // Naunyn Schmiedebergs Arch Exp Pathol Pharmak, 1884.-36. S. 478-487.

89. Hesse E. Uber einige faunistische Vorkommen aus dem Leipziger Gebiet // Zool. Anz. 1920. - 51. - S. 258.

90. Hecht G. Beitrage zur Verbreitung von Hirudo medicinalis in Deutschland//Zool. Anz. 1929.-85.-S. 105-110.

91. Herter K. Die Okologie der Hirudineer // Bronn Klassen und Ordnungen des Tierreichs. 1937. - Teil 2. - S. 321-496.

92. Hirst G.K. The effect of a polysaccharidesplitting enzyme on streptococcal infection//J.Exp.Med. 1941. -V, N 4. - P.493-505.

93. Indergand S. and Graf J. Ingested Blood Contributes to the Specificity of the Symbiosis of Aeromonas veronii Biovar Sobria and Hirudo medicinalis, the Medicinal Leech. Appl. Env. Microb. 2000. - V.66. P. 4735^741.

94. Iveson-Iveson J. Leeches in medicine // Nursing Mirror, 1978. 22.1. P.8-9.

95. Jennings J.B., and van der Lande V.M. Histochemical and bacteriological studies on digestion in nine species of leeches (Annelidia: Hirudinea)//Biol. Bull. 1967. - V.33. -P. 166-183.

96. Leake L.D. The Leeches as a scientific tool //Endeavor: 1983. 7. -P.88-93.

97. Lent C. New medical and scientific uses of the Leech // Nature. -1986.-323.-P. 494.

98. Lent С. M., Dickinson M. H. On the termination of ingestive behaviour by the medicinal leech// J. Exp. Biol. -1987. -V. 131 -P. 1-15.

99. Lent, C.M., Fliegner K.H., Freedman E., Dickinson M.H. Ingestive behavior and physiology of the medicinal leech// J. Exp. Biol. 1988. -V.137. -P.513-527.

100. Lent, С. M., Dickinson М. П., Marshall C.G. Serotonin and leech feeding behaviour: obligatory neuromodulation// Amer.Zool. 1989. -V.29. -P.1241-1254.

101. Mackay, D. R., Manders E. K., Saggers G. C., Banducci D. R., Prinsloo J., Klugman K. Aeromonas species isolated from medicinal leeches// Ann. Plast. Surg. 1999. -V. 42. -P.275-279.

102. Mann K.N. The ecology of the British freshwater leeches // J. Animal Ecology. 1955.- Vol. 24, № 1.

103. Mann K.N. Some factors influencing the distribution of freshwater leeches in Britan // Verh. Int. Ver. Limnol. 1955. - 12. - P. 582-587.

104. Munro R., Jones C., and Sawer R. Blood coagul. fibrinol.// 1991. -V.2. -P.179-184.

105. Moquin-Tandon A. Monographie de la famille des Hirudinees. -Paris, 1846.-P. 1-448.

106. Nehili M., Ilk C., Mehlhorn H., Ruhnau K., Dick W., Njayou M. Experiments on the possible role of leeches as vectors of animal and human pathogens: a light and electron microscopy study// Parasitol. Res. 1994. -V. 80. -P.277-290.

107. Payton B.W. History of Medicinal Leeching and Early Medical References // Neurobiology of the Leech. Eds. by Muller K.J., Nicholls J.G., Stent G.S.: Gold Spring Harbor lab. New York, 1981. - P. 27-33.

108. Pavlovski L.K. Pijawki (Hirudinea) // Fauna slodkowodna Polski -1936.-S. 26-176.

109. Remy P. Sangsues de Yugoslavie // Bull. Soc. Zool. France. 1937. -62.-P. 140-148.

110. Rigbi M., Levy H., Iraqi F. et al. The saliva of the medicinal leech Hirudo medicinalis: I. Biochemical characterization of the high molecular weight fraction. Comp Biochem Biophys 1987; 87. P. 567-573.

111. Rigbi M., Levy Ы., Eldor A. et al. The saliva of the medicinal leech Hirudo medicinalis: II. Ingibition of platelet aggregation and of leukocyte activity and examination of reputed anaestetic effects. Comp Biochem Physiol 1987; 88. -P. 567-573.

112. Roters F.J., Zebe E. Protease inhibitors in the alimentary tract of the medicinal leech Hirudo medicinalis: in vivo and in vitro studies// J.Comp Physiol. -1992.-V.162.-P. 85-92.

113. Sandner H. Badania nad fauna pijawek // Acta zool. et oecol. Univ. lodzoenzis. 1951. -4. - S. 5-50.

114. Sawyer R.T. Leech biology and behaviour. Oxford, 1986.

115. Sciacchitano I. Sangsues de 1 Afganistan // Contribution a l'etude de la fauna d'Afganistan. 1960. - 24. - P. 533-541.

116. Svendsen I., Boisen S., Hejgaard J. Amino acid sequence of serine protease inhibitor chymotripsin inhibitor 1 from barley // Homology with barley inhibitor 1 and leech eglin. Carlsberg Res. Commun, 1882.-47.- 1.-P. 45-53.

117. Tonkopii V., Kamenev O., Zagrebin A. A new principles of xenobiotics bioidentification in fresh water // Proceedings of International Congress on Environmental Problems of Mideterranean Region, 2002. Nicosia, North Cyprus.-P. 178-181.

118. Tonkopii V., Sherstneva L., Kamenev O. Bioidentification of pesticides in water // Proceedings of the Workshop on Monitoring, Typology, Ecological Classification and assessment of the State of Large Lakes. Joensuu, Finland, 2003.-P.36-41

119. Tonkopii V., Zagrebin A, Kamenev O., Iofina I. Ecotoxicological monitoring of surface water // Proceedings of the Workshop on Sustainable Use,

120. Management and Development of Lake Ladoga Basin. Joensuu, Finland, 2004. -P. 30-35.

121. Zick K. Zur Frage der Verbreitung des Medizinischen Blutegels (Hirudo medicinalis) in Deutschland // Zool. Anz. 96. - S. 328-330.