Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Разработка методов выделения и идентификации бактерий Afromonas hydrophila

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Разработка методов выделения и идентификации бактерий Afromonas hydrophila"

На правах рукописи

Канаева Татьяна Ивановна

РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИЙ АЕШШО^в НУБЯОРШЬА

03.00.23 - биотехнология 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Саратов - 2009

003487989

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия»

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Васильев Дмитрий Аркадьевич доктор медицинских наук Нафеев Александр Анатольевич

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, старший научный сотрудник Дыкман Лев Абрамович доктор биологических наук, профессор Новиков Борис Валентинович

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Оренбургский государственный аграрный университет»

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 года в часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова» по адресу: г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова»

Автореферат диссертации разослан «Л?» ноября 2009 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор Л.В. Карпунина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Как в России, так и за рубежом регистрируется рост пищевых инфекций. По информации ВОЗ (1999) ежегодно в мире острыми кишечными инфекциями (ОКИ) болеют 2 млрд. человек. В России из более чем 5 млн. случаев ОКИ, зарегистрированных за период с 1989 по 1999 гг., этиология половины (55,6 %) не установлена (Равллов, Гильмутдинов, Хусаинов, 1999). Одной из причин этого является то, что диагностические и профилактические бактериологические исследования предусматривают поиски и выделение лишь ограниченного числа патогенных микроорганизмов - в первую очередь возбудителей кишечных инфекций. Однако, этиологическое значение в заболевании людей могут приобретать самые разнообразные микроорганизмы, среди которых и Aeromonas hydrophila (Gibbs, Shawn, Mark, 2008).

Бактерии A. hydrophila являются возбудителями инфекционных патологий рыб и других гидробионтов, животных и человека. Биологическая особенность этих микроорганизмов заключается в их способности к свободному обитанию в пресной и соленой воде. Особую опасность для человека представляют контаминированые аэромонадами вода и морепродукты (рыба, ракообразные, моллюски), а также продукты растительного и животного происхождения.

Микроорганизмы данного вида представляют серьезную проблему для многих стран Европы и Азии, в которых аэромоиадная инфекция составляет от 1 до 10 % острых кишечных заболеваний у взрослых и до 50 % у детей (Agger, Cormick, Gurwith, 1985). В США A.hydrophila являются причиной 13 % острых кишечных инфекций (Schadich, Cole, 2009).

При заражении бактериями A.hydrophila у людей с ослабленным иммунитетом может развиться септицемия и в этом случае инфекция приобретает угрожающий жизни характер, поражая мозг, кости, почки, глаза, мягкие ткани. В результате у пациентов с таким заражением развивается пневмония, менингит, остеомиелит, септический артрит, гангренозные поражения кожи и т.п. (Zhiyong, Xiaoju, Yanyu, 2002).

Статистических данных о циркуляции аэромонад в объектах ветеринорно-саннтарного надзора в нашей стране не существует. Вместе с тем, роль A.hydrophila в возникновении пищевой инфекции уже доказана. Целенаправленного поиска

аэромонад в пищевом сырье и продуктах, не проводится, так как наличие этих микроорганизмов не регламентируется действующими нормативными документами Кроме этого, практические бактериолога имеют недостаточный комплект методических разработок по выделению и идентификации бактерий рода Аеготопая. А более детальная идентификация отдельных подвидов А.ИуФорЬИа стала разрабатываться лишь в последнее время.

Цель исследования - разработка методов выделения и идентификации бактерий витАеготопаз ЪуЛгоркИа из объектов ветеринарно-санитарного надзора.

Задачи исследования:

1. Изучить биологические свойства бактерий втаА.Ьу^орИНа.

2. Разработать транспортную среду, среду накопления и селективную среду для выделения бактерий вида АМуйгорИИа.

3. Разработать схему выделения и идентификации бактерий вида АМуФорИИа из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

4. Изучить распространение бактерий вида А.Иус1горЫ1а.

5. Создать биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации А.куФорИПа методом планшетной реакции агглютинации (РА).

Научная новизна работы. Разработана оптимальная схема выделения и идентификации бактерий вида А.кус}горЫ1а из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированы новые среды накопления, селективная и транспортная для выделения бактерий вида А.Иус1горЫ1а, а также среда для внутривидовой дифференциации данных бактерий. Изучено распространение аэромонад в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Создан биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации А.кус1горЫ1а методом пластинчатой РА.

Практическая значимость работы. Предложенная в диссертационной работе схема позволяет выделять и идентифицировать штаммы А.Ьус1горЫ1а из пищевого сырья, пищевых продуктов и объектов внешней среды. С помощью сконструированной дифференциальной среды появилась возможность определять биовариацты А.куЛгоркНа. Сконструирован биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации бактерий видаЛ.йуЛ-орйг'/я методом пластинчатой РА.

По материалам диссертационной работы предложена «Инструкция по выделению и идентификации бактерий Леготопая 1лус1горЫ1аъ, разработанная для сотрудников медико-биологических научных учреждений, врачей бактериологических лабораторий, в помощь работникам рыбоводческих хозяйств, определяющая временный порядок и правила проведения лабораторных исследований по выделению и идентификации данных бактерий. Материалы диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций, для практических занятий студентов, работы аспирантов на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Транспортная среда (УГСХА-тр.А.Ь.) позволяет сохранять жизнеспособность бактерий вида А.ку<1горМ1а при перевозке проб исследуемого материала до лаборатории. Среда накопления (УГСХА-1А.Ь.) способствует максимальному росту и размножению аэромонад. Плотная селективная среда (УГСХА-2А.Ь.) высоко специфична и обеспечивает рост большинства штаммов данного вида микроорганизмов. Дифференциальная среда для б поваров Аеготопая НуФоркНа позволяет осуществлять идентификацию до подвида.

2. Оптимальная схема дает возможность за 48 ч выделять и идентифицировать бактерии вида А.Иус1горкНа из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

3. Бактерии А.кус/горЬИа широко распространены в объектах санитарного надзора: выделяются из открытых водоемов, сточной воды и речной рыбы, при этом имеют стабильную сезонность.

4. Диагностический биопрепарат позволяет идентифицировать АМу&оркИа методом пластинчатой РА.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно-исследовательской темы: «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2006, 2007, 2008), Международных научно-практических конференциях «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 126 страницах, включают 20 рисунков, 18 таблиц. Список использованных литературных источников содержит 126 наименований, в том числе 81 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы н методы исследования

Штаммы: В работе было использовано 2 референс-штамма бактерий Aeromonas hydrophila 01 и 02, полученные из музея кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ВСЭ Ульяновской ГСХА, а также 52 штамма выделенных из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Помимо этого, при определении специфичности сконструированных сред, а также в других исследованиях использовались 21 штамм бактерий Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonasputida; Proteus mirabilis; Citrobacter freundii; Escherichia coli; Morgcmella morganii; Proteus vulgaris; Klebsiella pneumoinae; Enterobacter cloacae; Pastewella multocida; Providencia rettgeri; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia enterocolitica; Listeria monocytogenes; Staphylococus aureus, полученные из музея кафедры.

Питательные среды: Для бактериологического исследования использовали следующие готовые питательные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), мясо-пептонный агар (МПА) (НПО

«Питательные среды», г. Махачкала), среда Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), среда Клиглера (НИИ питательных сред, г. Макачкала), триптон-кровяной агар (Difco), соевый агар (Difco), среды Гисса с индикатором Андраде (глюкоза, лактоза, сахароза, манит, арабипоза, рамноза, дульцит, раффиноза, ксилоза, адонит, инозит, салицин) (НПО «Питательные среди», г. Махачкала), очищенный агар (Difco), DNA base (Difco), биохимические тест-системы для ускоренной идентификации микроорганизмов (НИИЭМ им. Пастера, г. Санкт-Петербург).

Приборы н оборудование: Холодильники бытовые и минусовые, микропланшетный фотометр Anthos Labtec Instruments (Австрия), ультратермостаты УТ-15У4-2, термостаты ТС-80М-2, микроскоп «Биомед б» с видеофотонасадкой, микроскопы МБИ-3, электронный микроскоп JEM-7A (Япония), ультразвуковой дезинтегратор «Soniprep 150» (Великобритания) с частотой 23 кГц, лабораторная центрифуга СМ-6М (Латвия), лупа бинокулярная МБС-9, колбы мерные, пипетки, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 мл, стекла покровные, стекла предметные, чашки Петри, пробирки, петли пастеровские, штампы-пробойники, вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия).

Методы: В работе использовались методы для выделения бактерий вида A.hydrophila на триптон-кровяном агаре (ТВА) (Difco) предложенные В.Е. Rose и A.J.G. Okaend (1998), на триптон-соевом агаре (Difco) L. Solei (2003), метод выделения с помощью среды Шмита-Шантелье по М.А. Сидорову (1995). Часть исследований проводили по рекомендациям «Методы исследований объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады», разработанные Московским научно-исследовательским институтом гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана в 1980 году. Морфологические, культурстъиые, биохимические свойства определяли по методам рекомендованным A.C. Лабинской (1974). Для выявления капсулообразования применяли окраску по методу Ольта (Сидоров, 1995). Подвижность бактерий исследовали двумя методами: «висячая капля» и посев «уколом» в полужидкий агар (Лабинская, 1974). Фенотипическое определение вирулентных факторов - по методам предложенным В.Е. Rose и A.J.G. Okaend (1998). Для определения чувствительности A.hydrophila к химиотерапевтическим средствам использовали метод диффузии в агар с применением стандартных дисков, содержащих антибиотики (Паркер, 1988). Реакцию иммунодиффузии (РИД) по

Оухтерлони (Остерман, 1983). Постановку реакции агглютинации осуществляли пробирочным и капельным методами (Фримель, 1979).

Статистическую обработку результатов проводили по методу И.А. Ойвина (1960). Эксперименты проводились не менее чем в трех повторениях. Нами учитывались лишь те результаты, достоверность которых была не ниже 95 %.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Изучение специфичности существующих сред для выделения A.hydrophila

В рамках диссертационных исследований изучали специфичность действия трёх существующих и рекомендованных к применению авторами селективных сред: А-1 и А-2, триптон-кровяной агар (ТВА) с добавлением 5 % дефибринированной крови и ампициллина, среда Шмита-Шанделье. По нашим данным на испытанных средах растут как штаммы A.hydrophila, так и ассоцианты данных бактерий. Отсутствие ингибиторов в среде А-2 позволяет выживать и расти на ней большинству бактерий из сопутствующей микрофлоры (Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida; Citrobacter freundii; Escherichia coli; Klebsiella pneumoinae; Enterobacter cloacae; Providencia rettgeri; Yersinia pseudotubercidosis; Yersinia enterocolitica). Среда ТВА, хотя и содержит селективный агент, все же не обладает высокой специфичностью, т.к. наблюдается рост Klebsiella pneumoinae, Enterobacter cloacae, Yersinia pseudotuberculosis. Кроме того, на среде ТВА с ампициллином не растут антибиотикочувствительные и негемолитические штаммы A.hydrophila. На среде Шмита-Шантелье по нашим данным растут не только аэромонады, но и Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida. Отсюда следует, что селективные свойства испытанных сред недостаточны.

Конструирование среды накопления Из результатов наших исследований по определению чувствительности A.hydrophila к химиотерапевтическим средствам следует, что наиболее приемлемым селективным агентом длй селективной среды, был бы ампициллин, доксициклин или пенициллин. Но некоторые виды из возможных ассоциантов (Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoinae, Enterobacter cloacae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica) так же устойчивы к данным антибиотикам. Кроме того, некоторые штаммы A.hydrophila являются

ампициллинчуветвительными, другие неустойчивы по отношению к доксициклину. Таким образом, мы пришли к выводу, что антибиотики нельзя использовать в виде селективного агента в среде для выделения А-куйгорИИа.

Чувствительность к красителям - один из критериев в систематике микроорганизмов. В результате проведенных нами опытов, выяснили, что селективный агент должен состоять из 3 г/л конго-рота, так как 94,4 % штаммов возможных ассоциантов чувствительны к данной концентрации красителя и не растут на испытуемой среде, и 0,1 г/л кристаллического фиолетового (33,3 % чувствительных штаммов из возможных ассоциантов). В качестве азотно-витамшшой основы использовали дрожжевой экстракт, а в качестве источника углерода -мальтозу. Проведя испытания, выяснили, что лучшие показатели по количеству КОЕ имеет образец питательной среды, содержащий 4,0 г дрожжевого экстракта и 3,5 г мальтозы. Хорошей минеральной базой оптимального состава для А.}тус!горЫ1а является набор солей фосфата калия двузамещенного (2,0 г) и семиводного сульфата магния (5,0 г). Соли калия, магния и фосфора стимулируют синтез микробной клетки А.ЬуйгорЪИа, а для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. Таким образом, данный набор солей целесообразно включить в селективную среду в применяемых дозах. Во избежание выпадения селективного агента в осадок и равномерного распространения его во всей среде решено было добавить желатин (1 %), учитывая также, что желатин является растворимым белком, а бактерии АМус1горЫ1а обладают протеолитической активностью и способны разжижать желатин.

В результате вышеизложенных исследований, предложенный нами рецепт среды накопления для бактерий А.кус1горЫ1а УГСХА-1А.Ь. имеет следующий состав: вода дистиллированная - 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; мальтоза - 3,5 г; К2НР04 - 2,0 г; - 5,0 г; желатин - 10,0 г; конго-рот - 3,0 г; кристаллический

фиолетовый - 0,1 г. Дрожжевой экстракт вносили в 1000 мл холодной воды, медленно нагревали. Затем последовательно добавили калий фосфорнокислый двузамещенный и магния сульфат, мальтозу, конго-рот (в виде 0,3 % водного раствора) и кристаллический фшолетовый (в виде 0,01 % водного раствора). Кипятили 2-3 минуты, при постоянном помешивании. В бульон вносили желатин и оставляли для набухания на 1 час, затем подогревали в водяной бане при 40-50 °С до полного

расплавления желатина. После этого горячую среду фильтровали через ватно-марлевый фильтр и разливали в стерильные пробирки по 5 мл. Стерилизовать при 110 °С 30 минут. Цвет среды красно-коричневый. Оптимальное время культивирования составляет 24 часа. Предложенная среда УГСХА-1А.Ь. обладает высокой специфичностью (отсутствует рост ассоциантов).

Конструирование плотной селективной среды и дифференциально-диагностической среды для А.куЛгорМ1а

Прототипом плотной селективной среды послужила среда накопления УГСХА-1А.Ь., к которой вместо желатина был добавлен агар-агар. Состав: вода дистиллированная - 1000 мл; агар-агар - 15 г; дрожжевой экстракт - 4,0 г; мальтоза -3,5 г; К2НРО4 - 2,0 г; - 5,0 г; конго-рот - 3,0 г; кристаллический фиолетовый -

0,1 г. Цвет среды красно-коричневый. Колонии А.кус1горЫ1а на данной среде округлые, выпуклые, блестящие, до 3 мм в диаметре, светло-бежевые, без изменения цвета среды под ними. Плотная среда позволяет проводить селекцию бактерий вида А.кус1горкИа по морфологии колоний и является также высоко специфичной.

Вид Аеготопая куЛгорИИа включает биовары: А. Нус1горЫ1а ¡иЬзр. ёкакепхЬ; А. Ьус1юрМ1а ¡иЬзр. Иус1горЫ1а; А. ИуйгорЫ1а БиЬБр. гапае; А. Иус!горЫ1а яиЬхр. anaerogenes; А. Иус1горЫ1а яиЬхр. с1есо1огаиоп1$, имеющих сходные биохимические характеристики, композицию ДНК и последовательность нуклеотидных образований. Для внутривидовой дифференциации нами была разработана среда, которая позволяет сократить набор тестов до минимума, к тому же он менее трудоемок и требует меньших затрат времени и посуды. Состав среды следующий: МПБ - 1000 мл, Ь-арабиноза - 10 г, Б-сахароза - 1 г, натрий хлорид - 5 г, агар-агар - 20 г, феноловый красный (0,2 % раствор в 50 % этиловом спирте) - 12 мл. Дифференциацию основывали на различие следующих ферментативных свойств: кислотообразование из Ь-арабинозы и Э-сахарозы, гидролиз мочевины и образование газа.

Разработка схемы выделения бактерий АМуйгорЬИа

Разработку бактериологического метода выделения и идентификации проводили, используя свойство разработанных сред: накопительной и плотной селективной, а также референс-штаммов А.куёюркИа 01 и 02. Производили посевы исследуемого материала на среду накопления. Спустя 24 часа культивирования при

температуре 37 °С на среде VrCXA-lA.h. наблюдали рост бактерий и разжижение желатина. Второй этап: со среды накопления пересевали культуру на плотную селективную среду УГСХА-2А.Ь. и среду IBA с добавлением 5 % дефибринированной крови. Спустя 24 часа культивирования при 37 °С на плотной селективной среде наблюдали рост округлых, выпуклых, бежевых, блестящих колоний, 3 мм в диаметре. Выделенные бактерии проверяли и окончательно идентифицировали с помощь окраски по Граму, с последующей микроскопией, тестов на оксидазу, индол, уреазу, триптофан, OF-теста, реакции на углеводы, наличие аргининдигидролазы, лизиндекарбоксилазы и орнитиндекарбоксилазы, образование сероводорода. На среде ТВА с кровью и DNA агаре вокруг колоний A.hydrophila спустя 48 ч культивирования появляется широкая зона лизиса. Схема выделения представлена на рисунке 1.

исследуемый материал

П накопптельиая среда УГСХА- 1A.1i.

и

I

селективная среда УГСХА - 2A.li.

Бпктеппологпчвгкяя идентификация:

-морфология клеток -т цнкт сриаль иые ев о йстка -ОР-тест

-определение окепдазы н ннтратредуктазы -ферментация ыялыочы, лактозы, глюкозы, сахарозы, арабпнозы, ыаннта. инозпта п ксилозы -проба на пндол -реакция Фоте са - Проскауэра -выявления фермента уреазы -декарбоксплазяая активность

Рис. 1. Схема выделения Аеготопаз куёгорИИа Предложенная схема позволяет выделять и идентифицировать бактерии A.hydrophila за 48 часов. С помощью данной схемы нами выделено 52 штамма бактерий вида А.куёгорЫЬ из проб от объектов окружающей среды, пищевого сырья

и пищевых продуктов. Были исследованы пробы морской рыбы, поступающей на рынки города Ульяновска в замороженном состоянии, а так же речной рыбы из местных водоемов. Кроме того, проводились исследования по обнаружению аэромонад в пробах водь( из открытых водоемов Ульяновской области, сточных водах и водопроводной воде Ульяновска. Также были исследованы пробы сырого молока, мяса и мясных продуктов, яйца, овощи и фрукты на контаминацию А.)гус1гор1гИа. Результаты исследования различных проб представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Результаты исследования объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов на контаминацию бактериями

Aeromonas hydrophila

Контаминация

№ Название и количество проб бактериями Аеготопая

п/п hydrophila (кол-во

выделенных штаммов)

1 Замороженная морская рыба (36 проб) + (2 штамма)

2 Свежая речная рыба (62 пробы) + (7 штаммов)

3 Вода из открытых водоемов (189 проб) + (24 штаммов)

4 Сточные воды (158 проб) + (16 штаммов)

5 Водопроводная вода (57 проб) + (1 штамм)

6 Молоко (31 проб) + (2 штамма)

7 Мясо и мясные продукты (43 пробы) -

8 Яйца (11 проб) -

9 Овощи (6 проб) -

10 Фрукты (4 пробы) -

Примечание: «+» случаи контаминации Aeromonas hydrophila; «-» отсутствовала контаминация Aeromonas hydrophila.

Наибольшее количество выделенных бактерий А.куйгоркИа приходится на открытые водоемы, сточные воды и речную рыбу. Из таких продуктов, как яйца, овощи, фрукты, а так же мяса и мясных продуктов изучаемых бактерий не выделено.

Изучили морфологические и биохимические свойства выделенных бактерий. Благодаря данным световой и электронной микроскопии мы установили, что выделенные нами A.hydrophila это прямые палочки с закругленными концами, располагаются поодиночке, парами, цепочками, подвижные (монотрихи). Бактерии имеют капсулу, микрокапсулу, кроме жгутиков в некоторых штаммах просматриваются пили. По Граму окрашивались отрицательно. Все выделенные штаммы A.hydrophila были оксидазоположительными, образовывали индол, давали положительные результаты в реакции с метиловым красным и реакции Фогеса-

Проскауэра. На среде Хью-Лейфсона изменение цвета наблюдалось во всех пробирках, это говорит о том, что все выделенные микроорганизма относятся к факультативнам анаэробам. Положительные по аргининдигидролазе и отрицательные по лизиндекарбоксилазе и орнитиндекарбоксилазе. Выделенные штаммы не одинаково реагируют с углеводами, гидролизуют мочевину, образуют сероводород. Это связано с наличием внутри вида деления на биоварианты с разной биохимией. Для фенотипического определения вирулентных факторов определяли наличие гемолитической активности у выделенных штаммов на триптон-кровяном агаре (Difco) с добавлением 5 % дифибринированной крови. Протеолитическую активность проверяли на питательном бульоне с желатином. ДНКазную активность на среде DNA ВА (Difco). Все выделенные бактерии отличаются по вирулентности. Так наиболее вирулентными по нашим данным являются штаммы выделенные из сточных вод и открытых водоемов, атак же молока.

Выживаемость A.hydrophila на разработанной транспортной среде Для перевозки проб исследуемого материала до лаборатории рекомендуем использовать транспортную среду УГСХА-тр.А.1т Она содержит желатин (5 %), уплотняющий среду, и необходимые питательные вещества. Мы исследовали температурную устойчивость и выживаемость бактерий A.hydrophila. В работе были использованы 1 референс-штамм A.hydrophila и 12 штаммов выделенных нами из различных объектов окружающей среды и патологического материала, а так же пищевых продуктов. Рост бактерий проверяли на среде УГСХА-тр.А.Ь. и плотной селективной среде УГСХА-2А.Ь., при -4, +5, +30, +41, +45 °С, в течение от 1 до 4 суток. Рост бактерий A.hydrophila при -4 °С не наблюдался, но при высевании из пробирок с замороженными бульонными культурами на агар и инкубации чашек в термостате при оптимальной температуре (30 °С), наблюдался характерный рост бактерий A.hydrophila. Данные бактерии могут находиться в замороженном состоянии на среде УГСХА-тр.А.Ь. до 12 месяцев, в бытовом холодильнике (при температуре +5 °С) до 4 месяцев. При температуре +5 °С в пробирках со средой УГСХА-тр.А.Ь. наблюдали рост аэромонад спустя 48 часов, в то время как на чашках, вырастали мелкие колонии уже через 24 часа. Температура +30 °С является оптимальной для роста бактерий A.hydrophila, спустя 24 часа в пробирках наблюдается характерный рост, а на чашках с УГСХА-2А.Ь. образование колоний. Температура +41 °С

считается не приемлемой для роста аэромонад, однако 10 из 12 проверяемых нами штаммов росли при данной температуре как в пробирках с транспортной средой, так и на чашках с УГСХА-2А.Ь. Референс-штамм также имел характерный рост на данных средах, спустя 24 часа А вот при температуре +45 °С не наблюдалось роста ни в пробирках, ни на чашках Петри. Соответственно температурные границы роста бактерий АМусЗгорЬНа составляют от +5 °С до +41 "С и выживаемость бактерий на среде УГСХА-тр.А.Ь. при температуре +5 °С достигает 4 месяцев.

Особенности распространения бактерий А.куЛторЫ1а Наиболее распространены бактерии А.Иу&орИИа в воде открытых водоемов. Исследовали 128 проб озёрной воды и 60 проб речной воды Ульяновской области. Из озерной воды данный микроорганизм выделяли в 9,1 % исследуемых проб. Из речной воды - в 2,7 % проб. По нашим данным, наибольшее количество выделяемых бактерий приходится на период мая-августа. Из 24 случаев выделения бактерий А.ИуёгорЫ1а из воды открытых водоемов показатели сезонности по месяцам распределяются следующим образом: январь - 0, февраль - 0, март - 2, апрель - 2. май - 5, июнь - 10, июль - 12, август - 9, сентябрь -2, октябрь - декабрь-0.

Конструирование антигенного препарата для идентификации А.ку<1горЫ1а Одной из задач диссертационной работы была конструирование диагностического биопрепарата для идентификации бактерий А.кус1горкИа. Мы учли, что антигены бактерий А.кус1горЫ1а локализуются в жгутиках, капсуле, клеточной стенке, рибосомах, цитоплазматической мембране и цитоплазме. Для получения гипериммунных сывороток, мы предложили собственную схему гипериммунизации кроликов и набор антигенов АМу^орИИа. Накопление бактериальной массы осуществляли на МПБ в термостате в течение 48 ч, при температуре 37 °С, затем для очистки клеток от питательного субстрата двукратно центрифугировали на аппарате СМ-6М при 1900 g в течение 20 мин и ресуспензировали физиологическим раствором. Наработанную бактериальную массу разделили на 4 образца. Для инактивации А.Ъу&оркИа в один из образцов был добавлен мертиолят (1:10000), другой подвергся кипячению на водяной бане в течение 30 мин. В третий добавили мертиолят (1:10000) и для дезинтеграции 0,25 % ББЗ (додецилсульфат натрия) детергент, разрушающий нативную структуру клетки. Четвертый образец, после добавления мертиолята (1:10000), подвергли ультразвуковой дезинтеграции с

помощью прибора «Soniprep 150» (частота 23 кГц) при охлаждении спиртом со льдом. Первоначально для получения ультразвукового антигена был проведен опыт по выбору оптимальной амплитуды для максимального разрушения клеток ультразвуком. Стерильные пробирки (эппендорф на 1,5 мл) заполняли 1,0 мл культуры, ставили в акустическую камеру дезинтегратора, так чтобы подающая энергию насадка была опущена в среду на 1 см и поочередно выставляли амплитуду ультразвуковых колебаний: 3 мк, 5 мк, 7 мк. По результатам микроскопии установили, что оптимальной является амплитуда в 7 мк.

Таким образом, получили готовые антигенные препараты 4-х видов (Т — антигенный препарат подвергшийся кипячению; М - антигенный препарат с добавленным мертиолятом; SDS - антигенный препарат содержащий SDS; УЗ -антигенный препарат обработанный на ультразвуковом дезинтеграторе). Проверили данные антигенные препараты на стерильность и получив отрицательные результаты (отсутствие колоний на агаре спустя 48 ч инкубации), антигенные препараты стандартизировали по показателям оттеской плотности с помощью микропланшетного фотометра Anthos Labtec Instruments (Австрия) приведя их к единым цифрам - 0,620-0,650 нм.

В результате гииериммунизации кроликов получили сыворотки А, В, С и D. Для выяснения антигенного действия применяемых суспензий определяли динамику образования агглютининов в ответ на гипериммунизацию кроликов. Установили, что титр антител, регистрируемых в РА, имеет значительную разницу при гипериммунизации различными антигенными препаратами, так максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение ультразвукового дезинтеграта и равна к 10 дню гипериммунизации 1:80. К 20 дню титр антител вырос до 1:320 и оставался самым высоким. В дальнейшем изучали структуру антигенных препаратов для выбора наиболее оптимального, содержащего наибольшее количество антигенных детерминант. С этой целью нами была использована реакция диффузионной преципитации (РДП). В результате в двух случаях, между центральной лункой, содержащей сыворотку А и В и лунками, заполненными исследуемыми антигеными препаратами, образовывалось по одной полосе преципитации, причем линии преципитации полностью сливались, что говорит об идентичности антигенов. Между центральной лункой содержащей сыворотку С и

лунками заполненными антигенным препаратом, содержащим ЗБЭ и УЗ образовывались две полосы преципитации (что говорит о наличие в системе как минимум двух комплексов антиген-антитело) (рис. 2а). Между центральной лункой содержащей сыворотку О и: лунками заполненными Т и М образовывалось по одной линии преципитации, лункой заполненной антигенным препаратом, содержащим ЗОЭ - две полосы преципитации, и одной лункой, заполненной ультразвуковым дезинтегратом наблюдалось 3 полосы преципитации (рис. 26).

Рис. 2. Результаты РДП а - РДП с полученной гипериммунной сывороткой (С) и изготовленными антигенами (М,

Т, ЗОБ, УЗ);

б - РДП с полученной гнпериммунной сывороткой (Б) и изготовленными антигенами (М,

Т, ЗОЭ, УЗ)

Благодаря проведенным исследованиям был выбран антигенный препарат бактерий А.кус1горкИа содержащий до 3-х специфических антигенов, что позволило сконструировать серологический комплект для антигенной идентификации выделенных бактерий, включающий гипериммунную сыворотку и ультразвуковой антиген. Для проверки данного препарата исследовали выделенные «полевые» штаммы А.кус1горЫ1а в пластинчатой реакции агглютинации. Получив положительные результаты пришли к выводу, что данный биопрепарат можно использовать для антигенной идентификации выделенных бактерий методом РА.

ВЫВОДЫ

1, Для выделения бактерий Леготопая кус1горЫ1а сконструированы и предложены среды обладающие специфичностью и высокой чувствительностью: транспортная, накопительная, селективная.

2. Сконструирована оптимальная схема выделения и идентификации А.куёгоркИа из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, позволяющая выделять и идентифицировать данные бактерии за 48 часов.

С помощью предложенной схемы нами было выделено 52 штамма бактерий вида A.hydrophila.

3. Изучены культуральные, морфологические и биохимические свойства бактерий A.hydrophila, позволившие сконструировать среду для внутривидовой диагностики аэромонад и тилировать 2 штамма выделенных в Ульяновской области как A. hydrophila subsp. dhakensis, еще 2 штамма - как A. hydrophila subsp. anaerogenes, все остальные выделенные нами штаммы являются биоварами А. hydrophila subsp. hydrophila.

4. Изучено распространение бактерий вида A.hydrophila в объектах санитарного надзора. Наибольший процент выделенных бактерий A.hydrophila приходится на открытые водоемы, сточные воды и речную рыбу.

5. Сконструирован диагностический биопрепарат для идентификации бактерий A. hydrophila методом пластинчатой РА.

Практические предложения

□ Предложены среды накопления, селективная и транспортная для выделения бактерий A.hydrophila, а также дифференциальная среда для определения биовариантов A.hydrophila.

U Предложена новая схема выделения и идентификации штаммов A.hydrophila из пищевого сырья, пищевых продуктов и объектов внешней среды.

G Предложен диагностический биопрепарат для идентификации бактерий A. hydrophila методом пластинчатой РА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Васильев, Д.А. Тесты по идентификации Pseudomonas aeruginosa и Aeromonas hydrophila / Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, Т.И. Елантьева, И.Р. Насибуллин // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 26-28 апреля, 2005. -Ульяновск, 2005. - Ч. 5. - С.230-233.

2. Васильев, Д.А. Токсины Aeromonas hydrophila / Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, Т.И. Елантьева, И.Р. Насибуллин // Современное развитие АПК: региональный опыт, проблемы, перспективы: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 26-28 апреля, 2005. - Ульяновск, 2005. - Ч. 5. - С.233-236.

3. Канаева, Т.Н. Распространение бактерии Aeromonas hydrophila и ее роль в патогенезе человека / Т.Н. Канаева, И.Р. Насибуллин // Молодежь и наука XXI века: Материалы Международной научно-практической конференции, 21-23 марта 2006. -Ульяновск, 2006. - С.352-356.

4. Канаева, Т.И. Обзор по выделению и идентификации бактерий вида Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, Э.А. Афонин, С.Н. Золотухин // Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных: Материалы Международной научной конференции, 21-23 июня 2006. -Ульяновск, 2006. - С.93-96.

5. Канаева, Т.И. Ускоренный метод внутривидовой дифференциации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Э.А. Афонин, Д.А. Васильев // Аграрная наука и образование в реализации национального проекта «Развитие АПК»: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, 22-24 ноября 2006. -Ульяновск, 2006. - С.345-348.

6. Канаева, Т.И. Рост бактерий Aeromonas hydrophila при различных температурных режимах культивирования I Т.И. Канаева, Э.А. Афонин, Д.А. Васильев // Молодежь и наука XXI века: Материалы 2-й Открытой Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, 24-26 апреля 2007. -Ульяновск, 2007. - С.71 -73.

7. Канаева, Т.И. Выделение и идентификация бактерий вида Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Биотехнология. Вода и пищевые продукты: Материалы Международной научно-практической конференции, 11-13 марта 2008. -Москва, 2008.-С. 124-125.

8. Канаева, Т.И. Результаты апробации использования антигенного биопрепарата при идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, A.A. Нафеев // Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая 2008. -Ульяновск, 2008. - С.40-47.

9. Канаева, Т.И. Результаты апробации предлагаемой схемы выделения и типизации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, A.A. Нафеев II Актуальные вопросы аграрной науки и образования: Материалы Международной научно-практической конференции, 20-22 мая 2008. -Ульяновск, 2008. - С.47-51.

10. Канаева, Т.И. Разработка селективных сред и бактериологической схемы диагностики бактерий Aeromonas hydrophiles, вызывающих аэромоноз рыб / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел: Материалы Международной научно-практической конференции, 26-27 ноября 2008. - Москва, 2008.-С.378-382.

11. Канаева, Т.И. Разработка бактериологической схемы диагностики аэромоноза рыб / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ, 2-5 декабря 2008. - Покров, 2008. - С. 111-114.

12. Канаева, Т.И. Изучение морфологических и биохимических свойств бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных: Труды Международной научно-практической конференции, посвященной 50-летию ВНИИВВиМ, 2-5 декабря 2008. - Покров, 2008. -С.222-223.

13. Канаева, Т.И. Новые методы выделения и идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Современный мир, природа и человек: Сборник научных трудов. - Томск, 2009. - С. 110-111.

14. Канаева, Т.И. Получение гипериммунных сывороток для идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев // Современный мир, природа и человек: Сборник научных трудов. - Томск, 2009. -С.111-113.

15. Канаева, Т.И. К вопросу выделения и идентификации бактерий Aeromonas hydrophila t Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, A.A. Нафеев // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2009. - № 9. - С.25-27.

16. Канаева, Т.И. Возможность использования антигенного биопрепарата для идентификации бактерий Aeromonas hydrophila / Т.И. Канаева, Д.А. Васильев, A.A. Наф)еев // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. - 2009. -№ 10. - С.27-31.

Отпечатано в типографии ООО «КОПИРИНГ» г. Ульяновск, ул. К. Маркса 26, (8422) 42-07-81

Заказ №438 Тираж 100 экз. Бумага офсетная

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Канаева, Татьяна Ивановна

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

1. Обзор литературы.г.

1.1. Распространение и эпидемиология бактерий Aeromonas hydrophila.

1.2. Развитие инфекционного процесса и патогенез.

1.3. Бактерии Aeromonas hydrophila и их место в классификации пищевых отравлений инфекционной этиологии.

1.4. Систематика бактерий рода Aeromonas и биологические свойства.

1.4.1. Систематика.

1.4.2. Морфология и биохимические свойства Aeromonas.

1.4.3. Устойчивость.

1.4.4. Восприимчивость Aeromonas hydrophila к химиотерапевтическим средствам.

1.5. Бактериологические схемы выделения бактерий Aeromonas hydrophila.

1.6. Методы идентификации Aeromonas hydrophila.

1.6.1. Фенотипическая идентификация.

1.6.2. Фенотипическое определение вирулентных факторов бактерии Aeromonas hydrophila.

1.6.3. Генетическое выявление факторов вирулентности

2. Собственные исследования.

2.1. Материалы и методы.

2.2. Результаты собственных исследований и их обсуждение.

2.2.1. Изучение специфичности существующих селективных сред.

2.2.2. Конструирование селективной среды накопления

2.2.2.1. Определение устойчивости Aeromonas hydrophila к некоторым антимикробным веществам

2.2.2.2. Определение устойчивости Aeromonas hydrophila к некоторым красителям.

2.2.2.3. Конструирование накопительной среды для Aeromonas hydrophila.

2.2.2.4. Расчет оптимального времени культивирования Aeromonas hydrophila на среде накопления.

2.2.3. Определение специфичности среды накопления УГСХА-1 A.h.

2.2.4. Конструирование плотной селективной среды для Aeromonas hydrophila.

2.2.5. Испытание специфичности плотной селективной среды УГСХА-2А.11.

2.2.6. Разработка бактериологического метода выделения и идентификации Aeromonas hydrophila

2.2.6.1. Изучение морфологических и тинкториальных свойств бактерий вида Aeromonas hydrophila.

2.2.6.2. Изучение биохимических свойств бактерий Aeromonas hydrophila.

2.2.7. Разработка среды для внутривидовой дифференциации Aeromonas hydrophila.

2.2.8. Выживаемость A. hydrophila на транспортной среде.

2.2.9. Особенности распространения и сезонные различия в количественном содержании бактерий Aeromonas hydrophila в открытых водоемах.

2.2.10. Конструирование антигенного препарата для серологической идентификации бактерий Aeromonas hydrophila.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Разработка методов выделения и идентификации бактерий Afromonas hydrophila"

Актуальность темы. Важную роль по обеспечению необходимого уровня качества и безопасности пищевой продукции занимает разработка новых методов исследования сырья, полуфабрикатов и готовой продукции на наличие инфекционных агентов, а также установления предельно допустимых уровней их содержания. Успешная профилактика инфекций возможна лишь при условии истинности идентификации микроорганизмов и хорошо налаженного санитарного надзора с использованием широкого спектра лабораторных методов, в том числе и биотехнологических (Orozova, Barker, Austin, 2009).

Как в России, так и за рубежом регистрируется рост пищевых инфекций. По информации ВОЗ (1999) ежегодно в мире острыми кишечными инфекциями (ОКИ) болеют 2 млрд. человек. В России из более чем 5 млн. случаев ОКИ, зарегистрированных за период с 1989 по 1999 гг., этиология половины (55,6 %) не установлена (Равилов, Гильмутдинов, Хусаинов, 1999). Одной из причин этого является то, что диагностические и профилактические бактериологические исследования предусматривают поиски и выделение лишь ограниченного числа патогенных микроорганизмов — в первую очередь возбудителей кишечных инфекций. Однако, этиологическое значение в заболевании людей могут приобретать самые разнообразные микроорганизмы, среди которых и Aeromonas hydrophila (Gibbs, Shawn, Mark, 2008).

Бактерии рода Aeromonas представляют серьезную проблему для многих стран Европы и Азии, в которых аэромонадная инфекция составляет от 1 до 10 % острых кишечных заболеваний у взрослых и до 50 % у детей (Agger, Cormick, Gurwith, 1985). В США аэромонады являются причиной 13 % острых кишечных инфекций (Schadich, Cole, 2009). В настоящее время общепризнанно, что патогенные штаммы вида Aeromonas hydrophila являются возбудителями пищевой инфекции (Figueras, Guarro, Martinez

Murcia, 2000). Биологическая особенность этих микроорганизмов заключается в их способности к свободному обитанию в пресной и соленой воде. Особую опасность для человека представляют контамшшрованые аэромонадами морепродукты (рыба, ракообразные, моллюски), продукты растительного происхождения (овощи, фрукты, ягоды), а также свинина, говядина, баранина и мясо птицы, молочные продукты и непосредственно вода (Хомякова, Макарова, Козловский, 2009). При заражении бактериями Aeromonas hydrophila у людей с ослабленным иммунитетом может развиться септицемия и в этом случае инфекция приобретает угрожающий жизни характер, поражая мозг, кости, почки, глаза, мягкие ткани. В результате у пациентов с таким заражением развивается пневмония, менингит, остеомиелит, септический артрит, гангренозные поражения кожи и т.п. Особенно велика вероятность такого неблагоприятного развития болезни у людей, больных лейкемией, карциномой, циррозом, а также у проходящих курс химиотерапии или принимающих иммуноподавляющие препараты (Zhiyong, Xiaoju, Yanyu, 2002).

Статистических данных о циркуляции A. hydrophila в объектах ветеринарно-санитарного надзора в нашей стране не существует. Вместе с тем, роль Aeromonas hydrophila в возникновении пищевой инфекции уже доказана. Целенаправленного поиска аэромонад в пищевом сырье и продуктах не проводится, так как наличие этих микроорганизмов не регламентируется действующими нормативными документами. Кроме этого, практические бактериологи имеют недостаточный комплект методических разработок по выделению и идентификации бактерий рода Aeromonas. А более детальная идентификация отдельных подвидов Aeromonas hydrophila стала разрабатываться лишь в последнее время.

Цель исследования - разработка методов выделения и идентификации бактерий вида Aeromonas hydrophila из объектов ветеринарно-санитарного надзора.

Задачи исследования:

1. Изучить биологические свойства бактерий вида Aeromonas hydrophila.

2. Разработать транспортную среду, среду накопления и селективную среду для выделения бактерий вида Aeromonas hydrophila.

3. Разработать схему выделения и идентификации бактерий вида Aeromonas hydrophila из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

4. Изучить распространение бактерий вида Aeromonas hydrophila.

5. Создать биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации Aeromonas hydrophila методом пластинчатой реакции агглютинации (РА).

Научная новизна работы. Разработана оптимальная схема выделения и идентификации бактерий вида Aeromonas hydrophila из объектов внешней среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Сконструированы новые среды накопления, селективная и транспортная для выделения бактерий вида Aeromonas hydrophila, а также среда для внутривидовой дифференциации данных бактерий. Изучено распространение аэромонад в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Создан биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации Aeromonas hydrophila методом РА.

Практическая значимость. Предложеная в диссертационной работе схема позволяет выделять и идентифицировать штаммы Aeromonas hydrophila из пищевого сырья, пищевых продуктов и объектов внешней среды. С помощью сконструированной дифференциально-диагностической среды появилась возможность определять биоварианты Aeromonas hydrophila. Сконструирован биопрепарат-диагностикум для антигенной идентификации бактерий вида Aeromonas hydrophila методом РА.

По материалам диссертационной работы предложена «Инструкция по выделению и идентификации бактерий Aeromonas hydrophila», разработаная для сотрудников медико-биологических научных учреждений и врачей бактериологических лабораторий, а так же в помощь работникам рыбоводческих хозяйств, и определяющая временный порядок и правила проведения лабораторных исследований по выделению и идентификации данных бактерий.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Транспортная среда (УГСХА-тр.А.Ь.) позволяет сохранять жизнеспособность бактерий вида Aeromonas hydrophila при перевозке проб исследуемого материала до лаборатории. Среда накопления (УГСХА-1А.Ь.) способствует максимальному росту и размножению аэромонад. Плотная селективная среда (УГСХА-2А.Ь.) высоко специфична и обеспечивает рост большинства штаммов данного вида микроорганизмов. Дифференциально-диагностическая среда для биоваров Aeromonas hydrophila позволяет осуществлять идентификацию до подвида.

2. Оптимальная схема дает возможность за 48 ч выделять и идентифицировать бактерии вида Aeromonas hydrophila из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов.

3. Бактерии Aeromonas hydrophila широко распространены в объектах санитарного надзора: выделяются из открытых водоемов, сточной воды и речной рыбы, при этом имеют стабильную сезонность.

4. Диагностический биопрепарат позволяет идентифицировать Aeromonas hydrophila методом пластинчатой РА.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы ФГОУ ВПО «Ульяновская государственная сельскохозяйственная академия» в рамках научно-исследовательской темы: «Разработка и усовершенствование методов диагностики, лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний».

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на: Всероссийских научно-практических конференциях Ульяновской ГСХА (Ульяновск, 2006, 2007, 2008), Международных научно-практических конференциях «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), «Современное состояние и перспективы исследований по инфекционной и протозойной патологии животных, рыб и пчел» (Москва, 2008), «Проблемы профилактики и борьбы с особо опасными, экзотическими и малоизученными инфекционными болезнями животных» (Покров, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 16 работ, из них 2 — в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, состоящих из материалов и методов, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических предложений, списка использованных литературных источников. Материалы диссертации изложены на 131 странице, включают 19 рисунков, 18 таблиц. Список использованных литературных источников содержит 125 наименований, в том числе 80 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Канаева, Татьяна Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Для выделения бактерий Aeromonas hydrophila сконструированы и предложены среды обладающие специфичностью и высокой чувствительностью: транспортная, накопительная, селективная.

2. Сконструирована оптимальная схема выделения и идентификации A.hydrophila из различных объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов, позволяющая выделять и идентифицировать данные бактерии за 48 часов. С помощью предложенной схемы нами было выделено 52 штамма бактерий вида A.hydrophila.

3. Изучены культуральные, морфологические и биохимические свойства бактерий A.hydrophila, позволившие сконструировать среду для внутривидовой диагностики аэромонад и типировать 2 штамма выделенных в Ульяновской области как A. hydrophila subsp. dhakensis, еще 2 штамма - как A. hydrophila subsp. anaerogenes, все остальные выделенные нами штаммы являются биоварами A. hydrophila subsp. hydrophila.

4. Изучено распространение бактерий вида A.hydrophila в объектах ветеринарно-санитарного надзора. Наибольший процент выделенных бактерий A.hydrophila приходится на открытые водоемы, сточные воды и речную рыбу.

5. Сконструирован диагностический биопрепарат для идентификации бактерий A. hydrophila методом пластинчатой РА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

• Предложены среды накопления, селективная и транспортная для выделения бактерий A.hydrophila, а также дифференциальная среда для определения биовариантов A.hydrophila.

• Предложена схема выделения и идентификации штаммов A.hydrophila из пищевого сырья, пищевых продуктов и объектов внешней среды.

• Предложен диагностический биопрепарат для идентификации бактерий A. hydrophila методом пластинчатой РА.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

До настоящего времени в России единственным нормативным документом по методам определения аэромонад в различных видах исследуемого материала являются Методические рекомендации «Методы исследований объектов окружающей среды и патологического материала на аэромонады», разработанные в Московском научно-исследовательском институте гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана в 1980 году. Использование им предлагаемых дифференциально-селективных питательных сред А-1 и А-2 не позволяет достаточно квалифицированно проводить работу по выявлению аэромонад в объектах санитарно-ветеринарного надзора. Кроме того, в упомянутом документе отсутствуют какие-либо ссылки, касающиеся исследования на наличие аэромонад в пищевых продуктах. В европейских странах и США, в качестве плотной питательной среды чаще всего применяется триптон-кровяной агар (ТВА) с добавлением 5 % дефибринированной крови и ампициллина (Boxmie, Okaend, 1998). Сидоров М.А. (1995) рекомендует для выделения Aeromonas hydrophila среду Шмита-Шанделье. В рамках диссертационных исследований изучали специфичность действия трёх данных селективных сред. На испытанных средах растут как штаммы Aeromonas hydrophila, так и ассоцианты данных бактерий. Отсутствие ингибиторов в среде А-2 позволяет выживать и расти на ней большинству бактерий из сопутствующей микрофлоры (Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida; Citrobacter freundii; Escherichia coli; Klebsiella pneumoinae; Enterobacter cloacae; Providencia rettgeri; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia enterocolitica). Среда ТВА, хотя и содержит селективный агент, все же не обладает высокой специфичностью (наблюдается рост Klebsiella pneumoinae, Enterobacter cloacae, Yersinia pseudotuberculosis). Кроме того, среда ТВА с ампициллином пропускает антибиотикочувствительные и негемолитические штаммы Aeromonas hydrophila. На среде Шмита-Шантелье по нашим данным растут не только аэромонады, но и Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida, Escherichia coli. Отсюда следует, что селективные свойства испытанных сред недостаточны.

Из результатов наших исследований по определению чувствительности Aeromonas hydrophila к химиотерапевтическим средствам, следует, что наиболее приемлемым селективным агентом для селективной среды, был бы ампициллин, доксициклин или пенициллин. Но некоторые виды из возможных ассоциантов (Pseudomonas aeruginosa, Citrobacter freundii, Escherichia coli, Klebsiella pneumoinae, Enterobacter cloacae, Yersinia pseudotuberculosis, Yersinia enterocolitica) так же устойчивы к данным антибиотикам. Кроме того, некоторые штаммы Aeromonas hydrophila являются ампициллинчувствительными, другие неустойчивы по отношению к доксициклину. Таким образом, мы пришли к выводу, что антибиотики нельзя использовать в виде селективного агента в селективной среде.

Чувствительность к красителям - один из критериев в систематике микроорганизмов. Е. Ishiguro, Т. Ainsworth, T.J. Trust (1985) предложили применять красители и для выявления факторов патогенности различных бактерий. В результате проведенных нами опытов, выяснили, что селективный агент должен состоять из 3 г/л конго-рота, так как 94,4 % штаммов возможных ассоциантов неустойчивы к данной концентрации красителя, и 0,1 г/л кристаллического фиолетового (33,3 % неустойчивых штаммов из возможных ассоциантов).

В качестве азотно-витаминной основы использовали дрожжевой экстракт, а в качестве источника углерода - мальтозу. Проведя испытания, выяснили, что лучшие показатели по КОЕ имеет образец, содержащий 4,0 г дрожжевого экстракта и 3,5 г мальтозы.

По данным литературы (Герхардт, 1984) хорошей минеральной базой оптимального состава для Aeromonas hydrophila является набор солей фосфата калия двузамещенного (2,0 г) и семиводного сульфата магния (5,0 г). Соли калия, магния и фосфора стимулируют синтез микробной клетки Aeromonas hydrophila, а для образования бактериальных белков необходимы анионы, содержащие серу. Таким образом, данный набор солей целесообразно включить в селективную среду в применяемых дозах.

Во избежание выпадения селективного агента в осадок и равномерного распространения его во всей среде решено было добавить желатин (1 %), учитывая также, что желатин является растворимым белком, а бактерии Aeromonas hydrophila обладают протеолитической активностью и способны разжижать желатин.

В результате вышеизложенных исследований, предложенный нами рецепт среды накопления для бактерий Aeromonas hydrophila YTCXA-lA.h. имеет следующий состав: вода дистиллированная — 1000 мл; дрожжевой экстракт - 4,0 г; мальтоза - 3,5 г; К2НРО4 — 2,0 г; MgS04 — 5,0 г; желатин — 10,0 г; конго-рот — 3,0 г; кристаллический фиолетовый — 0,1 г.

Дрожжевой экстракт вносили в 1000 мл холодной воды, медленно нагревали. Затем последовательно добавили калий фосфорнокислый двузамещенный и магния сульфат, мальтозу, конго-рот (в виде 0,3 % водного раствора) и кристаллический фиолетовый (в виде 0,01 % водного раствора). Кипятили 2-3 минуты, при постоянном помешивании. В бульон внести желатин и оставить для набухания на 1 час, затем подогреть в водяной бане при 40-50 °С до полного расплавления желатина. После этого горячую среду фильтровали через ватно-марлевый фильтр и разлили в стерильные пробирки по 5 мл. Стерилизовать при 110 °С 30 минут. Цвет среды красно-коричневый.

Оптимальное время культивирования составляет 24-48 часов. Предложенная среда YTCXA-lA.h. обладает высокой специфичностью (отсутствует рост бактерий Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas putida; Proteus mirabilis; Staphylococus; Citrobacter; Escherichia coli; Listeria monocytogenes; Morganella morganii; Proteus vulgaris; Klebsiella pneumoinae; Enterobacter; Pasteurella midtocida; Providencia rettgeri; Yersinia pseudotuberculosis; Yersinia enterocolitica).

Прототипом плотной селективной среды послужила среда накопления УГСХА-1А.Ь., к которой вместо желатина был добавлен агар-агар. Плотная среда позволяет проводить селекцию бактерий вида Aeromonas hydrophila по морфологии колоний и является также высоко специфичной (отсутствует рост колоний вышеуказанных бактерий ассоциантов Aeromonas).

В последние годы появились сообщения о разделение вида Aeromonas hydrophila на следующие биовары: A. hydrophila subsp. dhakensis; A. hydrophila subsp. hydrophila; A. hydrophila subsp. ranae; A. hydrophila subsp. anaerogenes; A. hydrophila subsp. decolorationis, имеющих сходные биохимические характеристики, композицию ДНК и последовательность нуклеотидных образований (Huys, 2003). Для внутривидовой дифференциации нами была разработана среда, которая позволяет сократить набор тестов до минимума, к тому же он менее трудоемок и требует меньших затрат времени и посуды. Состав среду следующий: МПБ — 1000 мл, L-арабиноза — 10 г, D-сахароза — 1г, натрий хлорид - 5 г, агар-агар — 20 г, феноловый красный (0,2 % раствор в 50 % этиловом спирте) - 12 мл. Дифференциацию основывали на различие следующих ферментативных свойств: кислотообразование из L-арабинозы и D-сахарозы, гидролиз мочевины и образование газа.

С помощью предложенного набора селективных сред нами было выделено 52 штамма бактерий вида Aeromonas hydrophila из проб от объектов окружающей среды, пищевого сырья и пищевых продуктов. Нами были исследованы пробы морской рыбы, поступающей на рынки города Ульяновска в замороженном состоянии, а так же речной рыбы из местных водоемов. Кроме того, проводились исследования по обнаружению аэромонад в пробах воды из открытых водоемов Ульяновской области, сточных водах и водопроводной воде Ульяновска. Также были' исследованы пробы сырого молока, мяса и мясных продуктов, яйца, овощи и фрукты на контаминацию Aeromonas hydrophila. Наибольший процент выделенных аэромонадных штаммов приходится на открытые водоемы, сточные воды и речную рыбу. Из таких продуктов, как яйца, овощи, фрукты, а так же мяса и мясных продуктов изучаемых бактерий не выделено. В то же время зарубежные исследователи выделяют Aeromonas hydrophila из растений и теплокровных животных (Khadori, Fainstein, 1988), а так же овощей поступающих в розничную продажу (Controversial., 2007), известно о контаминации куриных яиц бактерией Aeromonas hydrophila (Sha, 2002).

Изучили морфологические и биохимические свойства выделенных бактерий. Благодаря данным световой и электронной микроскопии мы установили, что выделенные нами Aeromonas hydrophila прямые палочки с закругленными концами, располагаются поодиночке, парами, цепочками, подвижные (монотрихи). Бактерии имеют капсулу, микрокапсулу, кроме жгутиков в некоторых штаммах просматриваются пили. По Граму окрашивались отрицательно. Все выделенные штаммы Aeromonas hydrophila были оксидазоположительными, образовывали индол, давали положительные результаты в реакции с метиловым красным и реакции Фогеса-Проскауэра. На среде Хью-Лейфсона изменение цвета наблюдалось во всех пробирках, это говорит о том, что все выделенные микроорганизма относятся к факультативнам анаэробам. Положительные по аргининдигидролазе и отрицательные по лизиндекарбоксилазе и орнитиндекарбоксилазе. Выделенные штаммы не одинаково реагируют с углеводами, гидролизуют мочевину, образуют сероводород. Это связано с наличием внутри вида деления на биоварианты с разной биохимией. Для фенотипического определения вирулентных факторов определяли наличие гемолитической активности у выделенных штаммов на триптозо-кровяном агаре (Difco) с добавлением 5 % дифибринированной крови. Протеолитическую активность проверяли на питательном бульоне с желатином. ДЕЖазную активность на среде DNA ВА (Difco). Все выделенные бактерии отличаются по вирулентности. Так наиболее вирулентными могут считаться штаммы выделенные из сточных вод и открытых водоемов, а так же молока.

Для перевозки проб исследуемого материала до лаборатории рекомендуем использовать транспортную среду УГСХА-тр.А.И. Так как она содержит желатин (5 %), уплотняющий среду, и необходимые питательные вещества. В связи с вышесказанным при изучении биологических свойств бактерий Aeromonas hydrophila мы посчитали необходимым определение их оптимальные температурные границы. В работе были использованы 1 референс-штамм бактерии Aeromonas hydrophila и 12 штаммов выделенных нами из различных объектов окружающей среды. Рост бактерий проверяли на среде УГСХА-тр.А.Ь. и плотной селективной среде УГСХА-2А.Ь., при -4, +5, +30, +41, +45 °С, в течение от 1 до 4 суток. Рост бактерий A.hydrophila при -4 °С не наблюдался, но при высевании из пробирок с замороженными бульонными культурами на агар й инкубации чашек в термостате при оптимальной температуре (30 °С), наблюдался характерный рост бактерий A.hydrophila. Данные бактерии могут находиться в замороженном состоянии на среде УГСХА-тр.А.Ь. до 12 месяцев, в бытовом холодильнике (при температуре +5 °С) до 4 месяцев. При температуре +5 °С в пробирках со средой УГСХА-тр.А.Ь. наблюдали рост аэромонад спустя 48 часов, в то время как на чашках, вырастали мелкие колонии уже через 24 часа. Температура +30 °С является оптимальной для роста бактерий A.hydrophila, спустя 24 часа в пробирках наблюдается характерный рост, а на чашках с УГСХА-2А.11. образование колоний. Температура +41 °С считается не приемлемой для роста аэромонад, однако 10 из 12 проверяемых нами штаммов росли при данной температуре как в пробирках с транспортной средой, так и на чашках с УГСХА-2А.Ь. Референс-штамм также имел характерный рост на данных средах, спустя 24 часа. А вот при температуре +45 °С не наблюдалось роста ни в пробирках, ни на чашках Петри. Соответственно температурные границы роста бактерий A.hydrophila составляют от +5 °С до +41 °С и выживаемость бактерий на среде УГСХА-тр.А.Ь. при температуре +5 °С достигает 4 месяцев.

При изучении распространения Aeromonas hydrophila исследовали 189 проб воды открытых водоемов Ульяновской области (128 проб озёрной воды и 60 проб речной воды). Из озерной воды данный микроорганизм выделяли в 9,1 % исследуемых проб. Из речной воды - в 2,7 % проб. По нашим данным, наибольшее количество выделяемых бактерий приходится на период мая-августа. Из 24 случаев выделения бактерий Aeromonas hydrophila из воды открытых водоемов показатели сезонности по месяцам распределяются следующим образом: январь - 0, февраль - 0, март - 2, апрель - 2, май - 5, июнь -10, июль - 12, август - 9, сентябрь - 2, октябрь-декабрь - 0. S. Misra и S. Sarkar (1990) подтвердили существование сезонных различий в количественном содержании бактерий рода Aeromonas в воде и планктоне.

Диссертационная работа была направлена и на изучение антигенной структуры Aeromonas hydrophila. Антигены данных бактерий локализуются в жгутиках, капсуле, клеточной стенке, рибосомах, цитоплазматической мембране и цитоплазме (Krovacek, 2006). Клетки данного вида микроорганизмов построены как из уникальных, только для них характерных, антигенов — специфических (видовых), так и групповых антигенов, которые содержаться также у других видов того же рода или разных родов (Перетрухина, Перетрухина, 2005). Мы предложили собственную схему получения антигенов Aeromonas и гипериммунизации кроликов. Для этих целей было создано 4 антигенных образца с бактериальной массой Aeromonas hydrophila. Для инактивации аэромонад в один из образцов был добавлен мертиолят (1:10000), другой подвергся кипячению на водяной бане в течение 30 мин. В третий добавили мертиолят (1:10000) и для дезинтеграции 0,25 % SDS (додецилсульфат натрия). Четвертый образец, после добавления мертиолята (1:10000), подвергли ультразвуковой дезинтеграции с помощью прибора «Soniprep 150» при охлаждении спиртом со льдом. Проверили данные антигенные препараты на стерильность и провелии стандартизацию полученных антигенных препаратов. В опыте были задействованы 4 группы кроликов, по 3 головы, со средним весом 3 кг. Первой группе кроликов вводили антигенный препарат содержащий мертиолят, второй — антигенный препарат инактивированный кипячением, третьей — обработанный SDS, четвертой — подвергнутый ультразвуковой дезинтеграции. В результате гипериммунизации кроликов получили сыворотки А, В, С и D.

Для выяснения антигенного действия применяемых суспензий определяли динамику образования агглютининов в ответ на гипериммунизацию кроликов. Установили, что титр антител, регистрируемых в РА, имеет значительную разницу при гипериммунизации различными антигенными препаратами, так максимальная величина титра антител наблюдается в ответ на введение ультразвукового дезинтеграта и равна к 10 дню гипериммунизации 1:80. К 20 дню титр антител вырос до 1:320 и оставался самым высоким. Дальнейшее изучение антигенных свойств у полученных препаратов было направлено на выяснение их антигенного состава. С этой целью нами была использована реакция преципитации. В результате в двух случаях, между центральной лункой, содержащей сыворотку А и В и лунками, заполненными исследуемыми антигеными препаратами, образовывалось по одной полосе преципитации, причем линии преципитации полностью сливались, что говорит об идентичности антигенов. Между центральной лункой содержащей сыворотку С и лунками заполненными антигенным препаратом, содержащим SDS и УЗ образовывались две полосы преципитации (что говорит о наличие в системе как минимум двух комплексов антиген-антитело). Между центральной лункой содержащей сыворотку D и: лунками заполненными Т и М образовывалось по одной линии преципитации, лункой заполненной антигенным препаратом, содержащим SDS — две полосы преципитации, и одной лункой, заполненной ультразвуковым дезинтегратом наблюдалось 3 полосы преципитации.

Благодаря проведенным исследованиям доказали, что бактерии Aeromonas hydrophila содержат до 3-х специфических антигенов. В силу высокой чувствительности и строгой специфичности, из исследуемых компонентов можно конструировать серологический биопрепарат для антигенной идентификации выделенных бактерий. Для проверки данного препарата исследовали выделенные полевые штаммы в реакции агглютинации. Получив положительные результаты пришли к выводу, что данный биопрепарат можно использовать для антигенной идентификации выделенных бактерий Aeromonas hydrophila методом пластинчатой РА.

112

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Канаева, Татьяна Ивановна, Саратов

1. Беляков, В.Д. Проблема саморегуляции паразитарной системы и механизм развития эпидемического процесса / В.Д. Беляков // Вестник АМН СССР. 1990. - № 10. - С. 15-19.

2. Блинов, А.И. Аэромонады: выделение, идентификация и дифференциация / А.И. Блинов, Н.А. Глушанова // Учебно-методические рекомендации. Новокузнецк, 1997. - С. 8-10.

3. Блохина, И.Н. Сравнительные бумажные индикаторные системы для ускоренной идентификации микроорганизмов / И.Н. Блохина, В.М. Лавровская, Р.Ш. Альтман//ЖМЭИ.- 1978.-№7.-С. 112-115.

4. Бондаренко, В.М. Факторы патогенности бактерий и их роль в развитии инфекционного процесса / В.М. Бондаренко // Журнал микробиологии. 1999.-№ 5.-С. 34-39.

5. Будагян, Ф.Е. Пищевые токсикозы, токсикоинфекции и их профилактика / Ф.Е. Будагян. М.: Медицина, 1972. - 216 с.

6. Бухарин, О.В. Факторы персистенции и патогенности вибрионов и аэромонад различной экотопической принадлежности / О.В. Бухарин, А.В. Бойко, Л.А. Журавлева // Журнал микробиологии. 1998. - №. 5. - С. 30-33.

7. Бухарин, О.В., Экологическая детерминированность внутривидового разнообразия патогенных бактерий / О.В. Бухарин, В.А. Гриценко // Журнал микробиологии. 2000. -№ 1. - С. 103-106.

8. Ванханен, В.Д. О пересмотре классификации пищевых отравлений / В.Д. Ванханен, К.А. Денисов // Вопросы питания. — 1991. — № 1. — С. 4-7.

9. Варвашевич, Т.Н. Психрофильность патогенных бактерий / Т.Н. Варвашевич, Г.П. Сомов // Журнал микробиологии — 1992. — № 4. — С. 62-66.

10. Высоцкий, В.В. Поли(гетеро)морфные формы патогенных бактерий в инфекционной патологии / В.В. Высоцкий, Г.А. Котлярова // Журнал микробиологии 1999. - № 2. - С. 100-104.

11. Герхардт, Ф. Методы общей бактериологии / Ф. Герхардт. — М.: Мир, 1984.-478 с.

12. Голубева, И.В. Энтеробактерии / И.В. Голубева. — М.: Медицина, 1985. 198 с.

13. Графова, Т.И. Методы индикации биоценоза патогенных и потенциально патогенных микроорганизмов / Т.И. Графова // Сборник научных трудов.-М., 1985.-С. 120-123.

14. Жаворонков, А.А. Прионовые болезни и амилоидоз головного мозга / А.А. Жаворонков, B.C. Рукосуев // Архив патологии. 1999. — Т. 61. — № 2. — С. 50-55.

15. Исхакова, Х.И. Неферментирующие грамотрицательные бактерии и их дифференциация от Pseudomonas aeruginosa / Х.И. Исхакова // Журнал микробиологии. — 1979. — № 6. — С. 11.

16. Калина, Г.П. Фильтрующиеся формы бактерий / Г.П. Калина // Журнал микробиологии. — 1982. — № 6. С. 3-5.

17. Калина, Г.П. Условно-патогенные микроорганизмы / Г.П. Калина // Журнал микробиологии. — 1984. № 10. - С. 30-35.

18. Калина, Г.П. Способность размножения псевдомонад в воде / Г.П. Калина, Н.Б. Комзолова // ЖМЭИ. 1988. - № 5. - С. 103.

19. Калина, Г.П. Условно-патогенные микроорганизмы — возбудители пищевых токсикоинфекций и острых кишечных заболеваний / Г.П. Калина, Н.С. Харитонов // Журнал микробиологии. 1982. - № 11. - С. 82-86.

20. Карплюк, И.А. К вопросу о классификации пищевых отравлений / И.А. Карплюк, Б.Л. Смолянский // Вопросы питания. 1990. - № 3. - С. 4-8.

21. Козярин, И.П. Неотложная помощь при пищевых отравлениях / И.П. Козярин, В.И. Слободкин // Скорая и неотложная медицинская помощь. 2002. — № 5. - С. 699-720.

22. Курбанова, И.З. Разработка и испытание микротестсистемы для идентификации анаэробов МТС-А / И.З. Курбанова, В.И. Кочеровец, П.И. Магомедова // Разработка медицинской биотехнологии. 1992. - № 2. - С. 75-76.

23. Лившиц, М.Л. Современные теоретические и практические представления об эпидемиологии шигеллезов / М.Л. Лившиц // Журнал микробиологии. 1991. — № 12. - С. 77-79.

24. Лурье, М.И. Об упрощении методики определения микробов кишечной группы / М.И. Лурье // Лабораторное дело. 1985. - № 4. - С. 30-31.

25. Мартынова, Е.А. Механизм развития эпидемического процесса дизентерии Зоне / Е.А. Мартынова, В.А. Зенков, В.В. Браиловский // Журнал микробиологии. 1997. - № 5. - С. 110-114.

26. Меджидов, Ш.М. Сухие питательные среды для бактериальной диагностики листериоза / Ш.М. Меджидов, С.М. Омарова, Э.М. Ахмедова // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: Материалы 2-й международной конференции. — Санкт-Петербург, 1998. С. 162.

27. Никитин, В.М. Влияние некоторых факторов на ускоренное определение ферментативной активности бактерий / В.М. Никитин, С.В. Плугару, А.П. Каланча // Материалы 1-го Всесоюзного съезда врачей-лаборантов. -Москва, 1973. Т. 3.-С. 137-139.

28. Петровская, В.Г. Проблема вирулентности бактерий / В.Г. Петровская. Ленинград: Медицина, 1967. - 220 с.

29. Погорелова, Н.П. Микробиологическая оценка загрязнения водных объектов дельты Волги / Н.П. Погорелова, JI.A. Журавлева, Ф.Х. Ибрагимов // Журн. Микробиологии. 1999. - № 4. - С. 62-66.

30. Постовит, В. Пищевые токсикоинфекции / В. Постовит // Медицинская газета. 1994. - № 58. - С. 8-9.

31. Равилов, А.З. Микробиологические среды / А.З. Равилов, Р.Я. Гильмутдинов, М.Ш. Хусаинов. — Казань: Академкнига, 1999. — 189 с.

32. Рукосуев, B.C. Прионовые болезни / B.C. Рукосуев, А.А. Жаворонков // Архив патологии. — 1999. — Т. 61. № 2. — С. 56-57.

33. Сидоров, М.А. Определитель зоопатогенных микроорганизмов, справочник / М.А. Сидоров, Д.И. Скородумов, В.Ф. Федотов. М.: Медицина, 1995-227 с.

34. Хмелевская, Г.В. Факторы патогенности некоторых условно-патогенных бактерий, вызывающих диареи / Г.В. Хмелевская, J1.B. Девтерова, Э.А. Яговкин, А.П. Шепелев и др. // Журнал микробиологии. — 1990. № 4. — С. 97-102.

35. Чайка, Н.А. Аэромонадная инфекция, библиографический указатель отечественной и зарубежной литературы / Н.А.Чайка, О.И.Семенова. -Ленинград: Медицина, 1987. — 34 с.

36. Шаханина, И.Л. Руководство по эпидемиологии инфекционных болезней / И.Л. Шаханина. М.: Медицина, 1993. - Т. 1.-161 с.

37. Штенберг, А.И. К вопросу о классификации пищевых отравлений / А.И. Штенберг // Вопросы питания. 1991. - № 2. - С. 14.

38. Щедрина, Н.А. Состояние и перспективы создания отечественной техники переработки гидробионтов / Н.А. Щедрина, В.В. Карцев. — Санкт-Петербург: Пищевая промышленность, 2004. 87 с.

39. Паркер, М. Внутрибольничная инфекция. Руководство по лабораторным методам исследования / М. Паркер. — М.: Медицина, 1988. 178 с.

40. Ойвин, И.А. Статистическая обработка результатов экспериментальных исследований / И.А. Ойвин. — М.: Наука, 1960. 168 с.

41. Остерман, JI.A. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / JI.A. Остерман. -М.: Наука, 1983. 304 с.

42. Фримель, X. Иммунологические методы / X. Фримель. М.: Мир, 1979. — 299 с.

43. Adams, D. Aeromonas hydrophila typing scheme based on patterns of agglutination with erythrocytes and yeast cells / D. Adams, H.M. Atkinson, W.H. Woods // Journal Clinical Microbiology. 1982. - V. 17. - P. 422-427.

44. Agger, W.A. Clinical and microbiological features of Aeromonas hydrophila-associated diarrhea / W.A. Agger, J.D. McCormick, M.J. Gurwith // Journal of Clinical Microbiology. 1985. - V. 21. - N 6. - P. 909-913.

45. Altwegg, M. Isolation of Aeromonas spp. from human faeces // Experientia. — 1986.-V. 42, N1.-P. 107.

46. Asao, T. Purification and characterization of an Aeromonas hydrophila hemolysin / T. Asao, S. Kozaki // Journal of Clinical Microbiology. 1986. - V. 24, N 2.-P. 228-232.

47. Assessment of immune response in freshwater catfish to different bacterins of Aeromonas hydrophila / K. Anbarasu et al. // Indian Journal of Microbiology. 1998. -V. 27.-P. 1114-1122.

48. Analysis of the interaction of Aeromonas caviae, A. hydrophila and A. sobria with mucins / F. Ascencio et al. // FEMS Immunology and Medical Microbiology. -1998.-V. 20.-P. 219-229.

49. Balsalobre, L.C. Detection of metallo-<beta>-lactamases-encoding genes in environmental isolates of Aeromonas hydrophila and Aeromonas jandaei / L.C. Balsalobre, M. Dropa, N. Lincopan // Amer. Med. Technol. 1980. - V. 46. - P. 179181.

50. Bernagozii, M. Aeroallergen alterations induced by airborne pollutants / M. Bernagozii, F. Bianucci, E. Scerre // Zentralbl. Hyg. und Umweltmed. 1994. - V. 195, N2.-P. 121-134.

51. Cahill, M.M. Virulence factors in motile Aeromonas species / M.M. Cahill // Journal of Applied Bacteriology. 1990. - V. 69. - P. 1-16.

52. Bhat, P. The characterization and significance of Plesiomonas shigelloides and Aeromonas hydrophila isolated from an epidemic of diarrhea / P. Bhat, S. Shanthakumari,

53. D. Rajan // Indian Journal of Microbiology. 1974. - V. 62. - P.l 051-1060.

54. Blatz, D. Open fracture of the tibia and fibula complicated by infection with Aeromonas hydrophila / D. Blatz // J. Bone Joint Surg. 1979. - V.61. - P.790-791.

55. Carnahan, A.M. Aerokey II: a flexible key for identifying clinical Aeromonas species / A.M. Camahan, S. Behram, S.W. Joseph // Journal of Clinical Microbiology. — 1991. V. 29. - P. 2843-2849.

56. Brenden, R. Pathophysiology of experimental Aeromonas hydrophila in mice / R. Brenden // J. Med. Microbiol. 1986. - V. 21, N 4. - P. 311-318.

57. Bromfendrenner, Y. On methods isolation and identification of the members of the colon typhoid group bacteria study of the bactericidal action of indicator / Y. Bromfendrenner, M.L. Schlesiger // J. Bacteriol. - 1980. - V. 79. - P. 87.

58. Immune protection in carp, after immunization with Aeromonas hydrophila crude lipopolysaccharude / T. Baba et al. // Journal of Fish Diseases. 1988. - V. 11. - P. 237-244.

59. Boillard, J. Septicemic a Aeromonas hydrophila chez une malade / J. Boillard, Y. Droumaguet, Th. Floch // I/Ouest. Med. 1984. - V. 37, N 11. - P. 631-634.

60. Boxmie, E.R. Methods isolation and identification Aeromonas hydrophila /

61. E.R. Boxmie, A.J.G. Okaend // Microbiology Laboratory Guidebook. 1998. - V. 3. — P. 31-34.

62. Brook, I. Pathogenicity of Aeromonas /1. Brook, J. Rogers // J. Infekt. 1985. -V. 10,N l.-P. 32-37.

63. Burgos, A. Identifying clinical Aeromonas species / A. Burgos, P. Rojo, G. Quindos // 5 Eur. Congr. Clin. Microbiol, and Infect. Diseases., Sept. 9-11, 1991. -Oslo, 1991.-P. 14.

64. Burke, V. The microbiology of childhood gastroenteritis: Aeromonas species and other infetive agents / V. Burke, M. Gracey, J. Robinson // J. Infect. Dis. 1983. -V. 148, N l.-P. 68-74.

65. Canonica, F. Identification of hydroxy fatty acids in Aeromonas hydrophila, Aeromonas sobria, and Aeromonas caviae / F. Canonica, M. Pisano // Journal of Clinical Microbiology. 1985. - V. 22, N 6. - P. 1061-1062.

66. Carcm, K.L. Aeromonas hydrophila / K.L. Carcm, J.W. Foster, A.K. Bej // Microbiology. 1994. - V. 14,N27.-P. 1731-1736.

67. Casco, A. Isolation Aeromonas hydrophila from a metropolitan water supply / A. Casco, J. Anguita, C. Hernanz, M. Sanchez // Applied and environmental microbiology. 1996. - V. 62, N 4. - P. 1167-1170.

68. Castro-Escarpulli, G. Characterisation of Aeromonas spp. isolated from frozen fish intended for human consumption in Mexico / G. Castro-Escarpulli // Internacional journal of food microbiology. 2003. - V. 84. - P. 41-49.

69. Chien, C.C. Polyhydroxyalkanoates production from carbohydrates by a genetic recombinant Aeromonas spp. / C.C. Chien, L.Y. Ho // Letters in Applied Microbiology. 2008. - V. 47, N 6. - P. 587-593.

70. Colaco, C. Aeromonas hydrophila liver abscess / C. Colaco // Lancet. 1982. — V. l.-P. 680.

71. Colwell, R. Proposal to recognize the family Aeromonadaceae / R. Colwell, M. McDonell, J. DeLey // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. - V. 36, N 3. - P. 473-477.

72. Cloning, sequencing, and role in virulence of two phospholipases (A1 and C) from mesophilic Aeromonas sp. serogroup 0:34 / S.A. Merino et al. // Infect. Immun. 1999. -V. 67. - P. 4008-4013.

73. Janda, J.M. Recent advances in the study of the taxonomy, pathogenicity, and infectious syndromes associated with the genus Aeromonas / J. M. Janda // Journal of Clinical Microbiology. 1991. - V. 4. - P. 397-410.

74. Huys, G. Aeromonas hydrophila subsp. ranaei subsp. nov., isolated from septicaemic farmed frogs in Thailand / M. Pearson, P. Kampfer, R. Denys // Int. J. Syst. Evol. Microbiol.-2003.-V. 53,N3.-P. 85-91.

75. Controversial data on the association of Aeromonas with diarrhoea in a recent Hong Kong study / M.J. Figueras et al. // Journal of medical microbiology. — 2007. — V. 56, N7.-P. 996-998.

76. Janda, J.M. The pathogenicity of Aeromonas strains relative to genospecies and phenospecies identification / J.M. Janda, R.P. Kokka // FEMS Microbiol. Lett. 1991. -V. 90,N l.-P. 29-33.

77. Khadori, N., Fainstein V. Aeromonas and Plesiomonas as etiological agents / N. Khadori, V. Fainstein // Ann. Rev. Microbiol. 1988. - V. 42. - P. 395-419.

78. Khushiramani, R. Evaluation of a digoxigenin-labelled probe for detection of Aeromonas spp. / R. Khushiramani, S.K. Girisha, I. Karunasagar // Letters in Applied Microbiology. 2009. - V. 48, N 3. - P. 383-385.

79. Krovacek, K. Antimicrobial susceptibility of Aeromonas spp., Vibrio spp. and Plesiomonas shigelloides isolated in the Philippines and Thailand / K. Krovacek // J Food Prot. 2006. - V. 69. - P. 1713.

80. Majeed, K.N. Probe for detection of Aeromonas spp. / K.N. Majeed, I.C. MacRae // Microbios. 1993. - V. 73, N 297. - P. 281-288.

81. Distribution of virulence genes in clinical and environmental isolates of Aeromonas spp. / M.R. Chacon et al. // Antonie van Leeuwenhoek. 2003. -V. 84, N 4.-P. 269-278.

82. Possible virulence factors involved in bacteraemia caused by Aeromonas hydrophila / J. Vadivelu et al. // J. Med. Microbiol. 1995. - V. 42. - P. 171-174.

83. Misra, S. Enteropathogenicity of Aeromonas hydrophila and Plesiomonas shigelloides / S. Misra, S. Sarkar // Zentralbl. Hyg. und Umweltmed. 1990. - V. 190, N95.-P. 434.

84. Moxon, E.R., The role of bacterial polysaccharide capsules as virulence factors. / E.R. Moxon, J.S. Kroll // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1990. - V. 150. - P. 6585.

85. Nishikawa, Y. Distribution and characterization of hemolytic, and enteropathogenic motile Aeromonas in aquatic environment / Y. Nishikawa, T. Kimura, T. Kishi//Epidemiol, and Inlec. 1991. - V. 107, N21.-P. 171-179.

86. Orozova, P. Identification and pathogenicity to rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum), of some aeromonads / P. Orozova, M. Barker, D.A. Austin // Journal of Fish Diseases.- 2009. -V. 32, N 10.-P. 865-871.

87. Osborne, J.A. Bacterial fish pathogens: disease in farmed and wild fish / J.A. Osborne, G.E. Fensch, J.F. Charba // Fla Sci. 1989. - V. 52, N 3. - P. 171-177.

88. Peng, X. Dentofacial morphology and tongue function during swaloving / X. Peng, J. Zhang, S. Wang // Journal of Microbiol. Methods. 2002. - V. 49. - P. 78.

89. Qureshi, N. Location of fatty acids in lipid A obtained from lipopolysaccharide of Rhodopseudomonas sphaeroides ATCC 17023 / N. Qureshi, J. Honovich, H. Hara // J. Biol. Chem. 1988. - V. 263. - P. 5502-5504.

90. Rahim, Z. Isolation of enterotoxigenic haemolytic and antibiotic-resistant Aeromonas spp. / Z. Rahim, K. Aziz // First International Workshop on Aeromonas and Plesiomonas. London: PHLS. - 1986. - P. 29.

91. Reina, J. Aeromonas hydrophila — associated diarrhea / J. Reina, J. Hervas, A. Serra A.//Clin. Lab. 1993. - V. 17, N92.-P. 60-65.

92. Roberts, I.S. The biochemistry and genetics of capsular polysaccharide production in bacteria / I. S. Roberts // Annu Rev Microbiol. 1996. - V. 50. - P. 285315.

93. Robson, W.L. Haemolytic-uraemic syndrome associated with Aeromonas hydrophila enterocolitis / W.L. Robson, A.K. Leung, C.L. Trevenen // Pediatr. Nephrol. 1992.-V. 6.-P. 221-222.

94. Schadich, E. Inhibition of frog antimicrobial peptides by extracellular products of the bacterial pathogen Aeromonas hydrophila / E. Schadich, A. L. J. Cole // Letters in Applied Microbiology. 2009. - V. 49, N 3. - P. 384-387.

95. Shane, S.M. Prevalence and pathogenicity of Aeromonas hydrophila / S.M. Shane, D.H. Gifford // Avian Dis. 1985. - T. 29, N 3. - P. 681-689.

96. Shumann, H., Ausbreitung und Eigenschafyen von Epidemiestammen / H. Shuman, H. Tschape // Y. Militaymed. 1988. - V. 29, N 3. - P. 158-161.

97. Singh, D.V. Production of hemolysis and its correlation with enterotoxicity in Aeromonas spp. / D.V. Singh, S.C. Sanyal // J. Med. Microbiol. 1992. - V. 37. - P. 262-267.

98. Soler, L. Evaluation of two miniaturized systems, MicroScan W/A and BBL Crystal E/NF, for identification of clinical isolates of Aeromonas spp. / L. Soler, F. Marco, J. Vila // Journal of Clinical Microbiology. 2003. - V. 41, N 12. - P. 57325734.

99. Stagnaro, S.M. Aeromonas hydrophila and its relation with drinking water indicators of microbiological quality in Argentine / S.M. Stagnaro, C. Chiale, H. Frade // Genetica. — 2000. — V. 108, N91.-P. 35-40.

100. Stotle, A. Incidence and identification of mesophilic Aeromonas spp. isolated from retail foods in Belgium / A. Stotle, H.I. Brunner // 3-rd World Congress foodbome infections and intoxications. Berlin, 1992. - V. 1. - P. 480-484.

101. Suraj, B.B. Detection of aerolysin gene in Aeromonas strains isolated from drinking water, fish and foods by the polymerase chain reaction / B.B. Suraj // Camp. Immun. Mhrobiol. Infect. Dis. 1995. -V. 18, N 1. - P. 17-26.

102. Trakhna, F. Rapid Aeromonas hydrophila identification by TaqMan PCR assay: comparison with a phenotypic method / F. Trakhna, C. Harf-Monteil, A. AbdelNour // Letters in Applied Microbiology. 2009. - V. 49, N 2. - P. 186-190.

103. Mateos, D. Influence of growth temperature on the production of extracellular virulence factors and pathogenicity of environmental and human strains of Aeromonas hydrophila / D. Mateos, J. Anguita // Appl. Bacteriol. 1993. - V. 74. - P. 111-118.

104. Zhang, Y.L. Detection and genetic analysis of group II capsules in Aeromonas hydrophila / Y.L. Zhang, E. Lau, E. Arakawa // Microbiology. 2003. - V. 149. - P. 1051-1060.

105. Zhang, Y.L. Novel Aeromonas hydrophila PPD134/91 genes involved in O-antigen and capsule biosynthesis / Y.L. Zhang, E. Arakawa, K.Y. Leung // Infect Immun. 2002. - V. 70. - P. 2326-2335.

106. Zhang, Y.L. Molecular analysis of genetic differences between virulent and avirulent strains of Aeromonas hydrophila isolated from diseased fish / Y.L. Zhang, C. T. Ong, K.Y. Leung // Microbiology. 2000. - V. 146. - P. 999-1009.

107. Zhiyong, Z., Aeromonas hydrophila infection: clinical aspects and therapeutic options / Z. Zhiyong, L. Xiaoju, G. Yanyu I I Rev. Med. Microbiol. 2002. - V. 13. - P. 12.

108. Vadivelu, J. Possible virulence factors involved in bacteraemia caused by Aeromonas hydrophila / J. Vadivelu, S.D. Puthucheary, M. Phipps, Y.W. Chee // J. Med. Microbiol. 1995. -V. 42. - P. 171-174.

109. Granum, P.E. Possible virulence factors of Aeromonas spp. from food and water / P.E. Granum, K. O'Sullivan, J.M. Tomas // FEMS Immunol. Med. Microbiol. -1998.-V. 21.-P. 131-137.

110. Wang, G. Detection and characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria by Multiplex PCR / G. Wang, C.G. Clark I I Journal of Clinical Microbiology. 2003. - V. 41, N 3. - P. 1048-1054.

111. Correlation of enterotoxicity with biotype in Aeromonas spp / V. Burke et al. // Journal of Clinical Microbiology. 1983. -V. 18. - P. 1196-1200.

112. Wiese, A. The dual role of lipopolysaccharide as effector and target molecules / A. Wiese, K. Brandenburg, A. Ulmer // J. Biol. Chem. 1999. - V. 380. - P. 767-784.

113. Whitfield, C. Structure, assembly and regulation of expression of capsules in Escherichia coli / C. Whitfield, I.S. Roberts // Mol. Microbiol. 1999. - V. 31. - P. 1307-1319.

114. Wolff, R. Aeromonas hydrophila bacteremia in ambulatory immuno-compremised hosts / R. Wolff, S. Wiseman, C. Kitchens // Amer. J. Med. 1980. -V.68.-P. 238-242.

115. Wong, C.Y. Inactivation of two haemolytic toxin genes in Aeromonas hydrophila attenuates virulence in a suckling mouse model / C.Y. Wong, M.W. Heuzenroeder, R.L. Flower // Journal of Clinical Microbiology. — 1998. V. 380. - P. 291-298.

116. Figueras M.J. Clinically relevant Aeromonas species / M.J. Figueras, J. Guarro, A. Martmez-Murcia // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2000. - V. 30, N 6. - P. 988-989.

117. Soler L. Comparison of three molecular methods for typing Aeromonas isolates / L. Soler, M.J. Figueras, M.R. Chacon // Antonie van Leeuwenhoek. 2003. - V. 83, N4.-P. 341-349.

118. Extended method for discrimination of Aeromonas spp. by 16S rDNA RFLP analysis / M.J. Figueras et al. // International journal of systematic and evolutionary microbiology. 2000. - V. 50, N 6. - P. 69-73.

119. In vitro activity of micafungin combined with itraconazole against Candida spp. / M. Marcal et al. // International journal of antimicrobial agents. 2007. - V. 30, N5.-P. 463-465.