Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и применение активного штамма-деструктора фенола и его хлорированных производных

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Содержание диссертации, кандидата технических наук, Кусова, Ирина Валерьевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Микроорганизмы - деструкторы фенола и его хлорированных производных 12 1Л. Фенол и его хдорированные производные как загрязнители окружающей среды

1.2. Штаммы-деструкторы фенола и его хлорированных производных

1.3. Особенности процессов биологической деградации фенола и его хлорированных производных

1.4. Генетические особенности бактерий-деструкторов фенола и его хлорированных производных

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.1.1. Штамм Bacillus subtüis В-1742Д

2.1.2. Штаммы ВКМ

2.1.3. Штамм Escherihia coli НВ

2.2. Получение чистой культуры штамма-деструктора 2,4-Д

2.3. Методы таксономических исследований

2.4. Рост культуры в жидкой питательной среде и его.учет

2.5. Определение устойчивости бактерий к антибиотикам

2.6. Определение количества 2,4-Д в культуральной жидкости

2.7. Идентификация продуктов метаболизма 2,4-Д 40 2.8 Биологическое тестирование культуральной жидкости

2.9. Получение препаратов геномной ДНК микроорганизмов

2.10. Получение препаратов плазмидной ДНК

2.11. Фракционирование препаратов плазмидной ДНК методом гель-фильтрации

2.12. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле

2.13. Обработка препаратов плазмидной ДНК рестрикционными эндонуклеазами

2.14. Определение размеров фрагментов ДНК

2.15. Получение векторных молекул pBR

2.16. Лигирование вектора pBR322 и фрагментов ДНК генома штамма Bacillus subtilis В-1742Д

2.17. Клонирование фрагментов ДНК штамма

Bacillus subtilis В-1742Д

2.18. Тестирование рекомбинантных штаммов на селективных средах

2.19. Ферментативный гидролиз препаратов ДНК микроорганизмов, фракционирование и перенос на мембранный фильтр

2.20. Получение препарата радиоактивной ДНК

2.21. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре

2.22. Статистический анализ результатов экспериментов

2.23. Физико-химические свойства и область применения фенола и его хлорированных производных

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Поиск штамма-деструктора

3.1.1. Исследование культурально-морфологических, физиолого-биохимических и генетических признаков штамма-деструктора

3.1.2. Исследование процесса деградации 2,4-Д штамма

Bacillus subtilis В-1742Д

3.1.3. Биологическое тестирование культуральной жидкости штамма Bacillus subtilis В-1742Д

3.1.4. Анализ субстратной специфичности штамма Bacillus subtilis В-1742Д в отношении фенола и его хлорированных производных

3.2. Использование штамма Bacillus subtilis В-1742Д для решения экологических проблем, связанных с обезвреживанием промышленных стоков химических и нефтехимических предприятий

3.2.1. Описание технологического процесса и технологической схемы очистных сооружений предприятий химического и нефтехимического профиля

3.2.2. Использование штамма-деструктора Bacillus subtilis В-1742Д для доочистки от фенолов сточных вод предприятий химического и нефтехимического профиля

3.3. Использование штамма Bacillus subtilis В-1742Д для решения проблем, связанных с поиском штаммов-деструкторов

3.3.1. Клонирование детерминант деградации 2,4-Д штамма

Bacillus subtilis В-1742Д

3.3.2. Культурально-морфологические, физиолого-биохимические и генетические признаки штамма E.coli рМК

3.3.3. Анализ структуры рекомбинантной плазмиды штамма

Е.coli ИВ 101 рМК

3.3.4. Сравнительный анализ деградации 2,4-Д штаммов

Е. coli HB 101 рМК 16 и Bacillus subtilis В-1742Д

3.3.5. Использование рекомбинантной плазмиды рМК16 в качестве зонда 94 ВЫВОДЫ 99 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота

2,4-Д(А) - аминная соль 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты

2.3-Д - 2,3- дихлорфеноксиуксусная кислота 5-окси-2,4-Д - 5-окси-2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота Ф - фенол

4-ХФ - 4-хлорфенол

2.4-ДХФ - 2,4-дихлорфенол

2-ХФУК - 2-хлорфеноксиуксусная кислота

4-ХФУК - 4-хлорфеноксиуксусная кислота

2,4,5-Т - 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота

НК - нуклеиновые кислоты

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

ТАЕ - трис-ацетатный буфер

Введение Диссертация по биологии, на тему "Поиск и применение активного штамма-деструктора фенола и его хлорированных производных"

Актуальность проблемы. Соединения ароматического ряда, содержащие в своем составе галогены, составляют одну из крупнейших групп экотоксикантов. Причина такого положения в том, что молекулы ксенобиотиков данной группы обладают труднорасщепляемой галогенуглеродной связью, а наличие нескольких заместителей-галогенов придает им особую устойчивость. Поэтому, попадая в окружающую среду, они имеют тенденцию накапливаться в клетках травянистых и древесных растений, постепенно проникают в ткани и репродуктивные органы животных

1]. В силу этого действие галогенсодержащих соединений ароматического ряда, как правило, пролонгировано во времени.

Некоторые авторы указывают, что присутствие галогенорганических соединений в окружающей среде создает эффект мины замедленного действия. Так, наблюдаемое в настоящее время вторичное диоксиновое поражение Южного Вьетнама, обусловленно сжиганием древесины, соломы, растительных остатков, загрязненных во время военных действий 1962-1971 гг. гербицидами 2,4,5-Т и 2,4-Д. Авторы отмечают, что вторичное загрязнение влечет за собой быстрое увеличение уже существующей пораженной площади, вследствие распространения диоксинов с продуктами сгорания в атмосфере

2].

К настоящему времени раскрыты некоторые механизмы действия на живые системы соединений ароматического ряда, содержащих галогены. Полученные сведения свидетельствуют о том, что большинство из них высокотоксично и обладает канцерогенными свойствами. Отдаленные последствия действия таких соединений связаны с тем, что они способны оказать существенное влияние на наследственный живых систем.

Вместе с тем соединения ароматического ряда, содержащие галогены, практически постоянно поступают в окружающую среду, т.к. используются в производственных циклах, входят в состав, гербицидов, растворителей, лаков, красителей, огнетушителей и медицинских препаратов.

Основной метод уничтожения соединений ароматического ряда, содержащих в своем составе галогены, в настоящее время - сжигание остатков, накапливаемых в результате производственных процессов, а также обжигание загрязненных почв. Этот метод достаточно дорог: обжигание 1 т. почвы стоит около 2000 канадских долларов. Дешевле обработка загрязненных почв растворителями. Оба метода не исключают возможности вторичного загрязнения окружающей среды продуктами сжигания. Известно, что неполное сжигание отходов приводит к образованию диоксинов. Понятно, что применение указанных способов не позволяет решить проблему уничтожения больших объемов загрязнений.

Альтернативный метод очистки среды основан на использовании микроорганизмов, обладающих специальными свойствами. Дело в том, что микроорганизмы, имея достаточно пластичный обмен веществ, могут вовлечь в круговорот органических веществ разные ксенобиотики и их смеси, включая трудноразлагаемые загрязнители промышленного ряда [3]. Процесс очистки с помощью микроорганизмов может осуществляться при использовании специальных штаммов, преимущественно бактерий, в очистных сооружениях или в виде биологических препаратов направленного действия [4]. В состав таких препаратов может входить один или несколько штаммов-деструкторов с известными свойствами. Места применения микроорганизмов в последнем случае могут рассматриваться как локальный биореактор. Использование микроорганизмов позволяет решить проблему конверсии значительных объемов загрязнений. Разрушение загрязнителей можно провести без накопления вредных или токсичных веществ и тем самым избежать вторичного загрязнения среды [5, 6]. Кроме этого, по оценкам специалистов микробиологический способ очистки среды примерно в 50 раз дешевле традиционных.

Реализация указанных идей и успешное специализированное применение штаммов-деструкторов для очистки почв и воды проводится в ряде промышленно развитых стран: в Германии, Великобритании, Швеции, США. Ряд фирм разрабатывает микробные смеси для специального применения, в частности, для очистки стоков и почв, конкретных предприятий. В Российской Федерации созданы биологические препараты для очистки среды от нефтезагрязнений: Деваройл, Родотрин, Путидойл и другие.

Вместе с тем, несмотря на значительные преимущества биологических технологий уничтожения загрязнителей, разработка и применение таких способов проводится недостаточно интенсивно. Одна из причин сложившегося положения в том, что число известных штаммов-деструкторов ограничено.

Ряд авторов отмечает, что для разработки эффективных методов биологической очистки среды от антропогенного загрязнения в настоящее время большое значение имеет как поиск активных культур микроорганизмов, так и конструирование новых штаммов-деструкторов in vitro [3, 7]. Конструирование штаммов представляется достаточно перспективным в связи с тем, что наблюдаемое сегодня существенное качественное и количественное увеличение ксенобиотиков в окружающей среде требует высокой скорости эволюции микроорганизмов, в то время как естественная скорость эволюции природных штаммов недостаточна для эффективного контроля за загрязнением среды. Однако в ряде исследований отмечено, что штаммы, созданные in vitro не всегда могут стабильно сохранять свои полезные свойства, поэтому их применение имеет ограниченный характер. В тоже время использование генетических элементов таких штаммов в качестве молекулярных зондов может найти широкое применение.

Здесь же следует принять во внимание и то, что исследования штаммов-деструкторов, направленные на решение важных практических проблем, имеют и теоретический интерес, так как они связаны с изучением разнообразия микроорганизмов в условиях антропогенного пресса на природу.

Цель и задачи исследования. Цель данной работы - получение нового штамма-деструктора фенола и его хлорированных производных.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Выделить новый штамм-деструктор фенола и его хлорированных производных;

2. Выявить культурально-морфологические, физиолого-биохимические и генетические особенности штамма - деструктора;

3. Выявить возможности практического применения штамма-деструктора для улучшения качества очистки сточных вод предприятий химического и нефтехимического профиля;

4. Выявить возможности применения штамма для решения проблем, связанных с поиском штаммов-деструкторов;

Практическая значимость. Проведены испытания штамма-деструктора Bacillus subUlis В-1742Д по улучшению качества стоков предприятий АО "Башнефтехим" (зона №3), ОАО "Уфахимпром", ОАО "Дубитель". Полученные результаты показали, что с помощью штамма-деструктора Bacillus subtilis В-1742Д можно существенно снизить концентрацию фенолов в стоках химических и нефтехимических предприятий. Степень доочистки от фенолов сточных вод АО "Башнефтехим" (зона №3) составила 88,4%, ОАО "Уфахимпром" - 99,7%, ОАО "Дубитель" - 91%. Штамм Bacillus subtüis В-1742Д рекомендован в качестве деструктора фенола и его хлорированных производных для использования в дополнительном блоке доочистки технологической схемы промышленных очистных сооружений химических и нефтехимических предприятий.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались и обсуждались на Всесоюзной конференции "Микробиологические методы защиты окружающей среды" (Пущино, 1988); на конференции "Генная и клеточная инженерия в решении фундаментальных проблем биотехнологии" (Тарту, 1989), на Республиканской научной конференции "Современные проблемы физико- химической биологии и биотехнологии" (Алма-Ата, 1989), на Республиканской конференции "Современные проблемы биологически активных веществ и биотехнологии" (Уфа, 1990), на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1990), на VII Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1990), на конференции "Экологические проблемы защиты растений" (Ленинград, 1990), на конференции "Микроорганизмы в сельском хозяйстве" (Пущино, 1991), на 5 конференции РФ "Новые направления биотехнологии" (Пущино, 1992), на 4 Симпозиуме по генетике бактерий и экологии (Нидерланды, 1993), на конференции "Экоаналитика 96" (Краснодар, 1996), на Международной конференции "Молекулярная генетика и биотехнология" (Минск, 1998).

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 20 печатных работах.

Структура работы. Работа состоит из введения, 3 глав, выводов и списка литературы. Материал изложен на 112 страницах машинописного текста, содержит 19 рисунков, 12 таблиц, библиографию из 122 наименований.

Данная работа была выполнена в соответствии с плановыми исследованиями и рядом программ РАН, в том числе: НТП 0.74.06 (Задание 09.09.М. Разработать и освоить производство бактериальной массы для биодеградации фенола и его производных, гербицидов и пестицидов), ГНТП РФ "Экологически безопасные процессы химии и химические технологии" (Пр.№204С), ГНТП РФ "Приоритетные направления генетики" (Раздел 17-1

94), "Биосферные и Экологические исследования АН СССР" (Раздел 7.2.16.), программ АН РБ: "Физико-химическая биология и биотехнология" (Раздел 7.2.2), "Оптимизация функционирования и использования потенциала биологических систем РБ". Работа была поддержана специальным фондом РФ (раздел "Биологические проблемы устойчивого развития", грант Б4.08.). и

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Кусова, Ирина Валерьевна

выводы

1. Из сообщества микроорганизмов активного ила БОС ОАО "Уфахимпром" выделен штамм Bacillus subtilis В-1742Д.

2. Установлено, что штамм Bacillus subtilis В-1742Д способен использовать в качестве единственного источника углерода и энергии следующие соединения: фенол, 4-ХФ, 2,4-ДХФ, 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4-Д(А) и 2,4,5-Т.

3. Показана принципиальная возможность использования штамма Bacillus subtilis В-1742Д для доочистки от фенолов стоков предприятий химического и нефтехимического профиля.

4. Проведено клонирование детерминант деградации 2,4-Д штамма Bacillus subtilis В-1742Д в клетках E.coli HB 101.

5. Получен новый рекомбинантный штамм E.coli HB 101 рМК16.

6. Показано, что штаммы E.coli НВ101 рМК16 и Bacillus subtilis В-1742Д образуют идентичные продукты метаболизма 2,4-Д, в частности, 5-окси-2,4-Д, 2,3-Д, 2-ХФУК и бензол.

7. Получена новая рекомбинантная плазмида рМК16. Плазмида рМК16 состоит из векторной молекулы pBR322 и двух Ват HI-фрагментов генома Bacillus subtilis длиной 3,1 т.п.н. и 1,3 т.п.н. Общий размер плазм иды рМК16 составляет 8,8 т.п.н.

8. Установлено, что детерминанты деградации 2,4-Д штамма Bacillus subtilis имеют гомологию с BamHI-фрагментами генома штамма Aspergillus niger Van Tieghem F-1119 и не имеют гомологии с фрагментами геномов штаммов Bacillus brevis В-503, Bacillus cereus И-370 , Bacillus megaterium B-512 и Bacillus megaterium sub phosphaticus B-847.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата технических наук, Кусова, Ирина Валерьевна, Уфа

1. Гильманов А.Ж., Галимов Щ.Н., Камилов Ф.Х. и др. Влияние диоксинсо-держащего гербицида 2,4-Д на гормональный статус экспериментальных животных // Медицина, труд и пром. экология. 1997. -N.8. - С. 15-18

2. Бочаров Б.В., Шадрин Ю.Н. Поражение биоты в результате массированного применения гербицидов в военных целях в Южном Вьетнаме // Сб.Отдал, биол. последствия войны в Юж.Вьетнаме / РАН. Ин-т пробл. экол. и эволюции.-М., 1996. С.17-35

3. Limbert E.S.B., Betts W.B. Influences of substrate chemistry and microbial metabolic diversity on the bioremediation of xenobiotic contamination // Genet. Eng. And Bioteclmol. 1996. - 16, N.3. - P.159-180

4. Ягафарова Г.Г., Хлесткин P.H. Биопрепарат для снижения загрзнения воды и почвы гербицидом 2,4-Д // Экология. 1994. - Т.1, Вып.З. - С.46-47

5. Благодатская E.B., Ананьева Н.Д. Оценка устойчивости микробных сообществ в процессе разложения поллютантов в почве // Почвоведение. 1996. -N.11. - С.1341-1346

6. Microbial technologies to overcome environmental problems of persistent pollutants: Expert Group Meet. Microb. Technol. Overcome Environ. Probl. Persist. Pol-lut., 4-7 July, 1993 //Ed. Alexander M. Nairobi: UNEP, 1987. - 132p.

7. Харлампович Г.Д., Чуркин Ю.В. Фенолы // М.: Химия, 1974. 376с.

8. Список пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению в Российской федерации 1998 год. Защита и карантин растений 1998: № 5? прилож., -С.119-125

9. Kitunen V.N., Valo R.J., Salkinoja-Salonen М. Contamination of soil around wood preserving facilities by polychlorinated aromatic compounds // Environ. Sci. Technol. 1987. - Vol.21. - P.96-101

10. Буркацкая Е.И., Иванова 3.B., Лысина Г.Г. Медицинское обследование лиц, работающих с пестицидами. Киев: Здоровье, 1995. - 184с.

11. Имельбаева Э.А., Теплова С.H., Камилов Ф.Х., Каюмова А.Ф. Состояние системы мононуклеарных фагоцитов при воздействии экотоксиканта -гербицида 2,4-Д // Баш. экол. вестн. 1998. - N.2. - С.48-52

12. Румак B.C. Медико-биологические основы отдаленных мкдицинских последствий применения в военных целях фитотоксикантов, содержащих 2,3,7,8-ТХДД: Афтореф. дис. док. мед. наук. С/Пб., 1993. - 50с.

13. Цырлов И.Б. Хлорированные диоксины. Биологические и медицинские аспекты. Аналитический обзор. Новосибирск, 1990. -210с.

14. Сафарова ВН., Пиленкова И.И., Фатьянова А.Д., Юркова Р.Г., Теплова Г.И. Исследование загрязненности почв и сельскохозяйственной продукции пестицидами в товаропроизводящих хозяйствах Республики Башкортостан // Экология. 1994. - Т.1, Вып.З. - С.48-52

15. Хизбуллин Ф.Ф., Эстрина Г.Я., Мавродиева H.H., Хазиев Ф.Х., Круглова Э.Я., Амирова З.К. Загрязненность сельскохозяйственных ландшафтов Башкортостана гербицидом 2,4-Д и диоксинами // Мед. труда и пром. экология. -1997. N.8. - С.26-31

16. Хизбуллин Ф.Ф., Чернова JI.H., Хасанова И.Р., Майстренко В.Н. полихлорированные дибензо-n-диоксины и дибензофураны. Источники эмиссии и поступление в окружающую среду // Баш. экол. вестн. 1998. - N.1. -С.31-38

17. Винокуров C.B., Кантор Л.И., Пинчук C.B. Особенности и пути развития водоснабжения г.Уфы // Экология. 1995. - Т.2, Вып.2. - С.4-7

18. Мельников H.H., Белан С.Р. Органические соединения хлора в окружающей среде // Агрохимия. 1998. -N.10. - С.83-93. - Библиогр.: С.92-93

19. Giuliette Ana.Maria, Silva Humberto J. Influence of sludge adaptation on biodegradation of phenol // MIRGEN Journal. 1989. - 5, N.3. - P.343-348

20. Malarczyk E. Transformation of phenolic acids by Nocardia II Acta Microbiología Polonica. 1989. - Vol.38, N.l. -P.45-53

21. Соляникова И.П., Головлева JI.А. Фенол гидроксилазы: современной состояние вопроса. Обзор // Биохимия. 1999. - Т.64. Вып.4. - С.437-446

22. Paris D.E., Wolfe N.L., Steen W.C. Structure-activity relationships in microbial transformation of phenols // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - Vol.44, N.l. -P.153-158

23. Kotturi Gopaul, Robinson W. Campbell., Inniss E. William Phenol degradation by a psychrotrophic stain of Pseudomonas putida II Appl. Microbiol. Biotechnol. -1991. -34. -P.539-543

24. Krug М., Ziegler Н, Straube G. Degradation of phenolic compounds by the yeast Candida tropicalis HP15 // J. Basic Microbiol. 1985 - Vol.25, N.2. - P.103-112

25. Gaal.A., Neujahr H.Y. metabolism of phenol and resorcinol in Trichosporon cutaneum II J. Bactenol. 1979. - Vol.137. -P.13-2127.

26. Perkins E.J., Gordon M.P., Caceres O., Lurquin P.F. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4 // J. of Bacteriology. 1990. - Vol.172, N5. - P.2351-2359

27. Apajalahti A. H. Juha, Salkinoja-Salonen S.Mirja Degradation of poly chloric nated phenols by Rhodococcus chlorophenolicus И Appl. Microbiol. Biotechnol. -1986.-25.-P.62-67

28. Горлатов C.H., Мальцева О.В., Шевченко В.И., Головлева Л.А. Разложение хлорфенолов культурой Rhodococcus erythropolis II Микробиология. 1989. -В.5, Т.58. - С.802-806

29. Моисеева О.В., Линько Е.В., Баскунов Б.П., Головлева Л.А. Деградация 2-хлорфенола и 3-хлорбензоата Rhodococcus opacus lcp II Микробиология. -1999.-Т.68, N.4. С.461-466

30. Sahasrabudhe S.R., Modi V.V. Microbial degradation of chlorinated aromatic compounds //Microbiol. Sciences. 1987. - Vol.4, N.10. -P.300-303

31. Kiyohara H., Hatta T., Ogawa Y., Kakuda T., Yokoyama H., Takizawa N. Izola-tion of Pseudomonas pickettii strains that degrade 2,4,6-trichlorophenol and their dechlorination of chlorophenols // Appl. Environ. Microbiol. 1992. - Vol.58. -P.1276-1283

32. Krieger R.I. Pesticide exposure assessment // Toxicol. Lett. 1995. - 82-83. -P.65-72

33. Майер-Боде Г. Гербициды и их остатки // под ред. Мельникова Н.Н. М.: Мир, 1972.- 560 с.

34. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Наумов А.В., Грищенков В.Г., Воронин A.M. Выделение и характеристика бактерий-деструкторов пестицидов // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.33, N3. - С.310-313

35. Ghosal D., You I.S., Chakrabarty A.M. Microbial degradation of halogenated compounds // Science. 1985. - Vol.228, N.4696. - P. 135-228

36. Ghosal D., You I.S. Gene duplication in haloaromatic degradative plasmids pJP4 and pJP2 // Can.J.Microbiol. 1988. - 34, - P.709-715

37. Sangodkar U.M.X., Aldnch T.L., Haugland R.A., Johnson J., Rothmel R.K., Chapman P.J., Chakrabarty A.M. Molecular basis of biodégradation of chloroaro-matic compounds // Acta Biotechnol. 1989. - 4, - P.301-316

38. Harker Alan R., Olsen R.H., Seidler R.J.Phenoxyacetic acid degradation by the 2,4-D. Patway of plasmid JP4:mapping and characterization of the 2,4-D regulatory gene,tfdR // J.of Bacteiolgy. 1989. - Vol.171, N.l. - P.314-320

39. Harker R.Alan, Kim Young Trichloroethylene degradation by two independent aromatic degrading pathways in Alcaligenes eutrophus JMP 134 // Appl. Envir. Microbiology. - 1990. - Vol.56, N.4. -P.l 179-1181

40. Haugland R.A., Schlemm D.J., Lyons R.P., Sferra P.R., Chakrabarty A.M. Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-D and 2,4,5-T by pure and mixed bacterial culture // Appl. Envir. Microbiology. 1990. - Vol.56, N5. -P.1357-1362

41. Tiedje J.M., Duxbury J.M., M.Alexander, J.E. Dawson. 2.4-D metabolism: pathway of degradation of chlorocatechols by Agrobacter sp. // J. Agr. food chem. -1969. Vol.17, N5. - P.1021-1026

42. Sandman E.R.I.C., Loos M.A. Aromatic metabolism by a 2.4-D degrading Ar-trobactersp. II Can. J. Microbiol. 1988. - 34, - P.125-130

43. Kukor J.J., Olsen R.H., Slak J.S. Recruitment of chromosomally encoded maleylacetate reductase for degradation of 2,4-D by plasmid pJP4 // J. Bacteriology. 1989. - Vol.171, N.6. - P.3385-3390

44. Kaphammer В., Olsen R.N. Cloning and characterization of tfdS, the repressor-activator gene of tfdB, from the 2,4-D catabolic plasmid pJP4 // J. Bacteriology. -1990. Vol.172, N.10. - P.5856-5862

45. Radjendirane V., Bhat M.A., Vaidyanathan C.S. Affinity purification and characterization of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from Pseudomonas cepacia II Arch. Biochem. Biophys. 1991. - Vol.288. -P.169-176

46. Аусмээс H.P., Нейнару A.JI. Новые плазмиды биодеградации гербицида 2,4-Д // Генетика. 1990. - Т.26, N.4. - С.770-772

47. Mae A. Andres, Mants O.Reet, Ausmees R.Nora, Koiv M.Viia, Heinaru L.Ain Characterization of a new 2.4-D degrading plasmid pEST4011: physical map and localization of catabolic genes // J. General Microbiology. 1993. - 139, - P.3165-3170

48. Sahasrabudhe V. Anjali, Modi V. V. Degradation of isomeric monochloroben-zoates and 2,4-D by a constructed Pseudomonas sp. II Apll. Microbiol. Biotechnol. -1991. 34, - P.556-557

49. Скрябин Г. К., Головлева JI. А. Использование микроорганизмов в органическом синтезе // М.: Наука, 1976. 334с.

50. Карасевич Ю. Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения // М.: Наука, 1982. 141с.

51. Экологическая биотехнология // под ред. Форстера К.Ф., Вейза Дж.Д.А. -Л.: Химия, 1990. -384с.

52. Hou C.N., Patel R., billard M.О. Extradiol cleavage of 3-methylcatechol by catechol 1,2-dioxygenase from various microorganisms // Appl. Environ. Microbiol.- 1977. Vol.33. - P.725-727

53. Stanier R.Y., Ornston L.N. The р-ketoadipate pathway // Adv. Microb. Physiol.- 1973. -N.9. -P.89-151

54. Hodgson E., Rose R.L., Ryu D.Y., Falls G., Blake B.L., Levi P.E. Pesticide-metabolizing enzymes // Toxicol. Lett. 1995. - 82-83, - P.73-81

55. Брода П. Плазмиды // Пер. с англ. М.: Мир, 1982. - 224с.

56. Дебабов В.Г., Лившиц В.А. Современные методы создания промышленных штаммов микроорганизмов // М.: Высш. шк., 1988. - 208с.

57. Бергквист П., Харди К., Оудега Б. Плазмиды // Методы, пер. с англ. под ред. К. Харди -М.: Мир, 1989. С.1-155

58. Воронин A.M., Цой Т.В. Генетика промышленных микроорганизмов и биотехнология. М.: Наука, 1990. - С.123-138

59. Boominathan К., Gurujeyalakshmi G., Balajee S., et al. Xenodissimilatory plas-mids // Curr. Sci. (India). 1988.-Vol. 57.-N.21.- P. 1182

60. Chakrabarty A.M. Genetic basis of the biodégradation of salicylate in Pseudomonas //J. Bacteriol. 1972. - Vol.112.-P.815-823

61. Baylev S.A., Morris P.W., Broda P. The relationship of degradative and resistance plasmids of Pseudomonas belonging to the same incompatibility group // Nature. 1979. - Vol.280. - P.338-339

62. Sakagushi K., Okanishi M. Degradative plasmids: aspect of microbial evolution. In: Molecular breeding and Genetics of Applied Microorganisms // eds. К Sakagushi M. Okanishi / N.Y.: Kodansha Academic Press, 1980. P.47-60

63. Дубейковский А.Н., Таранова JI.A., Овчаров Л.Ф., Воронин A.M. Генетический контроль деструкции ПАВ //Микробиология. 1997. - Т.66. - С.378-382

64. Кошелева И.А., Соколов С.Л., Балашова Н.В., Воронин A.M. Генетический контроль биодеградации нафталина штаммом Pseudomonas sp.8909N // Генетика. 1997. - Т.ЗЗ. - N.6. - С.762-768

65. Балашов С.В., Воронин A.M. Плазмиды биодеградации бензосульфоновой и n-толуолсульфоновой кислот бактерий вида Comamonas testosteroni // Генетика. 1997. - Т.ЗЗ, N.5. - С.608-609

66. Агапова С.Р., Андреева А.Л., Старовойтов И.П., Воробьева Л.П., Терентьев П.Б. Плазмиды биодеградации 2,4-диметилпиридина и пиридина у штаммов Arthrobacter // Мол. генетика и микробиология. 1992. - N.5-6. - С. 10-13

67. Duggleby С.J., Bayley S.A., Worsey M.J. Molecular sies and relationships of ТОГ plasmids in Pseidomonas II J. Bacteriol. 1977. - Vol.130. - P.1274-1279

68. Jan Roelof van der Meer. Genetic adaptation of the bacteria to chlorinated aromatic compounds // FEMS Microbiology Reviews 1994. - 15. - P.239-249

69. Jaenecke S., de Lorenzo V., Timmis K.N., Dfaz E. A stringently controlled expression system for analysing lateral gene transfer between bacteria. // Mol. Microbiol. 1996. - 21, N2. - C. 293-300

70. Chakrabarty A.M. Dissociation of a degradative plasmid aggregate in Pseidomonas //J. Bacteriol. 1974. - Vol.118. - P.815-820

71. Chakrabarty A.M. Plasmids in Pseidomonas II Ann. Rev. Genet. 1976. -Vol.10. -P.7-30

72. Ghosal D., You I.S., Chatterjee D.K., Chakrabarty A.M. Plasmids in the degradation of chlorinated aromatic compouns // New York Plenum. 1986. - P.667-686

73. Don R.H., Pemberton J.M. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alcaligenes paradoxus and Alcaligenes eutrophus II J. Bacteriol. 1981. -N.145. - P.681-686

74. Don R.H., Weightman A.J. Transposon mutagenesis and cloning analysis of the pathways for degradation of 2.4-dichlorophenoxyacetic acid and 3-chlorobenzoate in Alcaligenes eutrophus JMP 134 (pJP4) // J. Bacteriol. 1985. - Vol.161. - P.85-90

75. Top E.M., Maltseva O.V., Forney L.J. Capture of a catabolic plasmid that encodes only 2.4-dichlorophenoxyacetic acid: a-Ketoglutaric acid dioxygenase (TfdA) by genetic complementation // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - 62, N.7. -P.2470-2476

76. Fisher P.R., Appleton J., Pemberton J.M. Izolation and characterization of the pesticide degrading plasmid pJPl from Alkali-genes paradoxus // J. Bacteriol. -1978. - V.135. - P.798-804

77. Don R.N., Pemberton J.M. Properties of six pesticide degradation plasmids isolated from Alkaligenes paradoxus and Alkaligenes eutrophus // J. Bacteriol. 1981. - Vol.145, N.2. -P.681-686

78. Maltseva O., McGowan C., Fulthorpe R. Degradation of 2.4-dichlorphenoxyacetic acid by haloalkaliphilic bacteria. // Microbiology. 1996. -142, N5. - C.l 115-1122.

79. Furukawa K., Chakrabarty A.M. Involvment of plasmids in total degradation of chlorinated biphenyls // Appl. Environ. Microbiol. 1982. - Vol.44. - P.619-622

80. Воронин A.M., Анисимова Л.А., Головлева Л.А. и др. Участие плазмид в деградации а-метилстирола // Микробиология. 1985. - Т.54. - В.5. - С.854-855

81. Селифонов С.А. Катаболизм бифенила у штаммов псевдомонад, содержащих плазмиды pBS241 и pBS311: Автореф. дис. канд. биол. наук -ИБФМ АН СССР: Пущино, 1989. 157с.

82. Frantz В., Chakrabarty A.M. Degradative plasmids in Pseudomonas: The bacteria. N.Y.: Acad. Press, 1986. - Vol.10. - P.295-323

83. Chaudhy G.R., Huang G.H. Isolation and characterization of a new plasmid from a Flavobacterium sp. Which carries the genes for degradation of 2.4- dichlorophe-noxyacetate // J. Bacteriol. 1985. - Vol.228, N.4696. - P. 135-228

84. Скворцова И.Н. Идентификация почвенных бактерий рода Bacillus II М.: Изд-во МГУ, 1984. 26с.

85. Лугаускас.А.Ю., Микульскене А.И., Шляужене Д.Ю. // Каталог микроми-цетов-биодеструкторов полимерных материалов. М.: Наука, 1987. - С.72-340

86. Bergey's manual of systematic Bacteriology. The Williams & Wilkins Co. Baltimore. 1986. - V.2. - P. 1104-1141

87. Методы общей бактериологии // под. ред.Герхарда Ф. М.: Мир, 1990. - 1-Зт.

88. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии // под ред. Н.С. Егорова. М.: МГУ, 1976. - 307с.

89. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований // М.: Медицина, 1978. 394с.

90. Методы определения микроколичеств пестицидов // под ред. М.А. Клисенко М.: Медицина, 1984. - 256с.

91. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование // пер. с англ. под ред. А.А. Баева- М.: Мир, 1984. -480с.

92. Aaij С., Borst P. The gel electrophoresis of DNA // Biochim. Biophys. Acta.1972. 269. - P.192

93. Fisher M.P., Dingman C.W. Role of molecular conformation in determining the electrophoretic properties of polynucleotides in agarose-acrylamide composite gels //Biochemistry. 1971. - 10. -P.895

94. SharpP.A., Sugden В., Sambrook J. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using analytical agarose // Biochemistry.1973.- 12.-P.3055

95. Norgard M.V., Keem K., Monohan J.J. Factors affecting the transformation of Escherichia coli strain yYllb by pBR322 plasmid DNA // Gene. 1978. - 3. -P.279

96. Roberts R. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences // Nucleic Acids Res. 1982. - 10. - P. 117

97. Helling R. В., Goodman H. M., Boyer H.W. Analysis of RecoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose-gel electrophoresis // J. Virol. 1974. - 14. - P.1235

98. Godson G.N., Vapnek D. A simple method of preparing large amounts of ФХ174 RFI supercoiled DNA // Biochim. Biophys. Acta. 1967. - 299. - P.516

99. Bahl C.P., Wu R. Cloned seventeennucleotide-long synthetic lactose operator is biologically active // Gene. 1978. - 3. - P. 123

100. Sheller R.H., Dickerson R.E., Boyer H.W., Riggs A.D., Itakura К. Chemical synthesis of restriction enzyme recognition sites useful for cloning // Science. -1977. 196. -P.177

101. Mandel M., Higa A. Calcium dependent bacteriophage DNA infection // J. Mol. Biol. 1970. - 53. - P.154

102. Kushner S.R. An improved method for transformation of E.coli with ColEI-denved plasmids. // Genetic engineering. Eds. H.B. Boyer and S. Nicosia. Elsevier /North-Holland: Amsterdam, 1978. -P.17

103. Thomas P.S. Hybridization of denatured RNA and small DNA fragments transferred to nitrocellulose // Proc. Natl. Acad. Sei. 1980. - 77. - P.5201

104. Maniatis Т., Jeffery A., Kleid D.G. Nucleotide sequence of the rightward operator of phage X // Proc. Natl. Acad. Sei. 1975. - 72. - P. 1184

105. Rigby P.W.J., Dieckmann M., Rhodes C., Berg P. Labeling deoxyribonucleic acid to high specific activity in vitro by nick translation with DNA polymerase I // J. Mol. Biol. 1977. - 113. -P.237

106. Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - 98. - P.503

107. Статистические методы в инженерных исследованиях // под ред. Г.Крука. М.: Высш.Школа, 1983. - 216с.

108. Зайцев Г.Н. Математический анализ биологических данных// М.: Наука, 1991. 184с.

109. Воронин A.M., Скрябин Г.К. Генетические аспекты деградации бактериями ксенобиотиков // Успехи микробиологии. М.: Наука, 1985. -Т.20. - С.39-60

110. Биотехнология. Принципы и применение // под ред. A.A. Баева М.: Мир, 1988.-480 с.

111. Уотсон Дж., Туз Дж., Курц Д. Рекомбинантные ДНК // Краткий курс: пер. с англ. М.: Мир, 1986. - С.84-861. АКТо проведении производственных испытаний штаммов-деструкторовхлорорганических соединений

112. В результате проведенных производственных испытаний подобраны штаммы, позволяющие повысить эффективность процесса биоочистки стоков. Максимальнаяя степень очистки сточных вод от хлорорганических соединений составила 99,7%.

113. Разработанный способ биоочистки рекомендован для использования в производстве.

114. Начальник цеха очистных сооружений

115. К.б.н.,ст.н.с. ИБ УНЦ РАН Н.с. ИБ УНЦ РАН Н.с. ИБ УНЦ РАН1. ОАО "Уфахимпром

116. Маркушева Т.В. Кусова И.В. Журенко Е.Ю.1. Еникеев Р.И.1. АКТо проведении производственных испытаний штаммов-деструкторов хлорорганических соединений

117. В результате проведенных производственных испытаний подобраны штаммы, позволяющие повысить эффективность процесса биоочистки стоков. Максимальная степень очистки сточных вод от хлорорганических соединений составила 88,4%.

118. Разработанный способ биоочистки рекомендован для использования в производстве.

119. Зам.гл.технолога зоны N 3"БНХ" ----Ф.Х.Мазитов

120. К.б.н., ст.н.с. ИБ УНЦ РАН

121. И.о.зам.гл.специалиста-по 00С зоны N 3 "БНХ"1. Е.А.Андрианов1. Т.В.Маркушева1. Н.с. -ИБ УНЦ РАН1. Н.с. -ИБ УНЦ РАН1. Е.Ю.Журенко

122. ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО1. Д У Б И Т Е Л Ь450026, Республика БАШКОРТОСТАН, г. Уфа, ул. Огарева, д. 2 Тел. (3472) 31-25-32 приемная Факс: 31-49-61, 31-49-66р/с 40702810607920001112 КБ СИБ г. Уфы к/с 30101810900000000739, БИК 048073739 ИНН 0276023118

123. Код по ОКПО 05133190, Код по ОКОНХ - 174101. Исх. №от1. А БИОЛОГИИ1. ЧУРАЕВ199 г.

124. РАЛЬНЫЙ ДИРЕКТОР "ДУБИТЕЛЬ"пА-С.ДУБАКИН1. V-* 1999г.1. АКТо проведении производственных испытаний штаммов-деструкторов хлорорганических соединений

125. В результате проведенных производственных испытаний подобраны штаммы, позволяющие повысить эффективность процесса биоочистки стоков.Максимальная степень очистки сточных вод от хлорорганических соединений составила 91%.

126. Разработанный способ биоочистки рекомендован для использования в производстве.1. ГЛ.ИНЖЕНЕР ОАО"ДУБИТЕЛЬ"1. К.б.н.,ст.н.с.ИЕ УНЦ РАН1. Н.с. ИБ УНЦ РАН1. Н.с.ИБ УНЦ РАН1. В.Д.ИВАНОВ

127. Т.В.МАРКУШЕВА И. В. КУСОВА Е.Ю.ЖУРЕНКО

128. УГТ № 1. 1999 г. Зак. 362 /03. Тио. 1000.