Экологически обоснованная биотехнология воспроизводства Hirudo medicinalis L. в лабораторных условиях

Рассадина, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экологически обоснованная биотехнология воспроизводства Hirudo medicinalis L. в лабораторных условиях
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Экологически обоснованная биотехнология воспроизводства Hirudo medicinalis L. в лабораторных условиях"

На правах рукописи

РАССАДИНА ЕКАТЕРИНА ВЛАДИМИРОВНА

ЭКОЛОГИЧЕСКИ ОБОСНОВАННАЯ БИОТЕХНОЛОГИЯ ВОСПРОИЗВОДСТВА HIRUDO MEDICINALES L. В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

Специальности: 03.00.23. - биотехнология 03.00.16 - экология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ульяновск - 2006

Работа выполнена на кафедре биологии, генетики, паразитологии и экологии Федерального Государственного Образовательного Учреждения Высшего Профессионального Образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

РОМАНОВА Елена Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

ГЕНИНГ Татьяна Петровна

кандидат биологических наук, профессор НАЗАРЕНКО Владимир Александрович

Ведущая организация: ГНУ «Всероссийский научно-

исследовательский институт гельминтологии им. К.И. Скрябина»

Защита состоится «¿д» О-Ийх 2006 года в /У— часов на заседании диссертационного совета Д-*220.0б5.01 в Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии по адресу:

432980, г. Ульяновск, Бульвар Новый Венец, 1; телефон 44-30-58.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Автореферат разослан «?«?» с^сЛ^ллнЛ 2006 г. Ученый секретарь —,

диссертационного совета Пыхтина Лидия Андреевна

Я006А GGOG

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Диссертационная работа представляет собой законченное научное исследование, содержащее результаты, полученные автором в процессе выполнения плановых научных исследований кафедры биологии, генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (по теме № 01 200 203527) в период с 2002 по 2005 годы.

По характеру изучаемых явлений диссертация относится к области биотехнологии разведения животных и экологии. Работа сочетает теоретические и практические аспекты решения проблемы разработки оптимальной по срокам и экологическим параметрам биотехнологии разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях

Актуальность темы Организм медицинской пиявки - это естественная биофабрика по производству комплекса уникальных биологически активных веществ, в которых остро нуждаются современная медицина и ветеринария - это гирудин, эглины, бделлины, гементин, брадикинины Организм медицинской пиявки вырабатывает широкий спектр ферментов' гиалу-ронидазу, дсстабилазу, оргслазу. коллагеназу, апиразу. эластазу. триглице-ридазу Все эти вещества являются биологически активными субстанциями естественного происхождения (Никонов Г.И. Баскова И П.. 1986: Баскова И П., Завалова Л Л., 1998)

Видовые особенности Hirudo medicinalis настолько уникальны, что для извлечения из организма пиявки всего комплекса биологически активных веществ не требуется затрат на вьщеление, очистку, фасовку, доставку и сами средства введения. По биологической сущности пиявки являются кровососущими эктопаразитами, и все биологически активные вещества, самопроизвольно впрыскиваются в организм больного при кровоизвлечении. Это позволяет рассматривать медицинскую пиявку как идеальный инструмент решения широкого спектра эндоэкологических проблем больного человека или животного (Савинов В А.. Кудинов В.Г. и др., 1994; Селезнев К.Г., 2003; Геращенко Л. Л., 2004).

С точки зрения экологии, пиявки являются редким исчезающим видом, занесенным в Красную книгу (RED DATA BOOK, 1983). Вылов медицинских пиявок из естественных водоемов запрещен. В XXI веке потребности медицины и ветеринарии в биологически активных субстанциях естественного происхождения будут нарастать, соответственно будут возрастать потребности в медицинских пиявках (Баскова И П., 1987; Баскова И.П.. 2001; Никонов Г.И.. Латрилль Ж.. 2002).

В России природные ресурсы медицинской пиявки практически исчерпаны и для лечения используют пиявок, выращенных на биофабриках, кото-

рос НАЦИОНЛ библиотека

рых на территории РФ всего три. Особенности технологий разведения медицинских пиявок представляют коммерческую тайну и в литературных источниках не публикуются. Биофабрики торгуют только сертифицированными взрослыми пиявками, поэтому получить для исследовательских целей пиявок на разных стадиях онтогенеза невозможно. При отсутствии медицинских пиявок в естественной природной среде, остается единственная возможность разработать собственную биотехнологию разведения пиявок (для целей НИР) в лабораторных условиях.

Цель работы - разработать ускоренную биотехнологию лабораторного разведения Я. medicinalis, основанную на биологических и экологических особенностях вида.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи:

- подбор и оптимизация технологических режимов содержания и кормления пиявок в лабораторных условиях;

- оценка роли биотических и абиотических факторов среды в биотехнологии разведения Н. medicinalis-,

- характеристика веществ, выделяемых Я. medicinalis в окружающую среду;

- подбор и оптимизация технологических режимов для полной реализации репродуктивного потенциала пиявок;

- сравнительный анализ внутривидовых различий подвидов Я. medicinalis officinalis и Я. medicinalis orientalis;

- характеристика особенностей экзогенной и эндогенной микрофлоры медицинских пиявок, выращенных в лабораторных условиях.

На защиту выносится:

- полный биотехнологический цикл ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях;

- экологически обоснованные оптимумы технологических режимов разведения, выращивания и предреализационного хранения пиявок;

- потребительская ценность вод, обработанных пиявками,-

- характеристика эндогенной и экзогенной бактериальной микрофлоры медицинских пиявок.

Научная новизна. Разработан ускоренный биотехнологический цикл разведения медицинских пиявок для целей НИР в лабораторных условиях. Подобраны оптимальные температурные режимы выращивания, размножения и хранения пиявок.

Установлено, что вода, обработанная пиявками, представляет потребительскую ценность, поскольку содержит широкий комплекс биологически активных веществ; не является токсичной, что подтверждено тестированием на белых мышах, не содержит патогенной микрофлоры, что подтверждено бактериологическими посевами.

Установлено, что для технологии лабораторного разведения наиболее подходит по своим технологическим характеристикам пиявка подвида аптекарская (Н. т. officinalis).

Выделена и охарактеризована эндогенная и экзогенная бактериальная микрофлора медицинской пиявки, исследован химический состав веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду

Практическая значимость. Разработана биотехнология разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях, которая ускоряет в 2,5 раза половое созревание пиявок по сравнению с природной средой. Созданная технология внедрена на факультете ветеринарной медицины в Ульяновской сельскохозяйственной академии. По этой технологии получены первые 800 особей, давших полноценное потомство, не уступающее по своим потребительским характеристикам пиявкам, выращенным на биофабриках. Выявлен наиболее эффективный для разведения и практического использования подвид медицинской пиявки - Н. т. officinalis, поскольку его потребительские характеристики' скорость присасывания, количество поглощенной крови, уровень смертности превосходят таковые у Н. т. orientalis.

Разработанная биотехнология разведения пиявок в лабораторных условиях делает доступными для изучения все стадии онтогенеза этого вида и позволяет получать необходимый экспериментальный материал для научно-исследовательских и учебных целей.

Апробация результатов научных исследований и публикации. Материалы исследований были представлены и обсуждались на конференциях всех уровней, в том числе на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2004). на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК' региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск. ФГОУ ВПО «УГСХА». 2005). Результаты научно-исследовательской работы обсуждались на межвузовских научных семинарах кафедры биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «УГСХА» и кафедры биоэкологии ГОУ ВПО «УлГУ» (2004. 2005)

Обьем и структура работы. Диссертация изложена на 170 страницах, включает 23 таблицы. 22 рисунка, шесть фотографий Состоит из введения, обзора литературы по изучаемой проблеме, описания объектов, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения. заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Библиография включает 346 наименований, в том числе 83 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы: цель, задачи, научная новизна и практическая значимость работы, приведены положения. выносимые на защиту, изложена структура диссертации

В первой глав« изложен аналитический обзор литературных источников по изучаемой проблеме. Подробно рассмотрены- вопросы биологии и экологические особенности Н. тесПапЫ^. поведенческие реакции, проблемы разведения в искусственных условиях, перспективы применения в медицине и ветеринарии. Дан обзор всего комплекса уникальных биологически активных веществ, вырабатываемых организмом медицинской пиявки. Рассмотрена эктопаразитарная видовая специфика и взаимоотношения в системе хозяин-паразит.

Во второй главе приведена характеристика объекта, материалов и методов проведенных исследований. Схема исследований приведена на рисунке 1 Объектом исследования являлись пиявки подвидов аптекарская и восточная. В опытах использовались пиявки, полученные и выращенные в лаборатории кафедры биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии (800 особей).

Предварительный этап исследований был посвящен поиску медицинских пиявок в водоемах Ульяновской области. В 2002-2003 тт. были обследованы водоемы Ульяновской области, где по архивным данным краеведческого музея, в довоенные годы встречались пиявки В этих районах из представителей класса пиявок были обнаружены только конские, ложноконекие и рыбьи пиявки, которые не представляют потребительской ценности.

При выполнении диссертационной работы использовались биологические, экологические, морфометрические. микробиологические и математические методы исследований.

Кормление пиявок-маток проводилось двумя способами. При первом способе кормления пиявки получали кровь в ходе естественного кровоиз-влечения. При втором способе, кормление пиявок осуществлялось свежей кровью крупного рогатого скота, полученной с бойни, по разработанной в нашей лаборатории методике. Пиявки взвешивались на электронных весах до и после кормления.

Спаривание медицинских пиявок проводилось по методике М.В Синевой (1949). Для исследования бактериальной микрофлоры использовались половозрелые пиявки. Исследовалась эндогенная микрофлора кишечника и экзогенная микрофлора кожных покровов пиявок В качестве плотных питательных сред в микробиологических исследованиях были использованы среда МПА (мясопептонный агар). - для определения общего числа аэробных бактерий, среда Эндо для определения энтеробактерий. в качестве жидкой

питательной среды был использован МПБ (мясопептонный бульон). Чистые культуры получали по стандартным методикам (Егоров НС., 1976; Ежов Г.И.. 1981; Теппер Е.З., 1993).

Родовую и видовую идентификацию проводили общепринятыми методами, используя определители М.А. Сидорова с соавторами (1995) и Берджи (1997), а также монографию В.И. Покровского (1999).

Для анализа химического состава воды отбирались пробы воды, обработанной пиявками в течение трех суток. Исследование химических элементов и соединений проводилось методами титриметрии, спектрофотометрии (спектрофотометр С-115 М-1), фотометрии (фотометр ФМ-56), фотоэлекгро-колориметрии (фотоэлсктроколоримстр ФЭК-М), рефрактометрии (рефрактометр ИРФ-4546) по общепринятым методикам (Лебедев П.Т., Усович А.Т., 1969; Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики, 2004) и в соответствии с требованиями ГОСТа (ГОСТ 4011-72; ГОСТ 18164-72; ГОСТ 18165-89, ГОСТ Р 51232-98). Выявление аминокислот проводилось с помощью автоматического анализатора аминокислот Hd-1200 Е.

Результаты исследований обрабатывались на персональном компьютере с использованием программы Microsoft Excel ХР for Windows ХР Для исследования характера связи между отдельными параметрами вычислялись } коэффициенты корреляции. Достоверность выявленных различий между

средними показателями рассчитывали по критерию Стьюдента.

Экологически обоснованная биотехнология воспроизводства ЦтШо теЛстаИг /„. в лабораторных услониих

Обследование водоемов Ульяновской области иа наличие представителей семейства С1паЯюЬс1еШ<1ае Поставка пиявок с биофабрик г Балако-во Саратовской области и п. Удельная Московский области

Роль биотических и абиотических факторов в технологии лабораторного разведения пиявок 4 Доращивание до половозрелою состояния (отработка технолог ических режимов кормления и содержания)

Подбор и оптимизация

условий срсды для роста пиявок до половозрелого состояния в

лабораторных условиях + -

Подбор условий для проведения заказных спариваний и оплодотворения

+ -

Подбор субстратов и технологических параметров среды для откладки коконов и выведения нитчаток

Доращивакие до половозре лого состояния

Выращивание до

возраста технология использования

Оптимизация технологии режима выращивания нитчаток

Анализ химического состава вод, обработанных пиявками

Оценка вод, обработанных пиявками на стерильность и токсичность

» 2

о е

у й

^ £

-е- г

О. я

г с

л*

8-9

§3

! в «г г в *

Сравнение потребительской ценности Н т опегйаЬв н Н т оШстлЬя

Исследование эндогенной и -экзогенной микрофлоры шивки

Рис.1. Схема исследований

Результаты собственных исследований и их обсуждение изложены в главе 3 В подразделе 3.1 изложены результаты подбора и оптимизации технологического режима кормления и содержания медицинских пиявок в лабораторных условиях.

На первом этапе исследований стояла задача разработать технологию кормления пиявок. Разрабатывались два варианта кормления Первый представлял собой естественное кровоизвлечение. При втором способе пиявок кормили на сгустках крови крупного рогатого скота. По результатам исследований, кормление путем естественного кровоизвлечения давало лучшие результаты. При кормлении на сгустках крови только 72,0+5,96% пиявок активно питались, у 28,0+5,96% пищевые поведенческие реакции были слабо выражены.

При кормлении отмечался каннибализм Пиявок с элементами агрессивного поведения выявлено 20,5±8,94% от числа всей популяции. Сильно искусано, сразу несколькими пиявками было в среднем 5,0±1,98% особей, доля гибели составила - 0,5±0.06% от общего числа особей в популяции.

Четко прослеживалось, что группа, кормившаяся естественным способом, по характеристическим параметрам превосходила группу, кормившуюся на сгустках крови. После первого и второго кормления у пиявок, получавших кровь путем естественного кровоизвлечения, масса тела была в 1,4 -1,5 раза выше, чем у пиявок, накормленных на сгустках крови (р<0.05). Соответственно больше и масса поглощенной крови (р<0,05).

На следующем этапе работы стояла задача исследовать влияние продолжительности голодания на кровососущую способность пиявок. Было сформировано пять опытных групп (п=30) в зависимости от продолжительности голодания (пиявки кормились с интервалом в один, два, три. четыре и пять месяцев).

Наибольшее количество крови поглощалось пиявками, находившимися в состоянии голода в течение грех месяцев - 4,58±0,33 г. Также значительное количество крови поглощалось пиявками, голодавшими в течение одного и двух месяцев, соответственно - 2,42±0,17 г и 3,27±0,16 г. Пиявки, голодавшие в течение четырех и пяти месяцев, поглощали меньшее количество крови. соответственно - 2,03±0,36 г и 2,02±0,09 г, что может свидетельствовать о развившемся истощении.

Таким образом, было установлено, что для применения пиявок в медицинских и ветеринарных целях оптимальный срок голодания не должен превышать трех месяцев.

В подразделе 3.1.1. изложены результаты исследований значимости биотических факторов среды в био1ехнологпн разведения пиявок.

В адачи данного этапа исследований входило сравнительное изучение внутрипопуляционных взаимодействий II тесЬстаЬя при различной плот-

ности посадки.

По данным отдельных литературных источников, в стеклянных сосудах объемом 3000 см3 можно содержать до 50 пиявок (Ю.Я Каменев, 2003; Д.К. Стояновский, 2002; Г И. Никонов, 1998) В ходе наших исследований было показано, что такая плотность посадки допустима только в случае молодых и голодных пиявок, чьи размеры и масса еще достаточно малы. Было установлено, что при помещении в сосуд объемом 3000 см3 тридцати и более особей проявляется угнетение их жизнедеятельности Пиявки выпускали в большом количестве кровь, слизь и другие продукты жизнедеятельности Вода в сосуде приобретала палевый цвет, поведение пиявок становилось агрессивным, активизировался каннибализм Так проявлялся эффект перенаселенности

По результатам наших исследований пиявки, содержавшиеся в количестве не более 20-25 особей, не проявляли агрессивного поведения, масса после кормления была в 1,5-1,6 раза выше, количество поглощенной крови в 2,3-3,9 раза выше, чем у пиявок, содержавшихся по 30-35 особей (р<0,05).

Каннибализм (как проявление агрессивного поведения) отмечался у мелких пиявок при групповом кормлении на сгустках крови. Эти результаты хорошо согласуются с данными ряда исследователей (Синева М.В., 1944; Щеголев Г.Г, Федорова М.С., 1955; Никонов Г.И., 1998) Нами явление каннибализма отмечалось в группах с плотностью посадки 30-35 особей и бо- * лее, при биомассе свыше 91,4-100 г в объеме 3000 см3

Важная потребительская характеристика - скорость присасывания Она в наших экспериментах составляла в среднем 2,8±0,2 мин.

Таким образом, нами было установлено, что при содержании пиявок в количестве 30-35 особей в объеме не более 3000 см проявлялось угнетение жизнедеятельности, отравление метаболитами, провоцировавшее развитие агрессии у пиявок По результатам наших исследований, нецелесообразно содержать пиявок после кормления более чем по 20 особей на один сосуд объемом 3000 см3 , суммарная масса пиявок не должна превышать 91,4-100 г в объеме 3000 см3.

Голодным или плохо накормленным маленьким (неполовозрелым) пиявкам свойственен каннибализм Наиболее вероятно проявление каннибализма после длительного периода голодания, когда пиявка истощена и ее энергетических запасов явно недостаточно, чтобы прокусить толстую кожу млекопитающих и. работая как мощный насос, накачивать кровь в желудок.

Нами было установлено, что для предотвращения каннибализма необходимо неполовозрелых пиявок кормить не реже раза в месяц, оптимально -раз в две недели. Содержать пиявок необходимо с учетом плотности посадки, общей биомассы в сосуде и степени насыщения.

В подразделе 3 1.2. изложены результаты изучения роли абиотических факторов среды при разведении пиявок в лабораторных условиях

Данный этап наших исследований был посвящен изучению влияния различных факторов среда на процесс размножения Важнейшими абиотическими факторами, влияющими на жизнедеятельность пиявок, являются влажность, температура среды обитания, свет.

В первую очередь мы изучали влияние температурного фактора на проявление полового поведения и спаривание пиявок (таблица 1) С этой целью было отобрано 120 пиявок, т е 60 потенциальных пар. Было сформировано 4 опытных группы, в каждой по 15 пар пиявок.

В первой опытной группе - пиявки содержались при температуре среды 17 - 19°С, вторая группа - при 20 - 22°С, третья группа - при 23 - 25°С. четвертая группа - при 26 - 28°С.

Таблица 1

Влияние температуры среды на репродуктивную способность пиявок

№ Температу- Количество Доля спари- Средняя про- Количество

груп ра,^ пиявок (п) вающихся должитель- спариваний у

пы особей, % ность спари- одной пары за

вания, мин сутки

I 17-19 30 13,30+1,06 8,16±0,42 1.05+0,21

II 20-22 30 32,00±1,42 17,6210,87 3,41+0,26

III 23-25 30 68,00±28,14 28Д4±0,93 4,48±0,26

IV 26-28 30 12,13±0,72 12,13±0,72 1,67±0,14

Температурный фактор в половом поведении пиявок играет важную роль Анализ полученных результатов привел к заключению, что оптимальный температурный режим для спаривания пиявок - 23-25°С.

На следующем этапе исследований подбирался температурный оптимум для откладки и развития коконов. Учитывая высокую чувствительность пиявок к температуре, мы исследовали узкий температурный диапазон 20.24 и 28°С.

Медицинские пиявки подвида аптекарские, предварительно накормленные и прошедшие период спаривания (36 особей), были помещены в маточники с торфяным субстратом (по четыре в каждый). Маточники содержали при определенном температурном режиме в течение месяца (период необходимый для откладки коконов). Маточники № 1, 2 и 3 при температуре 20°С - первая опытная серия, маточники № 4. 5 и 6 - при 24°С - вторая опытная серия, маточники № 7, 8 и 9 - при 28°С - третья опытная серия (таблица 2)

Среднее число коконов у пиявок, содержавшихся при температуре 24°С. составило 14,67+2.5 и было в пять раз больше, чем у пиявок, содер-

жавшихся при 28°С. у которых среднее число коконов - 2,7±1,4 и в два раза больше, чем у пиявок при 20°С, у которых среднее число коконов - 7+1.43 (р<0,05). Среднее число коконов у пиявок первой опытной серии было в 2,6 раза выше, чем у пиявок третьей опытной серии (р<0,05).

Изменчивость по количеству коконов у пиявок первой опытной серии составила 11,4%, второй опытной серии - 12,9%, у пиявок третьей опытной серии -10,6%.

Таблица 2

Влияние температурного режима на плодовитость пиявок

Параметры Температура среды

20°С 24°С 28°С

Количество коконов 7,00+1,43 14,67±2,50 2,70±0,40

Су, % 11,40 12,90 10,60

Таким образом, было сделано заключение, что наиболее благоприятен для протекания процессов спаривания температурный режим в 23-25°С. Оптимальная температура для откладки коконов - 24°С.

По результатам наших исследований, пиявки хуже адаптированы к перегреву (28-30°С), чем к охлаждению (17-19°С).

В подразделе 3.1 3. приведены результаты исследований химического состава веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду

По данным литературных источников (Никонов Г.И., 1998; Савинов В.А., 20026), воды в которых содержались пиявки, обладают целебными свойствами и используются в медицине и ветеринарии. Поэтому, на данном этапе работы, перед нами стояла задача исследования химического состава вод. обработанных медицинскими пиявками Было установлено, что эта воды по химическому составу радикально отличались от контроля

Концентрация биогенных элементов калия и натрия в воде, где содержались пиявки, была соответственно в 1,9 раза и в 2,6 раза выше, чем в контроле. Содержание фосфора в 1,3 раза больше, чем в контроле (р<0,05).

Из микроэлементов в воде, где содержались пиявки, были обнаружены йод, бром, сера. Содержание йода в воде, где содержались пиявки, в два раза выше; брома в 2.4 раза выше; серы в два раза выше, чем в контрольной пробе. В воде, в которой содержались пиявки, также был обнаружен селсн, в контроле этот элемент отсутствовал.

В числе метаболитов, выделяемых пиявками в воду, нами были обнаружены вещества, обладающие высокой биологической активностью: белки сыворотки крови - альбумины и глобулины, гирудин, ферменты гиалурони-даза. триглицеридаза. эластаза. апираза По результатам наших исследова-

ний, основнъм компонентом вод, в которых содержались медицинские пиявки, были аминокислоты (таблица 3).

Таблица 3

Сравнительное содержание аминокислот в плазме крови и в водах, обработанных голодными и сытыми пиявками

Аминокислота Содержание в плазме крови, мг%* Содержание в воде, обработанной голодными пиявками, мг% Содержание в воде, обработанной сытыми пиявками, мг%

аптекарские восточные аптекарские восточные

Алании 3,4103,950 0,310±0,009 0,35510,019 0,27810,019 0,314:10,011

Глутами-новая кислота 3,400 0,583Ю,075 0,69310,064 0,283Ю,012 0,44710,080

Лизин 2,7203,000 0,325±0,012 0,334+0,015 0,21210,012 0,26910,023

Валин 2,8002,880 0,181+0,007 0,19710,018 0,06710,005 0,11610,023

Аргинин 1,5102,300 0,23310,009 0,25610,010 0,11810,010 0.16110,026

Лейцин 1,6901,900 0,324±0,013 0,32910,017 0,23810,011 0,27410,012

Глицин 1,750 0,29610,008 0,32310,023 0,26010,020 0,26910,010

Изо лейцин 0,8901,600 0,21810,009 0,26110,015 0,11810,011 0,159+0,025

Тирозин 1,0301,500 0,083Ю,006 0,10210,010 0,07710,017 0,08610,005

Фекила-ланин 0,8401,400 0,11610,009 0,13810,007 0,05910,005 0,096Ю,023

Гистидин 1,1501,400 0,12610,006 0,148Ю,010 0,04410,004 0,08810,003

Триптофан 1,0001,110 0,580+0,007 0,53110,053 0,34610,013 0,463+0,076

Метионин 0,3800,850 0,07710,004 0,09210,010 0,06610,016 0,06710,007

Аспараги-новая кислота 0,28310,035 0,28910,024 0,20810,012 0,22210,023

Серии - 0,199Ю,008 0,21910,017 0,15610,014 0,168+0,026

Пролин - 0,13610,006 0,16010,009 0,06710,005 0,11610,023

Треонин - 0,10710,005 0,12410,006 0,04810,004 0,10210,002

Цисгин - 0,05210.012 0,05810.009 0,04210.012 0,077Ю,005

Оксипро-лин - 0.04710,005 0,055+0.008 0,021+0.005 0,048Ю,012

*Приметание- значения приведены по данным Д.И Гольдбер!, Е Д. Гольдберг (1980)

Всего выявлено 19 аминокислот Наиболее высокое содержание обнаружили следующие аминокислоты триптофан (0,374+0 035 мг%). глутами-новая кислота (0.359+0,034 мт%); аланин (0 248-41.012 мг%), лизии (0.244+0.012 мг%) и лейцин (0.236+0.013 мг%) Выявленный нами аминокислотный состав в водах, в которых содержались пиявки, оказался аналогичен обнаруженному в плазме крови человека (Гольдберг Д И. Гольдбсрг ЕД 1980)

Более высокое содержание всех аминокислот отмечалось в воде, обработанной голодными пиявками Это связано с особенностями физиологии медицинской пиявки Голодные пиявки чаще выделяют в воду продукты обмена, чем сытые

Наиболее высокое содержание всех аминокислот отмечалось в воде, в которой содержались представители подвида И тесИапа/м- опчЫа!^

Все выявленные ингредиенты свидетельствуют о высокой биологической ценности вод, в которых концентрируются метаболиты, выделяемые организмом Н тесИстаН.ч Учитывая высокую биологическую ценность вод. обработанных пиявками, мы провели посев этих вод на стерильность, а также провели тестирование вод на 30 белых мышах Бактериальный посев доказал, что воды, обработанные пиявками, безопасны, поскольку не содержат патогенной микрофлоры Белые мыши после инъекции вод, обработанных пиявками, выжили 100%, чувствовали себя хорошо, что свидетельствует об отсутствии токсического эффекта.

Полученные нами результаты научно обосновали применение вод, обработанных пиявками, в лечебных целях. Комплекс биологически активных веществ, выявленных нами в водах, обработанных пиявками, уникален по своему составу, поскольку содержит белки плазмы крови, незаменимые аминокислоты, ферменты, гирудин и др

В подразделе 3 2 изложены результаты ра фаботки бшлехпологии репродукции медицинских пиявок в лабораторных условиях

Добиться размножения пиявок вне естественной среды обитания очень сложно, поскольку этот процесс в природной среде регулируется множеством биотических и абиотических факторов. Размножение зависит от возраста, массы пиявки, температуры окружающей среды, наличия соответствующего партнера для спаривания, подходящего субстрата для размножения, времени последнего кормления.

Параллельно с опытами по кормлению нами были предприняты попытки отобрать материал для размножения Из числа пиявок, закупленных на биофабрике, после первого кормления было отобрано 38 особей, обладавших наибольшей массой, для спаривания. Пиявки были попарно помещены в стеклянные сосуды объемом 1000 см3, где содержались в течение месяца при температуре 23-25°С '5а весь период наблюдения спариваний не было отме-

чено. Мы пришли к заключению, что пиявки в возрасте 12 месяцев не достигли половой зрелости.

По результатам наших исследований, пиявки, закупленные на биофабрике, приступали к размножению только после третьего кормления, когда их возраст достигал 14 месяцев Их масса, на этот момент начала спариваний, в среднем составляла 10,99±0,83 г.

В группе, питавшейся посредством естественного кровоизвлечения, спаривание было отмечено у 77,7% особей, а в группе пиявок, накормленных кровью крупного рогатого скота, у 60% особей.

На следующем этапе исследований мы занимались подбором субстратов для откладки пиявками коконов. Большое влияние на откладку коконов оказывала температура, влажность, плотность среды, ее аэрация.

Пиявки были размещены в маточники для откладки коконов. Маточников было девять: в трех использовался торф, покрытый сверху листовым мхом (АтЬШе&ит прапит)\ в трех использовалась глина, также покрытая сверху мхом для поддержания постоянной влажности. В трех остальных ма-> точниках использовался влажный речной песок. Выбор сред для размноже-

ния пиявок основывался на анализе литературных источников, в которых описывались естественные водоемы, где встречались пиявки. В каждый из маточников было посажено по четыре пиявки-матки г В качестве песчаных субстратов для откладки коконов нами использо-

вались разные виды песка, встречающиеся по берегам водоемов на территории Ульяновской области: кварцевый, или речной; железистый песок аллювиального происхождения. В наших экспериментах в маточниках с глиной и песком, покрытых листовым мхом, за весь период исследований пиявки не отложили ни одного кокона. Результаты исследований показали, что глина и песок в лабораторных условиях оказались малопригодными субстратами для откладки коконов, так как вода в такой среде распределялась неравномерно. В таких субстратах невозможно было поддерживать оптимальную влажность. Кроме того, для песчаных и глинистых субстратов характерна плохая аэрация и нарушение температурной регуляции

Нами было установлено, что наилучшей средой для откладки коконов в лабораторных условиях у медицинских пиявок является торф 100% влажности, покрытый сверху дерном или листовым мхом.

В маточниках с торфом на одну пиявку в среднем приходилось - 4±0,95 кокона, на один кокон - 12,167±0,853 нитчаток. Масса кокона составляла -0,796±0,032 г, длина - 25,98±0,58 мм. Масса нитчаток в среднем -0,033^,001 г.

В подразделе 3.3. изложены результаты изучения характеристических параметров маток, коконов, иитчаток. Основной задачей искусственного разведения пиявок является получение как можно большего количества по-

томства В задачи данного этана исследований входило изучение влияния массы ииявок-маток на величину коконов и количество зародышей в них (Рис. 2.3.4.5).

Рис 2. Количество коконов в зависимости от массы материнских особей

Рис 4 Длина коконов в зависимости от массы материнских особей

Рис. 3. Масса коконов в зависимости от массы материнских особей

Рис. 5. Количество нитчаток в зависимости от массы материнских особей

Корреляционный анализ показал, что между массой пиявок-маток и количеством коконов существует достоверная положительная средняя связь (г=0,56; р<0,05). Между массой пиявок-маток и массой коконов существует достоверная положительная сильная связь (т=0,79; р<0,05). Между массой пиявок-маток и длиной коконов также существует достоверная положительная сильная связь (г=0.84; р<0,05). Между массой пиявок-маток и количеством нитчаток в коконах тоже существует достоверная положительная сильная связь (г=0,78; р<0.05).

В литературных источниках нет единого мнения о наличии зависимости между размерами коконов и количеством нитчаток в них Результаты наших исследований свидетельствуют, что между длиной коконов и количеством нитчаток в них существует достоверная положительная средняя связь (г=0,66, р<0.05) Между массой коконов и количеством нитчаток также су-

ществует достоверная положительная средняя связь (г=0,6; р<0.05) Между массой коконов и длиной коконов существует четкая линейная зависимость (р=0,95; р<0,05) (Рис. 6,7,8).

Рис. 6. Количество нитчаток в зависимости от массы кокона

Рис. 7. Количество нитчаток в зависимости от длины кокона

Рис. 8. Длина коконов в зависимости от массы Чтобы подытожить полученные результаты необходимо выделил, основное: с увеличением массы пиявок-маток увеличивается количество отложенных коконов, их масса и длина, а также количество нитчаток в коконе. Количество нитчаток также зависит от размеров кокона.

В подразделе 3.4 приведены результаты исследований роста нитчаток в зависимости от особенностей кормления. На данном этапе работы мы определяли, какой вид кормления является оптимальным для выращивания нитчаток.

Для выращивания использовались нитчатки, полученные в лабораторных условиях, только что вышедшие из коконов. Кормление осуществлялось как сгустками крови крупного рогатого скота (I группа), так и за счет естественного кровоизвлечения - на лягушках (1П группа). Также практиковалось комбинированное кормление, предполагающее проведение первых кормлений на лягушках, а последующих на сгустках крови крупного рогатого скота (II груши). В каждой из трех опытных групп было по 200 нитчаток

После первого кормления нитчаток масса у третьей и второй опытных групп была в 1,3 раза выше, чем у нитчаток первой опытной группы

(р<0.05)

Масса после второго кормления у нитчаток третьей опытной группы была в 1.4 раза выше, по сравнению с первой опытной группой У нитчаток второй опытной группы масса была в 1,3 раза выше, чем у пиявок первой опытной группы Масса нитчаток третьей опытной группы была достоверно выше, чем во второй опытной группе (р<0,05).

У нитчаток третьей опытной группы масса после третьего кормления была достоверно выше, чему нитчаток первой опытной группы (р<0,05)

После четвертого кормления масса у нитчаток первой опытной группы была в 1,3 раза выше, а у нитчаток второй опытной группы в 1.2 раза выше, чем у нитчаток третьей опытной группы (р<0.05).

После пятого кормления у питчаток первой опытной группы масса была в 1,5 рам больше, а у нитчаток второй опытной группы в 1,6 раза больше, чем у пиявок третьей группы (р<0,05)

После шестого кормления у нитчаток первой опытной группы масса была в 1.9 раз. а у нитчаток второй опытной группы в два раза выше, чем у нитчаток третьей опытной группы (р<().()5).

Аналогичные результаты получены при исследовании количества поглощенной крови.

Важным пока ¡ятслем является выживаемость пиявок после кормления Мы исследовали уровень смертности нитчаток в зависимости от технологических особенностей кормления.

Наибольший процент смертности был характерен для всех опытных групп пиявок при первом групповом кормлении. Самый высокий уровень смертности - 25% отмечался среди нитчаток, накормленных на сгустках крови крупного рогатого скота У нитчаток, получавших комбинированное кормление, или питавшихся за счет естественного кровоизвлечения на лягушках, уровень смертности составил 10% и 12,5% соответственно. Нельзя исключить, что столь высокий уровень смертности обусловлен несовершенством пищеварительной системы и населяющей ее микрофлоры у молодых пиявок

В первой группе нитчаток смертность значительно снизилась только после четвертого кормления и составила 4,8%. У пиявок второй опытной группы смертность прогрессивно снижалась и после третьего кормления составила 0,5%. У пиявок третьей опытной группы при втором и последующем кормлениях гибели не отмечалось.

В итоге, мы пришли к заключению, что лучше всего при выращивании нитчаток себя зарекомендовал комбинированный тип кормления.

В подразделе 3.5. изложены результаты подбора и оптимизации условий для роста и развития пиявок в лабораторных условиях.

Полученные в лабораторных условиях пиявки в 2.5 раза быстрее достигают срока полового созревания, чем в природе По своим потребительским

характеристикам они не уступают, выращенным на биофабрике. Возраст полового созревания у пиявок в природной среде в среднем 36 мес., у пиявок, выращенных на биофабрике - 14 мес, у пиявок, выращенных в лабораторных условиях - 10-12 мес. Возраст технологического использования у пиявок в природной среде - 12-14 мес., у пиявок, выращенных на биофабрике и в лабораторных условиях - 6-8 мес.

В подразделе 3.6. проведен сравнительный анализ потребительских характеристик Н. medicinalis officinalis и Я. medîcinaUs orientalîs.

Вид пиявка медицинская (Я medicinalis) включает три подвида: аптекарская (Я т. officinalis), лечебная (Я. т. medicinalis) и восточная (Я т. orientalîs).

На данном этапе работы перед нами стояла задача выявить из трех подвидов подвид с лучшими потребительскими характеристиками. Подвид Я т. medicinalis не исследовался, поскольку, по данным литературных источников, имел целый комплекс недостатков, по сравнению с потребительскими характеристиками Я. т. orientalis и H. т. officinalis.

Большое значение для оценки потребительских качеств медицинских пиявок имеет скорость присасывания. У H. m officinalis скорость присасывания в среднем составляла 2,2 мин., у Я т. orientalis - 3,8 мин. (р<0,05). Ко !» второму кормлению у пиявок обоих подвидов скорость присасывания воз-

растала в 1,5 раза (р<0,05).

^ Сравниваемые подвиды пиявок также отличались продолжительностью

кровоизвлечения. У Я т. officinalis продолжительность кровоизвлечения при первом кормлении составила 48,2 мин., у Я т. orientalis - 60,9 мин.

Проводилось сравнение и других показателей. Количество крови, поглощенной после первого кормления, в 1,3 раза выше, а после второго кормления в 1,5 раза выше у Я т. officinalis (р<0,05).

Оценивался процент гибели пиявок после кровоизвлечения. После первого кормления среди Я. т. officinalis не было отмечено случаев гибели, при втором кормлении - 2%, среди Я т. orientalis при первом кормлении погибло 3% особей, при втором кормлении - 5%.

В итоге, согласно полученным результатам, Я. т. officinalis по потребительским характеристикам: скорости присасывания, скорости кровоизвлечения, выживаемости после кровоизвлечения превосходит Я. т. orientalis.

В подразделе 3 .7. изложены результаты исследований состава бактериальной микрофлоры медицинских пиявок, Перед нами стояла задача исследования бактериальной микрофлоры кишечника и кожных покровов медицинских пиявок. Эти исследования проводились для того, чтобы определить является ли использование медицинских пиявок и вод, обработанных ими, в медицине и ветеринарии, безопасным с микробиологической точки зрения При изучении бактериальной микрофлоры, в пробах крови из кишечника Я. medicinalis были обнаружены Aeromonas hydrophila, Proteus mirabilis из семейства Enterobacteriaceae и неопределенные ввды семейства

Enterohacteriac eae, в пробач слизи с поверхности тела - Proteus mirabitis из семейства Fntemhacteriaceae. Staphylococcus saccharolyticus, S intermedium из семейства Khcrococcaceae.

Л hvdrophila широко распространен в водной срсдс (Barillo D.J et at ,1996: Cunningham A A et al, 1996: Lin S.H. et al, 1996) Для пиявок Л. hvdrophila является бактерией-симбионтом, постоянно обитающим в кишечном канале и обеспечивающим процессы пищеварения и бактерицидное действие пиявочного секрета

/' mirabdh является условно-патогснным, вызывая заболевания у человека и животных только в случае выхода за пределы своего нормального места обитания (кишечный тракт)

S saccharolyhcns, S intermedins имеют повсеместное распространение, но чаще всего обнаруживаются на коже и слизистых оболочках человека и животных Эти виды стафилококков при определенных условиях, как правило, при пониженном иммунитете, способны вызывать локальные гнойно-восналительныс заболевания кожи у млекопитающих

Таким образом, можно сделать заключение, что микрофлора медицинской пиявки не содержит патогенных микроорганизмов, кроме того, бактерия-симбионт Л hydrophila обладает бактериостатичсским и бактерицидным действием, поэтому медицинских пиявок можно применять в медицине и ветеринарии без риска заражения.

Заключение. В результате проведенных исследований разработан полный цикл разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях Цикл включает доращивание и откорм пиявок, закупленных на биофабрике, до половозрелого состояния; проведение заказных спариваний; размещение в маточниках для откладки коконов; отбор коконов для вывода нитчаток; выращивание нитчаток и параллельный откорм до взрослого состояния, - на этом э1Эпс цикл замыкается и повторяется вновь Каждый из этапов цикла требовал разработки соответствующих технологических режимов.

В воде, в которой содержались пиявки, нами были обнаружены органические соединения, такие как' белки сыворотки крови - альбумины и глобулины. гирудин (высокоспецифичный ингибитор тромбина), ферменты- гиа-луронидаза (облегчает проникновение в организм различных веществ, увеличивая проницаемость тканей, стенок капилляров), триглицеридаза и эласта за (обеспечивают стимуляцию белкового обмена веществ), апираза (про-тивосклеротическое действие); 19 видов аминокислот Практически все выявленные аминокислоты характерны для плазмы крови млекопитающих

Заключение фактически обобщает технологическую схему ускоренного разведения пиявок в лабораторных условиях с изложением технологических параметров каждого из этапов разведения.

ВЫВОДЫ

1 Биотехнология репродукции пиявок в лабораторных условиях требует четкого соблюдения оптимума экологических факторов' температуры, освещения, условий увлажнения, плотности посадки, субстрата для откладки коконов и др Оптимальная температура разведения - 23 - 25°Г.

2. Важным биотическим фактором среды, определяющим выживание, потребительскую ценность и репродукцию пиявок в лабораторных условиях, является плотность популяции, выраженная через биомассу на единицу объема Биомасса пиявок не должна превышать 91,4-100 г на сосуд объемом 3000 см3.

3 В числе важных метаболитов в воде, обработанной пиявками, присутствуют вещества, обладающие высокой биологической активностью' белки сыворотки крови - альбумины и глобулины, гирудин, ферменты- гиалу-ронидаза, триглицеридаза, эластаза, апирата. Вода, обработанная пиявками. не содержит патогенной микрофлоры и нетоксична

4. В числе метаболитов, выделяемых пиявками - 19 видов аминокислот. В наибольших концентрациях' триптофан (0,373±0,035 мг%), глутаминовая кислота (0,359+0,034 мг%); аланин (0,24810,012 mi%); лизин (0,244d0,012 мг%) и лейцин (0,23610,013 мг%). Кроме того, биогенные элементы - калий и натрий; микроэлементы' селен, йод, бром, сера.

5. Разработанная биотехнология лабораторного разведения позволила сократить период половою созревания пиявок в 2-2,5 раза. Основными регулирующими технологическими факторами являются частота кормлений (раз в две недели), температурный режим содержания (23-25°С), плотность посадки.

6. Оптимальная среда для откладки коконов - влажный торф, покрытый листовым мхом, при температуре 23-25°С.

7. Для заказных спариваний использовать пиявок весом не менее 18-20 г. Выявлена достоверная положительная сильная связь между весом пиявок-маток и весом коконов (г=0,79; р<0,05), длиной коконов (1-^0,84; р<0,05), количеством нитчаток в коконах (г=0,78; р<0,05), между весом и длиной коконов (г=0,95; р<0,05).

8. В условиях лабораторного разведения подвид Н. т. officinalis по потребительским характеристикам, выживаемости, скорости присасывания, скорости кровоизвлечения, количеству поглощенной крови превосходит H. т. orientalis.

9. Экзогенная микрофлора пиявок включает Proteus mirabilis из семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus saccharofyticus, S. intermedins из семейства Micrococcaceae. Эндогенная микрофлора пиявок включает Aeromonas hydrophila, P. mirabilis и неопределенные виды из семейства Enterobacteriaceae. Эти виды не являются патогенными.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1 Разработанная биотехнология лабораторного разведения пиявок, из-!а простоты и доступности значигельного сокращения (в 2,5 раза) сроков полового созревания открывает возможности разведения пиявок в местах непосредственного применения трудотерапии, те. в ветеринарных лечебницах, районных больницах, где потребности в биологическом материале относительно невелики.

2 Ускоренная биотехнология лабораторного разведения пиявок может быть рекомендована для использования в НИИ, в вузах для целей учебного процесса и проведения НИРС

3 Води, обработанные медицинскими пиявками, содержат комплекс биологически активных веществ, включающий белки плазмы крови, незаменимые аминокислоты, противовоспалительные, обезболивающие вещества, биогенные элементы, микроэлементы Они не представляют биологической опасности, поскольку, нетоксичны и не содержат патогенной микрофлоры Все это позволяет рекомендовать воды, обработанные пиявками, для использования в лечебных целях.

4 По комплексу потребительских характеристик (скорости присасывания, скорости кровоизвлечения, количеству поглощенной крови, выживаемости) пиявки подвида аптекарская (// т о/АапаНь) проявили себя лучше других, и могут быть рекомендованы для преимущественного разведения в лабораторных условиях.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Рассадина Е.В. Особенности поведения медицинской пиявки в условиях искусственного разведения / Е.В. Рассадина, Е.М. Романова // Проблемы экологии и охраны пргфоды. Пути их решения: Мат. Все-росс. научно-практ. конф. - Ульяновск: УлГУ, 2003. - С. 116 -119.

2. Рассадина Е.В. Нормальный микробиоценоз медицинской пиявки Hirudo medicinalis / Е.В. Рассадина, Е.М. Романова II Проблемы экологии и охраны природы. Пути их решения: Мат. П Всеросс. научно-практ. конф. - Ульяновск: УлГУ, 2004. - С. 155 - 158.

3. Рассадина Е.В. Особенности группового поведения Hirudo medicinalis in vitro / E.B. Рассадина, Е.М. Романова // Региональные проблемы народного хозяйства: Мат. Всеросс. научно-практ. конф. - Ч. 1. - Ульяновск; 2004. - С. 311 - 351.

4. Рассадина Е.В. Влияние абиотических факторов среды на процесс выхода из коконов медицинских пиявок (Hirudo medicinalis) / Е.В. Рассадина, Е.М. Романова // Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека: Мат. П Всеросс. научной конф. Ульяновск: УлГУ, 2005. - С. 97.

5. Романова Е.М. Особенности биологии медицинской пиявки Hirudo medicinalis / Е.М. Романова, Е.В. Рассадина // Актуальные проблемы ветеринарной медицины: Мат. между нар. научно-практ. конф. - Т.1. -Ульяновск, 2003.-С. 153-155.

6. Романова Е.М. Прикладные аспекты использования лечебных свойств Hirudo medicinalis / Е.М. Романова, Е.В. Рассадина // Актуальные проблемы и перспективы развития ветеринарии и зоотехнии: Сб. науч. тр. - Самара, 2003. - С. 42 - 43.

7. Романова Е.М. Особенности внутрипопуляционных взаимоотношений Hirudo medicinalis при разведении in vitro / Е.М. Романова, Е.В. Рассадина, А.В. Ионова, Е.Г. Недвига // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Мат. Всеросс. научно-практ. конф. - Ч. V. Актуальные вопросы ветеринарной медицины, биологии и экологии. - Ульяновск, 2005. - С. 261 - 266.

Подписано в печать 23.03.06_г Формат 60x841/16

Бумага типографская. №1 Ризограф УГСХА. Усл.печ.л 1,0 Заказ 538 Тираж 100 экз. 432980, г. Ульяновск, бульвар Новый Венец, 1

esoG 6 6 0 6

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Рассадина, Екатерина Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Аналитический обзор литературы по изучаемой проблеме

1.1. Биология представителей вида Hirudo medicinalis L.

1.1.1. Морфология и физиология

1.1.2. Пищеварительная и выделительная системы

1.1.3. Нервная система и органы чувств

1.1.4. Репродуктивная система и особенности размножения

1.2. Экологические особенности вида

1.2.1. Характеристика среды обитания

1.2.2. Ареал медицинской пиявки в России и на сопредельных территориях

1.2.3. Этологические особенности и механизмы поведенческих реакций

1.3. Технологии промышленного разведения Hirudo medicinalis

1.3.1. Технологические аспекты содержания и кормления

1.3.2. Биотехнология размножения пиявок

1.4. Значение Hirudo medicinalis для медицины и ветеринарии

1.4.1. Характеристика биологически активных веществ, вырабатываемых пиявками

1.4.2. Биопрепараты на основе веществ, вырабатываемых организмом медицинской пиявки

1.4.3. Применение медицинских пиявок в медицине и ветеринарии

Глава 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика объекта исследования

2.2. Технологические приемы кормления и выращивания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях

2.3. Исследование веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду

2.3.1. Анализ спектра органических и неорганических метаболитов

2.3.2. Исследование аминокислотного состава

2.4. Разведение Hirudo medicinalis

2.5. Исследование микрофлоры Hirudo medicinalis

Глава 3. Результаты исследований и обсуждение

3.1. Подбор и оптимизация технологического режима кормления и содержания Hirudo medicinalis в лабораторных условиях

3.1.1. Значимость биотических факторов в биотехнологии разведения пиявок

3.1.2. Роль абиотических факторов среды при разведении пиявок

3.1.3. Химический состав веществ, выделяемых пиявками в окружающую среду

3.2. Размножение медицинских пиявок

3.3. Характеристические параметры маток, коконов, нитчаток

3.4. Рост нитчаток в зависимости от особенностей кормления

3.5. Рост и развитие взрослых медицинских пиявок

3.6. Сравнительный анализ внутривидовых различий Н. medicinalis officinalis и Н. medicinalis orientalis при разведении in vitro

3.7. Особенность видового состава бактериальной микрофлоры Hirudo medicinal is

3.7.1.Микрофлора кишечника

3.7.2. Микрофлора кожных покровов 126 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 130 ВЫВОДЫ 137 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 139 БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК 140 ПРИЛОЖЕНИЯ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

ФГОУ ВПО «УГСХА» - Федеральное Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»;

ГОУ ВПО «УлГУ» - Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального Образования «Ульяновский государственный университет»;

КРС — крупный рогатый скот;

НИР — научно-исследовательская работа;

БАВ — биологически активные вещества;

МПА - мясопептонный агар;

МПБ - мясопептонный бульон;

Cv — коэффициент вариации.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экологически обоснованная биотехнология воспроизводства Hirudo medicinalis L. в лабораторных условиях"

Общая характеристика работы. Диссертационная работа представляет собой законченное научное исследование, содержащее результаты, полученные автором в процессе выполнения плановых научных исследований кафедры биологии, генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» (по теме № 01.200.203527) в период с 2002 по 2005 годы.

Актуальность темы. В настоящее время медицинские пиявки широко используются для лечения человека и сельскохозяйственных животных, сформировалась самостоятельная область медицины — гирудотерапия, которая успешно развивается (Жаров Д.Г., 2003).

Организм медицинской пиявки - это, по сути, естественная биофабрика по производству целого комплекса уникальных биологически активных веществ, в которых остро нуждаются современная медицина и ветеринария — это гирудин, эглины, бделлины, гементин, брадикинины. Организм медицинской пиявки также вырабатывает широкий спектр ферментов: гиалуронидазу, дестабилазу, оргелазу, коллагеназу, апиразу, эластазу, триглицеридазу. Все эти вещества являются биологически активными субстанциями естественного происхождения. Их значимость для медицины и ветеринарии трудно переоценить (Никонов Г.И., Баскова И.П., 1986; Бас-кова И.П., Завалова Л.Л., 1998; Никонов Г.И., 1998; Савинов В.А., Чистов А.В., 2001).

Видовые особенности Н. medicinalis настолько уникальны, что для извлечения из организма пиявки всего комплекса биологически активных веществ не требуется затрат на выделение, очистку, фасовку, доставку и сами средства введения. По биологической сущности пиявки являются кровососущими эктопаразитами, и все биологически активные вещества самопроизвольно впрыскиваются в организм больного при кровоизвлече-нии. Это позволяет рассматривать медицинскую пиявку как идеальный инструмент решения широкого спектра эндоэкологических проблем больного человека или животного (Савинов В.А., Кудинов В.Г. и др., 1994; Селезнев К.Г., 2003; Геращенко Л.Л., 2004).

В XXI веке потребности медицины и ветеринарии в биологически активных субстанциях естественного происхождения будут нарастать, соответственно будут возрастать потребности в медицинских пиявках (Бас-кова И.П., 2001; Никонов Г.И., Латрилль Ж., 2002).

В Российской Федерации природные ресурсы медицинской пиявки также практически исчерпаны и для медицины и ветеринарии используют пиявок, выращенных на биофабриках, которых на территории РФ всего три. Особенности технологий разведения медицинских пиявок представляют коммерческую тайну и в литературных источниках не публикуются. Биофабрики торгуют только сертифицированными взрослыми пиявками, поэтому получить для исследовательских целей пиявок на разных стадиях онтогенеза с биофабрик невозможно. При отсутствии медицинских пиявок в естественной природной среде остается единственная возможность разработать собственную биотехнологию разведения пиявок (для целей НИР) в лабораторных условиях.

Цель и задачи исследования.

Цель работы - разработать ускоренную биотехнологию лабораторного разведения Н. medicinalis, основанную на биологических и экологических особенностях вида.

В соответствии с этой целью решались следующие задачи: подбор и оптимизация технологических режимов содержания и кормления пиявок в лабораторных условиях; оценка роли биотических и абиотических факторов среды в биотехнологии разведения Н. medicinalis', характеристика веществ, выделяемых Н. medicinalis в окружающую среду; подбор и оптимизация технологических режимов для полной реализации репродуктивного потенциала пиявок; сравнительный анализ внутривидовых различий подвидов Н. medicinalis officinalis и Н. medicinalis orientalise характеристика особенностей экзогенной и эндогенной микрофлоры медицинских пиявок, выращенных в лабораторных условиях. На защиту выносится: полный биотехнологический цикл ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях; экологически обоснованные оптимумы технологических режимов разведения, выращивания и предреализационного хранения пиявок; потребительская ценность вод, обработанных пиявками; характеристика эндогенной и экзогенной бактериальной микрофлоры медицинских пиявок.

Практическая значимость. Разработана биотехнология ускоренного разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях, она внедрена в Ульяновской сельскохозяйственной академии. По этой технологии получены первые 800 особей, давших полноценное потомство, не уступающее по своим свойствам пиявкам, выращенным на биофабриках и в природной среде (См. табл. 16). Выявлен наиболее эффективный для разведения и практического использования подвид медицинской пиявки - Н. т. officinalis, поскольку его потребительские характеристики: скорость присасывания, количество поглощенной крови, уровень смертности превосходят таковые у Н. т. orientalis.

Апробация результатов научных исследований. Материалы исследований были представлены и обсуждались на конференциях различных уровней, в том числе на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых «Региональные проблемы народного хозяйства» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2004), на Всероссийской научно-практической конференции «Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы» (Ульяновск, ФГОУ ВПО «УГСХА», 2005). Результаты научно-исследовательской работы обсуждались на межвузовских научных семинарах кафедры биологии, ветеринарной генетики, паразитологии и экологии ФГОУ ВПО «УГСХА» и кафедры биоэкологии ГОУ ВПО «УлГУ» (2004, 2005).

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано семь работ.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 170 страницах, включает 23 таблицы, 22 рисунка, шесть фотографий. Состоит из введения, обзора литературы по изучаемой проблеме, описания объектов, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, библиографического списка и приложений. Библиография включает 346 наименований, в том числе 83 на иностранных языках.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Рассадина, Екатерина Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Биотехнология репродукции пиявок в лабораторных условиях требует четкого соблюдения оптимума экологических факторов: температуры, освещения, условий увлажнения, плотности посадки, субстрата для откладки коконов и др. Оптимальная температура разведения — 23-25°С.

2. Важным биотическим фактором среды, определяющим выживание, потребительскую ценность и репродукцию пиявок в лабораторных условиях, является плотность популяции, выраженная через биомассу на единицу объема. Биомасса пиявок не должна превышать 91,4-100 г на сосуд объемом 3000 см3.

3. В числе важных метаболитов, выделяемых пиявками в окружающую среду, вещества, обладающие высокой биологической активностью: белки сыворотки крови - альбумины и глобулины, гирудин, ферменты: гиалуронидаза, триглицеридаза, эластаза, апираза.

4. В числе метаболитов, выделяемых пиявками - 19 видов аминокислот. В наибольших концентрациях: триптофан (0,373±0,035 мг%); глу-таминовая кислота (0,359±0,034 мг%); аланин (0,248±0,012 мг%); лизин (0,244±0,012 мг%) и лейцин (0,236+0,013 мг%). Кроме того, биогенные элементы - калий и натрий, а также фосфор и микроэлементы: селен, йод, бром, сера.

5. Разработанная биотехнология лабораторного разведения позволила сократить период полового созревания пиявок в 2-2,5 раза. Основными регулирующими технологическими факторами являются частота кормлений (раз в две недели), температурный режим содержания (23-25°С), плотность посадки.

6. Оптимальная среда для откладки коконов — влажный торф, покрытый листовым мхом, при температуре 23-25°С.

7. Для заказных спариваний рекомендуется использовать пиявок массой не менее 18-20 г. Выявлена достоверная положительная сильная связь между массой пиявок-маток и массой коконов (г=0,79; р<0,05), между массой пиявок-маток и длиной коконов (г=0,84; р<0,05), между массой пиявок-маток и количеством нитчаток в коконах (г=0,78; р<0,05), между массой и длиной коконов (г=0,95; р<0,05).

8. Подвид Н. medicinalis officinalis по потребительским характеристикам: скорости присасывания, скорости кровоизвлечения, выживаемости после кровоизвлечения, количеству поглощенной крови превосходит Н. medicinalis orientalis.

9. Экзогенная микрофлора пиявок включает Proteus mirabilis из семейства Enterobacteriaceae, Staphylococcus saccharolyticus, S. intermedins из семейства Micrococcaceae. Микрофлора кишечника пиявок включает Aeromonas hydrophila, P. mirabilis и неопределенные виды из семейства Enterobacteriaceae. Эти виды не являются патогенными, A. hydrophila обладает бактерицидным действием, поэтому применение пиявок в лечебных целях безопасно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработанная биотехнология лабораторного разведения пиявок, из-за простоты и доступности, значительного сокращения (в 2,5 раза) сроков полового созревания открывает возможности разведения пиявок в местах непосредственного применения гирудотерапии, т.е. в ветеринарных лечебницах, районных больницах, где потребности в биологическом материале относительно невелики.

2. Ускоренная биотехнология лабораторного разведения пиявок может быть рекомендована для использования в НИИ, в вузах для целей учебного процесса и проведения НИРС.

3. Воды, обработанные медицинскими пиявками, содержат комплекс биологически активных веществ, включающий белки плазмы крови, незаменимые аминокислоты, противовоспалительные, обезболивающие вещества, биогенные элементы, микроэлементы. Они не представляют биологической опасности, поскольку, нетоксичны и не содержат патогенной микрофлоры. Все это позволяет рекомендовать воды, обработанные пиявками, для использования в лечебных целях.

4. По комплексу потребительских характеристик (скорости присасывания, скорости кровоизвлечения, количеству поглощенной крови, выживаемости) пиявки подвида аптекарская (Н. т. officinalis) проявили себя лучше других, и могут быть рекомендованы для преимущественного разведения в лабораторных условиях.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований нами был разработан полный цикл разведения медицинских пиявок в лабораторных условиях. Цикл включает: доращивание и откорм пиявок, закупленных на биофабрике, до половозрелого состояния; проведение заказных спариваний; размещение в маточниках для откладки коконов; отбор коконов для вывода нитчаток; доращивание нитчаток и параллельный откорм до взрослого состояния, -на этом этапе цикл замыкается и повторяется вновь. Каждый из этапов цикла требовал разработки соответствующих технологических режимов.

II этап проведения заказных спариваний

I этап доращивания и откорма пиявок до половозрелого состояния

V этап выращивания и откорма нитчаток

III этап репродукции в маточниках для откладки коконов

IV этап отбора коконов для вывода нитчаток

Рис. 22. Биотехнологический цикл разведения медицинской пиявки в лабораторных условиях Этап доращивания и откорма пиявок до половозрелого состояния потребовал изучения условий, необходимых и достаточных для комфортного содержания пиявок в группах в определенных объемах жидкости. Для этого этапа было важно определить объемы сосудов с водной средой и количество особей в них, чтобы не сработал эффект перенаселенности, приводящий к угнетению жизнедеятельности и гибели животных. По результатам наших исследований было показано, что необходимыми и достаточными условиями в данном случае являются: стеклянные сосуды объемом 3000 кубических сантиметров с объемом жидкости не менее 2000 кубических сантиметров. В них можно комфортно размещать не более 2025 особей пиявок, общей биомассой не более 91,4-100 г. Для данного этапа были разработаны технологические приемы искусственного вскармливания пиявок на сгустках крови крупного рогатого скота, помещенных в мешки из нетканого синтетического материала с диаметром отверстий не более 0,1 мм. Для этапа доращивания и откорма важно было установить оптимальный температурный режим. По результатам наших исследований температурный оптимум содержания пиявок в лабораторных условиях с целью доращивания и откорма находится в узком диапазоне 23-25°С.

Этап проведения заказных спариваний является очень ответственным, поскольку от подбора пар зависит количество и качество потомства. Нами было установлено, что количество коконов и количество нитчаток в них, а также вес нитчаток достоверно коррелирует с массой родительских особей. Было установлено, что связь между массой пиявок-маток и массой коконов (г=0,79; р<0,05), между массой пиявок-маток и длиной коконов (г=0,84; р<0,05), между массой пиявок-маток и количеством нитчаток в коконах (г=0,78; р<0,05), между массой и длиной коконов (г=0,95; р<0,05).

Поэтому было сделано заключение, что в условиях лаборатории для проведения заказных спариваний необходимо подбирать пиявок с массой не менее 18 г, чтобы получить качественный приплод.

В естественной природной среде пиявки начинают размножаться в возрасте двух-трех лет. Перед нами стояла задача сократить этот период. Было установлено, что решающую роль в сокращении сроков полового созревания играют два фактора — частота кормления и температура содержания. Эмпирическим путем было установлено, что в условиях лаборатории при частоте кормления один раз в две недели и температуре содержания 23-25°С можно достичь полового созревания пиявок в возрасте 8-14 месяцев. Основными факторами, стимулирующими размножение пиявок, были частота кормлений (до достижения возраста восьми месяцев пиявок кормили два раза в месяц, затем - один раз в месяц) и температура содержания пиявок-маток, которая должна поддерживаться на уровне 23-25°С.

Этап репродукции в маточниках для откладки коконов потребовал изучения субстратов, способных обеспечить откладку наибольшего количества коконов; исследование абиотических факторов, влияющих на процесс откладки коконов и развитие в них зародышей. Лимитирующими экологическими факторами на этом этапе являлись: влажность, температура и характерные особенности субстрата.

По результатам наших исследований, лучшим из трех видов возможных субстратов (торф, глина, песок), в лабораторных условиях для откладки коконов медицинскими пиявками явился торф 100% влажности, покрытый листовым мхом. Было установлено, что оптимальной температурой для откладки коконов в лабораторных условиях является температура 24°С, при которой при прочих оптимальных условиях можно получить 14,67±2,5 коконов на один маточник.

Этап отбора коконов для вывода нитчаток требовал выработать критерии оценки готовности нитчаток к выходу из зародышевых оболочек, и подобрать оптимальные экологические условия, обеспечивающие выживание потомства.

Прежде всего, стояла задача отобрать только те коконы, где нитчатки уже сформировались и были готовы к смене среды обитания, т.е. созрели для самостоятельного существования в водной среде. Эмпирически было установлено, что окончание зародышевого развития можно определить по положению пиявок-нитчаток в коконе. Когда нитчатки были готовы к выходу из зародышевых оболочек, они группировались на одном из полюсов кокона в виде компактного темного, почти черного клубка, видимого в проходящем свете.

Для выживания нитчаток при выходе из коконов необходима 100% влажность и температура - 23-25°С. Наиболее благоприятными видами субстратов для выхода пиявок из коконов оказался торф и песок 100% влажности. Менее приемлемым субстратом была глина, в воздушной среде нитчатки из коконов не выходили и погибали.

Этап выращивания нитчаток и параллельного откорма до взрослого состояния включал подбор технологических условий кормления на ранних этапах онтогенеза, обеспечивавших наименьшие численные потери.

Технологически трудно проводить искусственное вскармливание микроскопически мелких нитчаток на сгустках крови крупного рогатого скота, т.к. из-за малых размеров объекта их трудно собрать для кормления, а потом, после кормления поместить обратно в сосуд, не повредив и не потеряв. Именно на этом этапе технологического цикла происходят наиболее значимые потери численности популяции. Чтобы избежать потерь, нитчаток из сосудов, в которых они содержались, сливали в мешочки из тонкого нетканого материала и помещали на сгустки крови крупного рогатого скота. По окончании процедуры кормления мешочки с нитчатками отмывали от остатков крови в воде и открывали в сосудах для содержания нитчаток. Аналогично проводились все последующие кормления, пока нитчатки не достигали массы 0,5 г, при которой риск их потерять при кормлении сводился до минимума.

Не менее важным было определить временные интервалы между кормлениями для разных возрастных и потребительских групп Н. medicinalis. Было установлено, что для пиявок, выращиваемых для применения в практической медицине и ветеринарии, оптимальный срок голодания - три месяца, после такого промежутка времени пиявки поглощали наибольшее количество крови. Пиявки-матки, выращиваемые для целей лабораторного разведения, должны кормиться ежемесячно. Выращиваемая молодь медицинской пиявки должна кормиться с интервалом в две недели.

При сравнении трех типов кормления: 1- кровью крупного рогатого скота, 2 - комбинированного, сочетавшего кормление на лягушках (три первых кормления) и на крови крупного рогатого скота (все последующие кормления), 3 - на лягушках. Лучше других зарекомендовал себя комбинированный тип кормления. Для него было характерно большее количество поглощенной крови, более высокая скорость роста и наименьший процент гибели.

В нашей работе было проведено сравнение потребительской ценности и пригодности для разведения в лабораторных условиях двух подвидов медицинской пиявки - Н. т. officinalis и Н. т. orientalis.

По комплексу потребительских характеристик пиявки подвида аптекарская {Н. т. officinalis) более предпочтительны для разведения и для применения в лечебных целях, чем пиявки подвида восточная (Н. т. orientalis).

Н. т. officinalis в 1,8 раза быстрее присасывались, чем Н. т. orientalis (р<0,05), продолжительность периода кровососания больше у пиявок подвида восточная. Количество поглощенной после первого кормления крови в 1,3 раза выше, а после второго кормления в 1,5 раза выше у пиявок подвида аптекарская, чем у пиявок подвида восточная (р<0,05).

В теоретическом плане важным разделом нашей работы была характеристика особенностей экзогенной и эндогенной микрофлоры медицинских пиявок, выращенных в лабораторных условиях. Кишечная микрофлора Н. medicinalis включала бактерии родов Aeromonas (вид A. hydrophila) и Proteus (вид P. mirabilis) из семейства Enterobacteriaceae. Микрофлора кожных покровов пиявки содержала бактерии рода Staphylococcus (виды S. saccharolyticus и S. intermedius) из семейства Micrococcaceae и Proteus (вид P. mirabilis) из семейства Enterobacteriaceae.

A. hydrophila - постоянный обитатель кишечного тракта пиявки находится с ней в симбиотических отношениях, эти микроорганизмы участвуют в процессах пищеварения и обеспечивают бактериостатическое и бактерицидное действие пиявочного секрета. Благодаря бактериостатиче-скому и бактерицидному действию пиявочного секрета, инфицирования животных и человека при укусе медицинской пиявки не происходит.

Пиявки являются представителями древнейших форм животного мира нашей планеты. Они выжили благодаря эволюционно сложившемуся симбиозу пиявок и микроорганизмов, который обеспечил этих эктопаразитов уникальным механизмом кровоизвлечения, при котором «хозяину» не только не наносится вред, но и в его организм вводится комплекс полезных биологически активных веществ, в выработке которых принимает участие симбионтная микрофлора. По данным литературных источников (Баскова И.П., Черкесова Д.У., 1980; Никонов Г.И., 1992; Савинов В.А., Кудинов В.Г., Сидоренко А.П., 1994; Селезнев К. Г., 2001; Никонов Г.И., Латрилль Ж., 2002), пиявки при кровоизвлечении впрыскивают в организм млекопитающих секрет, содержащий гирудин, бделлины, эглины, гиалу-ронидазу, дестабилазу, апиразу, эластазу, триглицеридазу, оргелазу и другие биологически активные вещества.

Мы предположили, что эти же вещества могут выделяться пиявками в водную среду, в которой они содержатся, наряду с другими метаболитами. С этой целью исследовалась вода, в которой содержались пиявки.

В воде, в которой содержались пиявки, нами были обнаружены органические соединения, такие как: белки сыворотки крови — альбумины и глобулины, гирудин (высокоспецифичный ингибитор тромбина), ферменты: гиалуронидаза (облегчает проникновение в организм различных веществ, увеличивая проницаемость тканей, стенок капилляров), триглице-ридаза и эластаза (обеспечивают стимуляцию белкового обмена веществ), апираза (противосклеротическое действие); 19 видов аминокислот. Практически все выявленные аминокислоты характерны для плазмы крови млекопитающих.

Концентрация биогенных элементов, в частности калия и натрия в воде, где содержались пиявки соответственно в 1,9 раза и в 2,6 раза выше, чем в контрольной пробе. Содержание фосфора было выше в 1,3 раза, чем в контроле (р<0,05).

Было установлено, что в воде снижается массовая доля нитратов и общая жесткость, кроме того, снижается концентрация общего железа, минеральных азотсодержащих веществ, марганца, цинка.

Из микроэлементов в воде, где содержались пиявки, были обнаружены йод, бром, сера, селен. Содержание йода в воде, где содержались пиявки, в два раза выше; брома в 2,4 раза выше; серы в два раза выше, чем в контрольной пробе (р<0,05), а селен в контрольной пробе не был обнаружен. Спектр содержащихся в воде веществ гораздо шире, однако, выявление их требует более совершенных методик.

Все выявленные ингредиенты свидетельствуют о высокой биологической ценности вод, в которых концентрируются метаболиты, выделяемые организмом Н. medicinalis.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Рассадина, Екатерина Владимировна, Ульяновск

1. Авдеева Н.И. Изменения ультраструктуры и биоэлектрической активиости клетки Ретциуса медицинской пиявки при сииаптическом и прямом раздражении / Н.И. Авдеева, И.С. Базапова // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1974.-Т. 60. -№ 10.-С. 1526-1530.

2. Агакишев Д.Д. К применению гирудотерапии в медицинской практике / Д.Д. Агакишев, Ш.Г. Абдуллаев, М.М. Джавадзаде // Вестник дерматологии и венерологии. 1993. - № 4. - С. 68-72.

3. Акимушкин И.И. Проблемы этологии / И.И. Акимушкин. М.: Молодая гвардия, 1985.- 191 с.

4. Акимушкин И.И. Мир животных: Беспозвоночные. Ископаемые животные / И.И. Акимушкин. М.: Мысль, 1999. - 384 с.

5. Акоев Г.Н. Электрофизиологическое и электронпомикроскопическое исследование электрической связи между гигантскими нервными клетками пиявки

6. Hirudo medicinalis / Г.Н. Акоев, П.О. Макаров, Б.С. Тучков // Нервная система.1975.-Вып. 15.-С. 92-96.

7. Аксенова О.П. Влияние дипитрофепола на парные гигантские клетки в центральной нервной системе пиявки / О.П. Аксенова, В.Ф. Антонов, О.Д. Те-решков // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1973. - Т. 59. - № 3. -С. 407-413.

8. Алибеков М.А. Пиявка в полости рта у ребенка / М.А. Алибеков, Г.Н. Нематов // Медицинский журнал Узбекистана. 1975. - № 6. - С.83.

9. П.Ахматова Р.Н. Опыт применения гирудотераиии при гинекологических и других заболеваниях / Р.Н. Ахматова. М.: Асклепейон, 1993. - 46 с.

10. Варне Р. Беспозвоночные: Новый обобщенный подход / Р. Варне, П. Кей-лоу, П. Олив, П. Голден. М.: Мир, 1992. - 583 с.

11. Барсова Е.В. Клонирование генов дестабилазы из медицинской пиявки и их экспрессия в гетерологических системах: Автореф. дис. канд. биол. наук. 03.00.03 / Е.В. Барсова М., 1996 - 19 с.

12. Баскова И.П. Биологически активные вещества, продуцируемые медицинской пиявкой (Hirudo medicinalis), и механизмы их действия / И.П. Баскова: Автореф. дис. д-ра биол. наук М., 1988. - 46 с.

13. Баскова И.П. Белки системы гомеостаза / И.П. Баскова // Белки и пептиды. М.: Наука, 1995. - С. 397-433.

14. Баскова И.П. Предисловие / И.П. Баскова // Практическая и экспериментальная гирудология: итоги за десятилетие: Сб. ст. Люберцы, 2001. - С. 4.

15. Баскова И.П. Исцеляющий укус / И.П. Баскова, Л.Л. Завалова // Химия и жизнь XXI век. - 1998. - № 9-10. - С. 30-34.

16. Баскова И.П., Завалова Л.Л. Ингибиторы протеолитических ферментов медицинской пиявки (.Hirudo medicinalis) / И.П. Баскова, Л.Л. Завалова // Биохимия. 2001. - Т. 66. - Вып. 7. - С. 869-883.

17. Баскова И.П. Дестабилаза фермент секрета слюнных желез медицинских пиявок гидролизует изопептидные связи в стабилизированном фибрине / И.П. Баскова, Г.И. Никонов // Биохимия. - 1985. - Т. 50. - № 3. - С. 424-431.

18. Баскова И.П. Обнаружение простагландинов в препаратах из медицинских пиявок (Hirudo medicinalis) / И.П. Баскова, Г.И. Никонов // Доклады АН СССР. -1987. Т. 292. - № 6. - С. 1492-1493.

19. Баскова И.П. Механизмы регуляции гемостаза и фибринолиза секретом слюнных желез медицинской пиявки / И.П. Баскова, Г.И. Никонов // Биохимия животных и человека. 1991. - Вып. 15. - С .28-39.

20. Баскова И.П. Влияние преператов из медицинских пиявок на показатели атерогенеза / И.П. Баскова, Г.И. Никонов, В.В. Долгов и др. // Кардиология. -1989. Т. 29. - № 5. - С. 75-79.

21. Баскова И.П. Механизмы ипгибирования сосудисто-тромбоцитарного гемостаза секретом слюнных желез медицинских пиявок Hirudo medicinalis / И.П. Баскова, Г.И. Никонов, А.В. Мазуров и др. // Биохимия. 1987. - Т. 52. - № 9. -С.1461-1468.

22. Баскова И.П. Влияние препарата из медицинских пиявок (.Hirudo medicinalis) на фагоцитоз и систему комплемента / И.П. Баскова, Г.И. Никонов, Э.Г. Миркамалова и др. // Казанский медицинский журнал. 1988. - Т. 69. - № 5. - С. 334-336

23. Баскова И.П. Липазная и холестерол эстеразная активность секрета слюнных желез медицинских пиявок / И.П. Баскова, Г.И. Никонов, Г.И. Юсупова // Биохимия. 1984. - Т. 49. - № 4 - С. 676-678.

24. Баскова И.П. Влияние секрета слюнных желез медицинских пиявок Hirudo medicinalis на внешний и внутренний механизмы свертывания крови / И.П. Баскова, С. Халиль, Г.И. Никонов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1984. - № 8. - С. 142-143.

25. Баскова И.П. Сравнительная характеристика гирудина из цельных пиявок, головок и туловища / И.П. Баскова, Д.У. Черкесова // Биохимия. 1980. - Т. 45. -№2.-С. 266-271.

26. Березовская И.В. Изучение общетоксического действия пиявита / И.В. Березовская, В.И. Рымарцев, В.В. Тычинин, Л.В. Ахабадзе // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 2. - Люберцы, 2003. - С. 51-55.

27. Беритов И.С. О возбуждении и торможении рефлекторных реакций у пиявки / И.С. Беритов // Труды Тбилисского гос. ун-та. 1945. - Т. 27. - С. 29-52.

28. Беритов И.С. О спонтанной активности в нервных узлах брюшной цепочки пиявки / И.С. Беритов, М.В. Гогава // Журнал общей биологии. 1940. -Т. И.-С. 20-30.

29. Беритов И.С. О координации сегментарных рефлекторных реакций у пиявки / И.С. Беритов, М.В. Гогава // Труды Тбилисского гос. ун-та. 1945. - Т. 27. -С. 1-27.

30. Брауде Г.Л. Наблюдения над осеменением у медицинской пиявки / Г.Л. Брауде // Доклады АН СССР. 1948. - Т. 63. - № 3. - С. 3-8.

31. Брауде Г.Л. О топографической анатомии полового аппарата медицинской пиявки / Г.Л. Брауде // Доклады АН СССР. 1950. - Т. 70. - № 2. - С. 307-310.

32. Брауде Г.Л. Наблюдения над развитием зубов у медицинской и ложнокон-ской пиявок / Г.Л. Брауде // Доклады АН СССР. 1951. - Т. 79. - № 6. - С. 1041— 1044.

33. Брыков И. Руководство к разведению, сохранению и употреблению пиявок / И. Брыков СПб, 1852. - 62 с.

34. Бурлаков А.А. Мои дорогие пиявочки / А.А. Бурлаков // Народная газета. -2004. -№68.-С. 15.

35. Великжанин В.И. Таксономия поведения сельскохозяйственных животных / В.И. Великжанин. Л., 1983 - 150 с.

36. Воскресенский А.Е. Монография врачебных пиявок / А.Е. Воскресенский. -СПб., 1859.-500 с.

37. Габоян А.С. Гирудотерапия и противовоспалительная рентгенотерапия в комплексном лечении острого панкреатита: Автореф. Дис. Канд. Мед. наук. 14.00.27 / А.С. Габоян М., 1999 - 17 с.

38. Геращенко Л.Л. Лечение пиявками в домашних условиях / Л.Л. Геращенко, Г.И. Никонов. М.: АСТ-ПРЕСС КНИГА, 2004. - 272 с.

39. Гилева О.С. Гирудотерапия при стоматологических заболеваниях / О.С. Гилева // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. — Кн. 2. Люберцы, 2003. - С. 23-25.

40. Гладкий Т.В. Состояние системы крови у лиц с различными заболеваниями после проведения курса гирудотерапии / Т.В. гладкий, Л.В. Тихоход, С.Ф.

41. Ужевская // Материалы II Межрегиональной конференции с международным участием «Гирудотерапия в зеркале патуротерапевтических технологий. -Брянск, 2001.-С. 12-15.

42. Голубев А.И. Электронномикроскопическое строение нервной системы Hirudo medicinalis: Автореф. дис. канд. биол. наук: / А.И. Голубев / Казань, 1968-20 с.

43. Гольдберг Д.И. Справочник по гематологии / Д.И. Гольдберг, Е.Д. Гольд-берг. Томск: Издательство Томского университета, 1980. - 268 с.

44. Горюнов А.И. Гирудотерапия при активном хирургическом лечении гнойного воспаления мягких тканей / А.И. Горюнов, Ю.И. Зимин // Медицинская помощь. 1993. - № 3. - С. 55-57.

45. ГОСТ Р 51232-98. Вода питьевая. Общие требования к организации и методам контроля качества. Введен впервые; Введ. 07.01.99 - без ограничения срока действия. - 17 с. - Группа Н08.

46. ГОСТ 4011-72. Вода питьевая. Методы измерения массовой концентрации общего железа. Взамен ГОСТ 4011-48; Введ. 01.01.74- без ограничения срока действия. - 10 с. - Группа Н09.

47. ГОСТ 18165-89. Вода питьевая. Метод определения массовой концентрации алюминия. Взамен ГОСТ 18165-81; Введ. 01.01.91 до 01.01.96. -7с.-Группа Н09.

48. ГОСТ 18164-72. Вода питьевая. Методы определения содержания сухого остатка Введен впервые; Введ. 01.01.74- без ограничения срока действия. - 9 с. -Группа Н09.

49. Григорян С.С. Влияние медицинской пиявки на реологические показатели крови крыс в норме и при развитии экспериментального липоидоза / С.С. Григорян, И.А. Соколова, А.А. Шахназаров и др. // Доклады АН. 1995. - Т. 340. - № 6.-С. 830-831.

50. Гробов О.Ф. Полезные беспозвоночные и проблемы, связанные с их патологией / О.Ф. Гробов // Труды всесоюзного института экспериментальной ветеринарии. 1978.-Т. 48.-С. 83-91.

51. Гурвич З.Г. Хранение медицинских пиявок в медицинских учреждениях / З.Г. Гурвич // Медицинская сестра. 1962. - № 11. - С. 55-56.

52. Гурин И.С. Биологически активные вещества гидробионтов — источник новых лекарств и препаратов / И.С. Гурин, И.С. Ажгихин. М.: Наука, 1981. -136 с.

53. Давид О.Ф. Спонтанная электрическая активность продольных мышц продольной мускулатуры медицинской пиявки / О.Ф. Давид // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1969. - Т. 5. - С. 540-546.

54. Давид О.Ф. Морфофизиологические основы локомоции аннелид / О.Ф. Давид.-Л.: Наука, 1990.-168 с.

55. Даринская B.C. Об изменении объема нейрона при его деполяризации и гиперполяризации / B.C. Даринская, Ю.А. Даринский // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1973. - Т. 75. - № 9. - С. 40-47.

56. Дзех С.А. Клиника, иммунологические нарушения и гирудотерапия больных синдромом Россолимо-Мелькерсона-Розепталя: Автореф. дис. канд. мед. наук: / С.А. Дзех Москва, 2000. - 24 с.

57. Диденко А.В. Влияние синаптической активации на синтез РНК клеток Ретциуса медицинской пиявки / А.В. Диденко // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1977а. - Т. 63. - № 10. - С. 1482-1485.

58. Диденко А.В. Влияние температуры на биоэлектрическую активность нейронов Ретциуса медицинской пиявки / А.В. Диденко // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 19776. - Т. 63. - № 11.- С. 1611-1615.

59. Диденко А.В. Корреляция между количеством РНК и величиной мембранного потенциала нейронов Ретциуса медицинской пиявки / А.В. Диденко, И.С. Базанова, В.В. Казанский // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1973. - Т. 59. - № 6. - С. 955-956.

60. Диденко А.В. Некоторые особенности биоэлектрической активности нейронов Ретциуса медицинской пиявки / А.В. Диденко, Н.А. Сергеев // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1974.-Т. 60.-№ 12.-С. 1888-1890.

61. Дьюсбери Д. Поведение животных / Д. Дьюсбери. М.: Мир, 1981. - 479 с.

62. Егоров Н.С. Практикум по микробиологии / Н.С. Егоров. М.: Издательство Московского университета, 1979. - 307 с.

63. Ежов Г.И. Руководство к практическим занятиям по сельскохозяйственной микробиологии / Г.И. Ежов. М.: Высшая школа, 1981. - 271 с.

64. Ена Я.М. Гирудотерапия в комплексном лечении больных гипертонической болезпыо / Я.М. Ена // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 24-25.

65. Жаров Д.Г. Секреты гирудотерапии или как лечиться пиявками / Д.Г. Жаров. Ростов-па-Дону, 2003. - 318 с.

66. Жернов В.А. Гирудотерапия в гинекологии / В.А. Жернов, С.В. Арсении, О.А. Штылева // Традиционные методы лечения в геронтологии: Сб. ст. М., 2001а.-С. 90.

67. Жернов В.А. Применение гирудотерапии в героитологической практике /

68. B.А. Жернов, С.В. Арсенин, О.А. Штылева // Традиционные методы лечения в геронтологии: Сб. ст. -М., 20016. С. 88-89.

69. Живогляд Р.Н. Антибактериальное лечение и гирудотерапия при гормонально-зависимых и воспалительных заболеваниях женских половых органов / Р.Н. Живогляд // Казанский медицинский журнал. 1998. - Т. 79. - № 4. - С. 280-281.

70. Иванова Казас О.М. Курс сравнительной эмбриологии беспозвоночных животных / О.М. Иванова - Казас, Е.Б. Кричинская - Л., 1988. - 350 с.

71. Ивлев С.Д. Влияние некоторых медиаторных веществ на мехапосенсор-ные нейроны пиявки Hirudo medicinalis / С.Д. Ивлев // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1981. - Т. 17. - С. 313-315.

72. Ивлев С Д. Влияние глутаминовой, аспарагиновой и гамма-аминомасляной аминокислот на клетки Ретциуса и АЕ-мотонейроны пиявки / С.Д. Ивлев, Д.Н. Ленков // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. -1982.-Т. 18.-С.465^70.

73. Иогансон Л. Определитель пиявок / Л. Иогансоп Л.: Изд-во АН СССР, 1935.-95 с.

74. Иорданишвили А.К. Результаты гирудотерапии больных с парестезией слизистой оболочки полости рта / А.К. Иордапишвили, II.K. Крупец // Стоматология. 1992. - Т. 71. - № 2. - С. 36-37.

75. Исаханян Г.С. Гирудотерапия в клинике внутренних болезней / Г.С. Исаханян Ереван: Айастан, 1991. - 167 с.

76. Исаханян Г.С. О рефлекторном механизме действия гирудотерапии / Г.С. Исаханян // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб.ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 22-23.

77. Исаханян Г.С., Арутюнян В.М. Медицинские пиявки: их лечебное применение в терапевтической клинике / Г.С. Исаханян, В.М. Арутюнян // Терапевтический архив. 1991. - Т. 63. - № 8. - С. 110-112.

78. Исаханян Г.С., Тумасян Н.С., Баргесян З.Э. Гирудотерапия и свертываемость крови / Г.С. Исаханян, Н.С. Тумасян, З.Э. Баргесян // Кардиология. 1992. -Т. 32.-№5.-С. 79-81.

79. Казарина Л.Н. Озоно- и гирудотерапия в комплексном лечении глоссалгии / Л.Н. Казарина, А.И. Воложин Нижний Новгород: Издательство НГМА, 2002 -47 с.

80. Казьмин В.Д. Пиявки при вашей болезни / В.Д. Казьмин Ростов-на-Дону: Издательство «БАРО-ПРЕСС», 2004. - 128 с.

81. Каменев О.Ю. Гирудотерапия. Биологически активные точки и зоны для постановки пиявок / О.Ю. Каменев // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 8-11.

82. Каменева М.В. Действие гепарина и ниявита на реологические свойства крови и агрегацию тромбоцитов / М.В. Каменева, А.С. Парфенов, Э.Л. Климано-ва и др. // Казанский медицинский журнал. 1988. - Т. 69. - № 5. - С. 331-334.

83. Киреев А. Целебные свойства пиявок / А. Киреев М.: Ч.А.О. и К°, 2001. -90 с.

84. Кобахидзе Д.Н. Животные, питающие медицинскую пиявку в некоторых местах ее распространения / Д.Н. Кобахидзе // Сообщения АН Грузинской ССР. Зоология. 1942а. - Т. 3. - Вып. 9. - С. 923-927.

85. Кобахидзе Д.Н. К выяснению местообитаний медицинской пиявки в условиях Грузии / Д.Н. Кобахидзе // Сообщения АН Грузинской ССР. Зоология. -19426. Т. 3. - Вып. 1. - С. 69-72.

86. Кобахидзе Д.Н. К экспериментальному изучению устойчивости медицинской пиявки к снижению влажности почвы / Д.Н. Кобахидзе // Сообщения АН Грузинской ССР. Зоология. 1943а. - Т. 4. - Вып. 5. - С. 439-444.

87. Кобахидзе Д.Н. Количество крови, высосанной медицинской пиявкой при однократном питании и ее дальнейшее изменение / Д.Н. Кобахидзе // Сообщения АН Грузинской ССР. Зоология. 19436. - Т. 4. - Вып. 2. - С. 173-178.

88. Кобахидзе Д.Н. К изучению гидростойкости медицинской пиявки / Д.Н. Кобахидзе // Сообщения АН Грузинской ССР. 1944а. - Т. 5. - Вып. 4. - С. 423429.

89. Кобахидзе Д.Н. Попытка установления термического порога жизни медицинской пиявки в экспериментальных условиях / Д.Н. Кобахидзе // Сообщения АН Грузинской ССР. Зоология. 19446. - Т. 5. - Вып. 5. - С. 543-548.

90. Кобахидзе Д.Н. Материалы к инвентаризации гидрофауны Грузии / Д.Н. Кобахидзе // Труды зоологического института АН Грузинской ССР. 1946 -Т. 6.-С. 135-146.

91. Козловская В.И. Холинэстеразы водных животных / В.И. Козловская, О.В. Мензикова, Г.М. Чуйко, Ф.Л. Майер // Физиология, биохимия и токсикология пресноводных животных. Л.: Наука, 1989. - С. 42-66.

92. Колчина А.П. Гирудотерапия в комплексном лечении больных с заболеваниями желудочно-кишечного тракта / А.П. Колчина // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 5051.

93. Коробейникова Г.А. Гирудотерапия в комплексном лечении больных гипертонической болезнью и сочетаемыми с нею поражениями слизистой оболочки полости рта на курорте Усть-Качка: Автореф. канд. мед. наук. / Г.А. Коробейникова Пермь, 2002 - 23 с.

94. Коржуев П.А. Об особенностях переваривания белков у кровососущих и хищных пиявок (.Hirudo medicinalis и Haemopis sanguisuga) / П.А. Коржуев, С.Р. Худайбердиев // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1937. Т. 3. - № 5. - С. 479-482.

95. Корпачев В.В. Целебная фауна / В.В. Корпачев. М.: Наука, 1989. -189 с.

96. Краткий определитель водных беспозвоночных Среднего Поволжья Казань: Издательство Казанского университета, 1967. - 252 с.

97. Крашенюк А.И. Лечение детских церебральных параличей методом гирудотерапии / А.И. Крашенюк, С.В. Крашенюк // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 45-46.

98. Крашенюк А.И. Нейротрофический фактор Hirudo medicinalis (пиявки медицинской) / Крашенюк А.И., Крашешок С.В., Чалисова Н.И. // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. — Кн. 1 — Люберцы, 2003. -С. 46-49.

99. Кудрина Г.П. Оценка иммунотоксических свойств препарата «пия-вит» / Г.П. Кудрина, Т.В. Гиевковская // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 2. - Люберцы, 2003. - С. 56-59.

100. Кузнецова О.Н. Распределение гирудина в теле медицинской пиявки, его свойства, методы получения и практическое использование: Автореф. дис. канд. мед. наук М., 1949. - 27с.

101. Кузнецова О.Н. Распределение гирудина в теле медицинской пиявки / О.Н. Кузнецова // Зоологический журнал. 1953. - Т. 32. - Вып. 5. - С. 833839.

102. Кузнецова О.Н. Научное пиявководство в Советском Союзе / О.Н. Кузнецова // Труды Московской ветеринарной академии. 1961. - Т. 33. - С. 149-152.

103. Кузьмина Л.В. Распределение биогенных моноаминов в нервной системе туловищного сегмента пиявки Hirudo medicinalis / Л.В. Кузьмина // Физиология и биохимия беспозвоночных Л., 1968. - С. 50-56.

104. Кулик P.M. Медицинская пиявка природный источник здоровья / P.M. Кулик // Материалы II Межрегиональной конференции с международным участием «Гирудотерапия в зеркале натуротерапевтических технологий. — Брянск, 2001.-С. 20-24.

105. Куликов И.П. Коррекция биополя человека медицинскими пиявками / И.П. Куликов, Г.И. Никонов // Материалы II Межрегиональной конференции с международным участием «Гирудотерапия в зеркале натуротерапевтических технологий. Брянск, 2001. - С. 115-120.

106. Кушнир А.С. Применение гирудотерапии в комплексном лечении некоторых заболеваний органов полости рта / А.С. Кушнир // Здравоохранение -Кишинев, 1989. № 3. - С. А2-АЪ.

107. Кэндел Э. Клеточные основы поведения / Э. Кэндел М.: Мир, 1980. - 600 с.

108. Лагутенко Ю.П. Особенности нейронной организации двигательной области нейропиля брюшного мозга медицинской пиявки / Ю.П. Лагутенко // Морфологические основы функциональной эволюции: Сб. ст. Л., 1978. - С. 13-17.

109. Лагутенко Ю.П. Структурная организация туловищного мозга ан-нелид: эволюционно-нейроморфологический анализ / Ю.П. Лагутенко Л.: Наука, 1981.- 127 с.

110. Лапицкий В.П. Влияние головных ганглиев на биоэлектрическую активность кольцевых нервов пиявки / В.П. Лапицкий, А.А. Русинов // Вестник ЛГУ. 1978. - № 3. - С. 86-91.

111. Лапкина Л.И. Пиявки Рыбинского водохранилища и их устойчивость к токсическим веществам: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03. 00. 18 / Л.И. Лапкипа / МГУ имени М.В. Ломоносова Москва, 1983. - 23 с.

112. Лебедев А.Н. Спонтанные импульсные потенциалы одиночных нейронов в неизолированных нервных ганглиях медицинской пиявки / А.Н. Лебедев // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1967. - Т. 53. - № 8. -С. 915-921.

113. Лебедев П.Т. Методы исследования кормов, органов и тканей животных / П.Т. Лебедев, А.Т. Усович. М.: Россельхозиздат, 1969. - 478 с.

114. Лоренц К. Кольцо царя Соломона / К. Лоренц. М.: Знание, 1970. -230 с.

115. Лоренц К. Агрессия (так называемое «зло») / К. Лоренц. СПб.: Амфора, 2001.-349 с.

116. Лукашова А.П. Опыт использования медицинских пиявок в поликлинике МИД России / А.П. Лукашева // Сборник научно-практических работ научно-практической конференции «Поликлиники МИД России». М., 1999. -С. 79-80.

117. Лукин Е.И. К вопросу о распространении медицинской пиявки в СССР / Е.И. Лукин // Зоологический журнал. 1957. - Т. 36. - № 5. - С. 658-669.

118. Лукин Е.И. К фауне пиявок реки Волги / Е.И. Лукин // Ученые записки Куйбышевского педагогического института. 1959. - Вып. 22 - С. 32-38.

119. Лукин Е.И. Класс пиявки (Hirudinea) / Е.И. Лукин // Жизнь животных. Т. 1. - М.: Просвещение, 1968. - С. 509-526.

120. Лукин Е.И. Пиявки пресных и солоноватых водоемов / Е.И. Лукин // Фауна СССР. Пиявки.-Т. 1.-Л., 1976.-484 с.

121. Лукин Е.И. Класс пиявки Hirudinea / Е.И. Лукин // Определительпресноводных беспозвоночных Европейской части СССР. JL: Гидрометеоиз-дат, 1977.-С. 201-212.

122. Любецкий А.Е. Победить болезнь / А.Е. Любецкий М.: Грэгори пэйдж, 1997-204 с.

123. Лялина Л.А. Физиологические функции гепарина / Л.А. Лялина // Успехи современной биологии. 1987. - Т. 103. - Вып. 1. - С. 66-80.

124. Магомедов М.М. Гирудотерапия при остром тромбофлебите / М.М. Магомедов // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. -Кн. 1.-Люберцы, 2003.-С. 30-31.

125. Мальцева Н.М. Опыт использования медицинских пиявок в поликлинической практике терапевта / Н.М. Мальцева, В.И. Радищевский // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 2. - Люберцы, 2003. -С. 35-38.

126. Мантейфель Б.П. Экология поведения животных / Б.П. Мантейфель. -М.: Наука, 1980.-220 с.

127. Меннинг О. Поведение животных / О. Меннинг. М.: Мир, 1982. -360 с.

128. Методы ветеринарной клинической лабораторной диагностики: Справочник / Под ред. И.П. Кондрахина. М.: КолосС, 2004 - 520 с.

129. Мешкова A.M. Пиявки озера Севан: Автореф. дис. канд. биол. наук. / A.M. Мешкова Баку, 1956 - 13 с.

130. Мигаль В.М. Медицинская пиявка на рубеже XX XXI столетия / В.М. Мигаль // Фармация в 21 веке: инновации и традиции: Тезисы докладов международной научной конференции. - СПб, 1999. - С. 179-180.

131. Можеренков В.П. Когда предпочтительна гирудотерапия: Офтальмология / В.П. Можеренков, Г.Л. Прокофьева, Л.А. Усова, Л.Н. Харченко // Медицинская газета. 1992. - 27 ноября. - С. 9.

132. Можеренков В.П. Гирудотерапия глазных заболеваний / В.П. Можеренков, Г.Л. Прокофьева, Л.А. Усова, Л.Н. Харченко // Врач. 1998. - № 10.-С. 26-27.

133. Можеренков В.П. Гирудотерапия в офтальмологии / В.П. Можеренков, Г.Л. Прокофьева, Л.А. Усова, Л.Н. Харченко // Медицинская помощь. -2001.-№3.-С. 40-41.

134. Можеренков В.П. Гирудотерапия в глазной практике / В.П. Можеренков, Г.Л. Прокофьева, Л.А. Усова, Л.Н. Харченко // Медицинские сестра. -2003.-№2.-С. 32-33.

135. Морозов В.П. Варикозная болезнь / В.П. Морозов, В.М. Савранский СПб.: Питер, 2001 - 122 с.

136. Мотова Т.И. Клинический опыт фито- и гирудотерапии при бронхо-легочной патологии / Т.И. Мотова // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 31-32.

137. Мохов Б.П. Поведение крупного рогатого скота / Б.П. Мохов. -Ульяновск, 2003.- 159 с.

138. Мохов Д.Е. Гирудотерапия в неврологии / Д.Е. Мохов, С.Г. Зальцман // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. -Люберцы, 2003. - С. 39-40.

139. Мусиенко B.C. Исследование электрической активности боковых нервов брюшной цепочки пиявки / B.C. Мусиенко, О.Д. Терешков // Физиология и биохимия беспозвоночных. Л., 1968. - С. 56-63.

140. Мусина О.Е. Флебогенные заболевания нижних конечностей и их коррекция методом гирудотерапии / О.Е. Мусина // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 19-21.

141. Никонов Г.И. Медицинская пиявка. Вчера, сегодня, завтра. / Г.И. Никонов. М.: Электроника, 1992. - 123 с.

142. Никонов Г.И. Медицинская пиявка. Основы гирудотерапии / Г.И. Никонов. СПб.: СДС, 1998. - 294 с.

143. Никонов Г.И. История гирудотерапии пример интеграции нетрадиционной и традиционной медицины / Г.И. Никонов // Гирудотерапия и гиру-дофармакотерапия. - Т. 4 - МО, 2002. - С. 28-38.

144. Никонов Г.И. Физиологические и биохимичекие аспекты лечебного действия медицинских пиявок Hirudo medicinalis / Г.И. Никонов, И.П. Баскова // Успехи современной биологии. 1986. - Т. 101.-№ 1.-С. 141-154.

145. Никонов Г.И. Использование медицинской пиявки для получения лекарственных средств / Никонов Г.И., Голиков А.А. // Фармация. 1993. - Т. 42. - № 3. - С.62-64.

146. Никонов Г.И. Научные основы гирудотерапии / Никонов Г.И., Лат-рилль Ж. // Гирудотерапия и гирудофармакотерапия. Т. 4. - МО, 2002. - С. 3964.

147. Никонов Г.И. Влияние препаратов из пиявок Hirudo medicinalis на метилирование ДНК печени крыс / Г.И. Никонов, Е.Б. Романенко, Б.Ф. Ванюшин, И.П. Баскова // Биологические науки. 1990. - № 4. - С. 21-25.

148. Никонов Г.И. Гирудология и гирудотерапия (о медицинской пиявке) / Г.И. Никонов, Е.А. Титова // Новая аптека. 2000. - № 11. - С. 28-31.

149. Никонов Г.И. Гирудология и гирудотерапия (о медицинской пиявке) / Г.И. Никонов, Е.А. Титова // Новая аптека. 2000. - № 12. - С. 20-23.

150. Определитель бактерий Берджи. В 2-х т. Т. 1. / Под ред. Дж. Хоул-та, Н. Крига, П. Снита, Дж. Стейли, С. Уилльямса - М.: Мир, 1997. - 432 с.

151. Орлова Е.Е. Гирудотерапия деструктивных форм верхушечного периодонтита: Автореф. дис. канд. мед. наук. 14.00.21 / Е.Е. Орлова; Красноярская государственная медицинская академия Красноярск, 2003 - 22 с.

152. Панкова И.А. Применение гирудотерапии в гинекологической практике / И.А. Панкова // Гирудотерапия и гирудофармакотерапия. Т. 4. - МО, 2002.-С. 159-173.

153. Петров А.Н. Разработка и изучение механизмов действия гирудотерапии при мастите у коров: Автореф. дис. канд. биол. наук: 16. 00. 04 / А.Н. Петров. Воронеж, 2000. - 27 с.

154. Петров И.П. Экспериментальные и клинические исследования по гирудотерапии / И.П. Петров, Н.В. Лапкина // Вестник хирургии. 1936. - № 47. -С. 163-179.

155. Покровский В.И. Медицинская микробиология / В.И. Покровский. -М., 1999.-350 с.

156. Попов Л.К., Петров А.Н. Гирудотерапия при скрытом мастите коров / Л.К. Попов, А.Н. Петров // Ветеринария. 1999. - № 10. - С. 36-37.

157. Попова И.С. Воспроизводительная способность молочных коров разных генотипов и использование гирудопунктуры для ее коррекции: Автореф. дис. канд. вет. наук: / И.С. Попова. Воронеж, 2003. - 21 с.

158. Пятраускене Л. Оценка токсичности седиментов реки Нямунас при помощи реакций медицинской пиявки / Л. Пятраускене // Тезисы докладов VII съезда гидробиологического общества РАН. Т. 2. - Калининград, 2001. - С. 166.

159. Рожкова Е.К. Холинорецепция спинной мышцы медицинской пиявки Hirudo medicinalis / Е.К. Рожкова // Физиология и биохимия беспозвоночных. -Л., 1968.-С. 160-166.

160. Рожкова Е.К. Влияние дегенерации двигательных нервов на холи-норецепцию спинной мышцы медицинской пиявки / Е.К. Рожкова // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1974. - Т. 10. - С. 628-630.

161. Романов А. Лечебный эффект гирудотерапии / А. Романов // Врач. -1993.-№8.-С. 25-26.

162. Русинов А.А. Влияние головных ганглиев па сегментарные моторные центры насекомых и пиявок: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03. 00. 13 /

163. A.А. Русинов.-Л., 1981.-21 с.

164. Рыбакова М.Л. О применении медицинской пиявки в дерматологии / М.Л. Рыбакова // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 73-75.

165. Сабирова М.М. Кровохаркание у больного с пиявкой в гортани / М.М. Сабирова // Проблемы туберкулеза. 1985. - № 9. - С. 75.

166. Савинов В.А. Иммунокоррекция, сопутствующая гирудотерапии /

167. B.А. Савинов. М.: Ассоциация гирудологов, 1993. - 14 с.

168. Савинов В.А. Роль гирудотерапии в клинической медицине / В.А. Савинов // Асклепейон. 1998а. - № 1. - С. 85-86.

169. Савинов В.А. Хронический простатит: лечение пиявками и другими нетрадиционными средствами / В.А. Савинов. -М.: Асклепейон, 19986. 107 с.

170. Савинов В.А. Гирудотерапевтические методы / В.А. Савинов // Медицинская сестра. 2000а. - № 5. - С. 34-36.

171. Савинов В.А. Гирудотерапия: показания к применению / В.А. Савинов // Медицинская сестра. 20006. - № 4. - С. 9-11.

172. Савинов В.А. Гирудоинформационпая терапия (введение в общую квантовую патологию) / В.А. Савинов. Брянск: Асклейпеон, 2001а. - 123 с.

173. Савинов В.А. Гирудотерапевтический практикум / В.А. Савинов. -Брянск: Асклейпеон, 20016. 143 с.

174. Савинов В.А. Лечение урогенитальных инфекций и патогенетически связанных с ними заболеваний у женщин пиявками и другими народными средствами / В.А. Савинов. М.: Асклепейон, 2001 в. - 247 с.

175. Савинов В.А. Эффективность гирудотерапии при некоторых соматических заболеваниях / В.А. Савинов // Медицинская сестра. 2001г. - № 6. - С. 19-22.

176. Савинов В.А. Аутокровь из приставной пиявки как средство активной неспецифической иммунотерапии / В.А. Савинов. Брянск: Асклепейон: Фонд им. св. блгв. князя Олега Брянского, 2002а. - 19 с.

177. Савинов В.А. Гирудотерапия в гастроэнтерологии / В.А. Савинов. -Брянск: Асклепейон, 20026. 51 с.

178. Савинов В.А. Гирудотерапия в лечении урогенитальных инфекций / В.А. Савинов // Медицинская сестра. 2002в. - № 5. - С. 28-29.

179. Савинов В.А. Клиническая гирудотерапия / В.А. Савинов. Брянск: Асклепейон, 2002г. - 439 с.

180. Савинов В.А. Роль и место гирудотерапии в комплексных терапевтических программах / В.А. Савинов, В.Г. Кудинов, А.П. Сидоренко // Новое в стоматологии. 1994. - № 1. - С. 40—46.

181. Савинов В.А. Гирудотерапия в комплексном лечении больных хроническим простатитом / В.А. Савинов, В.М. Кучерский // Лечение медициискими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003а. - С. 6668.

182. Савинов В.А. Роль гирудотерапии в профилактике рака / В.А. Савинов, В.М. Кучерский // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Ки. 1. - Люберцы, 20036. - С. 32-33.

183. Савинов В.А. Пиявка лечит все / В.А. Савинов, Т.В. Павлова. М.; СПб.: Диля, 2003.- 125 с.

184. Савинов В.А. Гирудотерапевтическая техника: Пособие для начинающих специалистов / В.А. Савинов, Т.Н. Чабан, Г.Д. Каверзнева. М.: Аскле-пейон, 1999.-32 с.

185. Савинов В.А. Гирудоэнерготерапия: Методическое пособие / В.А. Савинов, Т.Н. Чабан, Л.Д. Пухова. М.: Асклепейон, 1998. - 56 с.

186. Савинов В.А. Концептуальные основы гирудотерапии / В.А. Савинов, А.В. Чистов//Материалы II Межрегиональной конференции с международным участием «Гирудотерапия в зеркале натуротерапевтических технологий. -Брянск, 2001.-С. 3-4.

187. Селезнев К. Г. Регенеративное действие пиявок / К.Г. Селезнев // Медицинская газета. 1987. - 11 ноября. - С. 3.

188. Селезнев К.Г. Гирудотерапия при аутотрансплантации / К.Г. Селезнев // Материалы II Межрегиональной конференции с международным участием «Гирудотерапия в зеркале натуротерапевтических технологий. Брянск, 2001. -С. 113-114.

189. Селезнев К. Г. Лечение пиявками в домашних условиях / К.Г. Селезнев. СПб.: Нева, 2003. - 119 с.

190. Семикова Т.С. Гирудотерапия в лечении субретинального кровоизлияния: Клинический случай / Т.С. Семикова // Офтальмохирургия. 1992. - № 3 - С. 63-64.

191. Сидоров М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Б. Федотов. М.: Колос, 1995. - 319 с.

192. Синева М.В. Наблюдения над выращиванием медицинских пиявок / М.В. Синева // Зоологический журнал. 1944. - Т. 23. - Вып. 6. - С. 293 - 302.

193. Синева М.В. Биологические наблюдения над пиявками гематофа-гами: Автореф. дис. канд. биол. наук / М.В. Синева - М., 1945. - 23 с.

194. Синева М.В. Биологические наблюдения над размножением медицинской пиявки / М.В. Синева // Зоологический журнал. 1949. - Т. 28. - Вып. 3. -С. 213-224.

195. Синева М.В. Зависимость роста медицинской пиявки от приемов пищи / М.В. Синева // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отделение биологии. - 1950. - Т. LV. - № 6. - С. 50 - 56.

196. Скопиченко Н.Ф. О влиянии гирудотерапии на некоторые показатели свертывания крови / Н.Ф. Скопиченко // Врачебное дело. 1966. - № 5. С. 10 -14.

197. Слока Н.А. Определитель животных Латвийской ССР: Пиявки (#/-rudinea) / Н.А. Слока. Рига: ЛГУ, 1983. - 63 с.

198. Слоним А.Д. Среда и поведение / А.Д. Слоним.-Л.: Наука, 1976. -211 с.

199. Степанов К.Н. Первый опыт гирудотерапии в онкологии / К.Н. Степанов // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1 -Люберцы, 2003.-С. 33-34. •

200. Стояновский Д.Н. Медицинская пиявка. Кровопускание / Д.Н. Стояновский. Донецк: Сталкер, 2002. - 125 с.

201. Сулим Н.И. Гирудотерапия келлоидных рубцов / Н.И. Сулим // Материалы пленума Ассоциации травматологов и ортопедов РФ. — Самара, 1994. -С. 48-51.

202. Сулим Н.И. Гирудотерапия в травматологии и ортопедии / Н.И. Сулим.-М., 1997.-65 с.

203. Сулим Н.И. Целебная пиявка / Н.И. Сулим // Медицинская сестра. -2000. -№ 4.-С. 8-9.

204. Сулим Н.И. Основы клинической гирудотерапии / Н.И. Сулим. Т. 1. - М.: Народная медицина, 2003. - 204 с.

205. Талызин Ф.Ф. Гирудиноз / Ф.Ф. Талызин // Большая медицинская энциклопедия. Т. 6. - М., 1977. - С. 47 - 48.

206. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер. М.: Колос, 1993.- 175 с.

207. Терешков О.Д. О колебаниях биоэлектрической активности в брюшной нервной цепочке пиявки / О.Д. Терешков // Вестник МГУ. 1968. -Сер. 6.-С. 38-42.

208. Терешков О.Д. Материалы по электрофизиологии нервной системы пиявок: Автореф. дис. канд. биол. Наук / О.Д. Терешков М., 1969. - 19 с.

209. Терешков О.Д., Фомина М.С. Реакции некоторых нейронов пиявки на прокол и на прямое электрическое раздражение / О.Д. Терешков, М.С. Фомина // Физиологический журнал имени И.М. Сеченова. 1974. - Т. 60. - № 3. - С. 362 - 369.

210. Тинберген Н. Поведение животных / Н. Тинберген. М.: Мир, 1985. - 192 с.

211. Титова Е.А. Биология медицинской пиявки / Е.А. Титова // Гирудотерапия и гирудофармакотерапия: Сб. ст.-Т. 4.-МО, 2002.-С. 12- 17.

212. Тихоненко О.А. Действие эффектора из секрета медицинской пиявки Hirudo medicinalis на систему комплемента человека: Автореф. дис. канд. мед. наук. 03.00.04 / О.А. Тихоненко; Читинская государственная медицинская академия Чита, 2000 - 18 с.

213. Трут Л.Н. Очерки по генетике поведения / Л.Н. Трут. Новосибирск: Наука, 1978. - 256 с.

214. Тхай Т.Б. Двигательный аппарат пиявок: Автореф. дис. канд. биол. наук / Т.Б. Тхай М., 1965. - 12 с.

215. Утевская О.М. Оптимальные значения репродуктивных признаков медицинской пиявки {Hirudo medicinalis) в условиях искусственного разведения / О.М. Утевская // Вестник зоологии. 2000. - № 4 - 5. - С. 65 - 72.

216. Утевская О.М. Схема дисперсионного анализа для оценки наследуемых репродуктивных черт у медицинской пиявки Hirudo medicinalis L. / О.М. Утевская, J1.A. Атраментова // Генетика. 2003. - Т. 39. - № 10. - С. 1427 - 1433.

217. Фабри К.Э. Орудийные действия животных / К.Э. Фабри. М.: Знание, 1980.-64 с.

218. Федоров Т.В. Выделение, очистка и свойства биологически актив-пых веществ из медицинской пиявки {Hirudo medicinalis) и ее симбионта Аего-monas hydrophila: Автореф. дис. канд. биол. наук: 03.00.23 / Т.В. Федоров; -Щелково, 2000.-20 с.

219. Фомина М.С. Исследование структурно-функциональной организации ганглия пиявки: Автореф. дис. канд. биол. наук / М.С. Фомина М., 1971. -27 с.

220. Халиль С.И. Механизмы тромболизиса и ингибировапия свертывание крови препаратами из пиявок Hirudo medicinalis: Автореф. дис. канд. биол. наук / С.И. Халиль М., 1987. - 24 с.

221. Хейсин Е.М. Краткий определитель пресноводной фауны / Е.М. Хейсин. М.: Учпедгиз, 1962. - 148 с.

222. Ходжаев А.А. Редкий случай живого инородного тела (пиявки) в пищеводе / А.А. Ходжаев // Здравоохранение Таджикистана. 1973. - С. 64 - 65.

223. Хомяков Ю.Н. Природные и синтетические антикоагулянты и их использование для регуляции клеточной активности: Автореф. дис. д-ра биол. наук / Ю.Н. Хомяков М„ 2000. - 48 с.

224. Худайбердиев С.Р. Об особенностях переваривания белков у кровососущих и хищных пиявок (Hirudo medicinalis и Haemopis sanguisuga) / С.Р. Ху-дайбердиев // Труды Узбекского государственного университета. Т. 12. - Вып. 11. - Самарканд, 1939. - 15 с.

225. Чабан Т.Н. Гирудотерапия в гинекологической практике / Т.Н. Чабан, В.В. Капралова, В.А. Савинов // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 1. - Люберцы, 2003. - С. 68.

226. Чабан Т.Н. Гирудотерапия в амбулаторной офтальмологии / Т.Н. Чабан, В.А. Савинов // Лечение медицинскими пиявками и препаратами из них: Сб. ст. Кн. 2. - Люберцы, 2003. - С. 13-14.

227. Черкесова Д.У. «Псевдогирудин» из туловищ медицинских пиявок / Д.У. Черкесова, И.П. Баскова, В.В. Мосолов и др. // Доклады АН СССР. 1978. -Т. 241.-№3.-С. 720-722.

228. Шаев А.И. Современные данные о применении медицинской пиявки Hirudo medicinalis для лечебных целей / А.И. Шаев // Фармация. 1985. - Т. 34.-№4.-С. 72-77.

229. Шаповаленко Л. Наблюдения над активностью секрета, препятствующего свертыванию крови у медицинских пиявок разного возраста / Л. Шаповаленко // Бюллетень Московского общества испытателей природы. 1940. - Т. 10.-№2.-С. 23-28.

230. Шаповаленко Л. Наблюдения над активностью противосвертываю-щего экстракта из головок медицинских пиявок, снятых в начале сосания / Л. Шаповаленко // Бюллетень Московского общества испытателей природы. -1947. Т. 24. - № 2. - С. 25 - 30.

231. Шарова И.Х. Зоология беспозвоночных / И.Х. Шарова. М.: Гуманитарный издательский центр ВЛАДОС, 2002. 592 с.

232. Шишкина И.Д. Влияние медицинских пиявок на микроорганизмы и на организм человека: Автореф. дис. канд. мед. наук / И.Д. Шишкина Рязань, 1953.

233. Шумкина О.Б. Эмбриональное развитие медицинской пиявки: Автореф. дис. канд. биол. наук / О.Б. Шумкина; Академия медицинских наук СССР.-М., 1950.- Юс.

234. Щеголев Г.Г. Наблюдения над многократной откладкой коконов медицинскими пиявками / Г.Г. Щеголев // Зоологический журнал. 1948. - Т. 27.-Вып. 1.-С. 13-16.

235. Щеголев Г.Г. Пиявки Hirudinea / Г.Г. Щеголев // Жизнь пресных вод СССР. Т. 2. - М.-Л., Издательство АН СССР, 1949. - С. 131 - 145.

236. Щеголев Г.Г. Некоторые новые данные по биологии медицинской пиявки / Г.Г. Щеголев // Природа, 1950. № 11. - С. 62 - 63.

237. Щеголев Г.Г. Наблюдения над подвижностью медицинских пиявок в водоемах / Г.Г. Щеголев // Зоологический журнал. 1951. - Т. 30. - № 5. - С. 430-439.

238. Щеголев Г.Г. Медицинские пиявки как литофильпые организмы / Г.Г. Щеголев // Труды всесоюзного гидробиологического общества. 1952. - Т. 4. - С. 151 - 186.

239. Щеголев Г.Г. Медицинская пиявка и ее применение / Г.Г. Щеголев, М.С. Федорова-М.: Медгиз, 1955.-68 с.

240. Щекотов Г.М. Применение пиявок при варикозном расширении вен / Г.М. Щекотов // Военно-медицинский журнал. 1980. - № 3. - С. 68.

241. Эпштейн В.М. Изучение филогенетических преобразований формы тела пиявок из семейства Piscicolidae методом математического моделирования / В.М. Эпштейн // IX конференция Украинского паразитологического общества:

242. Тезисы докладов. Ч. 4. - Киев: Наукова Думка, 1980. - С. 191 - 192.

243. Эпштейн В.М. Щетинконосные, черепашьи и рыбьи пиявки мировой фауны: (Системный подход к классификации и филогении): Автореф. дис. д-ра биол. наук: 03. 00. 08 / В.М. Эпштейн; Зоологический институт АН СССР. -Л., 1989.-40 с.

244. Юркевич В.В. Гирудотерапия как средство профилактики и лечения венозных тромбозов после микрохирургических операций / В.В. Юркевич, Е.А. Войновский, Н.Е. Жовнерчук // Военно-медицинский журнал. 1991. - № 7. - С. 74.

245. Яхонтов Б.В. Случай офтальмогирудиноза человека / Б.В. Яхонтов, О.И. Исмаилов //Вестник офтальмологии. 1990. - Т. 106. - № 1. - С. 66.

246. Al-Hadrani A. Hoarsenass due to leech ingestion / Al-Hadrani A., Debry C., Faucon F., Fingerhut A. // J. Laryngology and Otolaryngology. 2000. - № 2. - P. 145-146.

247. Bannatyne B.A. New growth elicited in adult leech mechanosensory neurones by peripheral axon damage / Bannatyne B.A., Blackshaw S.E., McGregor M.S. // J. Exp. Biol. 1989. - Vol. 143. - P. 419-434.

248. Barillo D.J. Aeromonas bacteraemia in burn patients / Barillo D.J., McManus A.T., Cioffi W.G. et al. // Burns. 1996. - Vol. 22. - № 1. - P. 48 - 52.

249. Baylor D.A. Patterns of regeneration between individual nerve cells in the central nervous system of the leech / Baylor D.A., Nicholls J.G. // Nature. 1971. -Vol. 232.-P. 268-270.

250. Bhattacharya D. Leech infestation and livestock health / Bhattacharya D., LahaR., Chandra M.//Asian Livestock. 1996.-Vol. 81.-№ l.-P. 11-12.

251. Blackshaw S.E. Identifying genes for neuron survival and axon outgrowth in Hirudo medicinalis / Blackshaw S.E., Babington E.J., Emes R.D. et al. // Journal of Anatomy. 2004. - Vol. 204. - Issue l.-P. 13-24.

252. Borrell N. Phenotypic identification of Aeromonas genomospecies from clinical and environmental sources / Borrell N., Figueras M.J., Guarro J. // Can. J Microbiol. 1998. - Vol. 44. - № 2. - P. 103-108.

253. Budzinski A.Z. Interaction of hementin with fibrinogen and fibrin / Budzinski A.Z. // Fibrinolysis. 1991. - Vol. 2. - P. 149-152.

254. Budzinski A.Z. Composition of salvary gland extracts from the leech Haementeria ghiliani / Budzinski A.Z., Olexa S.A., Sawyer R.T. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1981.-Vol. 168.-P. 259-265.

255. Buss A.H. The psychology of aggression. New York: Wiley, 1961. -356 p.; ill.

256. Cang J. Model for intersegmental coordination of leech swimming: central and sensory mechanisms / Cang J., Friesen W.O. // J Neurophysiol. 2002. - № 6.- P. 2760-2769.

257. Chang C.Y. Pathogenic analysis of Aeromonas hydrophila septicemia / Chang C.Y., Tompson H., Rodman N. et al. // Ann Clin Lab Sci. 1997. - Vol. 27. -№4.-P. 254-259.

258. Chang J.Y. Evidence for the underlying cause of diversity of the disulfide folding pathway / Chang J.Y. // Biochemistry. 2004. - № 4. - P. 22-29.

259. Connor N.P. Augmented blood removal after medicinal leech feeding in congested tissue Flaps / Connor N.P., Conforti M.L., Heisey D.M. et al. // Journal of Rehabilitation Research and Development. 2002. - № 4 - P. 505 - 512.

260. Cooper J.E. A veterinary approach to leeches / Cooper J.E. // Veter. Rec.- 1990.-Vol. 127.-№9.-P. 226-228.

261. Crisp K.M. Distribution and development of dopamine- and octopamine-synthesizing neurons in the medicinal leech / Crisp K.M., Klukas K.A., Gilchrist L.S. et al. // Comp Neurol. 2002. - № 1. - P. 115-129.

262. Dabb R.W. The use of medicinal leeches in the salvage of flaps with venous congestion / Dabb R.W., Malone J.M., Leverett L.C. // Ann. Plast. Surg. 1992.- Vol. 29. № 3. - P. 250 - 256.

263. Deitcher S.R. Clinical utility of subcutaneous hirudins / Deitcher S.R. // J Health Syst Pharm. -2003. № 9. - P. 27-31.

264. Di Marco S. Structure of the complex of leech-derived tryptase inhibitor (LDTI) with trypsin and modeling of the LDTI-tryptase system / Di Marco S., Priestle

265. J.P. // Structure. 1997. - Vol. 5. - № 11. - P. 1465-1474.

266. Dykes I.M. Cloning and expression of a leech complexin / Dykes I.M., Davies J.A. // Gene Expr. Patterns. 2004. - № 4. - P. 93-97.

267. Dykes I.M. Molecular basis of gap junctional communication in the CNS of the leech Hirudo medicinalis / Dykes I.M., Freeman F.M., Bacon J.P., Davies J.A. // Neuroci. 2004. - № 1. - P. 886-894.

268. Eriksson B.I. Prevention of venous thromboembolism following orthopaedic surgery: clinical potential of direct thrombin inhibitors / Eriksson B.I., Dahl O.E. // Drugs. 2004. - № 6. - P. 577-595.

269. Esch T. Evidence for sequential decision making in the medicinal leech / Esch Т., Mesce K.A., Kristan W.B. // J Neurosci. 2002. - № 12. - P. 45-54.

270. Feige K. Pharmacokinetics of recombinant hirudin in healthy horses / Feige K., Dennler M., Kastner S.B. et al. // Equine Vet J. 2004. - № 3. - P. 135-141.

271. French J.K. Adjunctive use of direct thrombin inhibitors in patients receiving fibrinolytic therapy for acute myocardial infarction / French J.K., Edmond J.J., Gao W. et al. // J Cardiovasc. Drugs. 2004. - № 4. - P. 107-115.

272. French K.A. Regeneration of a distinctive set of axosomatic contacts in the leech central nervous system / French K.A., Muller K.J. //J. Neurosci. 1986. - № 6.-P. 318-324.

273. Graf J. Symbiosis of Aeromonas and Hirudo medicinalis, the medicinal leech / Graf J. // ASM News. 2000. - № 3. - P. 147-153.

274. Granum P.E. Possible virulence factors of Aeromonas sp. from food and water / Granum P.E., O'Sullivan K., Tombs J.M. et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1998. - Vol. 21. - № 2.— P. 131-137.

275. Handfield M. Differential media for quantitative recovery of waterborne Aeromonas hydrophila / Handfield M., Simard P., Letarte R. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - Vol. 62. - № 9. - P. 3544-3547.

276. Hanninen M.L. Aeromonas species in fish, fish-eggs, shrimp and freshwater / Hanninen M.L., Oivanen P., Hirveld Koski V. // Int. J. Food Microbiol. 1997. - Vol.34.-№ l.-P. 17-26.

277. Hanninen M.L. Association of Aeromonas sp. with travellers diarrhoea in Finland / Hanninen M.L., Salmi S., Mattila L. et al. // J. Med. Microbiol. 1995.1. Vol.42. -№ l.-p. 26-31.

278. Haycraft J.B. On the action of secretion obtained from the medicinal leech on the coagulation of the blood / Haycraft J.B. // Proc. R. Soc. Lond. 1884. -Vol. 36.-№7.-P. 478-487.

279. Henderson L.P. Structural and functional analysis of synaptic transmission between identified leech neurons in culture / Henderson L.P., Kuffler D.P., Nicholls J.G., Zhang R. // J. Physiol. 1983. - Vol. 340. - P. 347-358.

280. Hendrix C.M. The changing roles of Leeches in veterinary medicine / Hendrix C.M., Shealy P.M. // Compendium on continuing Educat. Practicing Veter. -1991.-Vol. 13.-№3.-P. 447-456.

281. Hill A.A. Model of intersegmental coordination in the leech heartbeat neuronal network / Hill A.A., Masino M.A., Calabrese R.L. // Neurophysiology. -2002. №3.- P. 586-602.

282. Indergand S. Ingested blood contridutes to the specificity of the symbiosis of Aeromonas veronii biovar sobria and Hirudo medicinalis, the medicinal leech / Indergand S., Graf J. // Appl. and Environ. Microbiol. 2000. - № 11. - P. 4735-4731.

283. Jezzini S.H. Detailed model of intersegmental coordination in the timing network of the leech heartbeat central pattern generator / Jezzini S.H., Hill A.A., Kuzyk P., Calabrese R.L. // Neurophysiology. 2004. - № 2. - P. 958-977.

284. Kilb W. Mechanism of the kainate-induced intracellular acidification on leech Retzius neurons / Kilb W., Schlue W.-R. // Brain Res. 1999. - № 2. - P. 168182.

285. Klemm D.I. Leeches (Annelida: hirudinea of North America / By Donald J. Klemm. Washington: Gov. print, off., 1982. - 350 p.

286. Kristan W.B. Peripheral feedback in the leech swimming rhythm / Kris-tan W.B., Stent G.S. // In: Cold Spring Harbor Symposium on Quantitative Biology. -1976. Vol. XL. - P. 356-362.

287. Kristan W.B. Neuronal control of swimming in the medicinal leech. I. Dynamics of the swimming rhythm / Kristan W.B., Stent G.S., Ort C.A. // J. Сотр. Physiol. 1974a. - Vol. 94. - P. 97-119.

288. Kristan W.B. Neuronal control of swimming in the medicinal leech. III. Impulse patterns of the motor neurons / Kristan W.B., Stent G.S., Ort C.A. // J. Сотр.

289. Physiol. 1974b. - Vol. 94. - P. 155-176.

290. Kuffler S.W. The physiology of neuroglial cells / Kuffler S.W., Nicholls JG. // Ergeb. Physiol. Biol. Chem. Exp. Pharmakol. 1966. - Vol. 57. - P. 1-90.

291. Kuffler S.W. Glia in the leech central nervous system: physiological properties and neuron-glia relationship / Kuffler S.W., Potter D.D. // J. Neurophysiol. 1964.-Vol. 27.-P. 290-320.

292. Li Y. Bitter substances suppress afferent responses to an appetitive mixture: evidence for peripheral integration of chemosensory stimuli / Li Y., Perruccio E., Zhang X., Kleinhaus A.L. // J Neurobiol. 2001. - № 12. - P. 255-263.

293. Lin C.S. Aeromonas hydrophila sepsis presenting as meningitis and necrotizing fasciitis in a man with alcoholic liver cirrhosis / Lin C.S., Cheng S.H. // J. formos Mad Assoc. 1998. - Vol. 97. - № 7. - p. 498 - 502.

294. Lin S.H. Fatal Aeromonas hydrophila bacteremia in a hemodialysis pa-tienttreated with deferoxamine / Lin S.H., Shien S.D., Lin Y.E. et al. // Am J Kidney Dis. 1996. - Vol. 27. - № 5. - P. 733 - 735.

295. Lineaweaver W.C. Aeromonas hydrophila infections following clinical use of medicinal leeches: a review of published cases / Lineaweaver W.C. // Blood Coagul. Fibrinolysis. 1991.-Vol. 2.-№ l.-P. 201 -203.

296. Lotz R.G. Test of a life support system with Hirudo medicinalis in a sounding rocket / Lotz R.G., Baum P., Bowman G.H. et al. // Life Sci. Space Res. -1972.-№ 10.-P. 133 143.

297. Maier R.A. Comparative animal behavior / Maier R.A., Maier B.M. -Belmont, Calif.: Brocks Cole, 1970. 270 p.

298. Mesce K.A. Metamodulation of the biogenic amines: second-order modulation by steroid hormones and amine cocktails / Mesce K.A. // Brain Behav Evol. 2002. - Vol. 60. - P. 339-349.

299. Milde H. Regulation of Na+ transport across leech scin by peptide hormones and neurotransmitters / Milde H., Weber W-M., Salzet M., Clauss W. // J. Exp. Biol.-2001.-№8.-P. 1509-1517.

300. Moses A.E. Aeromonas hydrophila myonecrosis accompanying mucormycosis five years after bone marrow transplantation / Moses A.E., Leibergal M., Ka-hav G. et al. // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 1995. - Vol. 14. - № 3. - P. 237 -240.

301. Moyer K.E. Kinds of aggression and their physiological basis / Moyer K.E. // Communications in Behavioral Biology. 1968. - № 2. - P. 65-87.

302. Moyer K.E. The psychobiology of aggression / Moyer K.E. New York: Harper and Row, 1976. - 350 p.

303. Miiller A. Ionic mechanism of 4-aminopyridine action on leech neuropile glial cells / Miiller A., Dierkes P. W., Schlue W.-R. // Brain Res. 1999. - № 1. - P. 63-73.

304. Murakami T. Hypercalcemia associated with Aeromonas hydrophila gastroenteritis / Murakami Т., Inoue Т., Kawakami H. et al. // Acta. Paediatr. Jph. -1995. Vol. 37.-№ 2. - P. 192-195.

305. Nicholls J.G. Specific modalities and receptive fields of sensory neurons in CNS of the leech / Nicholls J.G., Baylor D.A. // J. of Neurophysiology. 1968. -Vol. 31.-P. 740-756.

306. Nicholls J.G. The nervous system of the leech / Nicholls J.G., van Essen D. // Scientific American. 1974. - Vol. 230. - P. 38-48.

307. Ort C.A. Neuronal control of swimming in the medicinal leech. II. Identification and connections of motor neurons / Ort C.A., Kristan W.B., Stent G.S. // J. Сотр. Physiol. 1974. - Vol. 94. - P. 121 - 154.

308. Petrauskiene L. Water and sediment toxicity assessment by use of behavioural responses of medicinal leeches / Petrauskiene L. // Environ Int. 2003. - № 3. -P. 729-736.

309. Ready D. Identified neurons isolated from the leech CNS make selective connections in culture / Ready D., Nicholls J.G. //Nature. 1976. - Vol. 281. - P. 6769.

310. Richerson J.T. Aeromonas, acclimation and penicillin as complication when leech are applied to skin flaps in rabbits / Richerson J.T., Davis J.A., Meystrik R. // Lab. Anim. 1990. - Vol. 24. - № 2. - P. 147-150.

311. Rodriguez M.J. Modulation of mechanosensory responses by motoneurons that regulate skin surface topology in the leeeh / Rodriguez M.J., Iscla I.R., Szczupak L. // J Neurophysiol. 2004. - № 5. - P. 2366-2375.

312. Sawyer R.T. Leech biology and behaviour / Sawyer R.T. Oxford: Clarendon press, 1986. - 210 p.

313. Skoll P.J. Aeromonas hydrophila in burn patients / Skoll P.J., Hudson D.A., Simpson J.A. // Burns. 1998. - Vol. 29. - № 4. - P. 350 - 353.

314. Stuart A.E. Physiological and morphological properties of motoneurones in the central nervous system of the leech / Stuart A.E. // J. Physiol. 1970. - Vol. 209.- P. 627 646.

315. Takano Y. Fulminant pneumonia and sepsis due to Aeromonas hydrophila in an alcohol abuser / Takano Y., Asao Y., Kohri Y. et al. // Intern. Med. 1996.- Vol.35.-№5.-P.410-412.

316. The IUCN Amphibia Reptilia RED DATA BOOK, 1983. - Part 1. - P. 205-211.

317. Trueta C. Somatic exocytosis of serotonin mediated by 1-type calcium channels in cultured leech neurons / Trueta C., Mendez В., De Miguel F.F. // J. Physiol. 2003. - Vol. 547. - P. 405-416.

318. Tsai G.J. Incidence and toxigenicity of Aeromonas hydrophila in seafood / Tsai G.J., Chen Т.Н. // Int. J. Food Microbiol. 1996. - Vol. 31. - № 1-3. - P. 121 -131.

319. Utsalo S.J. Aeromonads in acute diarrhoea and asymptomatic infections in Nigerian children / Utsalo S.J., Eko F.O., Antia-Obong O.E. et al. // Eur. J. Epide-moil.- 1995.-Vol. 11.-№2.-P. 171-175.

320. Velazquez-Ulloa N. Convergence of mechanosensory inputs onto neu-romodulatory serotonergic neurons in the leech / Velazquez-Ulloa N., Blackshaw S.E., Szczupak L. et al. // J. Neurobiol. 2003. - Vol. 54. - P. 604-617.

321. Von Bernhardi R. Contact between identified leech neurones in culture prevents retraction of neurites following electrical activity / Von Bernhardi R. // J Exp. Biol. 1998.-№4. -P. 135-141.

322. Whitlock M.R. The medicinal leech and its use in plastic surgery: a possible cause for infection / Whitlock M.R., O'Hare P.M., Sanders R. et al. // Br. J. Plast. Surg. 1983. - Vol. 36. - № 2. - P. 240 - 244.

323. Willard A.L. Effects of serotonin on the generation of the motor program for swimming by the medicinal leech / Willard A.L. // J. Neurosci. 1981. - № 1. - P. 936-944.

324. Wilson E.O. Sociobiology: The new synthesis Cambridge, Mass.: Harvard University Press, 1975. - 280 p.

325. Zaccardi M.L. Nonassociative learning in the leech Hirudo medicinalis / Zaccardi M.L., Traina G., Cataldo E., Brunelli M. // J Behav. Brain Res. 2001. - № 29.-P. 81-92.

326. Zhang X. Chemical and thermal stimuli have short-lived effects on the Retzius cell in the medicinal leech / Zhang X., Wilson R.J., Li Y., Kleinhaus A.L. // J Neurobiol. 2000. - Vol. 43. - P. 304-311.

327. Zoccolan D. Highly variable spike trains underlie reproducible sensorimotor responses in the medicinal leech / Zoccolan D., Pinato G., Torre V. // J Neurosci.-2002,-№ 12.-P. 79-80.

Информация о работе

Рассадина, Екатерина Владимировна
кандидата биологических наук
Ульяновск, 2006
ВАК 03.00.23

Диссертация

Экологически обоснованная биотехнология воспроизводства Hirudo medicinalis L. в лабораторных условиях - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы