Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных

ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных"

На правах рукописи

005002479

МАРКУШЕВА ТАТЬЯНА ВЯЧЕСЛАВОВНА

БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ ФЕНОЛА И ЕГО ХЛОРИРОВАННЫХ ПРОИЗВОДНЫХ

03.02.03 - «Микробиология»

1 7 НОЯ 2011

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Уфа-2011

005002479

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор доктор биологических наук, профессор

Еникеева Светлана Ахметовна

Вахитов Венер Абсатарович Алимова Фарнда Кашифовна Кураков Александр Васильевич

Ведущая организация

Учреждение Российской академии наук Институт экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН

Защита состоится « 17 » ноября 2011 г. в /V часов на заседании Объединенного диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Автореферат разослан « 17 » октября 2011 г. I

Ученый секретарь диссертационного совета ¡¡И/^ ^ Лукманова К.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Известно, что в современной биосфере микроорганизмы играют важную роль в вовлечении синтетических производных в естественный обмен веществ и энергии. Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которой они выполняют процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Именно поэтому в настоящее время применение микроорганизмов рассматривается как основа наиболее выгодных способов поддержания качества окружающей среды.

Существенную роль в конверсии синтетических органических соединений играют бактерии. Это связано с тем, что важной особенностью бактериальных клеток является их высокая приспособляемость к изменяющимся факторам среды, из-за которой они приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии большое число антропогенных производных, включая и опасные по отношению к другим живым системам.

Значительную часть стойких экотоксикантов составляют хлорорганические производные, входящие в категорию крупнотоннажных продуктов, производимых для нужд сельского хозяйства, химической, лакокрасочной, деревообрабатывающей промышленности, целлюлозно-бумажного производства, нефтеперерабатывающей и коксохимической отраслей. Источниками эмиссии поллютантов этой группы являются зоны производства, сточные воды и отходы, а также термические установки по их сжиганию, часто производящие еще более токсичные полихлордиоксины [Винокуров С.В. и др., 1995; Майстренко В.Н., Клюев H.A., 2004; Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010]. Реальную опасность представляют собой и места складирования. Например, к настоящему времени на территории «Уфахимпром» - накоплено 412,14 тыс. м3 отходов в 8 шламонакопителях и 100 тонн высокотоксичных отходов (в т.ч. хлорфенолов), условия хранения которых по оценкам специалистов не соответствуют санитарным и экологическим нормам [Шамсутдинова Л.Р. и др., 2010]. Появление в окружающей среде токсикантов связано также с недостаточным качеством очистки промышленных стоков. По сведениям о работе очистных сооружений, приведенным в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2001 году», из 123 биологических очистных сооружений в проектном режиме функционировали 19, остальные - работали неэффективно. Даже в ситуации, когда сброс стоков в поверхностные водные объекты снизился, в водной среде обнаруживаются все химические соединения, которые вырабатываются заводами химического профиля. В питьевой воде г. Уфы идентифицировано более 100 химических соединений-загрязнителей, в т.ч. фенол, бензол, безапирен, ряд пестицидов, включая 2,4-Д, ДЦТ, изомеры гексациклогексана, летучие галогенсодержащие

углеводороды, 1,2-дихлорэтан, диоксины. Суммарное содержание опасных веществ в отдельные периоды года достигает критических значений [Винокуров C.B. и др., 1995; Ильин В.Г. и др., 1995].

Критические концентрации загрязнителей ароматического ряда обнаружены в Стерлитамаке, Кемерово, Славгороде, Перми, Дзержинске, Чапаевске, Волгограде и Павлодаре. В связи с высоким уровнем объемов накопленных отходов хлорорганического синтеза в 2010 году была организована инвентаризация и учет опасных объектов РФ с целью разработки мер по ликвидации экологического ущерба и определением механизмов их реализации, включая пилотные проекты отработки технологий утилизации загрязнителей [Хизбуллин Ф.Ф. и др., 2011].

Вместе с тем, анализ работ по проблеме утилизации синтетических соединений, показывает, что, несмотря на то, что современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные производные характеризуется выраженным практическим интересом к изучению микроорганизмов-деструкторов, число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии фенола и его производных, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus и Sphingomonas [Козловский С. и др., 1993; Lang Е., 1996; Prieto M. et al., 2002; Rehfuss M., Urban J., 2005; Gouda M., 2007; Agarry S. et al., 2008; Liu Y. et al., 2008; Wang C. et al., 2008; Wasi S. et al., 2008; Плотникова Е.Г., 2010].

В настоящее время отсутствие системных исследований микробных деструкторов является сдерживающим фактором развития безопасных и экономически выгодных технологий для решений частных задач рационального использования и охраны природных ресурсов. Следует подчеркнуть, что биотехнологии примерно в 50 раз дешевле традиционных методов, при этом конверсию загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ, что позволяет исключить вторичную контаминацию среды. Кроме этого, появляется возможность решения проблемы уничтожения значительных объемов накопленных отходов и невостребованных препаратов.

Вместе с тем, изучение микроорганизмов, способных ассимилировать молекулы экотоксикантов, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений микробиологии, раскрывающим новые особенности роли микробов в круговороте веществ. Это направление связано с исследованием теоретических основ жизнедеятельности микроорганизмов в техносфере. Оно охватывает вопросы биоразнообразия, генетической изменчивости, механизмов метаболических взаимоотношений с факторами трансформированной среды, раскрывает процессы адаптации и (микро)эволюции живых систем в условиях сильного антропогенного пресса, включая и случаи прямого их уничтожения.

Познание и освоение потенциала прокариот, обладающих особыми свойствами, а именно, способностью осуществлять контроль над содержанием загрязнителей в окружающей среде и представляющих собой в этом смысле

ценный микробиологический ресурс, - важная часть исследований современной биологии в целом.

Цель работы

Выявление новых природных бактерий-деструкторов фенола и его хлорированных производных, их сравнительный анализ и определение возможности практического применения. Задачи исследования

\. Выделить новые бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы.

2. Идентифицировать штаммы-деструкторы в соответствии с культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и молекулярными критериями систематики.

3. Исследовать пути метаболизма молекул ксенобиотиков и получить количественные и качественные характеристики процессов их конверсии.

4. Изучить роль экстрахромосомных элементов в генетическом контроле этапов ассимиляции хлорароматических производных.

5. Выявить уровень гомологии ДНК геномов изучаемых штаммов с ранее изученными генетическими системами конверсии хлорфеноксикислот бактерий.

6. Определить возможности практического применения вновь выделенных штаммов - деструкторов.

Научная новизна исследования

Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот.

Филогенетическое положение штаммов определено в соответствии с результатами исследования культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК и белкового профилирования. Согласно филогенетической обособленности штаммы Citrobacter sp. 36 4СРА, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Aiospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые установлено, что бактерии родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas выполняют оригинальные реакции ассимиляции хлорфеноксикислот с образованием феноксиуксусной кислоты с последующим раскрытием ароматического кольца.

Выявлено, что генетические системы, детерминирующие метаболизм хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas, располагаются на плазмидах.

Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением олигонуклеотидных праймеров установлено, что системы генетического контроля катаболизма молекул хлорфеноксикислот имеют существенные отличия от известных кластеров tfd- и tft-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia АС1100.

Теоретическое и практическое значение работы

Получены новые данные о разнообразии природных штаммов-деструкторов фенола и его хлорированных производных. Данные о деструкторах внесены в Консолидированный каталог культур микроорганизмов Российских немедицинских коллекций (Consolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L.V. Kalakoutskii - Vol. I. Bacteria, 2001.P. 3915-4077. Режим доступа: http://www.vkm.ru/eCatalogue.htm/).

Последовательности генов 16S рРНК вновь выделенных штаммов депонированы в международную базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022, DQ333356).

Установлены оригинальные пути ассимиляции моноароматических галогенидов и локализованы генетические элементы их контроля.

Показана принципиальная возможность применения новых штаммов-деструкторов в области защиты среды обитания человека.

Сведения о деструкторах, культуры деструкторов, а также их генетические элементы доступны для использования в научных и практических целях.

Результаты работы используются в образовательном процессе в курсах общебиологических дисциплин БПТУ им. М. Акмуллы и УГАТУ (биология, микробиология, экология, биохимия, генетика и биотехнология), а также при подготовке спецкурсов для магистров и бакалавров.

Практические рекомендации

Штаммы-деструкторы рекомендуются для очистки водной срсды и почвы в условиях предприятий нефтехимического профиля.

Штаммы-деструкторы Bacillus subtilis (Патент РФ № 1742226), Arthrobacter globiformis (Патент РФ № 2076523), Agi-obacterium tumefaciens (Патент РФ № 2077575) и Serratia marcescens (Патент РФ № 2074254) рекомендуются для ремедиации объектов окружающей среды с целью утилизации фенолов в стоках нефтехимических предприятий Северного промузла Республики Башкортостан.

Штаммы-деструкторы Bacillus cereus (Патент РФ № 2129605/ и Gluconobacter oxydans (Патент РФ №2130067J рекомендуются для утилизации фенолов и его хлорированных производных в почве.

Генетические ресурсы штаммов-деструкторов рекомендуются для создания новых штаммов с заданными свойствами ш vitro (Патенты РФ №№ 2064501, 2130074 и 2125263).

Основные положения, выносимые на защиту

1 В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных.

2 Деструкторами хлорфеноксикислот являются представители родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

3 Ассимиляция хлорфеноксикислот у культур деструкторов происходит через процессы дегалогенирования ароматического кольца с последующим его раскрытием.

4 Штаммы-деструкторы обладают оригинальными генетическими кластерами, детерминирующими катаболизм молекул хлорфеноксикислот, и их можно применить для создания новых штаммов-деструкторов in vitro.

5 Генетические детерминанты, контролирующие процессы катаболизма хлорфеноксикислот в клетках бактерий-деструкторов, могут располагаться на плазмидах.

6 Вновь выделенные бактерии-деструкторы рекомендуется использовать в качестве действующих элементов технологий очистки водной среды и почвы от фенола и его хлорированных производных, включая 2,4-дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались и обсуждались на международных научных мероприятиях, в частности, на Экологическом Конгрессе (Япония, 1990), I Конгрессе европейских микробиологов (Словения, 2000), симпозиумах ELSO (Германия, 2003, Франция, 2004), Сахаровских чтениях (Республика Беларусь, 2006, 2009); на 1 Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), II С.-Петербургском международном экологическом форуме (2008); съездах: XVI Менделеевском (1998), Всероссийского общества генетиков и селекционеров (2000, 2004, 2008), Биохимического общества (Москва, 2002), Общества биотехнологов (Москва, 2006); в ходе работы в научно-практических конференций, направленных на решение экологических проблем: «Экологический императив сельского хозяйства РБ» (Уфа, 1998), «Реновация: отходы-технологии-доходы» (Уфа, 2004), «Актуальные экологические проблемы» (Уфа, 2007), «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2009), а также в рамках

профильных конференций: «Микробиологические методы защиты окружающей среды» (Пухцино, 1988), «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), «Наука-Бизнес-Образование» (Пущино, 2005), «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Микробное разнообразие» (Пермь, 2008), «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), «Факторы экспериментальной эволюции» (Киев, 2010). Материалы исследований были обсуждены на межлабораторном научном семинаре Института биологии Уфимского научного центра РАН и расширенном заседании диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Уфа, 2011).

Публикации

Основные научные результаты диссертации изложены в 136 печатных работах, в том числе: 14 публикациях, указанных в Перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК Министерства науки и образования РФ, 9 патентах, в 1 работе, депонированной в ВИНИТИ, в 1 монографии, 7 публикациях в научных электронных изданиях, 32 работах в научных сборниках и 72 - в материалах всероссийских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 62 рисунка и 20 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Библиография включает 417 источников (89 - отечественных и 318 - зарубежных).

В приложении размещены последовательности нуклеотидов генов 16Б рРНК, депонированные в международной базе данных СепВапк, описания физико-химических свойств фенола и его хлорированных производных, использованных в исследованиях, акты испытаний, а также сведения о ранее изученных штаммах-деструкторах фенола и его хлорированных производных.

Связь работы с крупными научными программами

Работа выполнена в соответствии с планами НИР ИБ УНЦ РАН, а именно, в рамках научно-исследовательских тем «Механизмы деградации хлорароматических соединений у прокариот» (№ гос. регистрации 012 00607440) и «Биоразнообразие природных микроорганизмов-деструкторов хлорароматических производных» (№ гос. регистрации 01200903470). Исследования поддерживались научно-техническими программами Академии

наук Республики Башкортостан, в том числе, «Биотехнология Башкортостана» (1993-1995), «Проблемы физико-химической биологии в области медицины, сельского хозяйства и технологии живых систем в РБ» (1999-2001), РФФИ-Агидель № 02-04-97911, а также ГНТП «Экологически безопасные процессы химии и химической технологии» (1992-1993), ГНТП РФ «Приоритетные направления генетики» (1993-1995), ФЦНТП «Исследования науки и техники гражданского назначения» (1999-2001). В настоящее время НИР проводятся при содействии Программы фундаментальных исследований Президиума РАН «Биоразнообразие и динамика генофондов» (2006-2011).

Благодарности

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность коллегам по работе: к.б.н. Журенко Е.Ю., к.х.н. Галкину Е.Г., к.б.н. Коробову В.В., к.б.н. Жариковой Н.В., к.б.н. Ясакову Т.Р., м.н.с. Анисимовой Л.Г. и сотрудникам Центра «Биоинженерия» РАН к.б.н. Колгановой Т.В. и к.б.н. Кузнецову Б.Б. за сотрудничество, а также коллективу Института биологии УНЦ РАН за многолетнюю поддержку и всестороннюю помощь в проведении исследований.

Автор искренне признателен профессору Kazuhito Itoh (Shimane University, Япония) и профессору Sabine Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия) за образцы штаммов бактерий, любезно предоставленные для сравнительного анализа.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследования являлись штаммы бактерий, выделенные из образцов смешанных микробных популяций почв Северного промышленного узла города Уфы, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства, включая действие ряда высокотоксичных и канцерогенных синтетических производных ароматического ряда.

Штамм Burkholderia sp. M38-VN3-2W был получен от профессора К. Itoh (Shimane University, Япония). Культура Cupriavidus necator JMP134 предоставлена профессором S. Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Германия).

Чистые культуры штаммов-деструкторов были выделены по методу Коха [Теппер Е.З. и др., 1976] с небольшими модификациями.

Визуализация клеток бактерий осуществлена с помощью электронного микроскопа Н-300 фирмы Hitachi (Япония) и атомно-силовой микроскопии (АСМ) на сканирующем зондовом микроскопе Solver PRO-M фирмы NT-MDT (Россия). При АСМ-микроскопии сканирование препаратов на подложке из слюды типа мусковит велось в контактном режиме по методу постоянной силы с использованием кантилеверов CSG01 фирмы NT-MDT с радиусом кривизны зонда 10 нм по методике, рекомендованной изготовителем.

Идентификация изолятов проведена по результатам сравнительного анализа культурально-морфологических, морфометрических и физиолого-биохимических признаков в соответствии с критериями дифференциации бактерий, предложенными в 9-м издании руководства «Определитель бактерий Берджи» (1997), а также согласно принципам молекулярного типирования клеток прокариот.

При амплификации гена 16S рРНК использовались универсальные для большинства прокариот олигонуклеотидные праймеры [Edwards U. et al., 1989] и амплификатор Bio-Rad MJMini (США). Определение последовательности гена 16S рРНК производилось с применением секвенатора Avant 3150 (Applied Biosystems, США) со стандартным набором реактивов по методикам, рекомендованным производителем.

Для генетического анализа использовалась база данных нуклеотидных последовательностей GenBank и возможности Ribosomal Database Project. Выравнивание последовательностей осуществляли с использованием редактора BIOEDIT с помощью программы CLUSTALW v 1.75. Построение деревьев осуществлялось в формате пакета программы TREECON. Достоверность ветвления филогенетических деревьев просчитывалась в программе MEGA4.

Протеомные профили клеток бактерий были изучены с помощью времяпролетного масс-спектрометра Microflex (Bruker Daltonic, Германия). Параметры масс-спектрометра оптимизировали для диапазона m/z (отношение массы к заряду) от 2000 до 20000. Анализ данных проводился в программном пакете Biotyper 2.0 [Seng P. et al., 2009; Szabados F. et al., 2010].

Плазмидный статус штаммов исследовался с применением метода щелочного лизиса с небольшими модификациями [Маниатис Т. и др., 1984]. Элиминация плазмид проводилась по стандартной методике с небольшими модификациями [Герхард Ф., 1990]. В качестве элиминирующего агента применялся этидиум бромид или акридиновый оранжевый.

При конъюгации клеток бактерий использованы указания, изложенные в руководстве «Методы общей бактериологии» [Герхард Ф., 1990]. Суспензии клеток донора и реципиента засевали в свежую среду МПБ и проводили наращивание смешанной культуры в течение 8-12 ч при +30°С. По окончании инкубации в суспензию добавляли селективные агенты (2,4-Д и 2,4,5- Т) и инкубировали клетки в течение 1-2 часов в условиях аэрации. Далее клетки рассевались на МПА. Контролем чистоты эксперимента служил посев клеток штаммов донора и реципиента на МПА с селективными агентами.

Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК осуществлялась при модификации стандартного метода [Маниатис Т. и др., 1984]. В ходе проверки компетентности проводили трансформацию клеток E.coli HB 101 с применением препарата плазмиды pBR322, несущей ген устойчивости к ампициллину. В качестве контроля чистоты эксперимента выполняли посев клеток без трансформации на среду того же состава.

Фракционирование препаратов ДНК осуществлялось путем электрофореза в 1%-м агарозном геле в камере для Bio-Rad Wide mini-sub Cell GT (CI1IA) при напряжении электрического поля 6 В/см 25В. После окрашивания фрагментов ДНК гель фотографировали в проходящем УФ-свете при помощи системы документации (Biometra, Германия).

В анализе последовательностей, гомологичных гуй-генам, применялся метод дот-блот гибридизации препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре. Для этого получали препарат плазмиды pJP4 штамма Cupriavidiis necator JMP134 методом щелочного лизиса с небольшими модификациями [Маниатис Т. и др., 1984]. Метку в препараты ДНК вводили методом замещения нуклеотидов с использованием набора Nick-Translation System (Promega, США). При приведении сравнительного анализа tft-генов ДНК-матрицы для ПЦР-реакций получали по методике N.L. Huong с коллегами [Huong N.L. et al., 2007] с незначительными модификациями. Амплификация гена 1ftА осуществлялась с использованием препарата ДНК штамма Burkholdería sp. M38-VN3-2W в качестве положительного контроля [Huong N.L. et al., 2007].

Ферментативный гидролиз препаратов ДНК и ПДРФ-анализ проводился по стандартным методикам с учетом рекомендаций производителя (Fermentas, Литовская Республика). Определение размеров фрагментов ДНК осуществлялось относительно набора маркерных фрагментов ДНК фага X с использованием программы Gel Analysis.

Для определения чувствительности штаммов к антибиотикам использовали метод диффузии в агар с применением дисков [Лабинская A.C., 1978].

Рост культур осуществлялся в термостатированных установках УВМТ-12-250 при 115-120 об/мин. Контроль биомассы выполнялся путем измерения значений оптической плотности клеточной суспензии с использованием фотоколориметра КФК-2 (Россия) при длине волны 590 нм и чувствительности равной 2.

Анализ содержания фенола и хлорфенола проводился согласно стандартному фотометрическому методу с применением 4-аминоантипирина [Губен-Вейль И., 1963]. Количество фенолов определялось по градуировочному графику, построенному в стандартных условиях определения. Содержание хлорфеноксикислот в культуральной жидкости контролировалось согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» [Клисенко М.А., 1984]. Идентификация интермедиатов осуществлялась на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360.

Все эксперименты проведены не менее чем в трех повторностях. В ходе обработки данных определялась средняя арифметическая, стандартное отклонение и доверительный интервал. Обработка результатов проводилась с использованием программы Excel 5.0.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Из образцов почвенной биоты, подвергавшейся воздействию факторов нефтехимического производства, были выделены изоляты, способные к росту в условиях использования фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве единственного источника углерода и энергии. 1. Идентификация микроорганизмов-деструкторов

Выявленные культуры были идентифицированы согласно совокупности культурально-морфологических, морфометрических, физиолого-

биохимических признаков, а также в соответствии с принципами молекулярного типирования прокариот как штаммы Achromobacter xyloxidans ЗЗР, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, Arthrobacter globiformis 17S, Azospirillum irakense 38D, Bacillus cereus 33T, Bacillus subtilis 16, Brenneria scilcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, Enterobacter asburia 33D, Enterobacter cloacae 34 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pantoea agglomerans 36P, Pseudomonas aeruginosa 36DCP, Pseudomonas fluorescens 39D, Pseudomonas kilonensis 34T, Pseudomonas pulida 19S, Raoultella planticola 33 4CPA, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36T, Rhodococcus rubropertinctits 5D, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP.

ilSäS::?':^ ■ * Г ж. к Г /

г Г7 Ii»"- м 1 1 Ш

Рисунок 1 - ACM - изображения клеток Azospirillum irakense 38D (1), Stenotrophomonas sp. 33T (2,3), Citrobacter sp. 36 4CPA (4), Rhodococcus rubropertinctus 5D (5), Pseudomonas fluorescens 39D (6), Gluconobacter oxydans 2T (4). Изображения клеток Xanthomonas sp. 33DCP при разрешении 6000X (7), Gluconobacter oxydans 2T при разрешении 24000X (8), полученные с использованием электронной микроскопии. Стрелкой обозначены жгутики бактерий.

Основные диагностические морфологические и морфометрические характеристики микробных клеток были получены с использованием методов электронной и АСМ-микроскопии (рис. 1).

В ходе исследования физиолого-биохимических признаков были выявлена устойчивость изолятов 2Т, 33 4СРА, 36D, 36Т, 22S к антибиотикам (тетрациклину, хлорамфениколу, канамицину, биомицину) и ионам тяжелых металлов (кобальта, кадмия, серебра). В клетках нескольких культур, в частности, 36 4СРА, 34Т, 22S, ЗЗТ и 33DCP были обнаружены экстрахромосомные элементы.

Сравнительный анализ последовательностей 16S рРНК позволил установить филогенетические кластеры, в которые входили обнаруженные штаммы, и определить наиболее близкие им виды, представленные в базе данных нуклеотидных последовательностей GenBank.

100

Serratia marcescens Serratia marcescens i- Serratia marcescens

- Serratia marcescens

- Serratia marcescens ■ Serratia marcescens

Serratia marcescens ATCC13880' L ♦22S(HQ89M93)

-Serratia nibidaea JCM 1240'

0,02

- Serratia ficaria JCM 1241'

100

-Serratia liquefaciens JCM 1245T

100 _ Citrobacter werkmanii CDC 0876-58' Cürobacfer braak» CDC 080-58' Citrobacter treundii DSM 30039'

-Escherichia coli K-12

100 ¡-Citrobacter kosen CDC 8132-86 L Citrobacter kosen CDC 3613-63' r Citrobacteramalonalicus CDC 9020-77 100 l Citrobacter tarmeri CD C8r I— ^36 4CPA /'JF812082) H |— Citrobacter sedlakii CDC 4696-86' "— Citrobacter rodentium CDC 1843-73'

100

I RaoultellaomithinolyticaATCC31893 Raou Itella planüco/a 8433 Raoultella omithinolylica JCM 7251 Raoultella omithinolytica JCM6096T I Raoultella omithinolytica ¡90681 '— Raoultella planticola 4131 Raoultella omilhinolytica FSK9555 u Raoultella planticola ATCC 43176

Raoultella trevisanii ATCC 33558Г L Raoultella planticola DR3 Raoultella planticola 7444 Raoultella planticola 7 r— Raoulella planticola DSU 3069' L- f33 4CPA (DQ333356J

Raoultella terrigena ATCC33257T Raoultella terrigena SW4 Raoultella terrigena m 5 I Raoultella terrigena m 30 99 ' Raoultella terrigena m 19

Raoultella planticola JCM 725Г

Б

100

Рисунок 2 - Филогенетическое положение штаммов 36 4СРА, 22S (А) и 33 4СРА (Б). Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2 нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

В ходе титрования бактерий с учетом молекулярных маркеров было установлено, что культуры 36 4СРА и 22S принадлежат к филогенетической подгруппе энтеробактерий (рис. 2А).

Штамм 36 4СРА был отнесен к филогенетической подгруппе гетерогенного рода Citrobacter. Уровень сходства последовательностей генов 16S рРНК штамма 36 4СРА с последовательностями различных видов этой подгруппы составлял 97,6 - 98,8%, что оказалось заметно ниже внутривидового уровня для типовых видов С. koseri и С. farmery (99,4%). Внутри филогенетического кластера, составленного этими видами, штамм 36 4СРА образовывал самостоятельную ветвь (рис. 2А). Согласно полученным данным был сделан вывод о том, что штамм 36 4СРА представляет новый вид филогенетической подгруппы рода Citrobacter и он был обозначен как Citrobacter sp. 36 4СРА.

Штамм 22S входил в кластер, образованный несколькими штаммами Serratia marcescens, включая типовой. Уровень сходства последовательностей 16S рРНК изучаемого штамма со штаммами кластера Serratia marcescens оказался очень высоким и составил 99,4 - 99,8%. Этот уровень соответствовал внутривидовому для вида S. marcescens (98,8%). Уровень сходства последовательностей с другими видами рода Serratia был заметно ниже - 98,3 -98,5% (рис. 2А). Результаты анализа сходства последовательностей генов 16S рРНК позволили отнести изучаемый штамм к роду Serratia и виду marcescens.

Сравнительный анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов 33 4СРА, 36D и 36Т показал, что последовательности генов 16S рРНК этих штаммов идентичны и входят в филогенетический кластер видов рода Raoultella planticola, Raoultella ornithinolytica и Raoultella trevisanii (рис. 2Б). При этом наиболее близким к ним является типовой штамм вида Raoultella planticola (99.8%) (рис. 2Б). Такой уровень сходства соответствует внутривидовому для R. planticola (99,8%), что позволило однозначно идентифицировать штаммы 33 4СРА, 36D и 36Т как Raoultella planticola.

На основании анализа последовательности 16S рРНК было показано, что штамм ЗЗТ входит в филогенетический кластер рода Stenotrophomonas с уровнем сходства 98 - 99%, что ясно свидетельствовало о том, что штамм ЗЗТ является представителем рода Stenotrophomonas. При этом наиболее близкими видами к штамму ЗЗТ являлись Stenotrophomonas maltophilia LMG 958Т и Stenotrophomonas africae LMG 22072 (рис. ЗА).

Вместе с тем, принимая во внимание то, что согласно АСМ-изображениям у клеток штамма ЗЗТ было обнаружено наличие двух полярно расположенных жгутиков (рис. 1, изображения 2 и 3), в то время как для вида Stenotrophomonas maltophilia описано перитрихиальное жгутикование (Определитель бактерий Берджи, 1997), было сделано заключение о том, что штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ не может быть классифицирован как Stenotrophomonas maltophilia и близкий к нему Stenotrophomonas africae, и его следует классифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.

Достоверность классификации штамма ЗЗТ была проверена в ходе протеомного фингерпринтинга. По результатам анализа профиля белковых масс было установлено, что штамм Stenotrophomonas sp. ЗЗТ близок к штамму Stenotrophomonas sp. 109 Neb28 NFI. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, составляло 2,005. Это убедительно указывало на то, что штамм ЗЗТ следует идентифицировать как новый вид рода Stenotrophomonas.

то San Pomonas arborkola IMG 7471 'Xanthomonas bonorum IMG 733T 03 Xanthomonas bromi IMG 947T Xaiiihomonas pist LS fG 84 7T

__iTi Хал Pomonas ашсд'аг LUG 67ST

Xanihomonas vesicatoria LUG 9 ИТ Xarthmonas cucurbuae LUGT « Xanthomonas Cynarae DSM 16794T —Xanihomonas popuh IMG 5743T

- SttHöfrqpfomoHas rhbophila LUG 22075T

— St aadaminiphila IMG 22073T - Stenotrophomonas humi LUG 23959T

+ 33T/HQ87745!) Stenotrophomonas mahophilia LUG 95HT -Stenolrophomnas qfricae IMG22072

—Л"<шймпс»ш populi LUG 57V5-7' Xanthomonas vesicatoria LUG 9} IT -Xanihomonas thcicda LUG Ш4Т Xanthomonas Cucurbitae IMG T Xanthomonas Cynarae DSM 16794 Xanihomonas campestris 568-T ,Xant)mmas vasicola LUG 736T ■Pseudomonas cissicola LMG 2167T X'amhomcms codiaei LUG 8678T ■Xanthomonas axonopaiis IMG 53$T

-433DCP(HQS9I02})

-Xanthmortas sacchari LUG 47)T

~ Xanthomonas Mineans LUG 494-T —Xanthomonas campe suis LUG 876

- Xanthomonas melatis LUG 8670T

- Xanthomonas kyaantht IMG 739T

-r

ЛГ)1-

P seudomonas comigala DS\( 7228T Pseudomonas hlonensts DSM 13647T Pseudomonas thivervalensis CFBP II26IT

+ 34T(H0891022)

-Ps. ß-ederihbergmsis DSM 13022T

I-Pseudomonas congelans DSM ¡4939T

iöolpitiiwiomojui vemae CFBP 6ШТ Pseudomonas chlororaphis DSM I9603T

Pseudomonas chlororaphis DSM 6698

öl Pseudomonas cedrina CFML 96-I98T ¡Pseudomonas cedrina DSM 14938T

QPseudomonas mohnii lpA~2T - Pseudomonas moorei DSM ¡2647T

Рисунок 3 - Филогенетическое положение штаммов ЗЗТ (A), 33DCP (Б) и 34Т (В). Масштаб показывает эволюционное расстояние последовательности гена 16S рРНК, соответствующее 5 нуклеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "ЬооЫгар'-анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

По данным типировання штамма 33DCP с использованием последовательности 16S рДНК было установлено, что штамм принадлежит к филогенетическому кластеру, образованному представителями рода Xanthomonas. Уровень сходства последовательностей 16S рДНК изучаемого штамма и различных видов рода Xanîhomonas составлял более 99%. На основании этих данных было сделано заключение, что штамм 33DCP является представителем рода Xanthomonas.

Исследование белковых профилей штамма 33DCP не обнаружило достоверную близость ни с одним бактериальным штаммом, поэтому этот штамм был дифференцирован как штамм нового вида рода Xanthomonas (рис. ЗБ).

Из рис. ЗВ видно, что изолят 34Т принадлежит филогенетически гетерогенному роду Pseudomonas. Уровень гомологии последовательности гена 16S рРНК штамма 34Т и близких ему видов превышал 99%. Наиболее близкими к нему видами являлись P. thivervalensis CFBP 1126 ГГ, P. corrugata DSM 7228T и P. kilonensis DSM 13547T.

Анализ профиля белковых масс клеток данного штамма выявил, что он имеет наибольшее сходство со штаммом Pseudomonas kilonensis DSM 13647Т НАМ. Значение логарифмического показателя вероятности идентификации, равное 2,045, подтверждало достоверность таксономического определения этого штамма. На основании полученных данных штамм 34Т был идентифицирован как Pseudomonas kilonensis 34Т (рис. ЗБ).

Согласно совокупности результатов филогенетического анализа было установлено, что в составе смешанных популяций присутствовали 4 штамма рода Pseudomonas, а именно, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, Р. kilonensis 34Т и P. putida 19S, 3 штамма рода Raoultella - R. planticola 33 4СРА, R. planticola 36D и R. planticola 36T и по два деструктора родов Enterobacter -Е. asburia 33D и Е. cloacae 34 4СРА, а также Bacillus - В. cereus ЗЗТ и В. subtilis 16.

Таким образом, было обнаружено, что в составе биоты техногенной экосистемы присутствовали деструкторы фенола и его хлорированных производных нескольких таксонов протеобактерий, а именно родов: Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Данные таксономические группы протеобактерий были представлены штаммами альфа-подкласса (A. irakense 38D и G. oxydans 2Т), бета-подкласса (A. xyloxidans ЗЗР) и гамма-подкласса (A. tumefaciens 21SG, В. salcis 38Р, Citrobacter sp. 36 4СРА, Е. asburia 33D, Е. cloacae 34 4СРА, P. agglomérons 36P, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T, Xanthomonas sp. 33DCP), a также группой актиномицетов (Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S и R. rubropertinctus 5D). Кроме этого были обнаружены представители бациллярной линии (В. cereus ЗЗТ и В. subtilis 16).

Следует отметить, что ранее в ряде исследований среди деструкторов были обнаружены представители бактерий родов Achromobacter [Vedler Е. et al„ 2000; Quan X. et al., 2004], Bacillus [Gurujeyalakshmi G., Oriel Р., 1989; Козловский С. и др., 1993; Kim I., Oriel Р., 1995; Gunther К. et al., 1995; Lang E., 1996; Li D.-Y. et al., 1991; Matafonova G. et al., 2006; Herrera Y. et al., 2008; Wang

C. et al, 2008; Singh S. et al., 2008; Tallur P. et al, 2006; Kirchner U. et al, 2003; Satchanska G. et al, 2006], Citrobacter [Martinez M.et. al, 2000; Narde K. et al, 2004] и Rhodococcus [Hensel J, Straube G, 1983; Горлатов С. и др., 1989; Janke

D. et al, 1989; Мальцева О. и др., 1991; Stoecker М. et al, 1994; Briglia M. et al, 1996; Lang E„ 1996; Моисеева О. и др., 1999; Соляникова И. и др, 1999; Финкельштейн 3. и др, 2000; Prieto М. et al, 2002; Ferraroni М. et al, 2003; Rehfuss M, Urban J, 2005; Goswami M. et al, 2005; Margesin R. et al, 2005; Плотникова E. Г. и др, 2006; Pamukoglu M, Kargi F, 2008; Gouda M, 2007].

Принимая во внимание то, что ранее не были выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas, следует сделать вывод о том, что способности представителей указанных таксономических групп вовлекать в обмен веществ и энергии галогенсодержащие производные ароматического ряда выявлены впервые на примере вновь выделенных штаммов А. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP А. irakense 38D, В. salcis 38Р, £ asburia ЗЗД E. cloacae 34 4CPA, G. oxydans 2T, P. agglomerans 36P, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP.

2. Сравнительный анализ особенностей конверсии хлорфеноксиуксусных кислот

Исследование динамики использования вновь выделенными изолятами фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-

дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот в качестве источников углерода и энергии показало, что накопление биомассы культур в модельных системах коррелировало с убыванием субстратов (рис. 4).

Сравнительный анализ значений остаточного содержания фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т обнаружил различия в уровнях утилизации указанных источников питания (табл. 1).

Наиболее существенное снижение фенола, до 97% - 99%, наблюдалось для культур А. irakense 38D, В. cereus ЗЗТ, R. planticola 36Т и S. marcescens 22S.

Меньший уровень использования субстрата - до 93% - 95%, был обнаружен для Р. kilonensis 34Т и Stenotrophomonas sp. ЗЗТ.

В периодической культуре 2,4-дихлорфенол активно утилизировали, до 85% - 70%, штаммы Agromyces sp. 34DCP, В. subtilis 16, Р. aeruginosa 36DCP и R. planticola 33 4СРА. Вместе с тем, данный субстрат не метаболизировали культуры А. xyloxidans ЗЗР, А. tumefaciens 21SG, В. cereus ЗЗТ, В, salcis 38Р, G. oxydans 21, Р. kilonensis 34Т, R. planticola 36T, R. planticola 36D, R. rubropertinctus 5D и Stenotrophomonas sp. 33T.

По отношению к 4-ХФУК наиболее активными оказались Р. agglomerans 36Р (90%), ХшПЪотопах ер. ЗЗБСР (78%) и Р.Циогезсет 390 (81%).

Культуры В. сегет ЗЗТ, Р. Аиогехсет 390 и 81гпо1гор}готопа$ Бр. ЗЗТ утилизировали до 82% - 88% 2,4-Д от начальной концентрации.

2 3 4 5 6 7 5 Время культивирования, сутки

- Citrobacter sp. 36 4СРА

- RaoulteUa planticola 36T -Pseudomonas aeruginosa 36DCP

- Azospirülum irakense 38D

- Serratia marcescens 22S

- RaoulteUa planticola 36D -Pantoea aggüomerans 36P

- Agrobacterium tumefaciens 21SG

123456789 10 Время культивирования, сутки

-Agromyces sp. 34DCP -Pseudomonas kilonensis 34T -Glucooobacter oxydans 2T -Rhodococcus nibropertinctus 5D -Enterobacter cloacae 34 4CPA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 Время культивирования, сугкя

-Xantomonas sp. 33DCP j

- Bacillus cereus 33T : -RaoulteUa planticola 33 4CPA j

- Enterobacter asburia 33D |

- Achromobacter xylosoxidans 33P!

- Stenotrophomonas sp. 33T i

01234 5 678 9 10111213141516 Время культивирования, сутки

- Arthrobacter ¿lobiformis 17S j -Bacillus subtilis 16 j

- Pseudomonas putida 19S |

- Pseudomonas fluorescens 39D\

Рисунок 4 - Графики динамики зависимости значений оптической плотности клеточной суспензии от времени инкубации штаммов бактерий в условиях использования 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии в периодической культуре. Штаммы сгруппированы по месту обитания.

Таблица 1 - Остаточное содержание субстратов в среде культивирования

ШТАММ Концентрация субстрата, %

Фенол 2,4-ДХФ 4-ХФУК 2,4-Д 2,4,5-Т

Achromobacter xyloxidans ЗЗР 80,3 - 32,8 58,7 36,3

Agrobaclerium tumefaciens 21SG 21,8 - 37,6 34 Д 18,0

Agromyces sp. 34DCP 26,4 27,0 65,2 34,1 33,0

Arthrobacterglobiformis IIS 45,3 53,0 38,2 59,4 16,2

Azospirillwn irakense 38D 2,1 56,0 36,8 37,3 36,4

Bacillus cereus 33T 1,1 - 62,0 12,4 23,9

Bacillus subtilis 16 67,1 30,2 29,0 19,8 22,0

Brenneria salcis 38P 90,3 - 53,3 62,7 -

Citrobacter sp. 36 4CPA 84,2 46,4 26,9 34,0 24,2

Enterobacter asburia 33D 77,5 39,9 38,2 30,3 37,0

Enterobacter cloacae 34 4CPA 85,4 41,2 45,9 - 40,0

Gluconobacter oxydans 2T 79,3 - 84,9 31,1 18,2

Pantoea agglomerans 36P 74,1 31,9 10,1 62,0 26,6

Pseudomonas aeruginosa 36DCP 15,2 14,3 55,1 62,0 33,9

Pseudomonasfluorescens 39D 62,7 75,3 19,0 18,4 34,6

Pseudomonas kilonensis 34T 5,2 - 27,4 51,7 39,0

Pseudomonas putida 19S 67,0 30,1 62,4 65,0 55,2

Raoultella planticola 33 4CPA 48,4 27,3 77,0 62,7 50,9

Raoultella planticola 36D 64,3 - 56,0 67,8 25,0

Raoultella planticola 36T 3,1 - 29,8 61,4 55,3

Rhodococcus rubropertinctus 5D 85,1 - 50,4 45,0 60,1

Serratia marcescens 22S 1,1 56,4 65,4 41,0 33,2

Stenotrophomonas sp. 33T 8,7 - 58,1 16,3 27,0

Xanthomonas sp. 33DCP 69,3 95,2 21,4 40,1 35,3

Наиболее активными по отношению к 2,4,5-Т являлись G. oxydans 2Т, А. tumefaciens 21SG и /(. globiformis 17S, утилизировавшие примерно 82%-84% хлорфеноксикислоты. Довольно высокий уровень конверсии 2,4,5-Т показали культуры Citrobacter sp. 36 4СРА (76%) и В. subtilis 16 (78%).

Из данных, приведенных в таблице 1, следует, что для большинства штаммов была характерна полисубстратная активность, при этом фенол и 4-ХФУК метаболизировали все изоляты, а наиболее трудно подвергался ассимиляции 2,4-ДХФ. Штаммы .4. oxidans ЗЗР, A. tumefaciens 21SG, В. cereus ЗЗТ, В. salcis 38Р, G. oxydans 2Т, P. kilonensis 34T, R. planticola 36D, R. planticola 36T, R. rubropertinctus 5D и Stenotrophomonas sp. ЗЗТ не использовали 2,4-ДХФ в качестве источника углерода и энергии.

Ранее были обнаружены представители рода Achromobacter [Quan X. et al, 2004; Vedler F, et al, 2000], Arthrobacter [Sandman E„ Loos M, 1988; Karigar Ch. et al, 2006; Margesin R. et al, 2005], Bacillus [Gunther К. et al, 1995; Kim I.C, Oriel P.J, 1995], Citrobacter [Narde К. et al, 2004; Martinez M. et al, 2000] и Pseudomonas [Bhat M.A. et al, 1994; Radjendirane V. et al, 1991; Friedrich B. et al, 1983; Herrmann H. et al, 1995], способные к конверсии фенола и его хлорированных производных.

Вместе с тем, сравнивая обсуждаемые данные с исследованиями других авторов, можно сделать вывод о том, что на примере вновь выделенных и исследованных бактерий впервые показана способность к ассимиляции (хлор)ароматических субстратов для некоторых видов бактерий.

В частности, впервые установлена конверсия фенола, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Achromobacter xyloxidans на примере штамма A. xyloxidans ЗЗР, а также метаболизм фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Arthrobacter globiformis на примере штамма A. globiformis 17S.

При изучении представителей бациллярной линии, а именно, штамма В. subtilis 16, для представителей рода Bacillus впервые обнаружен катаболизм фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т, а на примере В. cereus ЗЗТ -установлено участие представителей данного вида в конверсии фенола, 2,4-Д, 4-ХФУК и 2,4,5-Т.

Исследование штамма Citrobacter sp. 36 4СРА впервые выявило, что представители данного рода способны катаболизировать фенол, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Для представителей рода Pseudomonas на примере P. fluorescein 39D описана реализация реакций конверсии 4-ХФУК и 2,4,5-Т, а также деструкция 2,4-ДХФ, 4-ХФУК и 2,4,5-Т для вида Р. pulida на примере штамма Р. putida 19S. Кроме этого, показана возможность участия штаммов вида P. aeruginosa в ассимиляции 4-ХФУК, 2,4,5-Т и 2,4-ДХФ на примере штамма P. aeruginosa 36DCP и установлена способность P. kilonensis вовлекать в обмен веществ фенол, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т.

На примере вновь выделенного штамма R rubropertinctus 5D установлено, что 4-ХФУК и 2,4,5-Т доступны для бактерий вида Rhodococciis rubropertinctus.

Таблица 2 - Результаты идентификации метаболитов штаммов-деструкторов

№ Интермедиа! (метиловый эфир) Характеристические пики ионов в масс-спектре m/z, % ШТАММ

1 2,4-дихлор-6-метил феноксиуксусная кислота М+ 264 (30), 233 (30), 19 (100), 175 (25), 147 (30), 87 (15), 59 (20) A. tumefaciens 21SG S. marcescens 22S

2 2.4- дихлорфеиоксиуксусная кислота М+ 234 (89), 236 (55), 199 (69), 178 (64), 175(100), 161 (50), 163 (32), 148 (30), 146 (42) Citrobacter sp. 36 4CPA G. oxydons 2T

3 2,3- дихлорфеноксиуксусная кислота М+234(20), 199(30). 175(100), 45(60) В. subtilis 16

4 5-оксиметил-2,4- дихлорфеноксиуксусная кислота М+264(80), 233(10), 191(100) В. subtilis 16

5 4-хлор-6- метилфеноксиуксусная кислота М+200 (100). 202 (32), 143 (32), 141 (100), 141 (100), 113 (38), 111 (58) Citrobacter sp. 36 4CPA

6 4-хлорфеноксиуксусная кислота М+200 (100), 202 (32), 143 (32), 141 (100), 141 (100). 113 (38), 111(58) A. xyloxidans ЗЗР G. oxydans 2T R. planticola 36D R. planticola 36T R. planticola 33 4CPA

7 2-хлорфеноксиуксусная кислота М+200(60), 155(100), 141(80), 107(100) B. subtilis 16

4- оксиметилфенокснужсусная кислота М+ 196 (45), 137(10), 123 (100), 107(10), 92 (10), 77 (10) A. xyloxidans 33P

9 феноксиуксусная кислота М+ 166 (50), 107 (120), 77 (80) A. xyloxidans 33P G. oxydans 2T S. marcescens 22S P. kilonensis 34T R. planticola 36D R. planticola 36T R. planticola 33 4CPA Stenotrophomonas sp. ззт Xanthomonas sp. 33DCP

10 2-гидрокси-2-гексендионовая кислота М+ 45 (100), 55 (20), 59 (8), 87 (5), 115(6), 129(20), 125(2), 188 (0,1) A. tumefaciens 21SG Citrobacter sp. 36 4CPA S. marcescens 22S

11 3 -метил-2, б-диоксо-4-гексеновая кислота М+ 156 (2), 126(6), 111 (10), 97 (20), 95 (20),85 (21), 83 (21), 71 (16), 57 (100), 44 (50) G. oxydans 2T R. planticola 33 4CPA R. planticola 36D R. planticola 36T

12 2-гексеналь М+ 98 (5), 83 (30), 69 (70), 57 (100), 44 (50) P. kilonensis 34T Stenotrophomonas sp. ззт Xanthomonas sp. 33DCP

В ходе анализа интермедиатов, появлявшихся в культуральной жидкости в условиях использования молекул ксенобиотиков в качестве единственных источников углерода и энергии, были идентифицированы ключевые молекулы конверсии А. tumefaciens 2JSG, А. xyloxidans ЗЗР, Citrobacter sp. 36 4СРА, В. subtilis 16, G. oxydans 2T, Р. kilonensis 34Т, R. planticola 33 4CPA, Ii planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP (табл. 2).

В частности, 2,4-дихлорфеноксиукусная кислота, была идентифицирована среди метаболитов G. oxydans 2Т и Citrobacter sp. 36 4СРА.

Метилированное производное 2,4-дихлорфеноксиукусной кислоты, а именно, 2,4-дихлор-6-метилфеноксиукусная кислота, была выявлена у А. tumefaciens 21SG и S. marcescens 22S.

Кроме этого, в культуральной жидкости А. xyloxidans ЗЗР, G. oxydans 2Т, R planticola 33 4СРА, R. planticola 36D и R. planticola 36Т была обнаружена 4-хлорфеноксиуксусная кислота, а ее метилированное производное, 4-хлор-6-метилфеноксиуксусная кислота, присутствовало в периодической культуре Citrobacter sp. 36 4СРА.

Среди промежуточных продуктов В. subtilis 16 отмечены 5-гидрокси-2,4-дихлорфеноксиукусная, 2-хлорфеноксиукусная и 2,3-дихлорфеноксиукусная кислоты.

В культуральной жидкости нескольких штаммов, а именно, А. xyloxidans ЗЗР, G. oxydans 2Т, Р. kilonensis 34Т, R. planticola 33 4СРА, R. planticola 36D, R. planticola 36T, 5. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP, наблюдались молекулы феноксиуксусной кислоты.

Р. kilonensis 34Т, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP образовывали 2-гексеналь.

3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислота присутствовала у культур G. oxydans 2Т, R. planticola 33 4СРА, R. planticola 36D и R. planticola 36Т, а 2-гидрокси-2-гексендионовая кислота образовывалась в ходе инкубации А. tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4СРА и S. marcescens 22S.

Присутствие среди метаболитов 2,4-дихлорфеноксиукусной, 4-хлорфеноксиуксусной, феноксиуксусной кислот и их производных позволяет сделать вывод, о том, что изучаемые бактерии способны выполнять реакции конверсии хлорфеноксикислот через последовательное дегалогенирование ароматического кольца до стадии его расщепления (рис. 5).

Следует заметить, что штамм В. subtilis 16, являющийся представителем бациллярной линии грамположительных протеобактерий, реализует реакции гидроксилирования ароматического кольца с последующей миграцией и отрывом ионов хлора.

Наличие 2-гидрокси-2-гексендионовой кислоты (производного муконата) в культуральной жидкости штаммов А. tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4СРА и S. marcescens 22S указывает на то, что у данных штаммов раскрытие ароматического кольца происходило по орто- пути, для которого при расщеплении ароматического субстрата характерно образование цис, 2/г/с-муконата и его производных, в дальнейшем метаболизируемых до ß-

Рисунок 5 - Схема деградации хлорфеноксикислот вновь выделенных штаммов-деструкторов.

кетоадипата (так называемый ß-кетоадипатный путь). Такой путь типичен для конверсии (хлор)ароматических соединений у бактерий.

Образование 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеноновой кислоты (кета-изомера полуальдегида 2-гидроксимуконовой кислоты) указывает на то, что у штаммов G. oxydans 2Т, R. planticola 33 4СРА, R. planticola 36D и R. planticola 36Т расщепление ароматического кольца происходило не по орто-, а по мета - пути.

Обнаружение 2-гексеналя в качестве интермедиата процесса деградации хлорфеноксиуксусных кислот для штаммов P. kilonensis 34Т, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP также свидетельствует в пользу реализации мета - пути конверсии хлорароматиков для этих культур, когда ароматическое кольцо раскрывается таким образом, что образуются муконовые полуальдегиды, дальнейший метаболизм которых, как правило, ведет к образованию пирувата, муравьиной кислоты и ацетальдегида, вступающих затем в основной обмен (цикл Кребса).

Такой характер образования промежуточных продуктов был установлен для ограниченного числа микроорганизмов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Штамм Pseudomonas sp. CBS3 [Klages U. et al., 1981] осуществлял мета - расщепление ароматического кольца ключевого метаболита деградации 4-ХФУК - 3,4-дигидроксифенилуксусной кислоты. Из деструкторов 2,4-Д только у штамма Azotobacter chroococcum [Balajee S., Mahadevan А., 1990] было обнаружено мета - расщепление, которое присутствовало как альтернативный (к ß-кетоадипатному) путь конверсии субстрата. Для бактерий, выполняющих диссимиляцию 2,4,5-Т, мета - путь ранее описан не был.

Таким образом, на примере A. xyloxidans ЗЗР, G. oxydans 21, Р. kilonensis 34Т, R. planticola 33 4СРА, R. planticola 36D, R. planticola 36T, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP впервые описан мета - путь ассимиляции 2,4,5-Т.

Результаты сравнительного анализа показали, что на примере вновь выделенных штаммов-деструкторов родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas впервые для представителей данных таксонов описаны реакции ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот.

3. Сравнительный анализ генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот

3.1. ПЦР-анализ ДНК геномов штаммов-деструкторов с применением геноспецифических праймеров гена tftA Burkholderia cepacia АС1100

Ранее для Burkholderia cepacia AC1100 были описаны особенности генетического контроля пути деструкции 2,4,5-Т, ключевыми особенностями которого являются отрыв остатка уксусной кислоты и образование 2,4,5-трихлорфенола. Вслед за этим происходило дехлорирование молекулы

трихлорфенола и разрыв ароматического кольца. Указанные реакции детерминировали tft-гены, входящие в кластер tftAB.

Конечным продуктом реакций этого пути являлся 3-оксоадипат, который в форме промежуточных метаболитов (ацетил-СоА и сукцинил-СоА) включался в ЦТК [Daubaras D.L. et а], 1996; Xun L, Wagnon K.B., 1995; Hiibner A. et al, 1998; Zaborina 0. etal, 1998; Ohtsubo Y. etal, 1999].

Ген IftA кодирует 2,4,5-Т-оксигеназу, которая катализирует первую реакцию метаболизма 2,4,5-Т, приводящую к образованию 2,4,5-трихлорфенола. Для определения в геномах прокариот гомологов i/Ы-гена было предложено использовать систему геноспецифичных олигонуклеотидных праймеров [Huong N.L. et al, 2007; Rice J.F. et al, 2005]. С применением этой системы было успешно показано наличие у Burkholderia sp. M38-VN3-2W последовательностей, гомологичных оригинальному гену tft А штамма Burkholderia cepacia АС1100 [Huong N.L. et al, 2007].

Разработанная Huong N.L. система геноспецифичных праймеров была применена для сравнения генетических структур, контролирующих деструкцию 2,4,5-Т в клетках изучаемых штаммов- деструкторов.

На рисунке 6 представлена электрофореграмма, полученная в ходе ПЦР -анализа гомологов tftA гена Burkholderia cepacia АС1100 .

1 2 3 4 5 6 Рисунок 6 - Электрофоретический

анализ ПЦР-продуктов гомологов гена

tftA штаммов Citrobacter sp. 36 4СРА,

Ют.п.н.—► R. planticola 36T, P. aeruginosa 36DCP.

Условные обозначения:

Iffliiillii 1 - маркер (Fermentas);

1,5 т.п.н,—► 2 - Burkholderia sp. M38-VN3-

2W, контроль;

3 - Citrobacter sp. 36 4CPA;

500 л.н.—► 4 —R. planticola 36T;

5 - P. aeruginosa 36DCP;

6 - контроль (матрица - mQ).

По результатам проведенного анализа можно сделать вывод об отсутствии ПЦР-продуктов в случае использования в качестве матриц геномной ДНК исследуемых штаммов, а, следовательно, об отсутствии последовательностей гена tftA в геномах Citrobacter sp. 36 4СРА, R. planticola 36T и P. aeruginosa 36DCP.

Аналогичные результаты были получены для штаммов A. xyloxidans ЗЗР, A. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S, A. irakense 38D, В. cereus ЗЗТ, В. subtilis 16, В. salcis 38Р, Е. asburia 33D, Е. cloacae 34 4СРА, G. oxydans 2T, P. agglomerans 36P, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R.rubropertinctus 5D, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ иXanthomonas sp. 33DCP.

3.2. Дот-блот гибридизация препаратов геномных ДНК штаммов -деструкторов и плазмиды pJP4 Cupriavidus necator JMP134

На примере плазмиды pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 Fukumori F. и Hausinger R. установили, что, несмотря на то, что наличие кластера tfd-генов не определяет способность к деструкции 2,4,5-Т, фермент tfdA, кодируемый геном tfdA плазмиды pJP4, способен катализировать конверсию 2,4,5-Т до 2,4,5-трихлорфенола [Fukumori F., Hausinger R.P., 1993].

Известно, что плазмида pJP4 штамма Cupriavidus necator JMP134 имеет в своем составе два гомологичных, но не идентичных генных кластера -tfdC\D\E\F\ (tfdrкластер) и tfdDnC\EnFn (tfdu-кластер) [Laemmli С.М. et al., 2000; itoh К. et al., 2002; Ledger T. et al., 2006].

С учетом приведенных выше данных был проведен поиск гомологов кластера генов tfdA-F плазмиды р1Р4 в геномах исследуемых штаммов.

На рисунке 7 представлены результаты дот-блот ^гибридизации препаратов геномных ДНК вновь выделенных штаммов с "Р - меченым препаратом плазмиды pJP4.

J 23456789 10

Л

Ii

в

Рисунок 7 - Результаты дот-блот гибридизации препаратов геномных ДНК штаммов с препаратом 32Р ДНК плазмиды pJP4.

Условные обозначения; K-контроль - препарат ДНК Cupriavidus necator JMP134; А, Б, В - препараты ДНК штаммов A. globiformis 17S (1), В. cereus ЗЗТ (2), В. subtilis 16 (3), Citrobacter sp. 36 4СРА (4), G. oxydans 2T (5), P.fluorescens 39D (6), P. kilonensis 34T (7), R. planticola 33 4CPA (8), Stenotrophomonas sp. 33T(9) иXanthomonas sp. 33DCP (10).

Принимая во внимание то, что такой же результат был обнаружен для препаратов ДНК штаммов A. xyloxidans ЗЗР, Agromyces sp. 34DCP, А. tumefaciens 21SG, A. irakense 38D, В. salcis 38Р, Е. asburia 33D, Е. cloacae 34 4СРА, P. agglomérons 36P. P. aeruginosa 36DCP, P. putida 19S, R. rubropertinctus 5D, R. planticola 36D, R. planticola 36T и S. marcescens 22S, становится очевидным факт отсутствия в геномах вновь выделенных бактерий последовательностей, гомологичных модельной гшазмиде pJP4.

Следует принять во внимание то, что ранее Smejkal С. с коллегами предпринимали попытку, оказавшуюся безуспешной, амплифицировать консервативные //У-гены среди членов консорциума с представителями рода Stenotrophomonas, способного деградировать гербициды 4-(2,4-дихлорфенокси)бутиловую кислоту (2,4-DB) и 4-(4-хлор-2-метилфенокси)бутановую кислоту (МСРВ) [Smejkal С. et al., 2003]. Наблюдения Smejkal С. и соавторов согласуются с полученными в данной работе результатами сравнительного анализа генетических структур вновь выделенного Stenotrophomonas sp. ЗЗТ.

Таким образом, на основе результатов ПЦР-аиализа, проведенного с использованием геноспецифических олигонуклеотидных праймеров и ДНК-ДНК гибридизации можно сделать заключение о том, что в геномах исследуемых штаммов отсутствуют кластеры, гомологичные последовательностям tftA и tfdA, кодирующим субъединицу 2,4,5-Т-оксигеназы и 2,4-Д/а-кетоглутарат диоксигеназу.

Приведенные данные делают очевидным то, что генетические системы, детерминирующие процессы деструкции 2,4,5-Т у изучаемых штаммов-деструкторов, являются оригинальными.

Следует отметить, что результаты исследований генетических особенностей вновь выделенных штаммов хорошо согласуются со сведениями об особенностях метаболизма хлорированных ароматических производных, которые были описаны выше в данной работе для A. xyloxidans ЗЗР, А. tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, A. globiformis 17S, A. irakense 38D, В. cereus ЗЗТ, В. subtilis 16, В. salcis 38Р, Citrobacter sp. 36 4CPA, E. asbitria 33D, E. cloacae 34 4CPA, G. oxydans 2T, P. agglomerans 36P, P. aeruginosa 36DCP, P. fluorescens 39D, P. kilonensis 34T, P. putida 19S, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, R. rubropertinetus 5D, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP, указывающими на то, что изучаемые штаммы выполняют оригинальные каталитические реакции конверсии моноароматических галогенидов.

Приведенный выше анализ детерминант деструкции хлорированных ароматических кислот, свидетельствует в пользу того, что генетические системы контроля катаболизма хлорированных ароматических соединений у вновь обнаруженных штаммов родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arlhrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raouhella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas отличаются от известных и обнаружены впервые.

4. Структурно-функциональные особенности плазмид штаммов-деструкторов

4.1 Сравнительный анализ плазмид деструкторов

Ранее было показано, что генетические системы катаболизма синтетических соединений, множественной устойчивости к антибиотикам, устойчивости к тяжелым металлам могут располагаться на плазмидах [Ledger Т. et а)., 2006; Ye J. et al„ 2010]. Плазмиды обеспечивают подвижность экологически важных групп генов как внутри клетки (между хромосомой и плазмидой), так и между разными видами через механизмы горизонтального переноса.

Одним из наиболее изученных примеров плазмид, несущих кластеры генов катаболизма ксенобиотиков, является плазмида pJP4 штамма Ciipriavidvs necator JMP134 [Trefault N. et al„ 2004].

Анализ плазмидного статуса вновь выделенных культур показал, что штаммы-деструкторы Citrobacter sp. 36 4СРА, R. planticola 33 4CPA, R. pianticola 36D, R planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T, P. kilonensis 34T и Xanthomonas sp. 33DCP обладают плазмидами

На рисунке 8 приведены результаты фракционирования плазмидной ДНК штаммов Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и Xanthomonas sp. 33DCP.

Рисунок 8 - Электрофореграмма плазмидной ДНК штаммов

Stenotrophomonas sp. ЗЗТ, Р. kilonensis 341 и Xanthomonas sp. 33DCP.

Условные обозначения:

1 - маркер - НтсШ фрагменты ДНК фага

X с указанием размеров;

2 - препарат плазмиды ХапЛотопаз ер.

ЗЗБСР;

3 - препарат плазмиды Р. kilonensis 34Т;

4 - препарат плазмиды ЙеиоггорЛошоиси

ер. ЗЗТ.

По результатам электрофоретического анализа было сделано заключение о том, что клетки штаммов Леиоггор/годаояда эр. ЗЗТ, Р. kilonensis 34Т и ХстЛотопаз ер. ЗЗБСР несут плазмиды, которые были обозначены как рЗТЗЗТ, рРК34Т и рХЗЗЗ, соответственно.

С помощью ПДРФ-анализа было установлено, что размер плазмид рБТЗЗТ 51епо1горЬотопаз 5р. и рРК34Т Р. Ыопепт 34Т ЗЗТ составляет около 27 т.п.п., а плазмиды рХ833 Хап1Ьотопа5 ер. ЗЗОСР - около 46 г.п.н.

В клетках R. planticolci 33 4 CPA, R. planticola 36D и R. planticola 36T были обнаружены плазмиды, обозначенные как pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T, соответственно (рис. 9).

ИМ-Ш6 -

5011-

i 4

iroo-

- 4

2 i 4 5 6 7

ЩЩ. ■ * Ы*

ш J®® J Ж

•■л- ш.

ш» ШШШ шш

ш ШШШШШШ- щ

V««

■if; т»

11 It

йШШ®?:

2 3 4 5 6

1 2 3 4 5

HSOl-9416

507747494507: 4361

11:01 -9416—- - • j

6557-

Ж-

Ш

!Vi~ -

Ж- ' K^i ,

m=*•.*■ ш..

Условные обозначения:

1,2 - маркер - Рзй- и НтсШ-фрагменгы ДНК фага X, с указанием размеров;

3.5.7- препараты плазмид рИРЗЗ 4СРА, рКРЗбБ и pRP36T;

4.6.8- фрагменты плазмид pRPЗЗ 4СРА, р36Б

и рЗбТ после рестрикции.

Рисунок 9 - Результаты электрофоретического фракционирования ВашРП-фрагмеитов (А), HindШ-фpaгмeнтoв (В) и РБИ-фрагментов (С) препаратов плазмид pRPЗЗ 4СРА, pRP36D и pRP36T.

Рамками показана область рестрикционного полиморфизма плазмид.

Проведенный РРЬР-анализ показал, что все три плазмиды имеют ВашШ-, НшёШ- и Рзй-сайты рестрикции, при этом у плазмид pRPЗЗ 4СРА и pRP36T обнаруживались идентичные профили фрагментов ДНК, в то время как в структуре pRP36D имелись существенные отличия (рис. 9).

На основании полученных данных были определены размеры плазмид: pRP33 4СРА и pRP36T - около 110 т.п.н., а плазмиды pRP36D - около 127 т.п.н.

Клетки Citrobacter sp. 36 4СРА и S. marcescens 22S несли плазмиды рАН 36 4СРА и pSM 22S, размеры которых составляли 5,2 т.п.н. и 48 т.п.н., соответственно.

С целью локализации кластеров генов, детерминирующих деградацию хлорфеноксикислот, был использован метод элиминации плазмид, индуцированной обработкой клеток микроорганизмов ДНК - троппыми агентами. В ходе сравнительных исследований было установлено, что с потерей плазмид клетки Citrobacter sp. 36 4СРА, R. planticola 33 4CPA, R. planticola 36D, R. planticola 36T, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T, P. kilonensis 34T и Xanthomonas sp. 33DCP утрачивали способность использовать 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии.

Эти данные свидетельствуют о том, что детерминанты, контролирующие катаболизм хлорфеноксиуксусных кислот Citrobacter sp. 36 4СРА, Р. kilonensis 34Т, S. marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP, располагаются на плазмидах.

На основе полученных характеристик плазмиды рАН 36 4СРА, pSM 22S, pRP33 4СРА, pRP36D, pRP36T, pST33T, pPK34T и pXS33 классифицированы как новые D-плазмиды бактерий.

4,2. Горизонтальный перенос плазмид и экспрессия функций катаболизма хлорфеноксикислот в других бактериальных хозяевах

Результаты изучения способности плазмид pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T к трансферу и экспрессии катаболических функций в различных хозяевах приведены таблице 3.

Из данных таблицы 3 следует, что конъюгативный перенос плазмид pRP33 4СРА и pRP36D в клетки родственного штамма R. planticola 36Т в модельной системе показал, что все трансконъюганты экспрессировали генотипы, соответствующие донорским плазмидам.

Сходный результат был получен и с использованием плазмид pRP33 4СРА, pRP36D, pRP36T для штамма G. oxydans 21.

В тоже время переход плазмид pRP33 4СРА, pRP36D, pRP36T в клетки штаммов Citrobacter sp. 36 4СРА и S. marcescens 22S не наблюдался.

Обнаруженные данные свидетельствовали в пользу возможности трансфера катаболических плазмид pRP33 4СРА, pRP36D и pRP36T в клетки других штаммов путем конъюгации.

Следует отметить, что экспрессия катаболических генов деградации хлорфеноксиуксусных кислот и функций устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов в новом хозяине осуществлялась в полном объеме.

Таблица 3 - Результаты анализа конъюгативного переноса плазмид RP33 4СРА, pRP36D и pRP36T

ШТАММ-РЕЦИПИЕНТ ШТАММ-ДОНОР Наличие трансконьюгантов Генотип трансформированных клеток

R. planticola 36Т R. planticola 33 4 CPA + кап" tfct, tff, tcp*

R. planticola 36D + bio сасГ tfct, tfl*, tcp+

Citrobacter sp. 36 4CPA R. planticola 33 4CPA — —

R. planticola 36D — —

R. planticola 36T — —

S. marcescens 22S R. planticola 33 4CPA — —

R. planticola 36D — —

R. planticola 36T — —

G. oxydans 2T R. planticola 3 3 4CPA + tef cob", сасГ tfif, tff, tcp"

R. planticola 36D + cat cact tfct, tff, tcp+

R. planticola 36T + tef arg+ tfct, tff, tcp"

Условные обозначения детерминант устойчивости: - к антибиотикам: tef - к тетрациклину; cat+ - хлорамфениколу; кап - канамицину; bio+ - биомицину; -к ионам тяжелых металлов: cobг - к Со2+; cad' - Cd2+; arg+ - Ag+ .

В ходе работы была также проверена возможность передачи обнаруженных плазмид путем трансформации.

Из данных, приведенных в таблице 4, видно, что трансформированные клетки штамма E.coli HB 101 с приобретением плазмид рАН 36 4СРА и pSM22S приобретали способность к конверсии селективных ксенобиотиков, а именно, 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Из данных табл. 4, также следует, что клетки штамма R. planticola 33 4СРА с приобретением плазмиды рАН 36 4СРА приобретали способность к конверсии 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Таблица 4 - Результаты тестирования катаболической активности штаммов при трансформации рАН 36 4СРА и рБШгБ

ШТАММ РЕЦИПИЕНТ ПЛАЗМИДА СРЕДА М9 с добавлением

2,4-Д 2,4,5-Т

E.coli HB 101 рАН 36 4CPA + +

pSM22S + +

отсутствует (контроль) — —

R, planticola 33 4CPA рАН 36 4CPA + +

отсутствует (контроль) — —

Условные обозначения: (+■) - наличие роста, (-) - отсутствие роста

Обретение способности использовать хлорфеноксиуксусные кислоты в качестве единственного источника углерода и энергии означает, что свойство деструкции ксенобиотиков может быть реализовано в различных бактериальных хозяевах в случаях трансфера плазмид.

Полученные результаты указывают на возможность передачи среди бактериальных членов популяций генетических кластеров, контролирующих реакции катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, расположенных на плазмидах рАН 36 4СРА Citrobacter sp. 36 4CPA и pSM22S S. marcescens 22S (путем трансформации) и на плазмидах pRP33 4СРА, pRP36D и рКРЗбТ штаммов R. planticola (путем конъюгации).

5. Результаты изучения возможности практического применения штаммов- деструкторов

Результаты исследований, приведенные выше, указывают на целесообразность практического применения вновь выделенных штаммов, в частности, для очистки объектов, загрязненных фенолом и его галогенсодержащими производными, а также для создания in vitro новых штаммов, способных изменять свойства молекул хлорфеноксикислот в сторону их детоксикации и снижения устойчивости в окружающей среде.

5.1. Использование штаммов-деструкторов для ремедиации окружающей среды

Перспективы использования штаммов-деструкторов в целях улучшения качества очистки промышленных стоков от фенолов были определены в ходе исследований, направленных на снижение содержания фенолов в стоках предприятий нефтехимического профиля.

В результате испытаний штаммов в условиях реальных сточных вод, характерных для нефтехимического производства Северного промышленного узла РБ, было обнаружено, что культуры А. ф>Ы]Ъптз 17Б, В. сегет 34Т, В. хиЫШ.ч 16, С. ахус1ат 2Т и 5. тагсехсет 22Б способны эффективно снижать концентрацию фенола и его производных в условиях загрязненной водной среды и почвы.

Культура А. §1оЫ/огт15 178 проявила активность в условиях комплекса загрязнений сточных вод производства дубильных экстрактов ОАО «Дубитель» и ОАО «Ново-Уфимский НПЗ» (табл. 5).

Таблица 5 - Результаты анализа содержания фенолов в стоках ОАО «НовоУфимский НПЗ» и ОАО «Дубитель» при применении культуры А. gloЫformis 17Б

ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ (СУТКИ)

Пробы сточных вод Пробы сточных вод

ХАРАКТЕРИСТИКА нефтехимического производства дубильных

СТОКОВ производства ОАО «Ново- экстрактов ОАО

Уфимский НПЗ» «Дубитель»

0 1 3 0 3 7

Содержание фенолов в сточных водах, мг/л 0,096 0,064 0,008 0,750 0,155 0,007

Содержание фенолов от контроля, % 100 33,3 11,6 100 20,6 9,3

Степень очистки, % 0 66,7 88,4 0 79,4 90,7

Заметное изменение содержания фенолов в сточных водах при использовании А. '¿1оЫ/оптх 17Б наблюдалось после 3-х суток обработки. Степень очистки сточных вод, достигаемая при применении штамма А. gIoЫformis 178, составляла для стоков нефтехимического производства 88,4%, а производства дубильных экстрактов - 90,7%.

Культура В. мЬИ7(5 16 проявила активность в условиях сточных вод нефтехимического производства ОАО «Уфахимпром».

Таблица 6 - Результаты анализа содержания фенолов в стоках нефтехимического производства ОАО «Уфахимпром» при применении культуры В. яиЫШя 16

ХАРАКТЕРИСТИКА СТОКОВ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ (СУТКИ)

Пробы сточной воды Пробы сточной воды с добавлением питательных солей

0 2 5 0 2 5

Содержание фенолов, мг/л 30,4 10,2 0,01 30,4 3,2 0,001

Содержание фенолов от контроля, % 100 33,6 0,03 100 10,5 0,003

Степень очистки, % 0 66,4 99,7 0 89,5 99,997

Из результатов, приведенных в таблице 6, видно, что степень очистки сточных вод от фенолов в течение 48 часов составила 66,4%, а к 5-м суткам экспозиции содержание фенолов падало более чем на 99%. Существенно улучшало эффективность процессов очистки добавление питательных солей. Так, в течение 48 часов в условиях использования питательных солей уровень очистки в случае применения штамма В. тЬННя 16 достигал 89,5%, а к концу срока (5 дней) стоки были освобождены от фенолов более чем на 99,9%.

Культура тагсезсеп.ч 22$ была активна в реальных условиях сточных вод нефтехимического производства и производства дубильных экстрактов.

Таблица 7 - Результаты анализа содержания фенолов в стоках ОАО «НовоУфимский НПЗ» и ОАО «Дубитель» при применении культуры 5. тагсеэсет 22Б

ХАРАКТЕРИСТИКА СТОКОВ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ (СУТКИ)

Пробы сточных вод ОАО «Ново-Уфимский НПЗ» Пробы сточных вод ОАО «Дубитель»

0 1 3 7 0 3

Содержание фенолов, мг/л 0,099 0,036 0,024 0,011 0,75 0,095

Степень очистки, % 0 63,5 76,7 88,4 0 87,3

Степень очистки сточных вод от фенолов, достигаемая при использовании штамма Я. тагсевсет 22Б, в течение 3 суток для стоков производства дубильных экстрактов составляла 87,3%, а при применении к стокам нефтехимического производства составляла 75,7% на 3-й сутки и 88,6% на 7-е сутки обработки (табл. 7).

Деградацию 2,4,5-Т в почве осуществляли культуры В. сегет 34Т и О. охуйат 2 Т.

Существенное изменение содержания 2,4,5-Т наблюдалось после 10-14 дней обработки почвы В. сегсих 34Т. Через 5 суток инкубации количество 2,4,5Т уменьшалось на 35,8%, далее к 14-м суткам - примерно на 50%, и впоследствии оставалось на этом уровне (табл. 8). Степень очистки почвы, достигаемая при использовании штамма С. охус1ат 2Т, составляла соответственно: 27,4% на 21-е сутки культивирования, 31,9% на 30-е сутки и около 66,5% на 48-е сутки.

Таблица 8 - Результаты анализа содержания 2,4,5-Т в почве при применении культуры В. cereus 34Т и G. oxydans 2Т

ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЧВЫ ВРЕМЯ ОБРАБОТКИ ПОЧВЫ, СУТКИ

1 5 10 14 21 30 48

культура В. cereus 34Т

Содержание 2,4,5-Т в почве, мг/г 100 64,2 58,0 50,3 50,0 не опр. не опр.

Степень очистки к контролю, % 0 35,8 42,0 49,7 50,0 не опр. не опр.

культура G, oxydans 2Т

Содержание 2,4,5-Т в почве, мг/г 100 95,0 87,6 85,0 72,6 68,1 33,5

Степень очистки к контролю, % 0 5,0 12,4 15,0 27,4 31,9 66,5

Приведенное выше показывает, что применение культур В. cereus 34Т и G. oxydans 2Т является перспективным для очистки почвы от 2,4,5-Т.

5.2. Использование штамма Bacillus subtilis 16 для создания штамма -деструктора с заданными свойствами in vitro

Создание рекомбинантного штамма-деструктора проводили путем клонирования детерминант деградации 2,4-Д штамма Bacillus subtilis 16 в составе вектора pBR322 в клетках E.coli HB 101.

Рекомбинантные клетки E.coli селектировали на жидкой среде М9, содержащей 2,4-Д в качестве единственного источника углерода и энергии.

Сравнительный анализ содержания 2,4-Д и продуктов ее деградации в пробах культуральной жидкости E.coli рМК 16 показал, что количество 2,4-Д к 14 суткам инкубации снижалось на 88,9%. Для штамма В. subtilis 16 к 14-м суткам инкубации концентрация 2,4-Д в культуральной жидкости снижалась примерно на 78% от начального уровня.

С использованием метода газо-жидкостной хроматографии и хромато-масс-спектрометрии проведено сравнение продуктов метаболизма 2,4-Д, накапливаемых в культуральной жидкости В. subtilis 16, E.coli pBR322 и E.coli рМК16, и обнаружено их сходство, а именно, в качестве интермедиата штаммы образовывали 5-оксиметил-2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту.

Приведенные данные указывают на то, что штаммы E.coli рМК 16 и штамм В. subtilis 16 обладают соизмеримой деструктивной способностью в отношении 2,4-Д и образуют одинаковые интермедиа™ конверсии.

Анализ структуры рекомбинантной плазмиды штамма E.coli рМК16 показал, что плазмида штамма E.coli рМК16 имеет размер 8,8 т.п.н. и состоит из векторной молекулы pBR 322 (А) и двух ВатШ-фрагментов, размер которых составляет 3,1 т.п.н. (В) и 1,3 т.п.н. (С).

Новый рекомбинантный клон E.coli с генотипом 2,4-Д1", был обозначен как штамм E.coli рМК16.

На основе приведенных сведений, демонстрирующих примеры практического использования новых штаммов-деструкторов, становится возможным сформулировать область их применения в целом, а именно:

• очистка/доочистка сточных вод предприятий химического и нефтехимического профиля от фенола и его хлорированных производных;

• детоксикация и очистка почвы от фенола и его хлорированных производных в случаях локального загрязнения;

• создание новых штаммов-деструкторов с заданными свойствами in vitro.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Присутствие в окружающей среде стойких синтетических соединений ароматического ряда создает одну из трудноразрешимых проблем в области поддержания качества среды обитания человека.

К настоящему времени сформировано представление о том, микроорганизмы, обладающие специфическими катаболическими способностями в отношении ксенобиотиков, могут использоваться для защиты и очистки среды в качестве действующих элементов биологических технологий нового поколения.

Вместе с тем, анализ результатов экспериментальных работ в области биоконверсии экотоксикантов обнаруживает слабую исследованность фундаментальных вопросов, связанных с описанием свойств отдельных культур, утилизирующих поллютанты, а также недостаточность знаний об организации и функционировании их консорциумов. Проявляется также неполное понимание сути механизмов биохимических превращений молекул загрязнителей, недостаточны сведения об особенностях генетического строения деструкторов.

В ходе настоящей работы из смешанных популяций почвенной биоты, подвергавшейся длительному воздействию техногенных факторов, были выделены новые бактериальные культуры, способные к ассимиляции фенола и его галогенидов.

Изучение характеристик вновь выделенных штаммов позволило существенно расширить представления о биоразнообразии современных деструкторов.

В частности, с применением молекулярных критериев систематики были дифференцированы новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые было обнаружено, что представители родов Agrobacterium, Agromyces, Aiospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas способны вовлекать в обмен веществ и энергии фенол, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Для представителей родов Achromobacter, Agrobacterium, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas впервые были описаны этапы ассимиляции хлорфеноксикислот и показано, что конверсия молекул ксенобиотиков происходит с образованием дегалогенированных производных феноксиуксусной кислоты, которые впоследствии подвергаются расщеплению до альдегида гексеновой кислоты, диоксогексендионовой кислоты или гексеналя. При этом впервые был обнаружен мета-путь конверсии 2,4,5-Т у штаммов родов Achromobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Stenotrophomonas и Xanthomonas, а также установлено, что конверсия хлорфеноксикислот у представителей рода Bacillus происходит через формирование гидроксилированных производных.

В геномах бактерий, принадлежащих родам Citrobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas, обнаружены

оригинальные плазмиды, несущие генетические детерминанты контроля над реакциями ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот. Эти плазмиды были классифицированы как новые D-плазмиды бактерий-деструкторов. Обнаружено, что плазмиды штаммов рода Raoultella способны к горизонтальному переносу и экспрессии детерминант деградации хлорфеноксикислот в других бактериальных хозяевах в полном объеме.

Показано, что генетические системы контроля конверсии ксенобиотиков вновь обнаруженных штаммов существенно отличаются от известных.

Следует подчеркнуть, что в настоящей работе изучение природных деструкторов было нацелено не только на понимание теоретических основ многообразия проявлений жизни, но и связывалось со стремлением использовать полученные данные на практике в качестве ключа, который открывает возможности разработки безопасных технологий сохранения окружающей среды. Поэтому была изучена принципиальная возможность использования новых штаммов-деструкторов для доочистки от фенолов стоков предприятий нефтехимического профиля, а также показаны перспективы применения их генетических элементов для дизайна штаммов с заданными свойствами in vitro.

ВЫВОДЫ

1. Из смешанных популяций почвенных микроорганизмов промзоны г. Уфы выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4-дихлорфенола и хлорфеноксиуксусных кислот, а именно: Achromobacter xyloxidans ЗЗР, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, Arthrobacter globiformis 17S, Azospirillum irakense 38D, Bacillus cereus 33T, Bacillus subtilis 16, Brenneria salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, Enterobacter asburia 33D, Enterobacter cloacae 34 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pantoea agglomérons 36P, Pseudomonas aeruginosa 36DCP, Pseudomonas fluorescens 39D, Pseudomonas kilonensis 34T, Pseudomonas putida 19S, Raoultella planticola 33 4CPA, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36T, Rhodococcus rubropertinctus 5D, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP.

2. Согласно фенотипическим признакам и филогенетической обособленности, выявляемой по молекулярным критериям систематики, штаммы Citrobacter sp. 36 4СРА, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

3. Впервые установлено, что представители родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirilhim, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas способны вовлекать в обмен веществ и энергии фенол, 2,4-дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоты.

4. Установлено, что ассимиляция хлорфеноксиуксусных кислот Achromobacter xyloxidans ЗЗР, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pseudomonas kilonensis 34T, Raoultella planticola

33 4СРА, Raoiiltella planlicola 36D, Raoultella planticola 36T, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP происходит с образованием дегалогенированных производных феноксиуксусной кислоты, которые подвергаются расщеплению до альдегида гексеновой кислоты, диоксогексендионовой кислоты или гексеналя. Конверсия хлорфенокснкислот Bacillus subtil is 16 происходит через формирование гидроксилированных производных

хлорфеноксиуксусной кислоты.

5. Показано, что штаммы-деструкторы Citrobacter sp. 36 4СРА, Serratia marcescens 22S, Raoultella planlicola 36T, Raoultella planlicola 36D, Raoultella planlicola 33 4CPA, Stenotrophomonas sp. 33T, Pseudomonas kilonensis 34T и Xanthomonas sp. 33DCP обладают оригинальными плазмидами, несущими детерминанты контроля над реакциями ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот. Обнаружено, что плазмиды штаммов Raoultella planlicola 33 4СРА, Raoultella planticola 36D и Raoultella planlicola ЗбТ способны к горизонтальному переносу и экспрессии детерминант деградации хлорфенокснкислот в других бактериальных хозяевах.

6. С использованием генетических кластеров штамма Bacillus subtilis 16 создан новый рекомбинантный штамм-деструктор E.coli рМК 16, осуществляющий конверсию молекул 2,4-Д.

7. Определена принципиальная возможность использования новых штаммов-деструкторов для доочистки от фенолов стоков предприятий нефтехимического профиля (Bacillus subtilis 16, Arthrobacter globiformis 17S, Agrobacterium tumefaciens 21 SG, Serratia marcescens 22S) и почвы (Bacillus cereus 33T, Ghiconobacter oxydans 2T).

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в периодических научных изданиях

1. Ясаков Т.Р., Куликов Е.Е., Летаров A.B., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Анисимова Л.Г., Гарафутдинов P.P., Маркушева Т.В. Новый бактериальный штамм-деструктор 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты // Известия Самарского научного центра Российской академии наук. - 2011. - Т. 13 - № 5(2). - С. 250-253.

2. Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В., Абрамов С.Н. Выделение и анализ биодеградационного потенциала нового природного штамма-деструктора хлорфенокснкислот рода Rhodococcus // Известия Самарского научного центра Российской академии наук -2011.-Т.13-№5(2).-С. 169-171.

3. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г. Штаммы-деструкторы хлорфенокснкислот гамма - подкласса протеобактерий // Известия Самарского научного центра Российской академии наук- 2011. - Т.13-№ 5(2). - С. 194-195.

4. Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В. Особенности структуры микробиоты техногенной экосистемы Северного промузла РБ: бактерии-деструкторы фенола и 2,4-дихлорфевола II

Известия Самарского научного центра Российской академии наук - 2011. - Т. 13 № 5(2). - С. 172-174.

5. Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В. Биоразнообразие бактерий-деструкторов хлорированных феноксикислот // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2009. - №6. - С. 121-123.

6. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Молекулярно-биологический подход при изучении бактерий-деструкторов хлорароматических соединений // Аграрная Россия. - 2009. - №S. -С. 119.

7. Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р., Маркушева Т.В. Анализ состава интермедиатов биоконверсии хлорароматических производных // Аграрная Россия. - 2009. - №S. - С. 121.

8. Журенко Е.Ю., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Маркушева Т.В. Анализ бактерий-деструкторов техногенной экосистемы // Вестник Оренбургского государственного университста.-2009-ifeS. - С. 444-445.

9. Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В., Коробов В.В., Жарикова Н.В. Особенности скрининга бактериальных деструкторов ксенобиотиков // Аграрная Россия. - 2009. - №S. - С. 135.

Ю.Жарикова Н.В., Маркушева Т.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Журенко Е.Ю., Ситдикова Л.Р., Колганова Т.В., Кузнецов Б.Б., Турова Т.П. Raoutella planlicola -новый штамм-деструктор 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты // Прикладная биохимия и микробиология. - 2006. - Т. 42. - № 3. - С. 292-297.

П.Коробов В.В., Маркушева Т.В., Кусова И.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Штамм бактерий Serratia marcescens В-6493 -деструктор фенола и 2,4-дихлорфенола // Биотехнология. - 2006. - № 2. - С.63-65.

12.Тронынина Т.С., Иванова Э.А., Вафина Г.Х., Иванов P.C., Ясаков Т.Р., Маркушева Т.В. Системный подход в биохимических исследованиях протеолитического процессинга протеома живых систем // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. IO.A. Овчинникова. - 2006. - Т. 2 - №4. - С. 14-15.

13.Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Идентификация и характеристика плазмиды штамма Aeromotias hydrophila IBRB-36-4CPA, несушей гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот//Генетика.-2004. - Т. 40. -№ 11.-С. 1469-1474.

14. Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Gluconobacter oxydons IBRB-2T - деструктор 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты II Биотехнология. - 2003. - № 6. - С. 67-71.

Патенты

1. Маркушева Т.В., Кусова И.В., Журенко Е.Ю., Чураев Р.Н. Способ обнаружения генов катаболизма 2,4-Д в геномах эукариот // Патент РФ № 2125263, Бюл.№2, 20.01.1999.

2. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Чураев Р.Н. Штамм бактерий Bacillus cereus, осуществляющий биологическую деградацию 2,4,5-Т // Патент РФ № 2129605, Бюл. № 12, 24.04.1999.

3. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Чураев Р.Н. Штамм бактерий Gluconobacter oxydons, осуществляющий биологическую деградацию 2,4,5-Т // Патент РФ №2130067, Бюл. №13,10.05.1999.

4. Маркушева Т.В, Кусова И.В, Журепко Е.Ю, Чураев Р.Н. Способ обнаружения генов катаболизма 2,4-Д в геномах микроорганизмов // Патент РФ № 2130074, Бюл. №13,10.05.1999.

5. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю, Кусова И.В, Чураев Р.Н. Штамм бактерий Serratia marcescens, осуществляющий биологическую деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола // Патент № 2074254, Бюл. № 6, 27.02.1997.

6. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю, Султанбекова М.Н, Кусова И.В, Каткова Е.Г, Никитина B.C., Чураев Р.Н. Штамм бактерий Arthrobacter globiformis, осуществляющий биологическую деградацию фенола и 2,4-дихлорфенола // Патент РФ № 2076523, Бюл. № 9, 27.03.1997.

7. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю, Султанбекова М.Н, Каткова Е.Г, Кусова И.В, Чураев Р.Н. Штамм бактерий AgrobacSerium tumefaciens, осуществляющий биологическую деградацию фенола // Патент РФ № 2077575, Бюл. № И. 20.04.1997.

8. Маркушева Т.В, Кусова И.В, Никитина B.C., Султанбекова М.Н, Чураев Р.Н, Журенко Е.Ю, Каткова Е.Г, Шакирова Р.С. Штамм бактерий Escherichia coli, осуществляющий биодеградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты, рекомбинантная плазмидная ДНК рМК16, содержащая гены биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты и способ конструирования рекомбинантиой ДНК рМК16, содержащей гены биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты //Патент РФ № 2064501, Бюл. № 21, 27.07.1996.

9. Маркушева Т.В, Никитина B.C., Скворцова И.Н, Чураев Р.Н, Кусова И.В, Журенко Е.Ю, Ягафарова Г.Г, Хлесгкин Р.Н, Мавзютов А.Р, Габидуллин З.Г. Штамм бактерии Bacillus subtilis, осуществляющий деградацию 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты // Патент РФ № 1742226, Бюл. № 23, 23.06.1992.

Работа, депонированная в ВИНИТИ

1. Муллагалиев И.Р, Монаков Ю.Б, Хафизова Г.Г, Журенко Е.Ю, Маркушева Т.В, Хусаинова И.А. Иммобилизация некоторых, микроорганизмов на полимерных матрицах // Деп. в ВИНИТИ. 11.06.1993. - № 1638-В93.

Монография

1. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю, Кусова И.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных // Уфа: Гилем, 2002. - 108 с.

Публикации в научных электронных изданиях

1. Zharikova, N, Korobov, V, Yasakov,T, Anisimova, L, Kolganova, T, Zhurenko, E, Kuznetsov, B. and Markusheva, T. Citrobacter sp. 36-4CPA 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Accession number JF812082, GenBank, 2011.

2. Yasakov, T.R, Kulikov, E.E, Letarov, A.V, Zharikova, N.V, Zhurenko, E.Y, Korobov, V.V, Anisimova, L.G. and Markusheva,T.V. Pseudomonas kilonensis 34T -new bacterial degrader of 2,4-D and 2,4,5-T 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. GenBank. 2011. Accession number HQ891022. GenBank, 2011.

3. Yasakov, T.R, Kulikov, E.E, Letarov, A.V, Zharikova, N.V, Zhurenko, E.Y, Korobov, V.V, Anisimova, L.G. and Markusheva, T.V. Xanthomonas sp. 33DCP -new bacterial degrader of chlorophenoxyalcanoic acids 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Accession number HQ891021. GenBank, 2011.

4. Yasakov, T.R, Kulikov, E.E, Letarov, A.V, Zharikova, N.V, Zhurenko, E.Y, Korobov, V.V, Anisimova, L.G. and Markusheva, T.V. Stenotrophomonas sp. 33T -new bacterial degrader of 2,4,5-T 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Accession number HQ877451. GenBank, 2011.

5. Anisimova, L., Zhurenko, E., Kolganova. Т., Bumazhkin, В., Patutina E., Korobov, V., Zharikova, N., Yasakov, T.. Kuznetsov, B. and Markushcva, T. The conjugative plasmid of 2,4-D and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid degradating bacterium Serratia marcescens ssp. B-6493. Accession number HQ896493. GenBank, 2010.

6. Zharikova N.V., Markusheva T.V., Galkin E.G., Korobov V.V., Zhurenko E.U., Sitdikova L.R., Kolganova T.V., Kuznetsov B.B., Tourova T.P. Raoultella planticola strain 33-4ch 16S ribosomal RNA gene, partial sequence. Accession number DQ333356. GenBank, 2006.

7. Markusheva T.V., Zhurenko E.Yu., Kusova I.V. Strains IBUNC //Consolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L.V. Kalakoutskii - E. Book Vol. I. Bacteria, 2001.P. 3915-4077.Режим доступа: http://www.vkm.ru/eCatalogue.htm.

Публикации в научных сборниках и материалах конференций

1. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Возможность использования культуры Gluconobacter oxydons 2Т в области ремедиации почв от гербицида 2,4,5-Т // Сборник трудов VI Международной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов». - Киев, 2010. - С. 248-252.

2. Актуганов Г.Э., Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Ясаков Т.Р., Маркушева Т.В., Мелентьев А.И. Хитинолитическая активность и антагонистический потенциал бактерий-деструкторов хлорированных феноксикислот // Материалы Десятой Международной конференции «Современные перспективы в исследовании хитина и хитозана». - Нижний Новгород, 2010. - С. 250-254.

3. Челатканова E.H., Романова Н.Б., Кусова И.В., Коробов В.В., Маркушева Т.В. Исследование процесса микробного дегалогенирования хлорсодержаших ароматических соединений // Материалы 9-й международной научной конференции «Сахаровские чтения 2009 года: экологические проблемы XXI века». - Минск, 2009 - С. 199-200.

4. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Возможность использования культуры Bacillus cereus IBRB-34T в области ремедиации почв от гербицида 2,4,5-Т // Сборник трудов V Международной конференции «Факторы экспериментальной эволюции организмов». - Киев, 2009. - Т.6. - С. 303-308.

5. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Молекулярно-генетическая организация новой плазмиды деградации хлорфеноксиуксусных кислот // Сборник трудов международной конференции «Факторы экспериментальной эволюции». - Киев, 2008. - С. 139142.

6. Жарикова Н.В.. Маркушева Т.В., Кузнецов Б.Б. Характеристика области репликации плазмиды рАН 36-4СРА штамма Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». - Москва, 2008. - С. 135-136.

7. Маркушева Т.В., Жарикова Н.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р. Плазмида Citrobacter hydrophila IBRB-364CPA, несущая гены конверсии хлорфеноксиуксусной кислоты, устойчивости к антибиотикам и тяжелым металлам // Материалы III Международной конференции

«Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». - Пермь, 2008. - С. 69-71.

8. Мавлявиева P.P., Анисимова Л.Г., Легушс Э.Ф., Журенко Е.Ю., Ясаков Т.Р., Маркушева Т.В. Исследование биотических взаимоотношений при разработке биологического препарата для очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов // Труды 51-й научной конференции МФТИ «Современные проблемы фундаментальных и прикладных наук». Часть IV «Молекулярная и биологическая физика». - Москва-Долгопрудный, 2008. - С. 20-22.

9. Жарикова Н.В., Коробов В.В., Ситдикова Л.Р., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Галкин Е.Г., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Характеристика генетической системы мобилизации ллазмиды рАН 36-4СРА // Материалы школы-семинара молодых ученых Уфимского научного центра РАН и волго-Уральского региона по физико-химической биологии и биотехнологии «Биомика - наука XXI века». -Уфа, 2007. - С. 46-48.

Ю.Чегодаева К.А., Бунакова О.И., Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Легушс Э.Ф., Коробов В.В., Кусова И.В. Исследование способности штаммов бактерий к извлечению ионов тяжелых металлов из водных растворов // Сборник статей Международной научно-технической конференции «Наука, образование, производство в решении экологических проблем». - Уфа, 2007. - С. 258-262.

11.Красногорская Н.Н., Кусова И.В., Легушс Э.Ф., Фащевская Т.Б., Маркушева Т.В. Реализация комплексного подхода при преподавании дисциплины «Источники загрязнения среды обитания» // Материалы III Международной научно-технической конференции «Наука, образование, производство в решении экологических проблем» (экология-2006). - Уфа, 2006. - Т. 2. - С. 205-206.

12.Фатхутдинова А.Ф., Легушс Э.Ф., Маркушева Т.В., Журенко Е. Ю., Кусова И.В. Биологический метод очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов // Материалы международной научно-практической конференции «Нефтегазопереработка и нефтехимия-2006». - Уфа, 2006. - С. 225-227.

13. Фатхутдинова А.Ф., Легушс Э.Ф., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В., Кусова И.В. Изучение способности бактерий Klebsiella terrigena dub.(36T), Bacillus cereus nunps (33T), Bacillus cereus shug (34T), Gluconobacter oxydans, Serratia marcescens к извлечению ионов тяжелых металлов из водной среды // Материалы 6-ой международной конференции «Сахаровские чтения 2006 года: экологические проблемы XXI века». - Минск, 2006. - С. 258-259.

14.Вдовина И.В., Фатхутдинова А.Ф., Маркушева 'Г.В., Легушс Э.Ф., Красногорская Н.Н. Изучение бактерий для разработки экологически безопасного метода доочистки сточных вод от тяжелых металлов // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Техносферная безопасность, надежность, качество, энергосбережение». - Ростов-на-Дону, 2005. - С. 216-219.

15. Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р., Журенко Е.Ю., Маджар В.В., Михалев А.А., Маркушева Т.В. Плазмида штамма Aeromonas hydrophila IBRB-36 4СРА и ее свойства // Материалы 2-й конференции Московского общества генетиков и селекционеров им. Н.И. Вавилова «Актуальные проблемы генетики». - Москва, 2003. - Т. 2. - С. 84-85.

16.Галкин Е.Г., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Маркушева Т.В. Масс-спектрометрия в исследованиях процессов биологической конверсии пестицидов (2,4-Д; 2,4,5-Т) // Школа-семинар «Масс-спектрометрия в химической

физике, биофизике и экологии»: сб. Материалов Школы-семинара. - Звенигород, 2002. - С. 51-52.

17.Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Маркушева Т.В. Биоремедиация: конверсия фенола и его хлорированных производных // Труды Всероссийской конференции «Научные аспекты экологических проблем России» / под ред. Ю.А. Израэля. - М: Наука, 2002. - С. 562-566.

18.Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Коробов В.В., Жарикова H.H., Маркушева Т.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных промзоны г. Уфы // Материалы конференции «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий». - Оренбург, 2001. - С. 10-14.

19. Кусова И.В., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Молекулярный зонд для поиска штаммов-деструкторов 2,4-Д // Материалы Международной конференции Молекулярная генетика и биотехнология. - Минск, 1998. - С. 59-60.

20.Markusheva T.V., Kusova I.V.,Tchuraev R.N. Comparative investigation of genes of 2,4-D degradation in plant and animals cells // Proceedings of Satellite Meeting of the XV IUB Congress of Biochemistry «Biochem.and Biophys. of Cytochrome P-450: Struc.and Funct., Biotechnol.and Ecology Aspects». - Moscow, 1992. - P. 416-418.

21. Никитина B.C., Яруллина Г.К., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Фотометрическое определение микроколичеств 2,4-дихлорфенола при исследовании биодеградации хлорсодержаших ароматических соединений // Основные направления биотехнологии в решении народнохозяйственных задач: сб. статей - Уфа, 1991. -С. 87-92.

22.Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Султанбекова М.Н., Каткова Е.Г., Совенко О.С., Маркушева Т.В. Поиск и исследование микроорганизмов для деградации гербицида 2,4-Д // Основные направления биотехнологии в решении народнохозяйственных задач: сб. статей - Уфа, 1991. - С. 81-86.

23.Маркушева Т.В., Никитина B.C., Султанбекова М.Н., Кусова И.В., Журенко Е.Ю., Каткова Е.Г., Чураев Р.Н. Молекулярно-генетическая характеристика клонированных генов деградации 2,4-Д штамма Bacillus sp. // Материалы VII Всесоюзного симпозиума «Молекулярные механизмы генетических процессов». -Москва, 1990. - С. 242-243.

24. Маркушева Т. В., Кусова И.В., Никитина B.C., Чураев Р.Н. Конструирование плазмиды биодеградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты // Материалы конференции «Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии». - Гарту, 1989. - Т.1. - С. 163-165.

Избранные тезисы докладов и стендовых сообщений

1. Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р., Маджар В.В., Абрамов С.Н. Особенности организации плазмид бактерий деструкторов ароматических соединений рода Bacillus // Материалы V съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Москва, 2009. -Часть I. - С. 33.

2. Мавлявиева P.P., Легушс Э.Ф., Маркушева Т.В., Сафарова В.И. Исследование способности бактерий к извлечению тяжелых металлов из водных растворов // Материалы VI Республиканской научно-практической конференции «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций». -Уфа, 2009. - С. 22-24.

3. Маркушева Т.В., Ясаков Т.Р., Анисимова Л.Г., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Журенко Е.Ю. Биоразнообразие бактерий - деструкторов хлорфеноксиуксусных

кислот // Вестник Российской военно-медицинской академии. - 2008. - № 3 (23). -ч . И. - С. 342.

4. Анисимова JI.A, Ясаков Т.Р, Жарикова Н.В, Коробов В.В, Журен ко Е.Ю, Маркушева Т.В. Бактериальные штаммы для ремедиации почв, загрязненных органическими токсикантами // Тезисы докладов I Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Фундаментальные достижения в почвоведении, экологии, сельском хозяйстве на пути к инновациям». - Москва, 2008. - С. 8 - 9.

5. Анисимова Л.Г., Ясаков Т.Р, Жарикова Н.В, Коробов В.В, Журенко Е.Ю, Маркушева Т.В. Сравнительный анализ илазмид штаммов - деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот родов Pseudomonas и Serratia // Материалы Международной школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология». - Москва, 2008. - С. 18.

6. Галкин Е.Г, Коробов В.В, Жарикова Н.В, Журенко Е.Ю, Ясаков Т. Р, Анисимова Л.Г, Маркушева Т.В. Масс-спектрометрия в исследованиях процессов биологической конверсии пестицидов (2,4-Д; 2,4,5-Т). Сообщение 3. Идентификация интермедиатов катаболизма пестицида 2,4-Д рекомбинантного штамма-деструктора при помощи хроматомасс-спетрометрии //Материалы 3-й Международной школы-конференции «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». - Звенигород, 2007. - С. 244.

7. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю, Галкин Е.Г, Коробов В.В, Жарикова Н.В, Анисимова Л.А, Гафшггова Л.Р. Сравнительная характеристика плазмид бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот родов Citrobacter, Pseudomonas и Serratia // Тезисы Российской школы-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология», посвященной 100-летию со дня рождения С.И. Алиханяна. - Москва-Пущино, 2006. - С. 64.

8. Жарикова Н.В, Коробов В.В, Ситдикова Л.Р, Маркушева T.B. Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА - новый штамм-деструктор хлорированных феноксиуксусных кислот // Тезисы докладов Всероссийской Молодежной школы-конференции «Актуальные аспекты современной микробиологии». - Москва, 2005. - С. 88.

9. Маркушева Т.В, Жарикова Н.В, Коробов В.В, Ситдикова Л.Р, Журенко Е.Ю. Идентификация и сравнительный анализ D-плазмид бактерий-деструкторов рода Raoultella // Материалы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» - Саратов, 2005. - С. 86.

10. Маркушева Т.В., Кусова И.В, Журенко Е.Ю, Коробов В.В, Жарикова Н.В, Ситдикова Л.Р. Молекулярный зоид для поиска штаммов-деструкторов 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты // Тезисы докладов Второй Международной конференции Наука-Бизнес-Образование, Биотехнология-Биомедицина-Окружающая среда. - Пущино, 2005. - С. 34.

11. Маркушева Т.В, Жарикова Н.В, Коробов В.В, Гафиятова Л.Р, Лубянов Е.А, Журенко Е.Ю, Маджар В.В. Плазмида штамма Serratia marcescens IBRB-22S, несущая гены конверсии хлорфеноксиуксусных кислот и устойчивости к тяжелым металлам // Материалы III съезда ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». - Москва, 2004. - Т. 1. - С. 394.

12. Gafiyatova L.R, Zharikova N.V, Korobov V.V, Lubyanov E.A, Zhurenko E.Yu, Madjar V.V, Markusheva T.V. Aeromonas hydrophila IBRB-36 4CPA plasmid,

carrying genes of chlorophenoxyacetic acid conversion antibiotic and heavy metals resistance // ELSO Meeting. - France, 2004. - P. 260, режим доступа org/index.php.

13.Маркушева T.B., Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Биоочистка стоков нефтехимического производства // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Реновация: отходы-технологии-доходы». - Уфа, 2004. - С. 68.

14.Маркушсва Т.В., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р. Бактерии для ремедиации окружающей среды // Труды международной конференции «Поиск и использование новых биомолекул: биоразнообразие, окружающая среда, биомедицина». - Пущино, 2004. - С. 57.

15.Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова Л.Р., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Масс-спектрометрия в исследованиях процессов биологической конверсии пестицидов // Материалы 2-го международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». - Москва, 2004. - С. 265.

16.Zharikova N.V., Gafiyatova L.R., Korobov V.V., Galkin E.G., Madjar V.V., Zhurenko E.Yu., Markusheva T.V. Plasmids of Klebsiella strains-degrading chlorophenoxyacetic acids // ELSO Meeting. - Germany, 2003. - P. 264. Режим доступа org/index.php.

17.Zharikova N.V., Korobov V.V., Zhurenko E.Yu., Gafiyatova L.R., Michalev A.A., Madjar V.V., Galkin E.G., Markusheva T.V. Bacteria-degrading phenol and its chlorinated derivatives // First FEMS Congress of European Microbiologists. - Slovenia, 2003. - P. 430.

18. Жарикова И.В., Гафиятова Л.P., Коробов B.B., Галкин Е.Г., Маджар В.В., Михалев А.А., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Плазмиды штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот бактерий рода Klebsiella // Сборник тезисов докладов 7-ой Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология -наука XXI века». - Пущино, 2003. - С. 273.

19. Markusheva T.V., Zhurenko E.Yu. Genome analysis: 2,4-D conversion determinants detection ELSO Meeting, 2002, Poster 1, Section 1 «Genome analysis and evolution». Режим доступа www elso. org/index.php.

20. Маркушева T.B., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Жарикова Н.В., Коробов В.В. Этапы конверсии 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты природных бактерий-деструкторов // Тезисы докладов III Съезда биохимического общества. - С.-Пб., 2002. - С. 43.

21.Коробов В.В, Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Маджар В.В., Жарикова Н.В., Катимуллина Э.Р., Гафиятова Л.Р., Маркушева Т.В. Микроорганизмы для очистки окружающей среды // Тезисы докладов 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития». - Москва, 2002. - С. 276.

22. Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Маркушева Т.В. Биоремедиация: конверсия фенола и его хлорированных производных // Материалы Всероссийской конференниии «Научные аспекты экологических проблем России». - С.-Петербург, 2001. - С. 280.

23.Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В. Штаммы-деструкторы фенола и его хлорированных производных // Биотехнологии 2000: сб. - Пущино, 2000. - С. 72.

24. Markusheva T.V., Zhurenko E.Yu., Kusova I.V., Galkin E.G., Korobov V.V. Strains -destructors of phenol and its chlorinated derivatives. Biotechbnology 2000. - Pushino, 2000. - V.2. - P. 153.

25.Маркушева Т.В., Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В. Штаммы-деструкторы фенола и его хлорированных производных. Биотехнологии 2000. - Пущино, 2000. - Т.1. - С. 72.

26.Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Маркушева Т.В. Исследование штаммов-деструкторов 2,4,5 -Т рода Bacillus // Тезисы докладов II съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - С.-Пб., 2000. - Т 2. - С. 10.

27.Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Маркушева Т.В. Биоремедиация почв: поиск и исследование штаммов-деструкторов для конверсии фенола и его хлорированных производных // Тезисы докладов Научно-практической конференции «Экологический императив сельского хозяйства Республики Башкортостан». -Уфа, 1998. - С. 84-85.

28. Галкин Е.Г., Журенко Е.Ю., Кусова И.В., Маркушева Т.В. Продукты биологической конверсии 2,4,5-Т и их анализ П Тезисы докладов XVI Менделеевского съезда по общей и прикладной химии.-С.-Петербург, 1998. - С. 60.

29. Markusheva T.V., Kusova I.V., Zchurenko E.Yu., Tchuraev R.N. Studies on the peculiarities of plant 2,4-D degradation genes // J. Plant physiology and Biochemistry, Special issue, 1996. P.303.

30. Маркушева T.B., Журенко Е.Ю. Сравнительное исследование генов катаболизма 2,4-Д штаммов рода Bacillus // Материалы I съезда ВОГиС, Генетика, 1994. Т.30. С.97.

31.Markusheva T.V., Kusova I.V., Sultanbekova M.N., Zhurenko E.Yu., Tchuraev R.N. Comparative investigation of bacterial 2,4-D degradation genes // Abstracts of 4-th Symposium on bacterial genetics and ecology. - Nederland, 1993. -P. 89.

32.Markusheva T.V., Kusova I.V., Sultanbekova M.N., Zhurenko E.Yu., Katkova E.G., Sovenko O.S., Tchuraev R.N. Xenobiotics and animals: investigation of 2,4-D herbicide metabolism genes // Journal of Basic and Clinical Physiology and Pharmacology. 1992. V.3, Sup., P. 146.

33.Markusheva T.V., Kusova I.V., Sultanbekova M.N., Zhurenko E.Yu., Katkova E.G., Tchuraev R.N. Investigation of 2,4-D herbicide degradation genes in plants // Abstracts of 35th International Symposium with Excursion on Vegetation Science «Applied Vegetation Ecology». - Shanghai, China, 1992. - P. 88.

34. Markusheva T.V., Kusova I.V., Sultanbekova M.N., Zhurenko E.Yu., Katkova E.G., Tchuraev R.N. Xenobiotics and plants: investigation of 2,4-D herbicide metabolism genes // Abstracts of 5 International Congress of Ecology. - Yokohama, Japan, 1990. -P. 282.

35.Маркушева T.B., Никитина B.C., Кусова И.В., Ягафарова Г.Г., Хлесткин Р.Н. Микробиологическая деградация гербицида 2.4-Д // Материалы Всесоюзной конференции «Микробиологические методы защиты окружающей среды». -Пущино, 1988. - С. 43.

36. Маркушева Т.В., Кусова И.В., Никитина B.C. Молекулярное клонирование и экспрессия генов биоде1радации гербицида 2,4-Д в клетках Е. coli // Материалы Всесоюзной конференции «Микробиологические методы защиты окружающей среды». - Пущино, 1988. - С. 39.

Подписано в печать 13.10.11 г. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Печать ризографическая. Тираж 100 экз. Заказ 546. Гаршпура «ТипезНе-етКотап». Отпечатано в типографии «ПЕЧАТНЫЙ ДОМЪ» ИП ВЕРКО. Объем 2,6 п.л. Уфа, Карла Маркса 12 корп. 4, т/ф: 27-27-600, 27-29-123

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Маркушева, Татьяна Вячеславовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Фенол и его хлорированные производные: проблема присутствия в окружающей среде.

1.2. Особенности биологической конверсии фенола и его хлорированных производных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследований.

2.2. Выделение чистых культур природных штаммов-деструкторов

2.3. Классификация штаммов.

2.4. Определение устойчивости бактерий к антибиотикам и тяжелым металлам.

2.5. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет.

2.6. Определение количества фенола, феноксикислот и идентификация интермедиатов их конверсии.

2.7. Получение препаратов ДНК микроорганизмов.

2.8. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре.

2.9. Сравнительный анализ генов деградации хлорфеноксикислот.

2.10. Элиминация плазмид, индуцированная химическими агентами.

2.11. Конъюгативный перенос генетического материала.

2.12. Клонирование фрагментов ДНК штамма Bacillus subtilis

В-1742Д.

2.13. Статистический анализ результатов экспериментов.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. БАКТЕРИИ-ДЕСТРУКТОРЫ АРОМАТИЧЕСКИХ ГАЛОГЕНИДОВ ТЕХНОГЕННОЙ ЭКОСИСТЕМЫ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ, ИЗУЧЕНИЕ ОСОБЕННОСТЕЙ МЕТАБОЛИЗМА И ВОЗМОЖНОСТИ ПРАКТИЧЕСКОГО ПРИМЕНЕНИЯ.

3.1.1. Характеристики микроорганизмов-деструкторов Уфимского промузла: экотоп ОАО «Дубитель».

3.1.2. Характеристики микроорганизмов-деструкторов Уфимского промузла: экотоп ОАО «НУНПЗ».

3.1.3. Характеристики микроорганизмов-деструкторов Уфимского промузла: экотоп ОАО «УНПЗ».

3.1.4. Характеристики микроорганизмов-деструкторов Уфимского промузла: экотоп ОАО «Уфахимпром».

3.1.5. Сравнительный анализ особенностей конверсии хлорфеноксиуксусных кислот.

3.1.6. Сравнительный анализ генетических детерминант катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот.

3.1.6.1. ПЦР-анализ геномов новых деструкторов с применением геноспецифических праймеров гена tftA Burkholderia cepacia AC 1100.

3.1.6.2. Дот-блот гибридизация препаратов геномной ДНК штаммов -деструкторов и плазмиды pJP4 Cupriavidus necator JMP134.

3.1.7. Структурно-функциональные особенности плазмид штаммов-деструкторов

3.1.7.1. Сравнительный анализ плазмид деструкторов.

3.1.7.2. Горизонтальный перенос плазмид деструкторов и экспрессия функций катаболизма хлорфеноксикислот в других 180 бактериальных хозяевах.

3.1.8. Результаты изучения возможности практического применения новых штаммов-деструкторов.

3.1.8.1. Применение новых штаммов-деструкторов для ремедиации окружающей среды.

3.1.8.2. Использование штамма Bacillus subtilis 16 для создания штамма-деструктора с заданными свойствами in vitro.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных"

Актуальность проблемы

Известно, что в современной биосфере микроорганизмы играют важную роль в вовлечении синтетических производных в естественный обмен веществ и энергии. Микробные клетки способны осуществлять ассимиляцию разнообразных химических субстанций, в ходе которой они выполняют процессы конверсии молекул ксенобиотиков до экологически безопасных продуктов. Именно поэтому в настоящее время применение микроорганизмов рассматривается как основа наиболее выгодных способов поддержания качества окружающей среды.

Существенную роль в конверсии синтетических органических соединений играют бактерии. Это связано с тем, что важной особенностью бактериальных клеток является их высокая приспособляемость к изменяющимся факторам среды, из-за которой они приобретают возможность использовать в качестве источников питания и энергии большое число антропогенных производных, включая и опасные по отношению к другим живым системам.

Значительную часть стойких экотоксикантов составляют хлорорганические производные, входящие в категорию крупнотоннажных продуктов, производимых для нужд сельского хозяйства, химической, лакокрасочной, деревообрабатывающей промышленности, целлюлозно-бумажного производства, нефтеперерабатывающей и коксохимической отраслей. Источниками эмиссии поллютантов этой группы являются зоны производства, сточные воды и отходы, а также термические установки по их сжиганию, часто производящие еще более токсичные полихлордиоксины [Винокуров C.B. и др., 1995; Майстренко В.Н., Клюев H.A., 2004;

Шамсутдинова J1.P. и др., 2010]. Реальную опасность представляют собой и места складирования. Например, к настоящему времени на территории ОАО «Уфахимпром» накоплено 412,14 тыс. м отходов в 8 шламонакопителях и 100 тонн высокотоксичных отходов (в т.ч. хлорфенолов), условия хранения которых по оценкам специалистов не соответствуют санитарным и экологическим нормам [Шамсутдинова J1.P. и др., 2010]. Появление в окружающей среде токсикантов связано также с недостаточным качеством очистки промышленных стоков. По сведениям о работе очистных сооружений, приведенным в Государственном докладе «О состоянии окружающей природной среды Республики Башкортостан в 2001 году», из 123 биологических очистных сооружений в проектном режиме функционировали 19, остальные - работали неэффективно. Даже в ситуации, когда сброс стоков в поверхностные водные объекты снизился, в водной среде обнаруживаются все химические соединения, которые вырабатываются заводами химического профиля. В питьевой воде г. Уфы идентифицировано более 100 химических соединений-загрязнителей, в т.ч. фенол, бензол, безапирен, ряд пестицидов, включая 2,4-Д, ДДТ, изомеры гексациклогексана, летучие галогенсодержащие углеводороды, 1,2-дихлорэтан, диоксины. Суммарное содержание опасных веществ в отдельные периоды года достигает критических значений [Винокуров C.B. и др., 1995; Ильин В.Г. и др., 1995].

Критические концентрации загрязнителей ароматического ряда обнаружены в Стерлитамаке, Кемерово, Славгороде, Перми, Дзержинске, Чапаевске, Волгограде и Павлодаре. В связи с высоким уровнем объемов накопленных отходов хлорорганического синтеза в 2010 году была организована инвентаризация и учет опасных объектов РФ с целью разработки мер по ликвидации экологического ущерба и определением механизмов их реализации, включая пилотные проекты отработки технологий утилизации загрязнителей [Хизбуллин Ф.Ф. и др., 2011].

Вместе с тем, анализ работ по проблеме утилизации синтетических соединений, показывает, что, несмотря на то, что современный этап исследований биологического воздействия на хлорированные производные характеризуется выраженным практическим интересом к изучению микроорганизмов-деструкторов, число изученных бактериальных культур ограничено. Данные, раскрывающие особенности биологической конверсии фенола и его производных, чаще всего касаются представителей рода Pseudomonas, несколько меньше известно о представителях родов Rhodococcus, Arthrobacter, Bacillus и Sphingomonas [Козловский С. и др., 1993; Lang Е., 1996; Prieto M. et al., 2002; Rehfuss M., Urban J., 2005; Gouda M., 2007; Agarry S. et al., 2008; Liu Y. et al., 2008; Wang C. et al., 2008; Wasi S. et al., 2008; Плотникова Е.Г., 2010].

В настоящее время отсутствие системных исследований микробных деструкторов является сдерживающим фактором развития безопасных и экономически выгодных технологий для решений частных задач рационального использования и охраны природных ресурсов. Следует подчеркнуть, что биотехнологии примерно в 50 раз дешевле традиционных методов, при этом конверсию загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ, что позволяет исключить вторичную контаминацию среды. Кроме этого, появляется возможность решения проблемы уничтожения значительных объемов накопленных отходов и невостребованных препаратов.

Вместе с тем, изучение микроорганизмов, способных ассимилировать молекулы экотоксикантов, имеет не только большое практическое значение, но и является одним из фундаментальных направлений микробиологии, раскрывающим новые особенности роли микробов в круговороте веществ.

Это направление связано с исследованием теоретических основ жизнедеятельности микроорганизмов в техносфере. Оно охватывает вопросы биоразнообразия, генетической изменчивости, механизмов метаболических взаимоотношений с факторами трансформированной среды, раскрывает процессы адаптации и (микро)эволюции живых систем в условиях сильного антропогенного пресса, включая и случаи прямого их уничтожения.

Познание и освоение потенциала прокариот, обладающих особыми свойствами, а именно, способностью осуществлять контроль над содержанием загрязнителей в окружающей среде и представляющих собой в этом смысле ценный микробиологический ресурс, - важная часть исследований современной биологии в целом.

Цель работы

Выявление новых природных бактерий-деструкторов фенола и его хлорированных производных, их сравнительный анализ и определение возможности практического применения.

Задачи исследования

1. Выделить новые бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных из образцов смешанных популяций микроорганизмов техногенной экосистемы.

2. Идентифицировать штаммы-деструкторы в соответствии с культурально-морфологическими, физиолого-биохимическими и молекулярными критериями систематики.

3. Исследовать пути метаболизма молекул ксенобиотиков и получить количественные и качественные характеристики процессов их конверсии.

4. Изучить роль экстрахромосомных элементов в генетическом контроле этапов ассимиляции хлорароматических производных.

5. Выявить уровень гомологии ДНК геномов изучаемых штаммов с ранее изученными генетическими системами конверсии хлорфеноксикислот бактерий.

6. Определить возможности практического применения вновь выделенных штаммов - деструкторов.

Научная новизна исследования

Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4-дихлорфенола, 4-хлорфеноксиуксусной, 2,4-дихлорфеноксиуксусной и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислот.

Филогенетическое положение штаммов определено в соответствии с результатами исследования культурально-морфологических, физиолого-биохимических признаков, сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК и белкового профилирования. Согласно филогенетической обособленности штаммы Citrobacter sp. 36 4СРА, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые выделены бактерии-деструкторы фенола, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые установлено, что бактерии родов Agrobacterium, Achromobacter, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas выполняют оригинальные реакции ассимиляции хлорфеноксикислот с образованием феноксиуксусной кислоты с последующим раскрытием ароматического кольца.

Выявлено, что генетические системы, детерминирующие метаболизм хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas, располагаются на плазмидах.

Методом ДНК-ДНК гибридизации и ПЦР-анализа с применением олигонуклеотидных праймеров установлено, что системы генетического контроля катаболизма молекул хлорфеноксикислот имеют существенные отличия от известных кластеров tfd- и ¿/¿-генов штаммов Cupriavidus necator JMP134 и Burkholderia cepacia АС 1100.

Теоретическое и практическое значение работы

Получены новые данные о разнообразии природных штаммов-деструкторов фенола и его хлорированных производных. Данные о деструкторах внесены в Консолидированный каталог культур микроорганизмов Российских немедицинских коллекций (Consolidated Catalogue of Microbial Cultures Held in Russian Non-medical Collections / Edit. L.V. Kalakoutskii - Vol. I. Bacteria, 2001.P. 3915-4077. Режим доступа: http://www.vkm.ru/eCatalogue.htm/).

Последовательности генов 16S рРНК вновь выделенных штаммов депонированы в международную базу данных нуклеотидных последовательностей GenBank (GenBank accession numbers: HQ877451, HQ891021, HQ891022, DQ333356).

Установлены оригинальные пути ассимиляции моноароматических галогенидов и локализованы генетические элементы их контроля.

Показана принципиальная возможность применения новых штаммов-деструкторов в области защиты среды обитания человека.

Сведения о деструкторах, культуры деструкторов, а также их генетические элементы доступны для использования в научных и практических целях.

Результаты работы используются в образовательном процессе в курсах общебиологических дисциплин БГПУ им. М. Акмуллы и УГАТУ (биология, микробиология, экология, биохимия, генетика и биотехнология), а также при подготовке спецкурсов для магистров и бакалавров.

Практические рекомендации

Штаммы-деструкторы рекомендуются для очистки водной среды и почвы в условиях предприятий нефтехимического профиля.

Штаммы-деструкторы Bacillus subtilis (Патент РФ № ' 1742226), Arthrobacter globiformis (Патент РФ № 2076523), Agrobacterium tumefaciens (Патент РФ № 2077575) и Serratia marcescens (Патент РФ № 2074254) рекомендуются для ремедиации объектов окружающей среды с целью утилизации фенолов в стоках нефтехимических предприятий Северного промузла Республики Башкортостан.

Штаммы-деструкторы Bacillus cereus (Патент РФ № 2129605,), и Gluconobacter oxydans (Патент РФ №2130067,) рекомендуются для утилизации фенолов и его хлорированных производных в почве.

Генетические ресурсы штаммов-деструкторов рекомендуются для создания новых штаммов с заданными свойствами in vitro (Патенты РФ №№ 2064501, 2130074 и 2125263).

Положения, выносимые на защиту

1. В составе почвенной биоты, подвергавшейся воздействию химических факторов промышленного производства, присутствуют бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных.

2. Деструкторами хлорфеноксикислот являются представители родов Achromobacter, Agrobacterium, Agromyces, Arthrobacter, Azospirillum, Bacillus, Brenneria, Citrobacter, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Pseudomonas, Raoultella, Rhodococcus, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

3. Ассимиляция хлорфеноксикислот у культур деструкторов происходит через процессы дегалогенирования ароматического кольца с последующим его раскрытием.

4. Штаммы-деструкторы обладают оригинальными генетическими кластерами, детерминирующими катаболизм молекул хлорфеноксикислот, и их можно применить для создания новых штаммов-деструкторов in vitro.

5. Генетические детерминанты, контролирующие процессы катаболизма хлорфеноксикислот в клетках бактерий-деструкторов, могут располагаться на плазмидах.

6. Вновь выделенные бактерии-деструкторы рекомендуется использовать в качестве действующих элементов технологий очистки водной среды и почвы от фенола и его хлорированных производных, включая 2,4-дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоту.

Апробация работы

Результаты исследований докладывались и обсуждались на международных научных мероприятиях, в частности, на Экологическом Конгрессе (Япония, 1990), I Конгрессе европейских микробиологов (Словения, 2000), симпозиумах ELSO (Германия, 2003, Франция, 2004), Сахаровских чтениях (Республика Беларусь, 2006, 2009); на 1

Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), II С.-Петербургском международном экологическом форуме (2008); съездах: XVI Менделеевском (1998), Всероссийского общества генетиков и селекционеров (2000, 2004, 2008), Биохимического общества (Москва, 2002), Общества биотехнологов (Москва, 2006); в ходе работы в научно-практических конференций, направленных на решение экологических проблем: «Экологический императив сельского хозяйства РБ» (Уфа, 1998), «Реновация: отходы-технологии-доходы» (Уфа, 2004), «Актуальные экологические проблемы» (Уфа, 2007), «Проблемы безопасности и защиты населения и территорий от чрезвычайных ситуаций» (Уфа, 2009), а также в рамках профильных конференций: «Микробиологические методы защиты окружающей среды» (Пущино, 1988), «Научные аспекты экологических проблем России» (Москва, 2001), «Биоразнообразие и биоресурсы Урала и его сопредельных территорий» (Оренбург, 2001), «Наука-Бизнес-Образование» (Пущино, 2005), «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005), «Микробное разнообразие» (Пермь, 2008), «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010), «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2010), «Факторы экспериментальной эволюции» (Киев, 2010). Материалы исследований были обсуждены на межлабораторном научном семинаре Института биологии Уфимского научного центра РАН и расширенном заседании диссертационного совета ДМ 208.006.05 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (Уфа, 2011).

Публикации

Основные научные результаты диссертации изложены в 136 печатных работах, в том числе: 14 публикациях, указанных в Перечне ведущих рецензируемых научных журналов и изданий ВАК Министерства науки и образования РФ, 9 патентах, в 1 работе, депонированной в ВИНИТИ, в 1 монографии, 7 публикациях в научных электронных изданиях, 32 работах в научных сборниках и 72 - в материалах всероссийских и международных конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 296 страницах, содержит 62 рисунка и 20 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и обсуждения собственных исследований, заключения, выводов, списка цитированной литературы. Библиография включает 417 источников (89 - отечественных и 318 -зарубежных).

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Маркушева, Татьяна Вячеславовна

выводы

1. Из смешанных популяций почвенных микроорганизмов промзоны г. Уфы выделены новые штаммы бактерий-деструкторов фенола, 2,4-дихлорфенола и хлорфеноксиуксусных кислот, а именно: Achromobacter xyloxidans ЗЗР, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Agromyces sp. 34DCP, Arthrobacter globiformis 17S, Azospirillum irakense 38D, Bacillus cereus 33T, Bacillus subtilis 16, Brenneria salcis 38P, Citrobacter sp. 36 4CPA, Enterobacter asburia 33D, Enterobacter cloacae 34 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pantoea agglomerans 36P, Pseudomonas aeruginosa 36DCP, Pseudomonas fluorescens 39D, Pseudomonas kilonensis 34T, Pseudomonas putida 19S, Raoultella planticola 33 4CPA, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36T, Rhodococcus rubropertinctus 5D, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP.

2. Согласно фенотипическим признакам и филогенетической обособленности, выявляемой по молекулярным критериям систематики, штаммы Citrobacter sp. 36 4СРА, Stenotrophomonas sp. ЗЗТ и Xanthomonas sp. 33DCP дифференцированы как новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

3. Впервые установлено, что представители родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas способны вовлекать в обмен веществ и энергии фенол, 2,4-дихлорфенол, 4-хлорфеноксиуксусную, 2,4-дихлорфеноксиуксусную и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусную кислоты.

4. Установлено, что ассимиляция хлорфеноксиуксусных кислот Achromobacter xyloxidans ЗЗР, Agrobacterium tumefaciens 21SG, Citrobacter sp. 36 4CPA, Gluconobacter oxydans 2T, Pseudomonas kilonensis 34T,

Raoultella planticola 33 4CPA, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 36T, Serratia marcescens 22S, Stenotrophomonas sp. 33T и Xanthomonas sp. 33DCP происходит с образованием дегалогенированных производных феноксиуксусной кислоты, которые подвергаются расщеплению до альдегида гексеновой кислоты, диоксогексендионовой кислоты или гексеналя. Конверсия хлорфеноксикислот Bacillus subtilis 16 происходит через формирование гидроксилированных производных хлорфеноксиуксусной кислоты.

5. Показано, что штаммы-деструкторы Citrobacter sp. 36 4СРА, Serratia marcescens 22S, Raoultella planticola 36T, Raoultella planticola 36D, Raoultella planticola 33 4CPA, Stenotrophomonas sp. 33T, Pseudomonas kilonensis 34T и Xanthomonas sp. 33DCP обладают оригинальными плазмидами, несущими детерминанты контроля над реакциями ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот. Обнаружено, что плазмиды штаммов Raoultella planticola 33 4СРА, Raoultella planticola 36D и Raoultella planticola 36T способны к горизонтальному переносу и экспрессии детерминант деградации хлорфеноксикислот в других бактериальных хозяевах.

6. С использованием генетических кластеров штамма Bacillus subtilis 16 создан новый рекомбинантный штамм-деструктор E.coli рМК 16, осуществляющий конверсию молекул 2,4-Д.

7. Определена принципиальная возможность использования новых штаммов-деструкторов для доочистки от фенолов стоков предприятий нефтехимического профиля (.Bacillus subtilis 16, Arthrobacter globiformis 17S, Agrobacterium tumefaciens 21 SG, Serratia marcescens 22S) и почвы {Bacillus cereus 33T, Gluconobacter oxydans 2T).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Присутствие в окружающей среде стойких синтетических соединений ароматического ряда создает одну из трудноразрешимых проблем в области поддержания качества среды обитания человека.

К настоящему времени сформировано представление о том, что микроорганизмы, обладающие специфическими катаболическими способностями в отношении ксенобиотиков, могут использоваться для защиты и очистки среды в качестве действующих элементов биологических технологий нового поколения.

Вместе с тем, анализ результатов экспериментальных работ в области биоконверсии экотоксикантов обнаруживает слабую исследованность фундаментальных вопросов, связанных с описанием свойств отдельных культур, утилизирующих поллютанты, а также недостаточность знаний об организации и функционировании их консорциумов.

Проявляется также неполное понимание сути механизмов биохимических превращений молекул загрязнителей, недостаточны сведения об особенностях генетического строения деструкторов.

В ходе настоящей работы из смешанных популяций почвенной биоты, подвергавшейся длительному воздействию техногенных факторов, были выделены новые бактериальные культуры, способные к ассимиляции фенола и его галогенидов.

Изучение характеристик вновь выделенных штаммов позволило существенно расширить представления о биоразнообразии современных деструкторов.

В частности, с применением молекулярных критериев систематики были дифференцированы новые виды гамма-подкласса протеобактерий родов Citrobacter, Stenotrophomonas и Xanthomonas.

Впервые было обнаружено, что представители родов Agrobacterium, Agromyces, Azospirillum, Brenneria, Enterobacter, Gluconobacter, Pantoea, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas способны вовлекать в обмен веществ и энергии фенол, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т.

Для представителей родов Achromobacter, Agrobacterium, Bacillus, Citrobacter, Gluconobacter, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas впервые были описаны этапы ассимиляции хлорфеноксикислот и показано, что конверсия молекул ксенобиотиков происходит с образованием дегалогенированных производных феноксиуксусной кислоты, которые впоследствии подвергаются расщеплению до альдегида гексеновой кислоты, диоксогексендионовой кислоты или гексеналя. При этом впервые был обнаружен мета-путь конверсии 2,4,5-Т у штаммов родов Achromobacter, Gluconobacter, Pseudomonas, Raoultella, Stenotrophomonas и Xanthomonas, а также установлено, что конверсия хлорфеноксикислот у представителей рода Bacillus происходит через формирование гидроксилированных производных.

В геномах бактерий, принадлежащих родам Citrobacter, Pseudomonas, Raoultella, Serratia, Stenotrophomonas и Xanthomonas, обнаружены оригинальные плазмиды, несущие генетические детерминанты контроля над реакциями ассимиляции хлорфеноксиуксусных кислот.

Эти плазмиды были классифицированы как новые D-плазмиды бактерий-деструкторов. Обнаружено, что плазмиды штаммов рода Raoultella способны к горизонтальному переносу и экспрессии детерминант деградации хлорфеноксикислот в других бактериальных хозяевах в полном объеме.

Показано, что генетические системы контроля конверсии ксенобиотиков вновь обнаруженных штаммов существенно отличаются от известных.

Следует подчеркнуть, что в настоящей работе изучение природных деструкторов было нацелено не только на понимание теоретических основ многообразия проявлений жизни, но и связывалось со стремлением использовать полученные данные на практике в качестве ключа, который открывает возможности разработки безопасных технологий сохранения окружающей среды. Поэтому была изучена принципиальная возможность использования новых штаммов-деструкторов для доочистки от фенолов стоков предприятий нефтехимического профиля, а также показаны перспективы применения их генетических элементов для дизайна штаммов с заданными свойствами in vitro.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Маркушева, Татьяна Вячеславовна, Уфа

1. Абарахманов Р.Ф. Проблемы гидроэкологии Башкортостана // Башкирский экологический вестник. 2010. - №4. - С. 5-15.

2. Аусмээс Н.Р., Нейнару А.Л. Новые плазмиды биодеградации гербицида 2,4-Д // Генетика. 1990. - Т.26. - №4. - С.770-772.

3. Балашов C.B., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации бензосульфоновой и n-толуолсульфоновой кислот бактерий вида Comamonas testosteroni II Генетика. 1997. - Т.ЗЗ. - №5. - С.608-609.

4. Биотехнология. Принципы и применение / Под ред. A.A. Баева. М.: Мир, 1988.-480 с.

5. Большаков Г.Ф. Сераорганические соединения нефти. Новосибирск: Наука, 1986. 243с.

6. Бонч-Осмоловская Е.А., Слесарев А.И., Мирошниченко Л.И., Светличная Т.П. Desulfurcoccus amylolyticus п. sp. новый вид экстремально-термофильной архебактерии из гидротерм // Докл. АН СССР. - 1986. - Т.290. - №5. - С. 1259-1263.

7. Воронин A.M., Анисимова Л.А., Головлева Л.А. Участие плазмид в деградации а-метилстирола // Микробиология. 1985. - Т.54. - В.5. - С.854-855.

8. Воронин A.M., Скрябин Г.К. Генетические аспекты деградации бактериями ксенобиотиков // Успехи микробиологии. М.: Наука, 1985. Т.20. - С.39-60.

9. Воронин A.M., Цой Т.В. Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. М.: Наука, 1990. С. 123-138.

10. Бочаров Б.В., Шадрин Ю.Н. Поражение биоты в результате массированного применения гербицидов в военных целях в Южном Вьетнаме // Отдаленные биологические последствия войны в Юж. Вьетнаме: Сборник / РАН. Ин-т проб л. экол. и эволюции. М., 1996. -С.17-35.

11. Брода П. Плазмиды: Пер. с англ. М.: Мир, 1982. 224 с.

12. Буркацкая Е.И., Иванова З.В., Лысина Г.Г. Медицинское обследование лиц, работающих с пестицидами. Киев: Здоровье, 1995. 184 с.

13. Вайнштейн М.Б., Гоготова Г.И. Влияние ОВП среды на образование сероводорода сульфатредуцирующими бактериями // Микробиология. 1987.- Т.56. - В. 1.- С. 31-35.

14. Валеев Т.К., Сулейманов P.A. Эколого-гигиеническая оценка риска воздействия алкилфенольных соединений // Башкирский экологический вестник. 2010. - №2. - С. 3-11.

15. Винокуров C.B., Кантор Л.И., Пинчук C.B. Особенности и пути развития водоснабжения г. Уфы // Экология. 1995. - Т.2. - В.2. -С.4-7.

16. Власова И.Л. Обращение с отходами производства и потребления предприятий г. Салават // Безопасность жизнедеятельности. 2004. -№8.-С. 40-43.

17. Галимов Ш.Н., Камилов Ф.Х. Биохимические показатели и функциональная активность сперматозоидов при экспериментальном воздействии экотоксикантов класса феноксигербицидов // Башкиоский . экологический вестник. 1999. - №4. - С.55-57.

18. Галлеев Р.Г., Теляшев Э.Г., Хамитов Р.З. Перспективы решения экологических проблем нефтехимического комплекса Башкортостана // Башкирский экологический вестник // Экология. -1998. №3. - С.20-23.

19. Герхард Ф. Методы общей бактериологии // М.: Мир, 1990. 1-Зт.

20. Гильманов А.Ж, Галимов Ш.Н, Камилов Ф.Х, Давлетов Э.Г, Щепанский В.О. Влияние диоксинсодержащего гербицида 2,4-Д на гормональный статус экспериментальных животных // Медицина, труда и пром. экология. 1997. - №8. - С. 15-18.

21. Глазунов В.И, Магид А.Б, Теляшев Э.Г. Оценка качества атмосферного воздуха промышленного узла // Безопасность жизнедеятельности. 2004. - №8. - С.22-25.

22. Головлева JI.A, Перцова Р.Н. Полное разложение и дехлорирование 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты штаммом Nocardioides simplex ЗЕ // Докл. АН СССР. 1990. - Т.314. - №4. - С.981-983.

23. Горлатов С.Н, Мальцева О.В, Шевченко В.И, Головлева JI.A. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1989. - Т.58 - В. 5. - С.802-806.

24. Губен-Вейль И. // Методы органической химии, М.: Госхимиздат, 1963,- 1032 с.

25. Дебабов В.Г, Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов. М.: Высш. шк, 1988. -208с.

26. Дмитриенко Г.Н, Овчаров Л.Ф, Курдюк K.M., Гвоздяк П.И. Использование биотехнологии очистки сточных вод от ионов тяжелых металлов // Химия и технология воды. 1997. - Т.19. - №5. - С. 544-548.

27. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. М.: Высш. шк, 1979. -455с.

28. Ильин В.Г, Мартыненкова Л.Н, Цыпышева Л.Г, Глебов Г.А, Замилова Л.М, Кантор Л.И. Контроль качества питьевой воды на предприятии "Уфаводоканал" // Башкирский химический журнал. -1995. Т.2. - В.2. - С.8-12.

29. Имельбаева Э.А, Теплова С.Н, Камилов Ф.Х, Каюмова А.Ф. Состояние системы мононуклеарных фагоцитов при воздействииэкотоксиканта гербицида 2,4-Д // Башк. экол. вести. - 1998. - №2. -С.48-52.

30. Кантор Л.И., Цыпышева Л.Г., Мельницкий И.А. Аналитический контроль предприятий водоподготовки как фактор обеспечения качества питьевой воды // Безопасность жизнедеятельности. 2004. -№8.-С. 18-21.

31. Капранова O.A., Волченко Е.В., Федоров А.Ю., Корженевич В.И., Крестьянинов В.Ю. Генетическое детерминирование и стабильность признака биодеградации фенола и ацетофенона // Новые направления биотехнологии: Тез. докл. V конф. РФ. Пущино, 1992. -С.157.

32. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М.: Наука, 1982.- 141 с.

33. Клисенко М.А. Методы определения микроколичеств пестицидов // М.: Медицина, 1984. 256с.

34. Козловский С.А., Наумов A.B., Цой Т.В. Выделение и характеристика штаммов микроорганизмов, утилизирующих фенол // Химия и технология воды. 1993. - Т. 15. - №5. - С.383-389.

35. Козырева А.П., Финкелынтейн З.И., Шурухин Ю.В., Баскунов Б.П., Головлева Л.А. Nocardioides simplex ЗЕ деструктор хлорфеноксиалкановых кислот // Новые направления биотехнологии: Тез. докл. V конф. РФ. Пущино, 1992. - С. 158.

36. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Наумов A.B., Грищенков В.Г., Воронин A.M. Выделение и характеристика бактерий-деструкторов пестицидов // Прикл. биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ. -№3. - С.310-313.

37. Кошелева И.А., Соколов С.Л., Балашова Н.В., Воронин A.M. Генетический контроль биодеградации нафталина штаммом Pseudomonas sp.8909N II Генетика. 1997. - Т.ЗЗ. - №6. - С.762-768.

38. Красногорская H.H., Фащевская Т.Б., Девятова А.П. Оценка влияния промышленного центра на гидрохимическое качество приемника сточных вод // Безопасность жизнедеятельности. 2004. - №8. -С.26-32.

39. Красовский В.О., Мухаметшин З.А. Опыт анализа эколого-гигиенических рисков населения в условиях нефтехимического загрязнения // Башкирский экологический вестник. 2010. - №2. - С. 12-17.

40. Кудлай Д.Г., Чубуков В.Ф., Оганесян М.Г. Генетика лекарственной устойчивости бактерий. М.: Медицина, 1972. 255с.

41. Кулакова А.Н., Кулаков J1.A., Наумов A.B., Мальцева О.В., Головлева JI.A., Воронин A.M. Клонирование генов деградации фенола из штамма Pseudomonas sp.5-T // Генетика. 1992. - Т.28. -№2. - С.35^42.

42. Лабинская A.C. Микробиология с техникой микробиологических исследований // М.: Медицина, 1978. 394 с.

43. Лугаускас. А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. Описание видов микромицетов-биодеструкторов // Каталог микромицетов-биодеструкторов полимерных материалов. М.: Наука, 1987. С.72-340.

44. Майер-Боде Г. Гербициды и их остатки / Под ред. H.H. Мельникова М.: Мир, 1972.-560с.

45. Майстренко В.Н., Клюев H.A. Эколого-аналитический мониторинг стойких органических загрязнителей. Учебное пособие. М., БИНОМ, 2004. 322с.

46. Майстренко В.Н., Хамитов Р.З., Будников Г.К. Эколого-аналитический мониторинг суперэкотоксикантов. М.: Химия, 1996. -319с.

47. Мальцева О.В., Головлева Л. А. Периферийный метаболизм трансконъюгантов Pseudomonas putida, разлагающих хлор- иметилароматические соединения // Микробиология. 1990. - Т.59. -В. 1. - С.163-165.

48. Мальцева О.В., Соляникова И.Г., Головлева JI.A. Пирокатехазы штамма Rhodococcus erythropolis деструктора хлорфенолов: очистка и свойства. // Биохимия. - 1991. - Т.56. - В. 12. - С.2188-2189.

49. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // пер. с англ. под ред. A.A. Баева М.: Мир, 1984. - 480с.

50. Мельников H.H., Белан С.Р. Органические соединения хлора в окружающей среде // Агрохимия. 1998. - №10. - С.83-93.

51. Мельников H.H., Новожилов К.В., Пылова Т.Н. Справочник по пестицидам. М.: Химия, 1985. 351 с.

52. Моисеева О.В., Линько Е.В., Баскунов Б.П., Головлева JI.A. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus lcp. // Микробиология. 1999. - Т.68. - В. 4. - С.461-466.

53. Определитель бактерий Берджи. 9-ое изд. В 2-х т. Пер. с англ./Под ред. Хоулта Дж., Крига Н., Снита П., Стейли Дж., Уильямса С. М.: Мир, 1997.-800с.

54. Орехов Д.А., Картомышева О.П., Морозов О.В., Кузмичева Е.В. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в Российской Федерации // Защита и карантин растений. 1998. - № 5. -С.119-125.

55. Пашин Ю.В., Козаченко В.И., Зацепилова Т.А., Бахитова Л.М. Химические мутагены окружающей среды. М.: Наука, 1983. 140 с.

56. Плотникова Е.Г., Рыбкина Д.О., Ананьина JI.H., Ястребова О.В., Демаков В.А. Характеристика микроорганизмов, выделенных из техногенных почв Прикамья // Экология. 2006. - №4. - С. 261-268.

57. Плотникова Е.Г. Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Пермь, 2010.-48с.

58. Потапов А.И., Новиков Ю.В., Минин Т.Д., Сайфутдинов М.М. // Здравоохранение Российской Федерации. 1999.- №4. - С. 15-18.

59. Радченко О.С., Таширев А.Б. Роль сульфатвосстанавливающих бактерий в анаэробной очистке сточных вод // Химия и технология воды. 1991. - Т. 13. - № 6. - С. 456—467.

60. Румак B.C. Медико-биологические основы отдаленных медицинских последствий применения в военных целях фитотоксикантов, содержащих 2,3,7,8-ТХДД // Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. С./Пб., 1993. - 50с.

61. Сафаров М.Г. Гербициды: 2,4-Д // Соросовский образовательный журнал. 2001. - Т.7. -№9. - С. 57-62.

62. Сафарова В.И., Пиленкова И.И., Фатьянова А.Д., Юркова Р.Г., Теплова Г.И. Исследование загрязненности почв и сельскохозяйственной продукции пестицидами в товаропроизводящих хозяйствах Республики Башкортостан // Экология. 1994. - Т. 1. - В.3. - С.48-52.

63. Сафарова В.И., Шайдулина Г.Ф., Хатмуллина P.M., Фатьянова Е.В., Теплова Г.И., Шихова JI.K. Аналитический контроль органических экотоксикантов в окружающей среде // Безопасность жизнедеятельности. 2004. - №8. - С.37-40.

64. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus. М.: Изд-во МГУ, 1984. 26с.

65. Скрябин Г. К., Головлева JI. А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: Наука, 1976. 334с.

66. Соколов В.Е., Клюев H.A., Бродский Е.С., Тху Ч.С., Нет Н.С. "Первичное" и "вторичное" диоксиновое загрязнение Южного Вьетнама // Докл. АН СССР. 1996. - Т.351. - №6. - С.847-849.

67. Соляникова И.П., Головлева Л.А. Фенол гидроксилазы: современное состояние вопроса // Биохимия. 1999. - Т.64. - В. 4. - С.437—446.

68. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии // под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1976. - 307с.

69. Федоров Л.А. Диалог о диоксинах // Химия и жизнь. 1990. -№11.1. C. 19-23.

70. Хазиев Ф.Х., Багаутдинов Ф.Я., Сахабутдинова А.З. Экотоксиканты в почвах Башкортостана. Уфа: Гилем, 2000. 60с.

71. Харлампович Г.Д., Чуркин Ю.В. Фенолы. М.: Химия, 1974. 376с.

72. Хизбуллин Ф.Ф. Диоксины в жизненном цикле хлорорганических химических продуктов. Уфа, 2005. 179 с.

73. Хизбуллин Ф.Ф., Чернова Л.Н., Хасанова И.Р., Майстренко В.Н. Полихлорированные дибензо-n-диоксины и дибензофураны. Источники эмиссии и поступление в окружающую среду // Башк. экол. вестн.- 1998.-№1.-С.31-38.

74. Хизбуллин Ф.Ф., Эстрина Г.Я., Мавродиева H.H., Хазиев Ф.Х., Круглова Э.Я., Амирова З.К. Загрязненность сельскохозяйственных ландшафтов Башкортостана гербицидом 2,4-Д и диоксинами // Медицина труда и пром. экология. 1997. - №8. - С.26-31.

75. Хизбуллин Ф.Ф., Даутов И.В., Шамсутдинова Л.Р., Алябьева H.H. Проблема санации территории ОАО «Уфахимпром»: текущее состояние и способы решения // Башкирский экологический вестник. -2011. -№ 1.-С. 15-23.

76. Цыпышева Л.Г., Кантор Л.И. Система аналитического контроля за содержанием органических загрязнителей в воде на предприятии «Уфаводоканал» // Безопасность жизнедеятельности. 2004. - №8. -С.33-37.

77. Цырлов И.Б. Хлорированные диоксины. Биологические и медицинские аспекты: Аналитический обзор. Новосибирск, 1990. -210с.

78. Шамсутдинова Jl.Р., Рыбина А.В., Карнаухов Ю.А., Головачев Н.В., Хизбуллин Ф.Ф. Загрязнение почв территории ОАО «Уфахимпром» // Башкирский экологический вестник. 2010. -№ 1. - С. 31-35.

79. Шамхалов Ф.И. Экономическая энциклопедия регионов России. Республика Башкортостан. М.:Экономика, 2004. 391с.

80. Экологическая биотехнология / Под ред. К.Ф. Форстера, Дж.Д.А. Вейза. -Л.: Химия, 1990. 384 с.

81. Ягафарова Г.Г., Хлесткин Р.Н. Биопрепарат для снижения загрязнения воды и почвы гербицидом 2,4-Д // Экология. 1994. -Т.1.-В. 3. - С.46-47.

82. Ягафарова Г.Г., Хлесткин Р.Н., Рябинина Т.А., Стелькощикова Т.М. Способ очистки сточных вод от фенольных соединений // Авторское свидетельство СССР 1597384. 1990.

83. Aaij С., Borst P. The gel electrophoresis of DNA // Biochim. Biophys. Acta. 1972. - V.269. - №1. - P. 192.

84. Abraham W.-R., Wenderoth D.F., GlâBer W. Diversity of biphenyl degaders in a chlorobenzene polluted aquifer //Chemosphere. 2005. -V.58.-P. 529-533.

85. Agarry S.E., Solomon, B.O., Layokun, S.K. Optimization of process variables for the microbial degradation of phenol by Pseudomonasaeruginosa using response surface methodology // African Journal of Biotechnology. 2008. - V. 7. - № 14. - P. 2409-2416.

86. Ahamad A., Kunhi A.A. Enhanced degradation of phenol by Pseudomonas sp. CP4 entrapped in agar and calcium alginate beads in batch and continuous processes // Biodégradation. 2011. - V.22. - №2.- P.253-265.

87. Ahmed A.M., Nakhla G.F., Farooq S. Phenol degradation by Pseudomonas aeruginosa //Journal of Environmental Science and Health.- Part A Environmental Science and Engineering. 1995. - V.30. - №1. -P. 99-107.

88. Amer S.M., Ali E.M. Cytological effects of pesticides. II. Meiotic effectsof some phenols // Cytologia. 1968. - V.33. - №1. - P.21-33.

89. Andretta, C.W.S.a , Rosa, R.M.a ,Tondo, E.C.b ,Gaylarde, C.C.a ,

90. Henriques, J.A.P.a Identification and molecular characterization of a Bacillus subtilis IS 13 strain involved in the biodégradation of 4,5,6-trichloroguaiacol // Chemosphere. 2004. - V. 55. - № 4. - P.631-639.

91. Apajalahti J.H.A., Kârpânoja P., Salkinoja-Salonen M.S. Rhodoccocus chlorophenolicus sp. nov., a chlorophenol-mineralizing actinomycete // Int. J. Syst. Bacteriol. 1986. - V.36. - P.246-251.

92. Apajalahti J.H.A., Salkinoja-Salonen M.S. Degradation of chlorophenols by Rhodococcus chlorophenolicus II Appl. Microbiol. Biotechnol. 1986. -№25. - P.62-67.

93. Arai H., Akahira S., Ohishi T., Maeda M., Kudo T. Adaptation of Comamonas testosteroni TA441 to utilize phenol: organization andregulation of the genes involved in phenol degradation // Microbiology. -1998. V. 144. - P.2895-2903.

94. Arutchelvan V., Kanakasabai V., Elangovan R., Nagarajan S., Muralikrishnan V. Kinetics of high strength phenol degradation using Bacillus brevis II Journal of Hazardous Materials. 2006. - V.129. -P.216-222.

95. Assinder S.J., Williams P.A. The TOL plasmids: determinants of the catabolism of toluene and xylenes // Adv. Microbiol. Physiol. 1990. -V.31. -P.1-69.

96. Atlas R.M. Limitations to microbial degradation of environmental pollutants: reasons for persistence and the potential role of biotechnology // Microb. Technol. to Overcome Environ. Probl. Persist. Pollut. 1987. -P.39-46.

97. Babbit B., Risch S., Choffnes E., Kalis J., Zupanic M., Boody G., Benson D., Spier S., Kleese R., Wickstrom J. Effects of 2,4,5-T on human chromosomes // Genetics. 1973. - V.71. - P.3.

98. Backman A., Jansson J.K. Degradation of 4-Chlorophenol at low temperature and during extreme temperature fluctuations by Arthrobacter chlorophenolicus A6 // Microbial Ecology. 2004. - V.48. - P. 246-253.

99. Bae H.S., Lee J.M., Lee S.-T. Biodégradation of 4-chlorophenol via a hydroquinone pathway by Arthrobacter ureafaciens CPR706. FEMS Microbiology Letters. 1996. -V. 145. - P. 125-129.

100. Bae H.S., Lee J.M., Lee S.-T. Biodégradation of the mixture of 2,4,6-trichlorophenol, 4-chlorophenol, and phenol by a defined nixed culture // Journal of General and Applied Microbiology. 1997. - V.43. - P.97-103.

101. Bak F., Widdel F. Anaerobic degradation of phenol and phenol derivatives by Desulfobacterium phenolicum sp. nov. // Arch. Microbiol. 1986.-V.146. P. 177-180.

102. Balajee S, Mahadevan A. Influence of chloroaromatic substances on the biological activity of Azotobacter chroococcum II Chemosphere. 1990. -V.21.-№1-2.-P.51-56.

103. Bamberger E.S. The effect of plant growth regulators on DNA // Phitochemistry. 1971. - V. 10. - P.957-966.

104. Bamberger E.S, Sharabani M. The effect of plant growth regulators on DNA // Israel J. Chem. 1969. - V.7. - P. 122.

105. Banerjee A, Ghoshal K. Isolation and characterization of hyper phenol tolerant Bacillus sp. from oil refinery and exploration sites // Journal of Hazardous Materials. 2010. - V.176. - P.85-91.

106. Bartilson M. and Shingler V. Nucleotide sequence and expression of the catechol 2,3-dioxygenase-encoding gene of phenol-catabolizing Pseudomonas CF600 // Gene. 1989. - V.85. - P.233-238.

107. Bathe S, Mohan T.V, Wuertz S, Hausner M. Bioaugmentation of a sequencing batch biofilm reactor by horizontal gene transfer // Water Sci. Technol. 2004. - V.49. - № 11—12. - P.337-344.

108. Beadle C.A, Smith A.R. The purification and properties of 2,4-dichlorphenol hydroxylase from a strain of Acinetobacter species. // Eur. J. Biochem. 1982. - V. 123. - P.323-332.

109. Bergey's manual of systematic bacteriology // The Williams & Wilkins Co. Baltimore. 1986.- V.2. - P. 1104-1141.

110. Biakley B.R., Gagnon J.M., Rousseaux C.G. The effect of a commercial 2,4-D formulation on chemical- and viral-induced tumor production in mice // J. Appl. Toxicol. 1992. - V.12. - №4. - P.245-249.

111. Bielefeldt A.R., Cort T. Dual substrate biodégradation of a nonionic surfactant and pentachlorophenol by Sphingomonas chlorophenolica RA2 // Biotechnol. Bioeng. 2005. - V.89. - P.680-689.

112. Bohacova V., Godocikova J., Polek B. Biodégradation of phenol substances by pure and mixed culture // Biologia. 2001. - V.56. - № 3. - P.263-269.

113. Bollag J.-M., Helling C.S., Alexander M. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols // J. Agr. Food Chem. 1968. -V.16. -P.826-828.

114. Bradley M.V., Crane J.C., Marel N. Some histological effects of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid applied to mature apricot leaves // Bot. Gaz. -1968.-V.129.-P.231-238.

115. Beadle C.A., Smith A.R.W. The purification and properties of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from a strain of Acinetobacter species // Eur. J. Biochem. 1982. - V.123. - P.323-332.

116. Briglia M., Eggen R.I.L., de Vos W.M., van Elsas J.D. Rapid and sensitive method for the detection of Mycobacterium chlorophenolicum PCP-1 in soil based on 16S rRNA gene-targeted PCR // Appl. Environ. Microbiol. 1996. -V.62. №4. - P. 1478-1480.

117. Briglia M., Rainey F.A., Stackebrandt E., Schraa G., Salkinoja-Salonen M.S. Rhodococcus percolatus sp. nov., a bacterium degrading 2,4,6-trichlorophenol // Int. J. Syst. Bacteriol. 1996. - V.46. - №1. - P.23-30.

118. Cai M., Xun L. Organization and regulation of pentachlorophenol-degrading genes in Sphingobium chlorophenolicum ATCC 39723 // J. Bacteriol. 2002. - V.184. - P.4672^1680.

119. Chandra R., Ghosh A., Kumar R., Singh S. Isolation and characterization oftwo potential pentachlorophenol degrading aerobic bacteria from pulp paper effluent sludge // J. Gen. Appl. Microbiol. 2006. - V.52. - P. 125130.

120. Chatterjee D.K., Bourquin A.W. Metabolism of aromatic compounds by Caulobacter crescentus II J. Bacteriol. 1987. - V.169. - №5. - P. 19931996.

121. Chaudhry G.R., Huang G.H. Isolation and characterization of a new plasmid from a Flavobacterium sp. which carries the genes for degradation of 2.4- dichlorophenoxyacetate // J. Bacteriol. 1988. -V.170. - P.3897-3902.

122. Chebotar' N.A., Grebenik L.A., Kirilenko A.I. Effect of stress (immobilization) on embryotoxic and teratogenic effect of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid and its derivatives // Arkh.Anat.Gistol.Embriol. -1978. V.75. - №8. - P.30-36.

123. Chen W., Bruhlmann F., Richins R. D., Mulchandani A. Engineering of improved microbes and enzymes for bioremediation // Current Opinion in Biotechnology. 1999. -№10. -P.137-141.

124. Chen W., Mulchandani A. The use of live biocatalysts for pesticide detoxification // Trends in Biotechnology. 1998. - V.16. - №2. - P.71-76.

125. Chen Y.-M., Lin, T.-F., Huang, C., Lin, J.-C. Cometabolic degradation kinetics of TCE and phenol by Pseudomonas putida II Chemosphere. -2008. V.72. -№ 11. -P.1671-1680.

126. Clement P., Matus V., Cardenas L., Gonzales B. Degradation of trichlorophenols by Alcaligenes eutrophus JMP134 // FEMS Microbiol. Lett. 1995. - V.127. - №1-2. - P.51-55.

127. Coenye T., Henry D., Speert D.P., Vandamme P. Burkholderia phenoliruptrix sp. nov., to accommodate the 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid and halophenol-degrading strain AC 1100 // Syst. Appl. Microbiol. -2004. V.27. - № 6. - P.623-627.

128. Colores G.M., Radehaus P.M., Schmidt S.K. Use of a pentachlorophenol degrading bacterium to bioremediate highly contaminated soil // Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. - V.54. - P.271-275.

129. Croker B.H. Effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on mitosis in Allium cepa // Bot. Gaz. 1953. - V.l 14. - P.274-283.

130. Crutescu R., Ungureanu C., Vasilescu, P. Biodégradation of phenols by a pure bacteria of Pseudomonas putida and by a mixed culture of pseudomonas various // Revista de Chimie. 2008. - V. 59. - № 4. -P.434-439.

131. Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms // Adv. Microbiol. Physiol. 1971. - V.6. - P. 1-76.

132. Dai M., Copley S.D. Genome shuffling improves degradation of the anthropogenic pesticide pentachlorophenol by Sphingobium chlorophenolicum ATCC 39723 // Appl. Environ. Microbiol. 2004.1. V.70. P.2391-2397.

133. Dai M., Rogers J.B., Warner J.R., Copley S.D. A previously unrecognized step in pentachlorophenol degradation in Sphingobium chlorophenolicum is catalyzed by tetrachlorobenzoquinone reductase (PcpD) // J. Bacteriol. 2003. - V. 185. - P.302-310.

134. Davring L., Hultgren K. Cytogenetic effects on in vivo bone-marrow cells of Mus musculus induced by a commercial 2,4,5-T ester product // Hereditas. -1977. V.85. - P.123-134.

135. Davring L., Sunner M. Cytogenetic effects of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid on oogenesis and early emryogenesis in Drosophila melanogaster II Hereditas. 1971. - V.68. - №1. - P.115-122.

136. Dean B.J. Genetic toxicology of benzene, toluene, xylene and phenols // Mutat. Res. 1978. - V.47. - №2. - P.75-97.

137. Deppenmeier U., Hoffmeister M., Prust C. Biochemistry and biotechnological applications of Gluconobacter strains // Appl Microbiol. Biotechnol. 2002. - V. 60(3). - P.233-242.

138. Dev K. Effects of some herbicides on the structure and behavior of plant chromosomes // Proc. Indian Sci. Congr. 1973. - V.60. - P.308.

139. Dietrich G., Winter J. Anaerobic degradation of chlorphenol by an enrichment culture // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1990. - №2. -P.253-258.

140. Don R.H., Pemberton J.M. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus //J. Bacteriol. 1981. - V. 145. -P.681-686.

141. Don R.H., Weightman A.J. Transposon mutagenesis and cloning analysis of the pathways for degradation of 2.4-dichlorophenoxyacetic acid and 3-chlorobenzoate in Alcaligenes eutrophus JMP134 (pJP4) // J. Bacteriol. -1985. V.161. -P.85-90.

142. Ederer M.M., Crawford R.L., Herwig R.P., Orser C.S. PCP degradation is mediated by closely related strains of the genus Sphingomonas II Mol. Ecol. 1997. - V.6. - P.39-49.

143. Edwards U., Rogall T., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA //Nucl. Acids. Res. 1989.-V.17.-P.7843-7853.

144. Farrell A., Quilty B. Degradation of monochlorophenols by a mixed microbial community via a meta-cleavage pathway // Biodégradation. -1999. V. 10. - №5. - P.353-362.

145. Fava F., Armenante P.M., Kafkewitz D. Aerobic degradation and dechlorination of 2-chlorophenol, 3-chlorophenol and 4-chlorophenol by a Pseudomonas pickettii strain // Lett. Appl. Microbiol. 1995. - V.21. -P.307-312.

146. Fetzner S., Lingens F. Bacterial dehalogeriases: biochemistry, genetics, and biotechnological applications // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1994. -№58(4).-P.641-685.

147. Crystallographica. -2003. V. 59. - P. 188-190.

148. Fisher P.R., Appleton J., Pemberton J.M. Isolation and characterisation of pesticide degrading plasmid pJPl, from Alcaligenes paradoxus II J. Bacteriol. 1978. - V.135. - P.798-804.

149. Fleming J.T., Yao W.-H., Sayler G.S. Optimization of differential display of prokaryotic mRNA: application to pure culture and soil microcosms // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - №.64. - P.3698-3706.

150. Foster L.J.R., Kwan B.H., Vancov T. Microbial degradation of the organophosphate pesticide, Ethion // FEMS Microbiology Letters. 2004. - V.240. - P.49-53.

151. Friedrich B., Meyer M., Schlegel H.G. Transfer and expression of the herbicide-degrading plasmid pJP4 in aerobic autotrophic bacteria // Arch. Microbiol. 1983. - V.134. - P.92-97.

152. Fulthorpe R.R., McGowan C., Maltseva O.V., Holben W.E., Tiedje. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria are mosaics of catabolic genes // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V.61. - P.3274-3281.

153. Furukawa K., Chakrabarty A.M. Involvement of plasmids in total degradation of chlorinated biphenyls // Appl. Environ. Microbiol. 1982. -V.44.-P.619-622.

154. Gaal A., Neujahr H.Y. Metabolism of phenol and resorcinol in Trichosporon cutaneum II J. Bacteriol. 1979. - V.137. - P.13-2127.

155. Ghosal D., You I.S. Gene duplication in haloaromatic degradative plasmids pJP4 and pJP2 // Can. J. Microbiol. 1988. - V.34. - P.709-715.

156. Ghosal D., You I.S., Chakrabarty A.M. Microbial degradation of halogenated compounds // Science. 1985. - V.228. - №4696. - P. 135228.

157. Ghosal D., You I.S., Chatterjee D.K., Chakrabarty A.M. Plasmids in the degradation of chlorinated aromatic compounds // New York Plenum Press. 1985.-P.667-686.

158. Gibson D.T, Parales R.E. Aromatic hydrocarbon dioxygenases in environmental biotechnology // Current Opinion in Biotechnology. -2000. -№11. -P.236-243.

159. Gibson S.A., Suflita J.M. Anaerobic biodégradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid in samples from a methanogenic aquifer: stimulation by short-chain organic acids and alcohols // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V.56. - P. 1825-1832.

160. Giulietti A.M., Silva H.J. Influence of sludge adaptation on biodégradation of phenol. // MIRCEN Journal. 1989. - V.5. - №3. -P.343-348.

161. Godson G.N., Vapnek D. A simple method of preparing large amounts of (j>Xl74 RFI supercoiled DNA // Biochim.Biophys. Acta. 1967. - V.9. -P.516.

162. Golovleva L.A., Pertsova R.N, Evtushenko L.I., Baskunov B.P. Degradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a Nocardioides simplex culture // Biodégradation. 1990. - V.l. - №4. - P.263-271.

163. Golovleva L.A, Zaborina O, Pertsova R, Baskunov B, Schurukhin J, Kuzmin S. Degradation of poly chlorinated phenols by Streptomyces rochei 303 // Biodegradation. 1992. - V.2. - P.201-208.

164. Gosselin R.E, Smith R.P, Hodge H.C. Clinical Toxicology of Commercial Products. 5th ed. Baltimore: Williams and Wilkins. 1984. -P. 130.

165. Goswami M, Shivaraman N, Singh R.P. Microbial metabolism of 2-chlorophenol, phenol and p-cresol by Rhodococcus erytropolis Ml in coculture with Pseudomonas fluorescens PI // Microbiological Research. -2005.-V.160.-P. 101-109.

166. Gouda M.K. Immobilization of Rhodococcus sp. DG for efficient degradation of phenol // Fresenius Environmental Bulletin. 2007. -V. 16(12 B). - P. 1655-1661.

167. Grishehenkov V, Slepen'kin A, Boronin, A. Anaerobic degradation of biphenyl by the facultative anaerobic strain Citrobacter freundii BS2211 // Applied Biochemistry and Microbiology. 2002. - V.38. - P.125-128.

168. Gunther K, Schlosser D, Fritsche W. Phenol and cresol metabolism in Bacillus pumilis isolated from contaminated groundwater // J. Basic. Microbiol. 1995. - V.35. - № 2. - P.83-92.

169. Gupta A, Singh V.K, Qazi G.N, Kumar A. Gluconobacter oxydans: its biotechnological applications // J Mol Microbiol Biotechnol. 2001. - V. 3(3). - P.445-56.

170. Gurujeyalakshmi G, Oriel P. Isolation of phenol degrading Bacillus stearothermophilus II Appl. Envir. Microbiol. 1989. - V.55. - P.500-502.

171. Hadorn E, Niggli H. Mutations in Drosophila after chemical treatment of gonads in vitro //Nature (London). 1946. - V.157. - P. 162-163.

172. Haigler B.E., Pettigrew C.A., Spain J.C. Biodégradation of mixtures of substituted benzenes by Pseudomonas sp. strain JS150 // Appl. Envir. Microbiol. 1992. - V.58. - №7. - P.2237-2244.

173. Harker R.A., Young K. Trichloroethylene degradation by two independent aromatic degrading pathways in Alcaligenes eutrophus JMP 134 // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - V.56. - №4. - P.1179-1181.

174. Harwood C.S., Gibson J. Anaerobic and aerobic metabolism of diverse aromatic compounds by the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris II Appl. Environ. Microbiol. 1988. - V.54. - P.712-717.

175. Haugland R.A., Schlemm D.J., Lyons R.P., Sferra P.R., Chakrabarty A.M. Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-D and 2,4,5-T by pure and mixed bacterial culture // Appl. Envir. Microbiol. -1990. V.56. - №5. - P.1357-1362.

176. Head I.M., Cain R.B., Suett D.L. Molecular aspects of enhanced microbial degradation of pesticides // Brighton crop protection conference. Pests and Diseases. 1990. - V.3. - P.907-916.

177. Heesche-Wagner K., Schwarz T., Kaufmann M. Phenol degradation by anenterobacterium: A Klebsiella strain carries a TOL-like plasmid and a gene encoding a novel phenol hydroxylase // Canadian Journal of Microbiology. -1999. Vol. 45. - №.2. - P. 162-171.

178. Hejazi A., Falkiner F.R. Serratia marcescens. // J. Med Microbiol. 1997.1. V.46. P.903-912.

179. Hensel J., Straube G. Physiology of phenol degradation with Rhodococcus spec. Pl. Part 1: relations between growth and phenol degradation // Act. Hydrochim. et Hydrobiol. 1983. - V.l 1. - №6. - P.637-645.

180. Heritage A.D., MacRae I.C. Identification of intermediates formed during the degradation of hexachlorocyclohexanes by Clostridium sphenoides II Appl. Environ. Microbiol. 1977. - №.33. - P. 1295-1297.

181. Herbert B.N., Gilfert P.D., Stockdale H., Walkinson R.J. Factors controlling the activity of sulfate-reducing bacteria in reservoirs during water injection. Offshore Eur. 85 Conf. Kingston-upon-Thames - 1985. -V.1.-P.1-10.

182. Herrera Y., Okoh A.I., Alvarez L., Robledo N., Trejo-Hernandez M.R. Biodégradation of 2,4-dichlorophenol by a Bacillus consortium // World J. Microbiol. Biotechnol. 2008. - V.24. - P.55-60.

183. Herrmann H., Muller C., Schmidt I., Mahnke J., Petruchka L., Hahnke K. Localization and organization of phenol degradation genes of Pseudomonas putida strain H // Mol. Gen. Genet. 1995. - V.247. - №2. - P.240-246.

184. Hofrichter M., Gunter T., Fritsche W. Metabolism of phenol, chloro- and nitrophenols by the Pénicillium strain Bi7/2 isolated from contaminated soil // Biodégradation. 1993. - V.3. - P.415-422.

185. Horvath R.S. Microbial cometabolism of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. 1970. - V.5. - P.537-541.

186. Hu X., Fukutani A., Liu X., Kimbara K., Kawai F. Isolation of bacteria able to grow on both polyethylene glycol (PEG) and polypropylene glycol (PPG) and their PEG/PPG dehydrogenases // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V. 73. - P.1407-1413.

187. Hou C.N., Patel R., Lillard M.O. Extradiol cleavage of 3-methylcatechol by catechol 1,2-dioxygenase from various microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. 1977. - V.33. - P.725-727.

188. Huong N.L., Itoh K., Suyama K. Diversity of 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-Trichlorophenoxyacetic acid Degrading bacteria in Vietnamese Soils // Microbes Environ. - 2007. - V. 22. - №3. - P. 243-256.

189. Janke D., Ilin W., Tresselt D. Critical steps in degradation of chloroaromatics by rhodococci // J. Basic Microbiol. 1989. - V.29. -№5. - P.305-314.

190. Ka J.O., Holben W.E., Tiedje J.M. Genetic and phenotypic diversity of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) -degrading bacteria isolated from 2,4-D-treated field soils // Appl. Envir. Microbiol. 1994. - V.60. - №4. — P.l 106—1115.

191. Kaioumova D., Susal C., Opeiz G. Induction of apoptosis in human lymphocytes by the herbicide 2,4-dichlolrophenoxyacetic acid // Human Immunology. 2001. - V.62. - №1. - P.64-74.

192. Kao C.M., Chai C.T., Liu J.K., Yeh T.Y., Chen K.F., Chen S.C. Evaluation of natural and enhanced PCP biodégradation at a former pesticide manufacturing plant // Water. Res. 2004. - V.38. - P.663-672.

193. Kaphammer B., Olsen R.N. Cloning and characterization of tfdS, the repressor-activator gene of tfdB, from the 2,4-D catabolic plasmid pJP4 // J. Bacterid. 1990. - V.172. - №10. - P.5856-5862.

194. Kar S., Swaminathan T., Baradarajan A. Biodégradation of phenol and cresol isomer mixtures by Arthrobacter II World Journal of Microbiology & Biotechnology. 1997. - V.13. -P.659-663.

195. Karigar Ch., Mahesh A., Nagenahali M., Yun D.J. Phenol degradation by immobilized cell of Arthrobacter citreus II Biodégradation. 2006. -V.17. - P.47-55.

196. Karlson U., Rojo F., Van Elsas J.D., Moore E. Genetic and serological evidence for the recognition of four pentachlorophenol-degrading bacterial strains as a species of the genus Sphingomonas II System. Appl. Microbiol. -1995. V.18. - P.539-548.

197. Karns J.S., Duttagupta S., Chakrabarty A.M. Metabolism of Halophenols by 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid-degrading Pseudomonas cepacia II Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V.46. - №5. - P. 1176-1181.

198. Karns J.S., Duttagupta S., Chakrabarty A.M. Regulation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid and chlorphenol metabolism in Pseudomonas cepacia AC 1100 // Appl. Environ. Microbiol. 1983. - V.46. - №5. -P. 1182-1186.

199. Kasberg T., Daubaras D.L., Chakrabarty A.M., Kinzelt D., Reineke W. Evidence that opérons tcb, tfd, and clc encode maleylacetate reductase, the fourth enzyme of the modified ortho pathway // J. Bacteriol. 1995. -VAll. - P.3885-3889.

200. Katayama-Hirayama K., Tobita S., Hirayma K. Degradation of phenol by yeast Rhodotorula H J .Gen. Appl. Microbiol. 1991. - V.37. - P. 147156.

201. Katsivela E., Moore E.R.B., Kalogerakis N. Biodegradation of Aliphatic and Aromatic Hydrocarbons: Specificity among Bacteria Isolated from Refinery Waste Sludge // Water, Air, & Soil Pollution: Focus. 2003. -V.3. - №3. -P. 103-115.

202. Khleifat K.M., Shawabkeh R., Al-Majali I., Tarawneh K. Biodegradation kinetics of phenol by Klebsiella oxytoca: Effect of carbon and nitrogen source // Fresenius Environmental Bulletin. 2007. - V.16. - №.5. -P.489-494.

203. Kilbane J.J., Chatterjee D.K., Karns J.S., Kellogg S.T. Chakrabarty A.M. Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid by a pure culture of Pseudomonas cepacia II Appl. and Environ. Microbiol. 1982. - V.44. -№1. -P.72-78.

204. Kilpi S., Backström V., Korhola M. Degradation of 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), benzoic acid and salicylic acid by Pseudomonas sp. HV3 // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - V.8. - P. 177-182.

205. Kim I.C., Oriel P.J. Characterization of the Bacillus stearothermophilus BR219 Phenol Hydroxylase Gene // Applied and Environmental Microbiology. 1995. - V.61. -№4. - P. 1252-1256.

206. Kim K.K., Lee K.C., Oh H.M., Kim M.J., Eom M.K., Lee J.S. Arthrobacter defluvii sp. nov., 4-chlorophenol-degrading bacteria isolated from sewage // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2008. - V.58. - P.1916-1921.

207. Kim C., Patrick J. Characterization of the Bacillus stearothermophilus BR219 Phenol Hydroxylase Gene. Applied and Environmental Microbiology. -1995. P.1252-1256.

208. Kirchner U., Westphal A.H., Müller R., van Berkel W.J.H. Phenol hydroxylase from Bacillus thermoglucosidasius A7, a two-protein component monooxygenase with a dual role for FAD // J. Biol. Chem. -2003. V.278. - №48. - P.47545^17553.

209. Kivisaar M.A., Habicht J.K., Heinaru A.L. Degradation of phenol and m-toluate in Pseudomonas sp. strain EST 1001 and its Pseudomonas putida transconjugants is determined by a multiplasmid system // J. Bacteriol. -1989. V.171. -№9. -P.5111-5116.

210. Klages U., Markus A., Lingens F. Degradation of 4-chlorophenylacetic acid by a Pseudomonas species. // J. Bacteriol. 1981. -V. - 146. - P.64-68.

211. Knackmuss HJ., Hellwig M. Utilization and cooxidation of chlorinated phenols by Pseudomonas sp. ВІЗ // Arch. Microbiol. 1978. - V.117. -№1. - P. 1-7.

212. Kotresha D., Vidyasagar G.M. Isolation and characterisation of phenol-degrading Pseudomonas aeruginosa MTCC 4996 // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2008. - V. 24. - № 4. - P.541-547.

213. Kotturi G., Robinson C.W., Inniss W.E. Phenol degradation by a psychrotrophic strain of Pseudomonas putida II Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1991. - V.34. - P.539-543.

214. Krieger R.I. Pesticide exposure assessment // Toxicol. Lett. 1995. -V.82-83. - P.65-72.

215. Krug M., Ziegler H., Straube G. Degradation of phenolic compounds by the yeast Candida tropicalis HP15 // J. Basic Microbiol. 1985. - V.25. -№2. - P.103-110.

216. Kukor J.J., Olsen R.H. Complete nucleotide sequence of tbuD, the gene encoding phenol/cresol hydroxylase from Pseudomonas pickettii PKOl, and functional analysis of the encoded enzyme // J. Bacteriol. 1992. -V. 174. -P.6518-6526.

217. Kukor J.J., Olsen R.H., Slak J.S. Recruitment of chromosomally encoded maleylacetate reductase for degradation of 2,4-D by plasmid pJP4 // J. Bacteriol. 1989. - V.171. -№6. -P.3385-3390.

218. Kurzbaum E., Kirzhner F., Sela S., Zimmels Y., Armon R. Efficiency of phenol biodégradation by planktonic Pseudomonas pseudoalcaligenes (a constructed wetland isolate) vs. root and gravel biofilm // Water Res. -2010. V.44. - №.17. - P.5021-5031.

219. Kushner S.R. An improved method for transformation of E.coli with ColEI-derived plasmids // Genetic engineering / Eds. H.B. Boyer and S. Nicosia. Elsevier; North-Holland: Amsterdam. 1978. - P. 17.

220. Kwon S.W., Kim J.S., Park I.C., Yoon S.H, Park D.H., Lim C.K., Go S.J. Pseudomonas koreensis sp. nov., Pseudomonas umsongensis sp. nov. and

221. Pseudomonas jinjuensis sp. nov, novel species from farm soils in Korea // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2003. - V.53. - P.21-27.

222. Lang E. Diversity of bacterial capabilites in utilizing alkylated benzenes and other aromatic compounds // Lett. Appl. Microbiol. 1996. - V.23. -№4. - P.257-260.

223. Lange C.C, Schneider B.J, Orser C.S. Verification of the role of PCP 4-monooxygenase in chlorine elimination from pentachlorophenol by Flavobacterium sp. strain ATCC 39723 // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996,- V.219. - P.146-149.

224. Lechner U, Baumbach R, Becker D, Kitunen V, Auling G, Salkinoja-Salonen M. Degradation of 4-chloro-2-methylphenol by an activated sludge isolate and its taxonomic description // Biodegradation. 1995. -V.6. - №2. - P.83-92.

225. Ledger T, Pieper D. H, Gonzalez B. Chlorophenol Hydroxylases Encoded by Plasmid pJP4 Differentially Contribute to

226. Chlorophenoxyacetic Acid Degradation // Applied and environmental microbiology. 2006. - V. 72. - №4. - P. 2783-2792.

227. Leung K.T., Cassidy M.B., Shaw K.W., Lee H., Trevors J.T., LohmeierVogel E.M., Vogel H.J. Pentachlorophenol biodégradation by Pseudomonas spp. UG25 and UG30 // World. J. Microbiol. Biotechnol. -1997.-V.13.-P.305-313.

228. Li D.-Y., Eberspacher J., Wagner B., Kuntzer J., Lingens F. Degradation of 2,4,6-trichlorophenol by Azotobacter sp. strain GP1 // Appl. Environ. Microbiol. 1991. - V.57. - №7. - P. 1920-1928.

229. Li S., Chen Z., Qiu L., Wu J., Lai Z. Isolation and identification of Bacillus cereus strain Jp-A and its capability in phenol degradation // Chinese Journal of Applied Ecology. 2006. - V. 17. - № 5. - P.920-924.

230. Li Y, Li J, Wang C, Wang P. Growth kinetics and phenol biodégradation of psychrotrophic Pseudomonas putida LY1 // Bioresour Technol. 2010. - V. 101. - №. 17. - P.6740-6744.

231. Limbert E.S.B., Betts W.B. Influences of substrate chemistry and microbial metabolic diversity on the bioremediation of xenobiotic contamination // Genet. Eng. and Biotechnol. 1996. - V.16. - №3. -P. 159-180.

232. Lin J., Reddy M., Moorthi V., Qoma B.E. Bacterial removal of toxic phenols from an industrial effluent // African Journal of Biotechnology. -2008. V.7. - №13. - P.2232-2238.

233. Lin, J.E., Wang H.Y. Degradation of pentachlorophenol by non-immobilized, immobilized and co-immobilized Arthrobacter cells // Journal of Fermentation and Bioengineering. 1991. - V.72. - №4. -P.311-314.

234. MacLeod R.D. Some effect of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid on the mitotic cycle of lateral root apical meristems of Vicia faba II Chromosoma. -1969. V.27. - P.327-337.

235. Madsen T., Licht. D. Isolation and characterization of an anaerobic chlorphenol-transforming bacterium // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V.58. - №9. - P.2874-2878.

236. Mae A.A., Mairs R.O., Ausmees N.R., Koiv V. M., Heinaru A.L. Characterization of a new 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degrading plasmid pEST4011: physical map and localization of catabolic genes // J. Gen. Microbiol. 1993. - V. 139. - P.3165-3170.

237. Majumdar S.K., Hall R.C. Cytogenetic effects of 2,4,5-T on in vivo bone marrow cells of mongolian gerblis // J. Hered. 1973. - V.64. - P.213 -216.

238. Maltseva O., McGowan C., Fulthorpe R. Degradation of 2.4-dichlorphenoxyacetic acid by haloalkaliphilic bacteria // Microbiology. -1996. V. 142. - №5. - P. 1115-1122.

239. Mandel M., Higa A. Calcium dependent bacteriophage DNA infection // J. Mol. Biol. 1970. - V.53. - P.154.

240. Maniatis T., Jeffery A., Kleid D.G. Nucleotide sequence of the rightward operator of phage X II Proc. Natl. Acad. Sci. 1975. - V.72. - №3. -P. 1184.

241. Mannisto M.K., Tiirola M.A., Salkinoja-Salonen M.S., Kulomaa M.S., Puhakka J.A. Diversity of chlorophenol-degrading bacteria isolated from contaminated boreal groundwater // Arch. Microbiol. 1999. - V.171. -№3.-P. 189-197.

242. Marc A. Deshusses Biological waste air treatment in biofilters // Current Opinion in Biotechnology. 1997. - №8. - P.335-339.

243. Margesin R., Fonteyne P.-A., Redi B. Low-Temperature biodegradation of high amounts of phenol by Rhodococcus spp. and basidiomycetous yests // Research in Microbiology. 2005. - V.156. - P.68-75.

244. Markus A., Klages U., Krauss S., Lingens F. Oxidation and dehalogenation of 4-chlorophenolacetate by a two-component enzyme system from Pseudomonas sp. strain CBS3 // J. Bacteriol. 1984. -V.160. -P.618 - 621.

245. Marr J., Kremer S., Sterner O., Anke H. Transformation and mineralization of halophenols by Penicillium simplicissimum SK9117 // Biodegradation. 1996. - V.7. - №2. - P. 165-171.

246. Martinez M., Baeza J., Freer J., Rodriguez J. Chlorophenol tolerant and degradative bacteria isolated from a river receiving pulp mill discharges // Toxicological and Environmental Chemistry. 2000. - V.77. - P. 159170.

247. Massé R., Messier F., Péloquin L., Ayotte C., Sylvestre M. Microbial biodegradation of 4-chlorobiphenyl, a model compound of chlorinated biphenyls // Appl. Environ. Microbiol. 1984. - P.947-951.

248. Matheson V.G., Forney L.J., Suwa Y., Nakatsu C.H., Sexstone A.J., Holben W.E. Evidence for acquisition in nature of a chromosomal 2.4225

249. D/a-ketoglutarate dioxygenase gene by different Burkholderia sp. // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V.62. - №7. - P.2457-2463.

250. Matrubutham U., Harker A.R. Analysis of duplicated gene sequences associated with tfdR and tfdS in Alcaligenes eutrophus JMP134 // J. Bacteriol. 1994. - V.176. -P.2348-2353.

251. McGowan C., Fulthorpe R., Wright A. Evidence for interspecies gene transfer in the evolution of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degraders // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - №10. - P.4089^1092.

252. Meer J.R. Genetic adaptation of the bacteria to chlorinated aromatic compounds // FEMS Microbiology Reviews. 1994. -V.15. - P.239-249.

253. Micales B.K., Johnson J.L., Claus G.W. Deoxyribonucleic Acid Homologies Among Organisms in the Genus Gluconobacter // Int. J. Syst. Bacteriol. 1985 - V.35. - P.79-85.

254. Mohite B.V., Pawar S.P., Morankar A. Isolation, Selection and Biodégradation Profile of Phenol Degrading Bacteria from Oil Contaminated Soil // Bull Environ Contam Toxicol. 2011. - V.87(2). P. 143-146.

255. Moore E. Genetic and serological evidence for the recognition of four pentachlorophenol-degrading bacterial strains as a species of the genus Sphingomonas II Syst. Appl. Microbiol. 1995. - V. 18. - P.539-548.

256. Muller C., Petruschka L., Cuypers H., Burchhardt G., Herrmann H. Carbon catabolite repression of phenol degradation in Pseudomonas putida is mediated by the inhibition of the activator protein PhlR // J. Bacteriol. 1996. - V.178. -№7. - P.2030-2036.

257. Nandish M.S., Jagadeesh K.S. Pentachlorophenol degradation by Enterobacter NV-5: Optimization of process parameters // Indian Journal of Microbiology. 2006. - V.46. - P.25-29.

258. Nam I.-H., Chang Y.-S., Hong H.-B., Lee Y.-E. A novel catabolic activity of Pseudomonas veronii in biotransformation of pentachlorophenol // Applied Microbiology and Biotechnology. 2003. - V.62. - №.2-3. -P.284-290.

259. Narde K., Kapley A., Purohit J. Isolation and characterization of Citrobacter strain HPC255 for broad-range substrate specificity for chlorophenols //Current Microbiology. 2004. - V.48. - P.419-423.

260. Neilson A.H. The biodégradation of halogenated organic compounds // J. Appl. Bacteriol. 1990. - V.69. -P.445^170.

261. Neujahr H.Y., Varga J.M. Degradation of phenols by intact cells and cellfree preparations of Trichosporon cutaneum II Eur. J. Biochem. 1970. -V.13. - P.37-44.

262. Nohynek L.J., Suhonen E.L., Nurmiaho-Lassila E.-L., Hantula J., Salkinoja-Salonen M. Description of four pentachlorophenol-degrading bacterial strains as Sphingomonas chlorophenolica sp. nov. // Syst. Appl. Microbiol. 1995. - V.18. -P.527-538.

263. Nordin K, Unell M., Jansson J.K. Novel 4-chlorophenol degradation gene cluster and degradation route via hydroxyquinol in Arthrobacterchlorophenolicus A6 // Applied and Environmental Microbiology. 2005. -V. 71. - №11. - P.6538-6544.

264. Novick R.P. Extrachromosomal inheritance in bacteria // Bacteriol. Rev. -1969.-V.33.-P.210-263.

265. Nurk A., Kasak L., Kivisaar M. Sequence of the gene (phe A) encoding phenol monooxygenase from Pseudomonas sp. EST1001: expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida II Gene. 1991. - V.102. -№1.-P. 13-18.

266. Nygren A. Cytological studies of the effects of 2,4-D, MCPA and 2,4,5-T on Allium cepa II Ann. Roy. Agric. Coll. Sweeden. 1949. - V.16. -P.723-728.

267. Oakes D.J., Pollak J.K. The in vitro evaluation of the toxicities of three related herbicide formulations containing ester derivatives of 2,4,5-T and 2,4-D using sub-mitochondrial particles // Toxicology. 2000. - V.151. -P. 1-9.

268. Orser C.S., Lange C.C. Molecular analysis of pentachlorophenol degradation // Biodegradation. 1994. - V.5. - P.277-288.

269. Orser C.S., Lange C.C., Xun L., Zahrt T.C., Schneider B.J. Cloning, sequence analysis, and expression of the Flavobacterium pentachlorophenol-4-monooxygenase gene in Escherichia coli II J. Bacteriol. 1993. - V.175. - P.411^116.

270. Pamukoglu M.Y., Kargi F. Biodegradation kinetics of 2,4,6trichlorophenol by Rhodococcus rhodochrous in batch culture // Enzyme and Microbial Technology. 2008. - V.43. - P.43-47.

271. Paris D.F., Wolfe N.L., Steen W.C. Structure-activity relationships in microbial transformation of phenols // Appl. and Environ. Microbiol. -1982. V.44. -№1. - P.153-158.

272. Pemberton J.M., Fisher P.R. 2,4-D plasmids and persistance // Nature (London). 1977. - V.268. - P.732-733.

273. Perkins E.J., Gordon M.P., Caceres O., Lurquin P.F. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative opérons of plasmid pJP4 // J. Bacteriol. 1990.- V. 172. №5. - P.2351-2359.

274. Pieper D. H., Reineke W. Engineering bacteria for bioremediation // Current Opinion in Biotechnology. 2000. -№11.- P.262-270.

275. Powlowski J., Shingler V. Genetics and biochemistry of phenol degradation by Pseudomonas sp. CF600 // Biodégradation. 1994. - V.5.- P.219-236.

276. Pradhan N., Ingle. A.O. Mineralization of phenol by a Serratia plymuthica strain GC isolated from sludge sample // International Biodeterioration & Biodégradation. 2007. - V.60. - №2. - P. 103-108.

277. Prieto-Samsonov D.L., Vazquez-Padro R.I., Ayra-Pardo C., Gonzalez-Cabrera J., de la Riva G.A. Bacillus thuringiensis: from biodiversity tobiotechnology // Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology. -1997. V. 19. - P.202-219.

278. Puhakka J.A, Herwig R.P, Koro P.M., Wolfe G.V, Ferguson J.F. Biodégradation of chlorophenols by mixed and pure cultures from a fluidized-bed reactor // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - V.42. -№6. - P.951-957.

279. Quan X, Shia H, Zhangc Y, Wanga J, Qiana Y. Biodégradation of 2,4-dichlorophenol and phenol in an airlift inner-loop bioreactor immobilized with Achromobacter sp. // Separation and Purification Technology. -2004. V.34. - №1-3. - P.97-103.

280. Radehaus P.M., Schmidt S.K. Characterization of a novel Pseudomonas sp. that mineralizes high concentrations of pentachlorophenol // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - V.58. - P.2879-2885.

281. Radjendirane V, Bhat M.A, Vaidyanathan C.S. Affinity purification and characterization of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from Pseudomonas cepacia II Archives of Biochemistry and Biophysics. 1991. - V.288. -№1.-P. 169-176.

282. Rehfuss M., Urban J. Rhodococcus phenolicus sp. nov, a novel isolated actinomycete with the ability to degrade chlorobenzene, di chlorobenzene and phenol as sole carbon sources // Systematic and Applied Microbiology. 2005. - V.28. - P.695-701.

283. Reinscheid M, Zuilhof H, Miiller R, Vervoort J. Biological, thermal and photochemical transformation of 2-trifluoromethylphenol // Biodégradation. 1998. - V.9. - P.487^199.

284. Resnick S.M, Chapman P.J. Physiological properties and substrate specificity of a pentachlorophenol-degrading Pseudomonas species // Biodégradation. 1994. - V.5. - №1. - P.47-54.

285. Ribbons D.W, Eaton R.W. Chemical transformations of aromatic hydrocarbons that support the growth of microorganisms // Biodégradation detoxification environment pollutants / Ed. A.M. Chakrabarty. Boca Raton (Fia): CRS press. 1982. - P.59-84.

286. Шее J.F., Menn F.M., Hay A.G., Sanseverino J., Sayler G.S. Naturalselection for 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid mineralizing bacteria in agent orange contaminated soil // Biodégradation. 2005. - V.16. - №6. -P.501-512.

287. Ricelli A., Baruzzi F., Solfrizzo M., Morea M., Fanizzi F.P.

288. Biotransformation of patulin by Gluconobacter oxydans H Appl. Environ. Microbiol. 2007. - V.73(3). - P.785-92.

289. Rittmann B.E., McCarty P.L. Environmental Biotechnology: Principles and Applications. McGraw-Hill International Edition: New York. 2001.

290. Rosso S.B., Paolo O.A.D., de Duffard A.M.E., Duffard R. Effects of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid on central nervous system of developmer assoiated changes in ganglioside pattern // Brain Research. 1997. -V.769. -№1. P.163-167.

291. Saber D.L., Crawford R.L. Isolation and characterization of Flavobacterium strains that degrade pentachlorophenol // Appl. and Environ. Microbiol. 1985. - V.50. -№6. - P. 1512-1518.

292. Sahasrabudhe S.R., Modi V.V. Degradation of isomeric monochlorobenzoates and 2,4-D by a constructed Pseudomonas sp. // Apll. Microbiol. Biotechnol. 1991. - V.34. - P.556-557.

293. Sahasrabudhe S.R., Modi V.V. Microbial degradation of chlorinated aromatic compounds // Microbiol. Sciences-1987. V.4. - №10. -P.300-303.

294. Sahinkaya E., Dilek F.B. Modeling chlorophenols degradation in sequencing batch reactors with instantaneous feed-effect of 2,4-DCP presence on 4-CP degradation kinetics // Biodégradation. 2007. - V.18. - №4. - P.427^37.

295. Sahoo NK, Pakshirajan K, Ghosh PK, Ghosh A. Biodégradation of 4-chlorophenol by Arthrobacter chlorophenolicus A6: effect of culture conditions and degradation kinetics // Biodégradation. 2011. - V.22(2). -P.275-286.

296. Sambrook J.; Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2nd ed. N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press. 1989. - P. 1659.

297. Sandman E.R.I.C., Loos M.A. Aromatic metabolism by a 2.4-D degrading Arthrobacter sp. // Can. J. Microbiol. 1988. - V.34. - P.125-130.

298. Sangodkar U.M.X., Aldrich T.L., Haugland R.A., Johnson J., Rothmel R.K., Chapman P. J., Chakrabarty A.M. Molecular basis of biodégradation of chloroaromatic compounds//Acta Biotechnol. 1989. - V.9. - №4-P.301-316.

299. Santacruz G., Bandala E.R., Torres L.G. Chlorinated pesticides (2,4-D and DDT) biodégradation at high concentrations using immobilized Pseudomonas fluorescens II J. Environ. Sc. Health. B. 2005. - V.40. -№4. - P.571-583.

300. Sastry B.V., Janson V.E., Clark C.P., Owens L.K. Cellular toxicity of 2,4,5-triclorophenoxyacetic acid: formation of 2,4,5-triclorophenoxyacetylcholine // Cell Mol. Biol. 1997. - V.43. - №4. -P.549-557.

301. Sayler G.S., Steven R. Field applications of genetically engineered microorganisms for bioremediation processes // Current Opinion in Biotechnology. 2000. - №11. - P.286-289.

302. Schirmer F., Ehrt S., Hillen W. Expression, inducer spectrum, domain structure, and function of MopR, the regulator of phenol degradation in Acinetobacter calcoaceticus NCIB8250 // J. Bacteriol. 1997. - V.179. -№4.-P. 1329-1336.

303. Schlomann M. Evolution of chlorocatechol catabolic pathways // Biodégradation. 1994. - V.5. - P.301-321.

304. Schmidt E., Knackmuss H.J. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Conversion of chlorinated muconic acids into maleoylacetic acid // Biochem. J. 1980. - V.192. - №1. -P.339-347.

305. Schmidt E., Hellwig M., Knackmuss H.-J. Degradation of chlorophenols by a defined mixed microbial community // Appl. and Environ. Microbiol. 1983. - V.46. -№5. - P.1038-1044.

306. Schulze G.E., Dougherty J.A. Neurobehavioral toxicity and tolerance to the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-n-butyl ester (2,4-D ester) // Fundam. Appl. Toxicol. 1988. - V.10. -P.413-424.

307. Selvakumaran S., Kapley A., Kashyap S.M., Daginawala H.F., Kalia V.C., Purohit H.J. Diversity of aromatic ring-hydroxylating dioxygenase gene in Citrobacter II Bioresour Technol. 2011. - V.102. - №7. -P.4600^1609.

308. Sgountzos I.N., Pavlou S., Paraskeva C.A., Payatakes A.C. Growth kinetics of Pseudomonas fluorescens in sand beds during biodégradation of phenol // Biochemical Engineering Journal. 2006. - V.30. - P. 164173.

309. Shah S., Thakur I.S. Enzymatic dehalogenation of pentachlorophenol by Pseudomonas fluorescens of the microbial community from tannery effluent // Curr. Microbiol. 2003. - V.47. - P.65-70.

310. Shailubhai K., Sahasrabude S.R., Vora K.A., Modi V.V. Degradation of chlorinated derivatives of phenoxyacetic acid by Aspergillus niger II FEMS Microbiol. Lett. 1983. - V.18. - P.279-282.

311. Sharma A., Thakur I.S. Characterization of pentachlorophenol degrading bacterial consortium from chemostat // Bulletin of Environmental Contamination and Toxicology. 2008. -V.81. - №1. -P.12-18.

312. Shawabkeh R., Khleifat K.M., Al-Majali I., Tarawneh K. Rate of biodégradation of phenol by Klebsiella oxytoca in minimal medium and nutrient broth conditions // Bioremediation Journal. 2007. - V.l 1. -№1. - P.13-19.

313. Shelley D., Copley S. Evolution of a metabolic pathway for degradation of a toxic xenobiotic: the path work approach // Trends in Biochemical Sciences. 2000. - V.25. - №6. - P.261-265.

314. Shingler V., Franklin F.C.H., Tsuda M., Horloyd D. and Bagdasarian M. Molecular analysis of a plasmid-encoded phenol hydroxylase from Pseudomonas CF 600 // J. Gen. Microbiol. 1989. - V.l35. - P. 10831092.

315. Short K.A., Seidler R.J., Olsen R.H. Survial and degradative capacity of Pseudomonas putida induced or constitutively expressing plasmid-mediated degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetate (TFD) in soil // Can. J. Microbiol. 1990. - V.36. - P.821-829.

316. Singh S, Singh B., Chandra R. Biodégradation of phenol in batch culture by pure and mixed strains of Paenibacillus sp. and Bacillus cereus II Pol. J. Microbiol. -2009. V.58(4). -P.319-325.

317. Singhal N., Rog D. Modeling kinetics of 2,4-D degradation by two new Pseudomonas isolates // The Chemical Engineering Journal. 1988. -V.39. -P.37^15.

318. Stanier R.Y., Ornston L.N. The (3-ketoadipate pathway // Adv. Microb. Physiol. 1973. -№9. -P.89-151.

319. Stanlake G.J., Finn R.K. Isolation and characterization of a pentachlorophenol-degrading bacterium // Appl. Environ. Microbiol. -1982. V.44. -№6. - P. 1421-1427.

320. Steiert J.G., Pignatello J.J., Crawford R.L. Degradation of chlorinated phenols by a pentaclorophenol-degrading bacterium // Appl. Environ. Microbiol. -1987. V.53. - №5. - P.907-910.

321. Steinle P., Stucki G., Stetttler R., Hanselmann K.W. Aerobic mineralization of 2,6-dichlorophenol by Ralstonia sp. strain RK1 // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V.64. - №7. - P.2566-2571.

322. Stoecker M.A., Herwig R.P., Staley J.T. Rhodococcus zopfii sp. nov., a toxicant-degrading bacterium // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - V.44. -№1. -P.106-110.

323. Styles J. A. Cytogenetic effects of various pesticides in vivo and in vitro // Mutat. Res. 1973.-V.21.-P.50-51.

324. Sun J.Q., Xu L., Tang Y.Q., Chen F.M., Liu W.Q., Wu X.L. Degradation of pyridine by one Rhodococcus strain in the presence of chromium (VI) or phenol // J. Hazard Mater. 2011. - V. 191. - №1-3. - P.62-68.

325. Suzuki T. Methylation and hydroxylation of pentachlorophenol by Mycobacterium sp. isolated from soil //J.Pestic.Sci. 1983. - V.8. -P.419-428.

326. Tallur P.N., Megadi V.B., Kamanavalli C.M., Ninnekar H.Z. Biodégradation of p-Cresol by Bacillus sp. Strain PHN 1 // Current Microbiology. 2006. - V. 53. - № 6. - P.529-533.

327. Thakur I.S., Verma P., Upadhayaya K. Molecular cloning and characterization of pentachlorophenoldegrading monooxygenase genes of Pseudomonas sp. from the chemostat // Biochem. Biophys. Res. Comm. -2002. V.290. - P.770-774.

328. Thomas S., Sarfaraz S., Mishra L.C., Iyengar L. Degradation of phenol and phenolic compounds by a defined denitrifying bacterial culture // World Journal of Microbiology and Biotechnology. 2002. - V.18. -P.57-63.

329. Thompson J., Higgins D., Gibson TJ. CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice // Nucleic Acids Res. 1994. - V.22. - P.4673-4680.

330. Tiedje J.M., Alexander M. Enzymatic cleavage of the ether bond of 2.4-D //J. Agr. Food Chem. 1969. - V. 17. - №5. - P. 1080-1084.

331. Tiedje J.M., Duxbury J.M., M.Alexander, Dawson J.E. 2.4-D metabolism: pathway of degradation of chlorocatechols by Agrobacter sp. // J. Agr. Food Chem. 1969. - V.17. - №5. - P.1021-1026.

332. Tomasi I., Artaud I., Berthean Y., Mansuy D. Methabolism of poly chlorinated phenols by Pseudomonas cepacia AC 1100: determination of the first two steps and specific inhibitory effect of methimazole // J. Bacteriol. 1995. - V.177. - №2. - P.307-311.

333. Tonso N.L., Matheson V.G., Holben W.E. Polyphasic characterization of a suite of bacterial isolates capable of degrading 2,4-D // Microb. Ecol. -1995.-V.30.-P.3-24.

334. Van der Meer J.R., de Vos W.M., Harayama S., Zehnder A.J.B. Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobiotic compounds // Microbiol. Rev. 1992. - V.56. - P.677-694.

335. Van Hylckama Vlieg J.E.T., Poelarends G.J, Mars A.E, Janssen D.B. Detoxification of reactive intermediates during microbial metabolism of halogenated compounds // Current Opinion in Microbiology. 2000. -№3. - P.257-262.

336. Vedler E, Koiv V, Heinaru A. Analysis of the 2,4-dichlorophenoxyacetic-degrative plasmid pEST 4011 of Achromobacter xylosoxidans subsp. denitrificans strain EST 4002 // Gene. 2000. -V.255. - №2. - P.281-288.

337. Veeresh G.S, Kumar P, Mehrotra I. Treatment of phenol and cresols in upflow anaerobic sludge blanket (UASB) process: a review // Water Research. 2005. - V.39. - P. 154-170.

338. Wang Y, Song J, Zhao W, He X, Chen J, Xiao M. In situ degradation of phenol and promotion of plant growth in contaminated environments by a single Pseudomonas aeruginosa strain // J. Hazard Mater. 2011. -V.192. -№1. -P.354-360.

339. Wasi S., Jeelani G, Ahmad M. Biochemical characterization of a multiple heavy metal, pesticides and phenol resistant Pseudomonas fluorescens strain // Chemosphere. 2008. - V.71. - №7. - P.1348-1355.

340. Weller R. Ward D.M. Selective recovery of 16s rRNA sequences from natural microbial communities in the form of cDNA. // Appl Environ Microbiol. 1989. -№.55. -P.l818-1822.

341. Westers L., Westers H., Quax W.J. Bacillus subtilis as cell factory for pharmaceutical proteins:a biotechnological approach to optimize the host organism // Biochimica et Biophysica Acta. 2004. - P. 299- 310.

342. Xiong W.C., Quan X.C., Ma J.Y., Wang R. Study on gfp labeling of a 2,4-D degrading strain and its detection in a wastewater biotreatment system // Huan Jing Ke Xue. 2010. - V.31. - №8. - P. 1864-1870.

343. Xun L., Orser C.S. Biodegradation of triiodophenol by cell-free extracts of a pentachlorophenol-degrading Flavobacterium sp. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991 (a). - V.174. - P.43-48.

344. Xun L., Topp E., Orser C.S. Diverse substrate range of a Flavobacterium pentachlorophenol hydroxylase and reaction stoichiometries // J. Bacterid. 1992 (a). - V.174. - P.2898-2902.

345. Xun L., Topp E., Orser C.S. Purification and characterization of a tetrachloro-p-hydroquinone reductive dehalogenase from a Flavobacterium sp. // J. Bacteriol. 1992 (b). - V.174. - P.8003-8007.

346. Xun L.Y., Orser C.S. Purification of a Flavobacterium pentachlorophenol-induced periplasmic protein (PcpA) and nucleotide sequence of the corresponding gene (pepA) II J. Bacteriol. 1991 (b). -V.173. -P.2920-2926.

347. Xun L., Wagnon K.B. Purification and Properties of Component B of 2,4,5-Trichlorophenoxyacetate Oxygenase from Pseudomonas cepacia

348. AC1100 // Appl Environ Microbiol. 1995. - V.61(9). - P.3499-3502.

349. Yang C.F., Lee C.M., Wang C.C. Isolation and physiological characterization of the pentachlorophenol degrading bacterium Sphingomonas chlorophenolica // Chemosphere. 2006. -V.62. - P.709-714.

350. Ye J., Su L.-H, Chen C.-L, Hu S., Wang J., Yu J. and Chiu C.-H. Analysis of pSC138, the multidrug resistance plasmid of Salmonella enterica serotype Choleraesuis SC-B67 // Plasmid. 2010. - V.65. -P.132-140.

351. Zhao Y., Li W., Chou I.N. Cytoskeletal perturbation induced by herbicides, 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) // J. Toxicol. Environ. Health. -1987.-V.20.-P.11-26.

352. Ziagova M., Liakopoulou-Kyriakides, M. Kinetics of 2,4-dichlorophenol and 4-Cl-m-cresol degradation by Pseudomonas sp. cultures in the presence of glucose // Chemosphere. 2007. - V.68. - №5. - P.921-927.