Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Идентификация и характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Идентификация и характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот"

На правах рукописи

КОРОБОВ ВЛАДИСЛАВ ВИКТОРОВИЧ

Идентификация и характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеиоксиуксусных кислот

03.00.03. Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2005

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук, с.н.с.

Маркушева Татьяна Вячеславовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Чемерис Алексей Викторович

доктор биологических наук, профессор Нигматуллин Тимербек Газизович

Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов

Пермского научного центра Уральского отделения РАН

Защита диссертации состоится «16» июня 2005 г. в часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01. при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан « 16 » мая 2005 г.

Ученый секретарь Регионального

диссертационного совета, к.б.н. Бикбулатова С.М.

GW

3 mniw

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что современная практическая деятельность человека сопровождается непрерывным поступлением в биосферу токсичных синтетических соединений. Среди этой многочисленной группы приоритетными глобальными загрязнителями являются хлорсодержащие органические производные [Woodwell et al., 1971].

Судьба хлорированных производных в окружающей среде определяется рядом физико-химических факторов, в частности, отмечено, что такие производные подвергаются реакциям фотохимического разложения. Однако основная роль в их деградации принадлежит микроорганизмам. Среди штаммов, способных к конверсии ксенобиотиков, особое место занимают бактерии.

Способности бактерий-дестру кторов обусловлены большим разнообразием ферментных систем и генетической пластичностью, которая во многом определяется наличием у бактерий внехромосомных генетических элементов - плазмид. Плазмиды детерминируют фенотипы, обуславливающие индивидуальные преимущества клеток в определенных селективных условиях. Эти преимущества могут реализовываться через рекомбинации плазмидных и хромосомных генов, а также через возможности горизонтального переноса плазмид. Показано, что плазмиды и мобильные элементы играют фундаментальную роль в приобретении новых катаболических функций и, следовательно, в развитии оригинальных катаболических путей, которые позволяют бактериям адаптироваться и конвертировать различные загрязнители в техносфере [van der Meer et al., 1992].

Плазмиды всегда представляли большую ценность как материал для исследования молекулярной структуры и механизмов функционирования геномов прокариот, так как делали возможным проведение многих молекулярно-генетических экспериментов. В этом контексте плазмиды биодеградации, или D-плазмиды, являются прекрасной моделью для изучения

вопросов строения, функционирования

реакции современных живых систем на условия окружающей среды, а именно, на действие ксенобиотиков. Очевидным является то, что результаты таких исследований имеют не только фундаментальное, но и большое практическое значение: О-плазмиды и несущие их клетки можно использовать для дизайна штаммов-деструкторов нового поколения.

Вместе с тем следует отметить, что к настоящему моменту известно всего лишь несколько видов бактерий-деструкторов, у которых полностью или частично описаны свойства внехромосомных элементов, контролирующих деградацию хлорированных ароматических соединений. Во многом закономерности организации и функционирования О-плазмид прокариот остаются неизвестными. Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - выявить молекулярно-генетические особенности организации новых плазмид штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Задачи:

1. идентифицировать новые плазмиды штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот;

2. выявить особенности структуры плазмид, а именно, установить их размеры, сайты рестрикции для некоторых редкощепящих эндонуклеаз, сделать сравнительный анализ;

3. провести метаболический мониторинг свойств деструкторов, в ходе которого описать количественные и качественные характеристики конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот и установить их связи с плазмидами;

4 локализовать генетические детерминанты катаболизма

хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах штаммов-деструкторов.

е.* » •

Новизна исследований. Впервые показано, что штаммы-деструкторы Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S обладают плазмидами; указанные плазмиды получили следующие обозначения - рСНЗ6 4СРА, pPA21SG и pSM22S. Построены рестрикционные карты плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG, pSM22S и определены их размеры: длина плазмид составляет 5,4 т.п.н., 6,2 т.п.н. и 24,1 т.п.н., соответственно. Показано, что на плазмиде рСНЗб 4СРА и плазмиде pSM22S расположены гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот. В соответствии с этим плазмиды рСНЗб 4СРА и pSM22S были классифицированы как новые D-плазмиды бактерий. Обнаружено, что гены деградации хлорфеноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне плазмиды pPA21SG. Выявлено, что плазмиды рСНЗб 4СРА и pSM22S имеют существенные отличия от плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134.

Установлено, что катаболизм 2,4,5-Т штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S происходит с образованием метилированных форм хлорфеноксиуксусных кислот и 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты.

Практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования расширяют представления об особенностях организации молекулярно-генетических систем, контролирующих процессы конверсии ксенобиотиков в клетках прокариот. Полученные данные могут быть применены для создания новых штаммов-деструкторов с заданными свойствами, а также в разработках ресурсосберегающих технологий восстановления окружающей среды в сфере предприятий нефтехимического профиля.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы Vlli-ro Экологического конгресса (Корея, 2002), Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), Х1Х-го Международного генетического конгресса (Австралия, 2003), конференции

ЕЬЯО (Франция, 2004), 1-го Международного конгресса «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), Ш-го съезда биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), Международной конференции «Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), 4-го Международного семинара-презентации «Биотехнология 2000» (Пущино, 2000), 2-го Международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), Ш-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), конференции «Молодые ученые Волго-урапьского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), Х1У-Й зимней молодежной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), 6-ой и 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002, 2005).

Публикации. Результаты диссертации изложены в 16 печатных работах.

Структура и объем диссертации. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (глава 3), выводов, списка цитированной литературы, включающей 112 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 111 страницах, содержит 19 рисунков и 11 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования служили природные штаммы бактерий, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства.

Для определения основных морфологических и морфометрических характеристик и структурно-популяционных особенностей микробных популяций исследуемых бактерий использовали стандартные методы просвечивающей электронной микроскопии. Работу проводили на электронном микроскопе Н-300 «Hitachi».

Идентификацию культур по физиолого-биохимическим признакам проводили согласно принципам руководства «Определитель бактерий Берджи» [1997]. Классификацию бактерий по молекулярным критериям систематики проводили по последовательности генов 16S рРНК. Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов был проведен с помощью сервера BLASTA. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов с помощью программы CLUSTAL.W [Edwards et al., 1989]. Построение бескорневых филогенетических деревьев производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON [Thompson et al., 1994].

Выделение внехромосомных элементов осуществляли

модифицированным методом щелочного лизиса [Маниатис с соавт., 1984; Герхард, 1990]. Сравнительный анализ препаратов плазмид проводили фракционированием в агарозном геле в стандартных условиях [Fisher et al., 1971; Aaij et al., 1972; Maniatis et al., 1982]. Элиминацию плазмид индуцировали бромистым этидием согласно стандартной методике с небольшими модификациями [Герхард, 1990]. Для определения размеров фрагментов ДНК использовали пакет программ Bio-Edit и Gel Analysis. Гибридизацию препаратов ДНК проводили по методу Саузерна [1975] с небольшими модификациями.

Для анализа количества хлорфеноксиуксусных кислот в культуральной жидкости использовали модифицированные методы определения микроколичеств пестицидов [Клисенко, 1984]. Идентификацию интермедиатов проводили методом хромато-масс-спектрометрии на хроматомасс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360, анализируя совокупность данных о сроках удерживания соединений в хроматограф ической колонке и данных анализа масс-спектров, основанных на зависимости структура - характер распада. Данные интерпретировали, используя «внутренний интеллект» системы обработки данных MS HP ChemStation, содержащей библиотеку из 138 тыс. масс-спектров Base Date WILEY138L.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Морфологические, морфометрические, физиологические и биохимические признаки исследуемых бактерий. В начале работы с целью классификации исследуемых объектов, а именно, природных культур IBRB-36 4СРА, IBRB-21SG, IBRB-22S и IBRB-2T, были изучены их основные характеристики.

В ходе анализа морфологических и морфометрических признаков клеток культуры IBRB-36 4СРА было показано, что они представляют собой подвижные палочки с закругленными концами, до сферических. При исследовании препаратов штамма в просвечивающем электронном микроскопе было установлено, что размеры клеток варьировали в пределах 0,55-0,5/0,76-5,0 и 0,6/0,8-2,0 мкм (рис. 1А). При росте на МПА наблюдались полупрозрачные колонии с неровным краем, выпуклые.

Исследование морфологических признаков культуры IBRB-21SG показало, что клетки штамма также представляют собой подвижные палочки, которые при росте на МПА образуют гладкие не пигментированные колонии. На момент анализа большинство клеток популяции имело форму палочек размерами 0,37/0,73-1,4 мкм с ровной поверхностью (рис. 1Б).

Рис.1.Электронно-микроскопические изображения бактерий: А - клетки Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА (X 18000); Б - клетки Agrobacterium tumefaciens IBRB-21SG (X 18000); В - клетки Serratia marcescens IBRB-22S (X 24000), Г - клетки Gluconobacter oxydans IBRB-2T (X 18000). Стрелкой указаны молодые клетки, двумя стрелками - старые клетки, пунктирной стрелкой - жгутики клеток.

Изучение ультраструктуры культуры IBRB-22S показало, что большинство клеток представляют собой подвижные кокки и овалы размером 0,63 и 0,63/1,05 мкм, со жгутиками (рис. 1 В). При росте на МПА наблюдалось образование красноватых колоний.

Клетки культуры IBRB-2T представляли собой подвижные коккобациллы, одиночные и сдвоенные с многочисленными жгутиками. Размеры клеток - 0,46-0,46/0,6 мкм (рис. 1Г). При росте на богатой среде наблюдались беловатые, гладкие, блестящие, непрозрачные колонии, которые на некоторых средах были полупрозрачными.

Для всех культур был выявлен характер роста при различных значениях pH и температуры, отношение к различным источникам углерода и азота, оксидазная, каталазная и гидролитическая активности.

Согласно совокупности культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков исследуемые культуры были дифференцированы как штаммы Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА, Agrobacterium tumefaciens IBRB-21SG, Serratia marcescens IBRB-22S и Gluconobacter oxydans IBRB-2T.

Филогенетическое положение штаммов по данным секвенирования генов 16S рРНК. При проведении анализа секвенированных коротких фрагментов, представляющих наиболее вариабельные участки генов 16S рРНК исследуемых штаммов, по базе данных GenBank, было показано, что они принадлежат к одной таксономической группе, а именно к гамма-подклассу протеобактерий. Для окончательного анализа было секвенировано 1400 нуклеотидов генов 16S рРНК, по номенклатуре Е coli примерно соответствующих позициям с 30 по 1500 нуклеотид.

На основании проведения сравнительного филогенетического анализа с использованием последовательностей генов 16S рРНК, представленных в базе данных Ribosomal Database Project, было показано, что культуры IBRB-36 4СРА и IBRB-22S принадлежат к филогенетической подгруппе энтеробактерий (рис. 2). При этом штамм IBRB-36 4СРА можно было отнести к филогенетической подгруппе гетерогенного рода Citrobacter. Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемого штамма с последовательностями указанных видов подгруппы составлял 97,6-98,8%, что оказалось заметно ниже внутривидового уровня для типовых видов С koseri и С farmery (99,4%). Внутри филогенетического кластера, образованного этими видами, изучаемый штамм IBRB-36 4СРА образовывал самостоятельную ветвь. Поэтому был сделан вывод о том, что по молекулярным критериям дифференциации штамм

IBRB-36 4CPA может представлять отдельный новый вид данной филогенетической подгруппы рода Citrobacter; он был обозначен нами как Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА.

4

Serratia marcescens Serratia marcescens u Serratia marcescens Serratia marcescens Serratia marcescens Serratia marcescens Serratia marcescens ATCC 13 8 8 0T i Serratia marcescens 22S

— Serratia rubidaea KM 1240T

— Serratiaßcaria JCM 1241T Serratia hquefaciens JCM 12 4 5 T Citrobacter werkmann CDC 0 8 7 6 -5 8T Citrobacter braaku CDC 0 8 0 -5 8 T Citrobacterfreundu D6 M 30039T Escherichia coli K-l 2

oof Citrobacter kosen CDC 8132-86 Citrobacter kosen CDC 3 613 -63 T - f Citrobacter amalonaücus CDC 9020-77 1 P Citrobacter formen CDC 8' n .— Citrobacter hydrophila 36 4CPA

q— Citrobacter sedlakii CDC 4 69 6 -8 6 T Citrobacter rodentmm CDC 1843-737 Pseudomonas aeruginosa 86351 Pseudomonas aeruginosa 21SG

Pseudomonas aeruginosa AL9 8 Pseudomonas aeruginosa NIH " Pseudomonas aeruginosa ATCC 25330 Pseudomonas aeruginosa LMG1242 T Pseudomonas aeruginosa AL9 8

■ Pseudomonas muctdolens IAM 2406'

■ Pseudomonas azotoformans IAM 16 03 T ■ Pseudomonas tolaasu LMG 23 4 2T

" Pseudomonas rhodesiaeCiP 104664T ■ Pseudomonas fluorescens IAM 12022T

" Pseudomonas fluorescens

" Pseudomonasfluorescens VUN 10,011 iPseudomonas veromt CiP 1046631 [ Pseudomonasfluorescens DS M 5 010 8 Pseudomonas fluorescens NCIMB 9815

Рис.2.Филогенетическое положение изучаемых штаммов. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2 нуклеотидным заменам на каждые ЮОнуклеотидов.Цифрамипоказана достоверность ветвления, установленная с помощью «bootstrap» -анализа 100 альтернативных деревьев.

Согласно результатам анализа последовательностей генов 16SpPHK штамм IBRB-21SG входил в кластер, образованный несколькими штаммами Р aeruginosa, включая типовой (рис. 2). Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК со штаммами этого кластера оказался очень высоким и составил 99,4-99,9%. Этот уровень соответствовал внутривидовому для вида P. aeruginosa (99,6-99,9%). Поэтому, согласно существующим представлениям, по изучаемым молекулярным критериям [Stackebrandt, Goebel, 1994]штамм IBRB-21SG можно было идентифицировать как представителя этого вида, а именно, как Р. aeruginosa.

Штамм IBRB-22S входил в кластер, образованный несколькими штаммамииизолятами5еггайя»»агсе5сега, включая типовой (рис. 2). Уровень сходства последовательностей 16SpPHK со штаммамиэтого кластера оказался очень высоким и составил 99,4-99,8%. Этот уровень соответствовал внутривидовому для вида S. marcescens (98,8%). Уровень сходства последовательностей с другим и видам и рода Serratiabun зам етно ниже - 98,398,5%. Обнаруженныйуровень сходства последовательностей генов 16SpPHK позволил отнести изучаемый штамм к роду Serratia и виду marcescens.

На данном этапе работы было обнаружено, что штамм Gluconobacter oxydans IBRB-2Tидентифицируется как смешанная культура.

Резюмируя, можно заключить, что на основании современных молекулярных критериев систематики прокариот изучаемые культуры были дифференцированы следующим образом -.Citrobacter hydrophila IBRB-364CPA (Aeromonas hydrophila IBRB-36 4CPA), Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG (Agrobacterium tumefaciens IBRB-21SG)h Serratia marcescens IBRB-22S.

Динамика деградации хлорфеноксиуксусных кислот периодическими культурами С. hydrophila IBRB-36 4СРА, P. aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S. На рис.3 приведены данные, описывающие динам ику роста штам м ов и оценка использования им и м олекул

хлорфеноксиуксусных кислот, а именно 2,4,5-Т, 2,4-Д и 4-Х ФУК, в качестве источников углерода и энергии. Из приведенных данных следует, что штам м ы способны осуществлять конверсию ксенобиотиков и их можно отнести к штам мам-деструкторам. Отметим, что ранее среди деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот не бы ли обнаружены штаммы родов Citrobacter и Serratia.

Рис.3. Динамика роста штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА (АХ Pseudomonas aeruginosa IB RВ-21SG (Б) и Serratia marcescens 1BRB-22S (В)в условиях использования в качестве источников углерода и энергии 4-ХФУК(1), 2,4-Д (П) и 2,4,5-Т (Ш). Оценка остаточного количества хлорфеноксиуксусных кислот (%)в среде культивирования (Г).

Идентификация плазм на штаммов С. hydrophila IBRB-36 4СРА, P. aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S. Фракционирование в агарозном геле препаратов плазм ид, полученных из клеток исследуемых бактерий (рис. 4), показало, что плазмиды имеют различия в раз мерах, приэтом наиболее длинной является плазмида штам м а Serratia marcescens IBRB-22S,a наиболее короткой - плаз м ида С itr obac ler hydr ophila IB R В -36 4С PA. Плаз м ида С. hydr ophila IBRB-36 4СРА получила обозначение рСНЗб 4СРА, Р aeruginosa IBRB-21SG -pPA21SG, а 5 marcescens IBRB-22S-pSM22S.

Шяи •

2 825-

2 120-

Рис. 4. Электрофоре г рам м а препаратов плазмид штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S.

1 - маркерные фрагменты ДНК фага X, рестриктированной

3 вдону клеаз ой Ps tl;

2 - препарат плазмиды штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36

4 CPA;

3 - препарат плазмиды штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG;

4 - препарат плазмиды штамма Serratia marcescens IBRB-22S.

Рестрикционное картирование плазмид рСНЗб 4СРА, рРА218в и р8М228. В ходе дальнейшей работы плазмиды рСНЗб 4СРА, рРА21БС и р8М22Б были подвергнуты рестрикционному анализу, в результате которого были построены их рестрикционные карты (рис. 5). Из рисунка видно, что плазмиды действительно имеют различный раз мер. Длина плазмцды рБМ225 составляет около 24,1 т.п.н., рРА218С-примерно 6,2 т.п.н. и наименьшую длину имеет плазмида рСНЗб 4СРА -она составляет около 5,4 т.п.н.

BamHI

2,3

Pstl —'

Hindlll

BamHI

1,1

4,1

BamHI

21SG \1^BamHI

_BamHI

2,4 BamHI

Рис. 5. Рестрикционные карты плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S.

Локализация генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA2TSG и pSM22S. С использованием метода дискриминации признака был проведен поиск детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S. Для этого плазмиды были элиминированы из клеток бактерий-хозяев. Такие клетки с генотипом pi были испытаны на потерю возможных функций, а именно - способности использовать хлорфеноксиуксусные кислоты в качестве источника углерода и энергии С этой целью они были высеяны на агаризованную минимальную солевую среду М9, к которой были добавлены ксенобиотики в качестве источников углерода и энергии. В табл. 1 приведены оценки роста штаммов С. hydrophila IBRB-36 4СРА (рСНЗб 4СРА ), P. aeruginosa IBRB-21SG (pPA21SG ) и S marcescem

1ВЯВ-228 (р8М22Б ) в сравнении с контролем, которым служили оценки роста штаммов на среде без добавления ксенобиотиков.

Таблица 1

Оценка катаболической активности штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S после элиминации плазмид

Штамм Оценка катаболической активное!и штаммов

контроль Среда М9 с ксенобиотиками

4-ХФУК 2,4-Д 2,4,5-Т

С. hydrophila IBRB-36 4СРА (рСНЗб 4СРА ) + - - -

P. aeruginosa 1BRB-21SG (рРА21SG ) + + + +

5 marcescens IBRB-22S (pSM22S ) + - - -

Условные обозначения: (+) - наличие роста, (-) - отсутствие роста

Из данных табл. 1 видно, что клетки штаммов С hydrophila 1BRB-36 4СРА и S marcescens IBRB-22S с потерей плазмид утрачивали способность использовать хлорфеноксиуксусные кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти результаты указывают на то, что гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот расположены на плазмиде рСНЗб 4СРА штамма С hydrophila IBRB-36 4СРА и плазмиде pSM22S штамма S marcescens IBRB-22S, в то время как гены деградации хлорфеноксиуксусных кислот штамма Р aeruginosa IBRB-21SG расположены вне исследуемой плазмиды. Таким образом, можно заключить, что плазмиды штаммов С hydrophila IBRB-36 4СРА и S marcescens IBRB-22S могут быть

классифицированы как плазмиды деградации. Из приведенных данных также следует, что гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот Р aeruginosa IBRB-21SG расположены в составе хромосомы. Резюмируя, подчеркнем, что у штаммов родов Citrobacter и Serratia D-плазмиды обнаружены впервые.

Анализ процессов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот С. hydrophila IBRB-36 4СРА, P. aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S. Сравнение результатов идентификации продуктов метаболизма 2,4,5-Т, приведенных в табл. 2, показывает, что среди метаболитов С hydrophila IBRB-36 4СРА отмечены производные хлорфеноксиуксусных кислот: 2,4-Д и 4-хлор-6-метил-ФУК. В среде культивирования Р aeruginosa IBRB-21SG и S marcescens IBRB-22S наблюдалось присутствие 2,4-дихлор-6-метил-ФУК, а ее дегалогенированная форма отмечена только для 5 marcescens IBRB-22S. Во всех исследованных пробах было обнаружено присутствие 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты. Эти результаты указывают на то, что к числу реакций, осуществляемых С. hydrophila IBRB-36 4СРА, P. aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S, можно отнести дехлорирование молекул 2,4,5-Т с образованием молекул галогенированных феноксиуксусных кислот, которые подвергались расщеплению с образованием 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты.

Следует отметить, что присутствие 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты указывает на то, что штаммы С. hydrophila IBRB-36 4СРА, P. aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S способны осуществлять мета-путь расщепления ароматического кольца, в ходе которого оно раскрывается по - соседству с гидроксильной группой. Такой путь обмена ранее был установлен для нескольких микроорганизмов, а именно для Commamonas testosteroni PI [Arai et al., 1998], Pseudomonas putida H [Herrmann et al., 1995], Pseudomonas sp. 5-T [Кулакова с соавт., 1992] и Pseudomonas sp CF600 [Nordlund et al., 1993; Bartilson et al., 1989].

Таблица 2

Результаты идентификации метаболитов 2,4,5-Т Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S

Метаболит Основпые пики в масс-спектре m/z,% Присутствие в среде культивирования

Citrobacter hydrophila IBRB36-4CPA Pseudomonas aeruginosa IBRB 21 SG Serratia marcescens IBRB 22 S

OTIIj-f СИХ llj ф"' л 2,4-Д М* 234 (89), 2.16 (55), 199 (69), 17* (64), 175 (100), 161 (50), 163 (32), 148 (30), 146 (42) + -

OCHj-tOOCH, о 2,4-дмхлар-б-иетнл ФУК М* 264 (30), 233 (30), 19 (100), 175 (25), 147 (30), 87 (15), 59 (20) - + +

Oí IIJ-ÍOOÍ II, CI 4-хлор-6-метил ФУК М*200 (100), 202 (32), 143 (32), 141 (100), 141 (100), 113 (38), 111 (58) М' 166 (50), 107 (120), 77 (80) + - -

«к lift'tu Kl i, Ó ФУК - +

ÍU». "■"V йен Xj 2-гндрокси-2-гвксен диоиовяя кислота М+45 (100), 55 (20), 5» («), 87 (5). 115 (6), 129 (20), 125(2), 188 (0.1) + + +

Суммируя можно заключить, что штаммы С hydrophila IBRB-36 4СРА, P.

aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S способны осуществлять совокупность процессов дегалогенирования молекул 2,4,5-Т. При этом эти реакции находятся под контролем плазмид рСНЗб 4СРА и pSM22S у штаммов С hydrophila IBRB-36 4СРА и S. marcescens IBRB-22S и хромосомных генов в случае штамма P. aeruginosa IBRB-21SG.

Сравнительный анализ генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот С. hydrophila IBRB-36 4СРА, P. aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S с плазмидой pJP4 штамма Alcaligenes eutrophus JMP134. Принимая во внимание то, что плазмида pJP4 является наиболее изученной из ряда D-плазмид бактерий-деструкторов хлорированных ароматических соединений, было проведено сравнение генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов С. hydrophila IBRB-36 4СРА, Р aeruginosa IBRB-21SG и S. marcescens IBRB-22S с плазмидой pJP4. Штамм Alcaligenes eutrophus JMP134, несущий плазмиду pJP4, был любезно предоставлен для работы профессором Sabine Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Germany).

Из рис. 6 видно, что сравниваемые препараты ДНК не имеют значимого уровня гибридизации. Уровень гибридизации препарата плазмиды рСН 36 4СРА с препаратом плазмиды pJP4 составляет 9 %, плазмиды pSM22S -3 %, тотальной ДНК штамма Р aeruginosa IBRB-21SG - 3 % от контроля, в качестве которого был принят уровень гибридизации препаратов плазмиды pJP4 (100%).

1 2 3 4 Рис. 6. Результаты гибридизации

препаратов плазмиды рСНЗб 4СРА

• С hydrophila IBRB-36 4СРА,

тотальной ДНК Р aeruginosa IBRB-21 SG и плазмиды pSM22S S marcescens IBRB-22S с препаратом

• Л плазмиды pJP4 штамма Alcaligenes

eutrophus JMP134. 1 - препарат плазмиды pJP4 (конт-

• роль); 2 - препарат плазмиды рСНЗб

4СРА; 3 - препарат тотальной ДНК штамма P. aeruginosa IBRB-21 SG; 4 _ - препарат плазмиды pSM22S

Эти данные свидетельствуют в пользу того, что на плазмидах рСНЗб 4СРА и pSM22S расположены детерминанты катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, имеющие существенные отличия от изученного ранее кластера деградации хлорфеноксиуксусных кислот плазмиды pJP4.

20

ВЫВОДЫ

1. Впервые идентифицированы плазмиды штаммов-деструкторов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S. Указанные плазмиды получили следующие обозначения: рСНЗб 4СРА, pPA21GS. pSM22S, соответственно. Построены рестрикционные карты и определены размеры плазмид.

2. Показано, что на плазмидах рСНЗб 4СРА и pSM22S расположены генетические детерминанты конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот, поэтому данные плазмиды классифицированы как новые D-плазмиды бактерий. Обнаружено, что гены конверсии хлорфеноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне плазмиды этого штамма.

3. Установлено, что плазмиды рСНЗб 4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА и pSM22S Serratia marcescens IBRB-22S имеют существенные отличия от плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134.

4. Впервые установлены этапы метаболизма 2,4,5-Т штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S. Показано, что катаболизм 2,4,5-Т этих штаммов происходит с образованием метилированных молекул хлорфеноксиуксусных кислот и 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты.

5. Выявлено, что согласно молекулярным критериям систематики, штамм Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА может являться новым видом филогенетической подгруппы бактерий рода Citrobacter

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Markusheva Т.V., Zhurenko E.Yu., Kusova I.V., Galkin E.G., Korobov V.V. Strains - destructors of phenol and its chlorinated derivatives // Biotechnology -2000. - Pushino, 2000.-P. 153.

2. Markusheva T.V., Zhurenko E. YU., Galkin E.G., Korobov V.V., Zharikova N.V. Ecosystems exposed to anthropogenic pollutants action: biodiversity of soil bacteria - destructors // VIII Congress of Ecology. - Korea, 2002. - P. 19.

3. Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Маджар В.В., Жарикова Н.В., Калимуллина Э.Р., Гафиятова Л.Р., Маркушева Т.В. Микроорганизмы для очистки окружающей среды // Материалы 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». -Москва, 2002. - С. 276.

4. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Жарикова Н.В., Коробов В.В. Этапы конверсии 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты природных бактерий-деструкторов // Материалы III съезда биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002. - С. 43.

5. Коробов В.В., Жарикова Н.В., Калимуллина Э.Р., Гафиятова Л.Р., Михалев А.А. Природные штаммы бактерий, вовлекающие ксенобиотики в обмен веществ // Тезисы докладов 6-ой Пущинской школы-конференции молодых ученых. - Пущино, 2002. - Т. 3. - С. 30-31.

6. Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Маркушева Т.В. Биоремедиация: конверсия фенола и его хлорированных производных // Труды Всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России». - Москва, 2002. - Т. 2. - С. 189-193.

7. Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Gluconobacter oxydans IBRB-2T - деструктор 2,4,5-три-хлорфеноксиуксусной кислоты // Биотехнология. - 2003. - № 6. - С. 67-71.

8. Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р., Журенко Е.Ю., Маджар В.В., Михалев А.А., Маркушева Т.В. Плазмида штамма Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА и ее свойства // Материалы 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики». - Москва, 2003. - Т. 2. - С. 84-85.

9. Zharikova N.V., Korobov V.V., Zhurenko E.Yu., Gafiyatova L.R., Michalev A.A., Madjar V.V., Galkin E.G., Markusheva T.V. Bacteria-degrading phenol and its chlorinated derivatives // First FEMS Congress of European Microbiologists. - Slovenia, 2003. - P. 430.

10. Markusheva T.V., Zhurenko E.Yu., Korobov V.V., Zharikova N.V., Gafiyatova L.R., Madjar V.V., Michalev A. A. Serratia marcescens IBRB-22S plasmid and its properties // XIX International Congress of Genetics. -Australia, 2003. - P. 3032.

П.Маркушева T.B., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Идентификация и характеристика плазмиды штамма Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА, несущей гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот // Генетика. - 2004. - Т. 40. - № 11. -С. 1469-1474.

П.Маркушева Т.В., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Гафиятова J1.P., Лубянов Е.А., Журенко Е.Ю., Маджар В.В. Плазмида штамма Serratia marcescens IBRB-22S, несущая гены конверсии хлорфеноксиуксусных кислот и устойчивости к тяжелым металлам // Материалы III съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». -Москва, 2004. - Т. 1.-С. 394.

13.Gafiyatova L.R., Zharikova N.V., Korobov V.V., Lubyanov E.A., Zhurenko E.Yu., Madjar V.V, Markusheva T.V. Aeromonas hydrophila IBRB-36 4CPA plasmid, carrying genes of chlorophenoxyacetic acid conversion antibiotic and heavy metals resistance // ELSO Meeting. - France, 2004. - P. 260.

14.Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р., Журенко Е.Ю, Маркушева ТВ. Масс-спектрометрия в исследованиях процессов биологической конверсии пестицидов // Материалы 2-го Международного семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». - Москва, 2004. - С. 265.

15.Markusheva T.V., Zhurenko E.Yu., Galkin E.G., Korobov V.V., Zharikova N.V., Gafiyatova L.R. Bacteria for environment remediation // International conference «Science and Business Partnerships in Action: Issues and Solutions in Discovery and Use of Novel Biomolecules: Biodiversity and Environment». - Pushino, 2004. - P. 57,210.

16.Коробов B.B., Гафиятова Л.Р., Жарикова H.B., Лубянов Е.А., Логинова А.Н., Ягудин Р.А., Дремова А.Ю., Фатхиева Г.Р., Маджар В.В., Маркушева Т.В. Микроорганизмы промышленных экосистем: деструкторы хлорзамещенных ароматических кислот // Тезисы докладов 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2005. - С. 196.,

Коробов Владислав Викторович

Идентификация и характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот

03 00 03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лиц на издат леят Б848421 от 03 11 2000 г Подписано в печать 12 05 2005 Формат 60x84/16 Компьютерный набор Гарнитура Times New Roman Отпечатано на ризографе Уел печ л - 1,5 Уч -изд л - 1 7 Тираж 100 экз Заказ № 83

Издательство БГПУ 450000 г Уфа, ул Октябрьской революции, За

€10246

РНБ Русский фонд

2006-4 6343

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коробов, Владислав Викторович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Структурно-функциональные особенности организации плазмид биодеградации

1.1. Плазмиды биодеградации бактерий

1.2. Особенности организации катаболической плазмиды pJP4 15 Alcaligenes eutrophus JMP

1.2.1. Особенности организации производных плазмиды pJP

1.3. Другие плазмиды биодеградации ксенобиотиков

1.4. Трансмиссивные свойства плазмид биодеградации

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Идентификация штаммов

2.2.1. Идентификация штаммов по признакам морфологической, 33 морфометрической, физиологической и биохимической дифференциации

2.2.2. Классификация бактерий по последовательности генов 34 16S рРНК

2.3. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет

2.4. Определение количества хлорфеноксиуксусных кислот в 37 культуральной жидкости

2.5. Идентификация продуктов метаболизма 2,4,5-Т

2.6. Выделение внехромосомных элементов геномов бактерий

2.7. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле

2.8. Элиминация плазмид из клеток бактерий, индуцированная 40 бромистым этидием

2.9. Фракционирование препаратов плазмидной ДНК методом гель- 40 фильтрации

2.10. Обработка препаратов плазмидной ДНК рестрикционными 41 эндонуклеазами

2.11. Определение размеров фрагментов ДНК

2.12. Иммобилизация препаратов ДНК на мембранном фильтре

2.13. Получение препарата радиоактивной ДНК

2.14. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре

2.15. Физико-химические свойства и область применения 43 хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Морфологические, морфометрические, физиологические и 45 биохимические признаки штаммов IBRB-36 4CPA, IBRB-21SG, IBRB-22S и IBRB-2T

3.2. Филогенетическое положение штаммов IBRB-36 4СРА, IBRB- 59 21SG, IBRB-22S и IBRB-2T по данным секвенирования генов

16S рРНК

3.3. Динамика деградации хлорфеноксиуксусных кислот Citrobacter 64 hydrophila IBRB-36 4СРA, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S в периодической культуре

3.4. Идентификация и структурно-функциональный анализ плазмид 70 штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S

3.4.1. Получение сферопластов и выделение плазмид

3.4.2. Рестрикционное картирование плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG 74 и pSM22S

3.4.3. Локализация генетических детерминант катаболизма 81 хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S

3.5. Анализ процессов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S

3.6. Сравнительный анализ генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S с плазмидой pJP4 штамма Alcaligenes eutrophus JMP

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Идентификация и характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот"

Актуальность проблемы. Известно, что современная практическая деятельность человека сопровождается непрерывным поступлением в биосферу токсичных синтетических соединений, которые трудно включаются в элементарные циклы обмена углерода, азота, серы и фосфора. Среди этой многочисленной группы приоритетными глобальными загрязнителями являются хлорсодержащие органические производные. Они обнаруживаются во всех объектах живой и неживой природы: в атмосферных осадках, в океанах, в почвах заповедников, в водной биоте, их присутствие отмечено во многих организмах, населяющих планету [Woodwell et al., 1971].

Судьба хлорированных производных в окружающей среде определяется рядом физико-химических факторов, в частности, отмечено, что такие производные подвергаются реакциям фотохимического разложения. Однако большинство исследований указывает на то, что основная роль в их деградации принадлежит микроорганизмам.

Среди штаммов, способных к деградации ксенобиотиков, особое место занимают бактерии. Показано, что бактерии способны трансформировать или полностью утилизировать широкий спектр органических соединений, начиная от простейших углеводородов и заканчивая достаточно сложными химически стабильными молекулами.

Отмечено, что способности бактерий-деструкторов обусловлены большим разнообразием ферментных систем и генетической пластичностью, которой способствует наличие внехромосомных генетических элементов - плазмид. Плазмиды детерминируют фенотипы, обуславливающие индивидуальные преимущества клеток в определенных селективных условиях. Эти преимущества могут реализовываться также через возможности периодического переноса и рекомбинации плазмидных и хромосомных генов. Предполагается, что плазмиды и мобильные элементы играют фундаментальную роль в приобретении новых катаболических функций и, следовательно, в развитии катаболических путей, которые позволяют бактериям адаптироваться и конвертировать различные загрязнители в техносфере [Van der Meer et al., 1992]. Плазмиды, по-видимому, всегда выполняли центральную роль в создании конкурентного разнообразия, служащего материалом для естественного отбора. Такая роль заключалась в увеличении числа функций, которые могут выполнять как отдельные клетки, так и популяция в целом, в случае горизонтального генетического обмена.

В настоящее время плазмиды представляют большую ценность как материал для исследований молекулярной структуры и механизмов функционирования геномов современных прокариот. Они обладают несколькими достоинствами. Плазмиды имеют относительно небольшие размеры, а это означает, что манипулировать с ними in vitro гораздо проще, чем с хромосомами. Кроме того, обычно клетки-хозяева плазмид могут существовать и размножаться без них, поэтому можно выявить те свойства, которые плазмиды сообщают клетке. Поскольку такие, детерминируемые плазмидой функции, нередко могут быть использованы для скрининга, плазмиды делают возможным проведение многих молекулярно-генетических экспериментов. В этом контексте плазмиды биодеградации, или D-плазмиды, представляют собой прекрасную модель для изучения вопросов строения, функционирования и эволюции генов, вовлеченных в реакции живых систем на условия окружающей среды, а именно, на действие ксенобиотиков. Очевидным является то, что результаты таких исследований имеют не только фундаментальное, но и большое практическое значение, так как D-плазмиды и несущие их клетки можно использовать для создания штаммов-деструкторов нового поколения.

Основные направления молекулярных исследований в области биодеградации можно сформулировать следующим образом:

• выявление разнообразия плазмид штаммов-деструкторов;

• выяснение строения и молекулярно-генетических механизмов функционирования и эволюционирования модулей ассимиляции ксенобиотиков;

• разработка стратегии конструирования штаммов-деструкторов с заданными свойствами in vitro',

• разработка основ эффективного управляемого применения биодеструкторов в качестве действующих объектов биотехнологий конверсии ксенобиотиков как альтернатива методам удаления таких соединений в «безопасные» места.

Вместе с тем следует отметить, что к настоящему моменту известно всего лишь несколько видов бактерий-деструкторов, у которых полностью или частично описаны свойства внехромосомных элементов, контролирующих деградацию хлорированных ароматических соединений. Во многом закономерности их организации и функционирования остаются неизвестными.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы — выявить молекулярно-генетические особенности организации новых плазмид штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот.

Задачи:

1. идентифицировать новые плазмиды штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот;

2. выявить особенности структуры плазмид, а именно, установить их размеры, сайты рестрикции для некоторых редкощепящих эндонуклеаз, провести сравнительный анализ плазмид с плазмидой pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134;

3. провести метаболический мониторинг свойств деструкторов, в ходе которого описать количественные и качественные характеристики конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот;

4. локализовать генетические детерминанты катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот на плазмидах штаммов-деструкторов.

Объекты исследований. Объектами исследования служили природные штаммы, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства.

Новизна исследований. Впервые показано, что штаммы-деструкторы Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S обладают плазмидами; указанные плазмиды получили следующие обозначения -рСНЗб 4СРА, pPA21SG и pSM22S. Построены рестрикционные карты плазмид рСНЗб 4СРА, pPA21SG, pSM22S и определены их размеры: длина плазмид составляет 5,4 т.п.н., 6,2 т.п.н. и 24,1 т.п.н., соответственно. Показано, что на плазмиде рСНЗб 4СРА и плазмиде pSM22S расположены гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот. В соответствии с этим плазмиды рСНЗб 4СРА и pSM22S были классифицированы как новые D-плазмиды бактерий. Обнаружено, что гены деградации хлорфеноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне плазмиды pPA21SG. Выявлено, что плазмиды рСНЗб 4СРА и pSM22S имеют существенные отличия от плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP134.

Установлено, что катаболизм 2,4,5-Т штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S происходит с образованием метилированных форм хлорфеноксиуксусных кислот и 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты.

Практическая значимость работы. Результаты настоящего исследования расширяют представления об особенностях организации молекулярно-генетических систем, контролирующих процессы конверсии ксенобиотиков в клетках прокариот. Полученные данные могут быть применены для создания новых штаммов-деструкторов с заданными свойствами, а также в разработках ресурсосберегающих технологий восстановления окружающей среды в сфере предприятий нефтехимического профиля.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы VIII-го Экологического конгресса (Корея, 2002), Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), XIX-го Международного генетического конгресса (Австралия, 2003), конференции ELSO (Франция, 2004), 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 111-го съезда биохимического общества (С.-Петербург, 2002), Международной конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), Международной конференции «Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина» (Пущино, 2004), 4-го Международного семинара-презентации «Биотехнология 2000» (Пущино, 2000), 2-го Международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Москва, 2004), Всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), Ш-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004), конференции «Молодые ученые Волго-уральского региона на рубеже веков» (Уфа, 2001), XIV-й зимней молодежной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2002), 6-ой и 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2002, 2005).

Публикации. Результаты диссертации изложены в 16 печатных работах.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы (глава 1), описания объектов и методов исследования (глава 2), изложения результатов и их обсуждения (глава 3), выводов, списка цитированной литературы, включающей 112 работ отечественных и зарубежных авторов. Работа изложена на 111 страницах, содержит 19 рисунков и 11 таблиц.

Гранты. Работа выполнена при поддержке ФЦНТП "Интеграция науки и высшего образования России" (Э0029), а также гранта РФФИ №02-04-97911.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Коробов, Владислав Викторович

выводы

1. Впервые идентифицированы плазмиды штаммов-деструкторов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S. Указанные плазмиды получили следующие обозначения: рСНЗб 4СРА, pPA21GS и pSM22S, соответственно. Построены рестрикционные карты и определены размеры плазмид.

2. Показано, что на плазмидах рСНЗб 4СРА и pSM22S расположены генетические детерминанты конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот, поэтому данные плазмиды классифицированы как новые D-плазмиды бактерий. Обнаружено, что гены конверсии хлорфеноксиуксусных кислот штамма Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG расположены вне плазмиды этого штамма.

3. Установлено, что плазмиды рСН36 4СРА Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА и pSM22S Serratia marcescens IBRB-22S имеют существенные отличия от плазмиды pJP4 Alcaligenes eutrophus JMP 134.

4. Впервые установлены этапы метаболизма 2,4,5-Т штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА, Pseudomonas aeruginosa IBRB-21SG и Serratia marcescens IBRB-22S. Показано, что катаболизм 2,4,5-Т этих штаммов происходит с образованием метилированных молекул хлорфеноксиуксусных кислот и 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты.

5. Выявлено, что, согласно молекулярным критериям систематики, штамм Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА может являться новым видом филогенетической подгруппы бактерий рода Citrobacter.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коробов, Владислав Викторович, Уфа

1. Aaij С., Borst P. The gel electrophoresis of DNA // Biochim.

2. Biophys. Acta. 1972. - V. 269. - № 1. - P. 192

3. Arai H., Akahira S., Ohishi Т., Maeda M., Kudo T. Adaptation of

4. Comamonas testosteroni TA441 to utilize phenol: organization andregulation of the genes involved in phenol degradation //

5. Microbiology. 1998. - V. 144. - P. 2895-2903.

6. Balajee S., Mahadevan A. Influence of chloroaromatic substances onthe biological activity of Azotobacter chroococcum И Chemosphere. 1990. V. 21. - № 1-2. - P. 51-56.

7. Bollag J.-M., Helling C.S., Alexander M. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols // J. Agr. Food Chem. 1968. - V. 16. - № 5. - P. 826-828.

8. Bouanchaud D.H., Scavizzi M.R., Chabbert Y.A. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in Enterobacteria and Staphylococci II J. Gen. Microbiol. 1968. - V. 54. - Pt. 3. - P. 417.

9. Burlage R.S., Bemis L.A., Layton A.C., Sayler G.S., Larimer F. Comparative genetic organization of incompatibility group P degradative plasmids // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - № 12. -P. 6818-6825.

10. Clement P., Matus V., Cardenas L., Gonzales B. Degradation of trichlorophenols by Alcaligenes eutrophus JMP134 // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V. 127. - № 1-2. - P. 51-55.

11. Don R.H., Pemberton J.M. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus //J. Bacteriol. 1981. - V. 145. - № 2. - P. 681-686.

12. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA // Nucl. Acids Res. 1989. - V. 17. - № 19. - P. 7843-7853.

13. Evans W.C., Smith B.S.W., Fernley H.N., Davies J.I. Bacterial metabolism of2,4-D// J. Biochem. 1971. - V. 122. - P. 543-551.

14. Fisher P.R., Appleton J., Pemberton J.M. Isolation and characterisation of pesticide degrading plasmid pJPl from Alcaligenes paradoxus 111. Bacteriol. 1978. - V. 135. - № 3. - P. 798-804.

15. Friedrich В., Meyer M., Schlegel H.G. Transfer and expression of the herbicide-degrading plasmid pJP4 in aerobic autotrophic bacteria // Arch. Microbiol. 1983. -V. 134. - № 2. -P.92-97.

16. Ghosal D., You I.S. Gene duplication in haloaromatic degradative plasmids pJP4 and pJP2 // Can. J. Microbiol. 1988. - V .34. - № 6.-P. 709-715.

17. Ghosal D., You I.S. Operon structure and nucleotide homology of the chlorocatechol oxidation genes of plasmids pJP4 and pAC27 // Gene. 1989. - V. 34. - № 2. - P.225-232.

18. Ghosal D., You I.S., Chakrabarty A.M. Microbial degradation of halogenated compounds // Science. 1985. - V. 228. - № 4696. -P. 135-228.

19. Ghosal D., You I.S., Chatterjee D.K., Chakrabarty A.M. Plasmids in the degradation of chlorinated aromatic compouns // New York Plenum. New York, 1986. - P. 667-686.

20. Gstalder M.E., Faelen M., Mine N., Top E.M., Mergeay M., Couturier M. Replication functions of new broad host range plasmids isolated from polluted soils // Res. Microbiol. 2003. - V. 154. - № 7. -P. 499-509.

21. Harker A.R., Olsen R.H., Seidler R.J. Phenoxyacetic acid degradation by the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (TFD) pathway of plasmid JP4: mapping and characterization of the 2,4-D regulatory gene tfdR // J. Bacteriol. 1989.-V. 171.-№ 1. - P. 314-320.

22. Haugland R.A., Schlemm D.J., Lyons R.P., Sferra P.R., Chakrabarty A.M. Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-D and 2,4,5-T by pure and mixed bacterial culture // Appl. Envir. Microbiol. 1990. - V. 56. - № 5. - P. 1357-1362.

23. Hawkins A.R., Harwood C.S. Chemotaxis of Ralstonia eutropha JMP134(pJP4) to the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate I I Appl. Envir. Microbiol. 2002. - V. 68. - № 2. - P. 968-972.

24. Helling R.B., Goodman H.M., Boyer H.W. Analysis of RecoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis // J. Virol. 1974. - V. 48. - P. 1235.

25. Herrmann H., Muller C., Schmidt I., Mahnke J., Petruchka L., Hahnke K. Localization and organization of phenol degradation genes of Pseudomonas putida strain H // Mol. Gen. Genet. 1995. - V. 247. -№ 2. - P. 240-246.

26. Horvath R.S. Microbial cometabolism of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. 1970. - V. 5. - P. 537541.

27. Kaphammer В., Kukor J.J., Olsen R.N. Regulation of tfdCDEF by з tfdR of the 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation plasmid pJP4

28. J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - № 5. . p. 2280-2286.

29. Kaphammer В., Olsen R.N. Cloning and characterization of tfdS, the repressor-activator gene of tfdB, from the 2,4-D catabolic plasmid pJP4 //J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - № 10. - P. 5856-5862.

30. Karns J.S., Duttagupta S., Chakrabarty A.M. Regulation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid and chlorphenol metabolism in Pseudomonas cepacia AC 1100 // Appl. Environ. Microbiol. 1983. -V. 46.-№5.-P. 1182-1186.

31. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T. Chakrabarty A.M. Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia // Appl. and Environ. Microbiol. -1982.-V. 44. -№ l.-P. 72-78.

32. Kilpi S., Backstrom V., Korhola M. Degradation of 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), benzoic acid and salicylic acid by Pseudomonas sp. HV3 // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - V. 8 - P. 177-182.

33. Kivisaar M., Kasak L., Heinaru A., Habicht J. Selection of , independent plasmids determining phenol degradation in

34. Pseudomonas putida and the cloning and expression of genes encoding phenol monooxygenase and catechol 1.2-dioxygenase // Plasmid. 1990. - V. 24. - № 1. - P. 25-36.

35. Kukor J.J., Olsen R.H., Ballou D.P. Cloning and expression of the catA and catBC gene clusters from Pseudomonas aeruginosa PAOl. //J. Bacterid. 1988.-V. 170.-P. 4458-4465.

36. Kukor J.J., Olsen R.H., Slak J.S. Recruitment of chromosomally encoded maleylacetate reductase for degradation of 2,4-D by plasmid pJP4 //J. Bacteriol. 1989. - V. 171. - № 6. - P. 3385-3390.

37. Laemmli C.M., Werlen C., van der Meer J.R. Mutation analysis of the different tfd genes for degradation of chloroaromatic compounds in Ralstonia eutropha JMP134 // Arch. Microbiol. 2004. - V. 181. -№2.-P. 112-121.

38. Leveau J.H.J., de Vos W.M., van der Meer J.R. Analysis of the binding site of the LysR-type transcriptional activator TcbR on the tcbR and tcbC divergent promoter sequences // J. Bacteriol. 1994. -V. 176.-№7.-P. 1850-1856.

39. Leveau J.H.J., van der Meer J.R. Genetic characterization of insertion seqence ISJP4 on plasmid pJP4 from Ralstonia eutropha JMP134 // Gene. 1997. - V. 202. - №1-2. - P. 103-114.

40. Мае А.А., Mairs R.O., Ausmees N.R., Koiv V.M., Heinaru A.L. Characterization of a new 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading plasmid pEST4011: physical map and localization of catabolic genes //J. Gen. Microbiol. 1993.- V. 139. - P. 3165-3170.

41. Maniatis Т., Jeffery A., Kleid D.G. Nucleotide sequence of the rightward operator of phage X II Proc. Natl. Acad. Sci. 1975. -V. 72. - № 3. - P. 1184.

42. Markus A., Klages U., Krauss S., Lingens F. Oxidation and dehalogenation of 4-chlorophenolacetate by a two-component enzyme system from Pseudomonas sp. strain CBS3 // J. Bacteriol. 1984. -V. 160.-P. 618-621.

43. Neilson J.W., Josephson K.L., Pepper I.L., Arnold R.B., Di Giovanni G.D., Sinclair N.A. Frequency of horizontal gene transfer of a large catabolic plasmid (pJP4) in soil // Appl. Environ. Microbiol. 1994.-V. 60. - № 11.-P. 4053-4058.

44. Newby D.T., Gentry T.J., Pepper I.L. Comparison of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation and plasmid transfer in soil resulting from bioaugmentation with two different pJP4 donors // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - V. 66. - № 8. - P. 3399-3407.

45. Norgard M.V., Keem K., Monohan J.J. Factors affecting the transformation of Escherichia coli strain %1776 by pBR322 plasmid DNA // Gene. 1978. - V. 3. - № 2. - P. 279.

46. Novick R.P. Extrachromosomal inheritance in bacteria // Bacteriol. Rev. 1969. - № 33. - P. 210-263.

47. Nurk A., Kasak L., Kivisaar M. Seqence of the gene (pheA) encoding phenol monooxygenase from Pseudomonas sp. EST1001: expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida II Gene. — 1991. -V. 102.-№ l.-P. 13-18.

48. Overhage J., Sielker S., Homburg S., Parschat K., Fetzner S. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encoding the degradation of quinaldine to anthranilate // Microbiology. 2005. -V. 151.-Pt. 2.-P. 491-500.

49. Perez-Pantoja D., Ledger Т., Pieper D.H., Gonzalez B. Efficient turnover of chlorocatechols is essential for growth of Ralstonia eutropha JMP134(pJP4) in 3-chlorobenzoic acid // J. Bacteriol. — 2003.-V. 185.-№5. p. 1534-1542.

50. Perkins E.J., Gordon M.P., Caceres O., Lurquin P.F. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4 // J. Bacteriol. -1990. V. 172. - № 5. - P. 2351-2359.

51. Plumeier I., Perez-Pantoja D., Heim S., Gonzalez В., Pieper D.H. Importance of different tfd genes for degradation of chloroaromatics by Ralstonia eutropha JMP134 // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. -№ 15.-P. 4054-4064.

52. Radjendirane V., Bhat M.A., Vaidyanathan C.S. Affinity purification and characterization of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from Pseudomonas cepacia. II Archives of Biochemistry and Biophysics. -1991.-V. 288.-№ l.-P. 169-176.

53. Reineke W., Knackmuss H.-J. Construction of haloaromatics utilizing bacteria // Nature. 1979. - V. 277. - № 5695. - P. 385-386.

54. Rigby P.W.J., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I // J. Mol. Biol. 1977. - V. 113. -P. 237.

55. Roberts R. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences // Nucleic Acids Res. 1982. - V. 10. - № 1 -P. 117.

56. Sahasrabudhe S.R., Modi V.V. Degradation of isomeric monochlorobenzoates and 2,4-D by a constructed Pseudomonas sp. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V. 34. - P. 556-557.

57. Sakai M., Ezaki S., Suzuki N., Kurane R. Isolation and characterization of a novel polychlorinated biphenyl-degrading bacterium, Paenibacillus sp. KBC101 // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2005. - Springer-Verlag, On line Jan. 28.

58. Sandman E.R.I.C., Loos M.A. Aromatic metabolism by a 2.4-D degrading Arthrobacter sp. // Can. J. Microbiol. 1988. - V. 34. -№ l.-P. 125-130.

59. Sangodkar U.M.X., Aldrich T.L., Haugland R.A., Johnson J., Rothmel R.K., Chapman P.J., Chakrabarty A.M. Molecular basis of biodegradation of chloroaromatic compounds // Acta Biotechnol. -1989. V. 9. - № 4. - P. 301-316.

60. Schliman M. Evolution of chlorocatechol catabolic pathways. Conclusions to be drawn from comparisons of lactone hydrolases // Biodegradation. 1994. - V. 5. - № 3-4. - P. 301-321.

61. Sharp P.A., Sugden В., Sambrook J. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose // Biochemistry. 1973. - V. 12. - P. 3055.

62. Singer A.C., van der Gast C.J., Thompson I.P. Perspectives and vision for strain selection in bioaugmentation. // Trends Biotechnol. 2005. -V. 23.-№2.-P. 74-77.

63. Singhal N., Rog D. Modeling kinetics of 2,4-D degradation by two new Pseudomonas isolates // The Chemical Engineering Journal. -1988.-V. 39.-P. 37-45.

64. Smith C.A., Thomas C.M. Comparison of the organisation of the genomes of phenotypically diverse plasmids of incompatibility group P: members of the IncP beta sub-group are closely related // Mol. Gen. Genet. 1987. - V. 206. - № 3. - P. 419-427.

65. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - V. 98. -P. 503.

66. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. -V. 44. 4. - P. 846-849.

67. Streber W.R., Timmis K.N., Zenc M.H. Analysis, cloning and high-level expression of 2,4-dichlorophenoxyacatate monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP 134 // J.Bacteriol. 1987. -V. 169.-№7.-P. 2950-2955.

68. Tiedje J.M., Duxbury J.M., Alexander M., Dawson J.E. 2.4-D metabolism: pathway of degradation of chlorocatechols by Agrobacter sp. // J. Agr. Food Chem. 1969. - V. 17. - № 5. -P.1021-1026.

69. Tomasi I., Artaud I., Berthean Y., Mansuy D. Methabolism of polychlorinated phenols by Pseudomonas cepacia AC 1100: determination of the first two steps and specific inhibitory effect of methimazole // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - № 2. - P. 307-311.

70. Top E.M., Holben W.E., Forney L.J. Characterization of diverse 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmids isolated from soil by complementation // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. -№5.-P. 1691-1698.

71. Trefault N., Clement P., Manzano M., Pieper D.H., Gonzalez B. The copy number of the catabolic plasmid pJp4 affects growth of Ralstonia eutropha JMP4(pJP4) on 3-chlorobenzoate // FEMS Microbiol. Lett. -2002. -V. 212. -№ l.-P. 95-100.

72. Trefault N., De la Iglesia R., Molina A.M., Manzano M., Ledger Т., Perez-Pantoja D., Sanchez M.A., Stuardo M., Gonzalez B. Genetic organization of the catabolic plasmid pJP4 from Ralstonia eutropha

73. JMP134 (pJP4) reveals mechanisms of adaptation to chloroaromatic pollutants and evolution of specialized chloroaromatic degradation pathways // Environ. Microbiol. 2004. - V. 6. - № 7. - P. 655-668.

74. Van der Meer J.R., de Vos W.M., Harayama S., Zehnder A.J.B. Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobiotic compounds // Microbiol. Rev. 1992. - V. 56. - P. 677-694.

75. Van de Peer Y., De Wachter R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment // Comput. Applic. Biosci. 1994. -V. 10.-P. 569-570.

76. Van Hylckama Vlieg J.E.T., Poelarends G.J., Mars A.E., Janssen D.B. Detoxification of reactive intermediates during microbial metabolism of halogenated compounds // Ecolog. and Industr. Microbiol. 2000. -V. 3.-P. 257-262.

77. Vedler E., Koiv V., Heinaru A. TfdR, the LysR-type transcriptional activator, is responsible for the activation of the tfdCB operon of Pseudomonas putida 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrative plasmidpEST4011 //Gene. -2000.- V. 245.-№ l.-P. 161-168.

78. Vedler E., Koiv V., Heinaru A. Analysis of the 2,4-dichlorophenoxyacetic-degrative plasmid pEST 4011 of Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans strain EST 4002 // Gene. 2004. - V. 255. - № 2. - P. 281-288.

79. Watanabe T. Evolutionary relationships of R-factors with other episomes and plasmids // Fed. Proc. 1967. - № 26. - P. 23.

80. Woodwell G.M., Craig P.P., Johnson H.A. DDT in the biosphere: where does it go? // Science. 1971. - V. 174. - № 14. - P. 11011107.

81. You I.S., Ghosal D. Genetic and molecular analysis of a regulatory region of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate catabolic plasmid pJP4 // Mol. Microbiol. 1995. - V. 16. - № 2. - P. 321-331.

82. Аусмээс H.P., Нейнару A.Jl. Новые плазмиды биодеградации гербицида 2,4-Д // Генетика. 1990. - Т. 26. - № 4. - С. 770-772.

83. Брода П. Плазмиды: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - 224 с.

84. Головлева Л. А., Перцова Р.Н. Полное разложение и дехлорирование 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммом Nocardioides simplex ЗЕ // Докл. АН СССР. 1990. -Т. 314. -№4. с. 981-983.

85. Горлатов С.Н., Мальцева О.В., Шевченко В.И., Головлева Л.А. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1989. - Т. 58. - Вып. 5. - С.802-806.

86. Капранова О.А., Волченко Е.В., Федоров А.Ю., Корженевич стабильность признака биодеградации фенола и ацетофенона //

87. Тез. докл. V конф. РФ «Новые направления биотехнологии». -Пущино, 1992. С. 157.

88. Карасевич Ю. Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982. - 141 с.

89. Козловский С. А., Наумов А.В., Цой Т.В. Выделение и характеристика штаммов микроорганизмов, утилизирующих фенол // Химия и технология воды. 1993. - Т. 15. - № 5. - С.383-389.

90. Козырева А.П., Финкелынтейн З.И., Шурухин Ю.В., Баскунов Б.П., Головлева JI.A. Nocardioides simplex ЗЕ -деструктор хлорфеноксиалкановых кислот // Тез. докл. V конф. РФ «Новые направления биотехнологии». Пущино, 1992. -С. 158.

91. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Наумов А.В., Грищенков В.Г., Боронин A.M. Выделение и характеристика бактерий-деструкторов пестицидов // Прикл. биохимия и микробиология. -1997. Т. 33. - № 3. - С. 310-313.

92. Кудлай Д.Г., Чубуков В.Ф., Оганесян М.Г. Генетика лекарственной устойчивости бактерий. М.: Медицина, 1972. — 255 с.

93. Кулакова А.Н., Кулаков Л.А., Наумов А.В., Мальцева О.В., Головлева Л.А., Боронин A.M. Клонирование генов деградации фенола из штамма Pseudomonas sp.5-T // Генетика. 1992. - Т. 28. - № 2. - С. 35-42.

94. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Под ред. А.А. Баева М.: Мир, 1984. - 480 с.

95. Методы общей бактериологии: В 3-х т. / Под. ред. Ф. Герхарда и др.-М.: Мир, 1990.

96. Методы определения микроколичеств пестицидов / Под ред. М.А. Клисенко. М.: Медицина, 1984. - 256 с.

97. Миронов А.А., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине. СПб.: Наука, 1994.-400 с.

98. Моисеева О.В., Линько Е.В., Баскунов Б.П., Головлева Л.А. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus 1 ср. // Микробиология. 1999. - Т. 68. - Вып. 4. - С. 461-466.

99. Определитель бактерий Берджи: В 2-х т. / Под ред. Дж. Хоулта и др.-М.: Мир, 1997.