Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Деградация фенола, бензойной кислоты и ее производных почвенными бактериями

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Деградация фенола, бензойной кислоты и ее производных почвенными бактериями"

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСОСР САРАТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВСЕСОЮЗНЫЙ НАЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСШ ПРОТИВОЧУМНЫЙ ИНСТИТУТ - МИКРОБ"

На правах рукописи

ЫИРОНОВ Александр Давидович

ДЕГРАДАЦИЯ ФЕНОЛА, БЕНЗОЙНОЙ КЙСЛОТК И ЕЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПОЧВЕННЫМИ БАКТЕРИЯМИ

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов, 1991

Работа ввполнэна в Саратовском дожив Всесоюзного вгдояо-вссдэдоветелского кнститута генетики в селекцяи проявленная, някроргшшхов и Сарлтовскок Ордена Трддозого. ».рссного Зшшева Всесоюзной аадчво-ис^едозате/ъском протнвочдавеш анствтдте "Микроб".

Научные руководитель - контор иедицзмсик паев, профессор

пеанов ' арта? внйторсбмч

Сфн"чад;>щэ ошошштв - доктор ивдицанскяя нада, старввЗ шзчнай за&.отдоаив патательнв» сред ШШШГШ "Сихроб"

вешш мчесш «&ы1ч; каадндеттщкуцмят шц^.старБнй иавчшгё) сотрвдшт, зев.лаб. генетта й гшцкзлмки Стслрзпсдьсиого протвзочдхного каствтдта Кавказа к ЗаВ88КйЗЪО. ' ■

шатш ойег ййкзшвич.

Вззшжая организация - Р.одгогрзлсккЛ щятизочдшша ваститцт.

йвтореверат разослан 1991 г.

Защита состоятся »-О- -^L^tit/.^— 1391г. а часов

на озеедаялв спзцхаямзкровещааго 9чввого Совета Д 074.32.tj прн Сератазсисй Ордена Тридоссго Красного Знамени Всесоюзном ве^по-ЕСсгЕдоватгльсь-ой протазечзетои шетктете "üiaipoS" CilOl'/i, CiipüTOS, Зш385СйТ0Т£!ИЯ 46).

о . .

С дяссврткцггд ¡гояво «звзиоиятьса в библиотека кветкюта.

Ичвнвй секретарь слэциалнзмрогггвого Зчиваго Соьата доктор биадоптских паук

Ворвоев Г.Й.

СОДЕРЖАНИЕ РЯБОТК

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Проблема охраны окру«а«цей среды от загрязнений вредными веществами является одшй из глобальных проблей, стоящих в настоящее время Брег, перед человечеством.

Развитие и игенсификация современнной прэмыыилэнности и сельского хозяйства неразрывно связаны с применением новых материалов и технологий, что в конечной итоге способствует загрязнении биосферы токсическими соединениями, Среди больного количества веществ, поступавших с промышленными сточными водами в естесвенные водоемы, ванное место занимаот ароматические соединения, в числе которых находятся фенол, бензойная кислота и ее производные. Основными источниками этих ароматических соединений- является черная металлургия, газогенераторные станции, пищевые, фармацевтический и другие предприятия (Грувко Я.К.,1382). По характеру общего действия фенол, бензойная кислота и ее производные относятся к соединениям, имеющим ярко выраженные токсические свойства. Они вызывают раздражавшее, аллергенное, змбркотоксическое и другие воздействия на человека и теплокровных животных, в виде нарувения функционирования яизненно-вамных систем организма (нервной, пищеварительной, выделительной и др. У, а в дозах, превнаав^их предельно-допустимые концентрации (от cortix до десятых кг/л) могут вызвать летальный исход (Вредные вещества...,1976; Свнявин U.K., Ыясоодов Б.Ф., 1987., Dangerous properties of..., 1975).

Существенны и негативные экологические последствия воздействия на биосферу фенола, бензойной кислоты и ее производных. Вызывая гибель водных и почвенных организмов, в силу своей биорезистентности, зги соединении разрушэлт естественные биоценозы, что косвенно оказывает неблагоприятное воздействие на человека.

Иирокое распространение ароматических соединении ряда фенола и его производных в качестве загрязнителей окруяавщей среды и их вырааенное действие на биологический мир диктует необходимость разработки и использования эффективных методов очистки водоемов, <оторые максимально сникают . отрицательное воздействие этих :оединений на человека и окруяашщув среду.

К сожалению, современные технологические и санитарно-гехническке мероприятия зачастую не способны обеспечить достаточную 1ациту водоемов от загрязнения ар: (этическими соединениями. В [астоячее время разработаны различные методы очистки промышленных

- 4 - .

сточных вод от токсических ароматических ксенобиотиков, наиболее экономичными и эффективными из которых являются микробиологические, ' основанные на использовании микроорганизмов , адаптированного активного ила (Нилованов П.Ъ., Краснов В.П.,1967; Путилина Н.Т., Квмтницкая Н.Н., Ксотовецкий Я,И.,1964; ¡Оровская Е.М., 1984).

Однако, эта технология ке всегда обеспечивает достаточную степень очистки промышленных стоков, что обусловлено рядом объективна)' причин. Большинство микроорганизмов адаптированного активного ила из отвечает требованиям, предъявляемым к микроорганизмам-деструкторам:широтой субстратной специфичности, скорос-ыа ассимиляции, ■ способностью утилизировать высокие концентрации ароматических соединений без выделения и накопления в среде токсических пром'енуточных продуктов метаболизма.

"уцествцющие методы адаптации активных илов к сточным водам довольно сложны и требуют высокое предварительное разбавление стоков для предотвращения отравления микроорганизмов-деструкторов, что делает очистные сооружения громоздкими и относительно дорогостоящими.

Наиболее перспективным направлением повышения эффективности очистки промышленных стоков является выделение и селекция вксскозктивнм и иирояоспецифических штаммов бактерий-деструкторов, детальное изучение характеристик их биодеградативкой активности, а . такке ¿этапов подготовительного метаболизма ароматических ксенобиотиков. Это позволит создать компактные, экономически рентабкльные локальные системы очистки с использованием специально селекционированных для конкретного производства штаммов микроорганизмов, способных полностью удалить токсические ароматические вещества еще до подхода в об^ие очистные сооругения.

Кроме того, нркменяемкз в очистных сооружениях бактерии могут быть использованы для . получения микробного белка из непищевого сырья, подобно получаемому в настоящее гремя на углеводородах нефти и кетгиоле типа " Прцтин.", " Пекило", и др.С Кг1вег Л., 5Ьегиоос1 Й,,1584; бСг1пдег И.Й., 1982);

Однако, самой эффективной является очистка сточных вод при помоги микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованных на инертных, нерастворимых в- воде носителях. Иммобилизация микроорганизмов, участвующих в очистке сточных вод позволяет: , создать высокуи концентрации клеток, .устранить их внмнваемость из очистных соорцйений, сконструировать самые разнообразные микробные сообщества без их взаимной конкуренции, защитить ыикроорганизмы-десгруктон от

высоких бактерицидных концентраций токсических компонентов сточных вод Г Гвоздяк П.И,, 1987; Keueloh Н.. Heipieper H.H., Rehn.H.-J., 1989). Все вышеперечисленные данные и определяв! актуально с т ь исследований по выделении и селекуии новых штаынпв бактерий-деструкторов фенола, бензойной кислоты и ее производных, изучении их биоде-радатйвной активности и биохимических путей утилизации.

Цельи настоящей работы явилось внделение высокоактивных атамыов грамотрицатедышх бактерий, способных разруиать высокие концентрации фенола, бензойн.ой кислоты и ее производных: изучение этапов подготовительного метаболизма этих соединений, исследование принципиальной возможности применения их для локальной очистки сточннх вод предприятий химической промышленности. .

В соответствии с поставленной целью и на основании анализа литературных данных били- определены следующие конкретные задачи исследования:

1. Определить распространенность в различных природных биоценозах аэробных гранотрииательных бактерий, способных использовать бензойную кислоту и ее производные в качестве единственного источника углерода и энергии.

2. Изучить биодеградативнае . характеристики полученных и селекционированных штаммов: субстратную специфичность, оптимальные и лимитирувщие концентрации, время 1 утилизации ароматических субстратов, влияние температуры и аэрации.

3. Исследовать этапы подготовительного метаболизма фенола, бензойной кислоты и ее производных у селекционированных штаммов.

4. Нстановить принципиальную возмояность очистки локальных сточннх вод от ароиатических веществ-загрязнителей с псмоцьв свободных и иммобилизованных .клеток втанмов-деструкгоров.

НйЗЧНАЯ НОВИЗНА. Показано распространение бактерий, утилизирующих бензойную кислоту и ее производные среди общего числа грамотрицательных микроорганизмов природного ироисхоадения. Изолированы и селекционированы 2 ятамма псевдомонад с высокой специфичностью и деструктивной активностьи по отношения к фенолу, бензоату и его окси—, диокси-,. амино- и нитропроизводным ( получено авторское свидетельство на изобретение No 1597346 СССР).

Впервые показан путь подготовительного кетаболизка бензойной кислотк у итамма Pseudomonas pseudoalcaligenes MUH, ключевым интермедиатом которого является 2,3-диоксибензойная кислота.

Разработан ««год иммобилизации бактерий в гель агар-агара.

Показана перспективность использования этого метода при очистке сточных вод от дранола, бензойной кислоты и ее окси-, амино- и ' нчтропроизводних при помоци выделенных гтамыов. Получено пэловителъное решение на выдачу авторского свидетельства С заявка N0 4518803, полоаителсиое ре®ение па выдзчу а.с. от 28.0В.90)

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИШЬ РПЗОТН:

- в результата селекции выделенных из окруващей среды аэробных И Оакультатквно-аназробныых грамотрицательных микроорганизмов создана коллекция штаммов, способных утилизировать . различные ароматические соединения в качестве единственного источника углерода и знэг-ий в концентрации от 250 до 3000 ыг/л.

- наиболее активные итамии из этой коллекции идентифицированы, как. Р$еи<1о1опа8 р$еий&б1са115епез МОП С В—4347 > и РзешЗоиопаг сэра-Ла 5Н9 СВ-5873).

- ниакыы депонированы во Ваесовэн'ой коллекции промышленых микроорганизмов С" ВНК1! генетика", г. Иосква),

- подобраны оптимальные- условия процессов биодеградации ароматических соединений, входящих в спектр утилизируемых субстратов данными штаммами псевдоаонад.

разработан метод 'иммобилизации штакыов-деструкторов в полисахарлднье гели, позволяющий существзнно интенсифицировать процессы бнсдеструнции ароматических ксенобиотиков.

Практическая ценность исследований определяется такие ислользосаниеи штаммов-деструкторов в работе различных лабораторий научно-исследовательских институтов и высших учебных заведений (акты о внедрении от 18.С3.91 г:, 28.С3.91 г., 26,04.91 г., 07.05.91).

На зачьту выносятся сле-дупцие полонен и я:

1. Результаты исследований по изучению распространенности бактерий, способных утилизировать бвнзойнуа кислоту к ее производные среди грамотрицательных микроорганизмов различных природных биоценозов; биодеструктивной' 0 актизности выделенных и селекционированных щтаммпз; э.тапов подготовительного метаболизма ароматических субстратов.

?.. Результаты, обосновывавшие принципиальную возмоаность использования полученных втамысв для очистки сточных вед от ароматических . ксенобиотиков при помощи свободных и иммобилизованных '.¡леток,

АИРОБРЛЩ'РЙБОТЗ. Материалы исследования и основные положения были долоаеня и обсукдались на конференциях: "Экологические прс'лемы

Волги" (Саратов, 1988), "Обезвреяивание и регенерация органических отходов и растворителей" (Пенза, 1990), "Биотехника и биотехнология" (Вий-90) (Тамбов, 1990), "Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия" ( Оренбург, 1991),,.

ПУБЛИКАЦИЙ. По теме диссертации опубли.човано 9 работ, имеется 2 авторских свидетельства на изобретения.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИЙ. Диссертационная'работа состоит из введения, обзора литературы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, списка, литературы, включавшего 55 работ отечественных и 122 эарубепных авторов. Текст диссертации.изложен на 129 страницах машинописи г. иллюстрирован 10 таблицами, 18 рисунками И 3-мя схемами.

МАТЕРИАЛ» й МЕТОДЫ.

В работе использовано 530 кеидеятифицировашш;; штаммов грамотрицательных бактерий, выделанных из объектов внешней среды. 498 культур было выделено из образцов почвы, 32 - из образцов активного ила очистных сооружений и промышленных сточных вод предприятий нефтеперерабатывающей и химической промышленности.'

Микроорганизмы хранили на столбиках с 0,75% мясопептонным агзром Хоттингера с пересевами 2 раза в год. Культуры бактерий, способные утилизировать ароматические соединения хранили на полужидкой минимальной среде с иОО мг/л ароматического субстрата, или на 0,752 картофельном агаре, или в лиофилизированном состоянии.

В экспериментах иейзльзовали следующие среды: а) мясопептонный агар Хоттингера (рН 7,2), б) картофельный агар (рН 7,(КО,2), в) синтетическая минимальная среда Н9 (Миллер Дк,, 1976), г) индикаторная среда (г/л): МаНС03- 0,13; КН^РО^- 0,1; НН^С! - 0,05; дрожяевой экстракт - 0,01; броытимоловыЯ синий - 0,04; рН - 7,0 (А.с 13061)2). П'^и необходимости яидкие среды уплотняли добавлением агар-агара до конечной концентрации 1,5 г/я.

Культуры почвенных грамотрицательных бактерий выделяли из образцов, взятых с полей, обрабатызаеиых различными гербицидами; территорий промпредприытий, а. та^е лэсов, лугов, лесостепей Саратовской области. Для выделения микроорганизмов из проб сточных вод и активного ила применяли.метод накопительных культур.

Идентификацию выделенных штаммов-деструкторов проводили на основании изучения совокупности культурально-морфологических и Физиолого-биохимических признаков (Шендеров 5.Й., Серкова Г.П.,

. - 8 .

1900; Bews's, Í974; Hendrie U.S., Sheuati 3.H., 1979; Staniar R.Y,. Palleroni. NJ., Doudoraff M., I960),

Использованные в экспериментах ароматические соединения отечественного производства были дважды перекристаллизованы, фенол во. всех опытах быо свевег.ерегнанним.

Количественную характеристику процесса утилизации ароматических соединений определяли по' изменению величины пика оптической плотности-в УФ-области споктра, используя спектрофотометры СФ-26-01 и Upecoid М40 (ГДР). В пределах использованных концентраций (250-3000 кг/л) зависимость оптической плотности от концентраций аром^имвских субстратов' имела линейный характер. Динамику развития мигробнсй популяции изучали путам измерения оптической плотности кцдьтуральной аидкис'ти при 600,0 на с интервалами, равными 6 часав, Темг^рйтура кукьтивироваиия во всех экспериментах была 30°С, аэрация' достигалась перемевшцанием на круговом встряхивателе НШ-12-250.

Изучение этапов подготовительного метаболизма ароматических соединений проводили з экспериментах с целыми покоящимися клетками и бегл;лето".ныйи экстрактами, получекниаи " разрушением клеток ультразвуком н» дезинтеграторе -UD-11 ( ПНР). За ■ единицу Феригнтативной активности принимали количество микроыолей субстрата, потребляемого за. 1 мин I мг ферментативного белка. В качество косубстрата исполмовапи НЙД(Ф)11 (Р.еапаП. , Предварительное олрйдепении пути расцепления .ароматического кольца проводили качестзстшмим методами, в основе которых логит ярко-желтое окрааиваиие гредк инкубации при формировании полуальдегида гидроксимукэновой кислоты (мета-пугь), либо положительная реакция 1'отера Í орт о—путь) (Otto« З.С., Zeig Н,, 1974).

Содержание .б прчде аммиака, нитратов и нитритов определяли общепринятыми методами^ Лурье ¡D.S., 1971).

Выделение и идентификацию продуктов метаболизма нитробензойних кислот, а такав биологическую активность штаммов-деструкторов в промышленных сточнкх водах проводили и изучали при помоки тонкослойной, высокоэффективной аидкостной и газо-яидкостной хроматографии. ;

Иммобилизации,итомшш-деструкторов осуществляли путем дробного внесения клеток, сманенных с 4У. раствором агар-агара в охламдзнкое вазелиновое ' масло' определенной динамической вязкости (Кораеневич Б,И. и др., 1,930).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В настоящее время известно достаточно больиое количество микроорганизмов, утилиаирущих ароматические свздинения в качестве единственного источника углерода и энергии, однако, поиск высокоактивных штачмов постоянно продолжается С Antat J.P., Crawford O.L., 1983: Krug Н., Ziegler Н., Straube G., 1935),

Считывая, что по данным литературы, наиболее активными деструкторами различких ксенобиотиков является грамотрицагеяьные бактерии (Скрябин-Г.К., Головлева H.A., 1976), в качества объекта наших исследований была выбрана именно эта группа микроорганизмов.

Выделение бактерий, способных разрушать различные ароматические субстраты, проводили на минимальной синтетической среде М9 и специально разработанной для этой цели индикаторной среде, позволяющей быстро обнаружить сред» обцего числа микроорганизмов бактерии-деструкторы, огличзвциеся от остальных колоний интенсивной аелто-коричневой окраской. Били изучены образцы почв, постоянно подвергаемых антропогенному загрязнения - полей, промышленных предприятий; и не находившихся в контакте с химическими загрязнителями - почп лесов, лугов, лесостепей; а такяа образцы промышленных сточных вод и активного ила очистных сооруяений.

Из всех проб было выделено и изучено 530 культур аэробных и факультативно анаэробных грамотрицательных бактерий. Из них было отобрано 123 штамма, способных к росту на минимальной синтетической среде с ароматическими соединениями в виде единственного источника углерода и энергии. Эти бактериальные штаммы были селекционированы на средах, содержащих возрастающие концентрации бензойной кислоты и зе производных от 5С0 до ЗООО ur/л. В результате проведенной селекции нам удалось выделить из общего числа микроорганизмов -Деструкторов 2 штамма бактерий, способных утилизировать значительное число различных ароматических соединений; фенола, резорцина, гидрохинона, пирогаллола,бензойной кислоты и ее окси-, диокси-, амино- и нитропроизводных, а гакге толуиловых :* фталевых кислот. Ятзмм SK3 разрушает 11 ароматические*субстратов, а штамм MV11 - 22 из 36 изученных в концентрации SOO-3000 мг/я,

На ' основании изучения морфологических, культуральных и биохимических свойств, штаммы SM3 и ЙО'11 , были идентифицированы как Pseudomonas cepacia и Pseudomonas pseucioalca! igenes.

Путем сравнения биодеструктивной активности данных штаммов при

- 10 - ...

Различных условиях культивирования были определены оптимальные условия пр-оцэссов утилизации ароматических субстратов: температура -. 30°С, pH - ?,0t0,2; интенсивная аэрация ( г/льтивирование на круговом естряхивателз при 160 об/мин); концентрация субстрата -500—¿ССС мг/л. В sOix условиях содержание в среде ароматических соединений снижалось за "-'24-120 часов инкубации на 85-99% (граница чувствительности метода определения).

С цэлбш выяснения вопроса о возмо«ном применении полученных ■танков для биологической очистки промыалвнных сточных вод было проведено изучение этапов подготовительного метаболизма фенола, бакаойчой, антранкловой • и нитробензойных кислот, т.к., при утилизации микроорганизмами многих ароматических веществ в среде культивирования могут' образовываться и накапливаться промеяуточные продеты метаболизма, прерывающие по своей токсичности исходные сочинения,

Известно, что биодеградация фенола под действием бактериальных монооексгеназ всегда идет через стг.дии образования пирокатехина, хотя эти ферменты, могут отличаться у различных микроорганизмов (Карасевич Ю.Н., 1S82; Buswel1 J.Д., 1975). Для проверки предположим о вогмовнсй роли пирокатехина в качестве интермедиата пути деградации фенола исследуемыми штаммами было проведено изучение 'активности 0'есоеточкых экстрактов по отношении к этому соединенна. При добавлении экстрактов клеток штамма - Pseudomonas, pseudoalcaligenes Müll к ЮмК раствору пирокатехина, было обнаружено гноение основного, пика поглощения пирокатехина (274,0 нм) в длинноволновую область спектра и появление нового пика при 375,0 нм. Зти указывает на формирование полуальдегида гидроксимуконовой кислоты, который- образуется из пирокатехина при мета-разрыве ароматического кольца. Коньчниьи соединениями этого пути метаболизма явлчттся пировиноградиая кислота и ацетальдегид, которые затем включатся в основной обиек микробной клетки,.

Бвсклеточные экстракты штамму Pseudoaonas cepacia SMS• так^з активно взаимодействовали гс пирокатехином, .однако, смещение максимума поглощения пирокатехина происходило в коротковолновый участок спектра с максимумом 260,0 нм. Это указывало на Формирование цис.цис-иуконэвой кислоты, которая образуется из пирокатехина при расцеплении ароматического кольца по орто-пути. Положительный результат реакции Ротера позволил установить дальнейшее превращение цис.цкс-мукснэвой кислоты в 3-кетоадииинозув кислоту под действием пирокатехин-!.2-дииксигенази (пирокагехазы). Продц; :амй

- Ii -

подготовительного метаболизма пирокатехина пс 3-кетоадипатному пути являится янтарная кислота и ацетил-Кой- классические метаболиты г микробной клетки.

В дальнейием было установлено, что клетки обоих штаммов, выращенные на синтетических минимальных средах, сэдераащих сукцинат,. цитрат, или различные ароматические соединения (кроме фенола), а такие их бесклеточные экстракты, не сбладэит фенолгидроксилазной и пирокатехазной активностьо. Это свидетельствует о том, что ферменты начального этапа метаболизма фенола у . обоих итаммов имеют индуцибвльиув природу. *

Максимальная ферментативная гктивность у покоящихся клеток штамма SM9,выращенных на беизоате или антраниловой кислоте была также отмечена к пирокатехину,а в среде инкубации удавалось обнарцяить цис.цис-муконовув и 3-кетоадипиновув кислоты. Таким образим, было установлено, что утилизация бензойнтй и антраниловой кислот у втамма Pseudomonas cepacia SMS осуществляется через образование пирокатехина с последующим расцеплением ароматического кольца по орто-пути.

Наибольшая Активность клеток втамма Pseudoisonas pseudoalcaligenes MUil, выращенных на бензоате и антранилате и их бесклеточных экстрактов отмечена к 2,3-диоксибензойной кислоте. Среда инкубации, такяе, как и в экспериментах с фенолом, приобретала прко-яелтую окраску и отмечалось быстрое накопление полульдегида гидроксимуконовой кислоты. Ферментом, катализирующим эту реакции, является 2,3-диоксибензоатдиоксигеназа. Таким образом, у данного штамма метаболизм бензойной и антраниловой кислот осуществляется через стадии образования 2.3-диоксибэнзойной кислоты с последующим^ расщеплением ее ароматического кольца. :

Кроме специф~шских, индуцибельнах систем ферментов утилизации фенола, бензоата и антрачиловой кислоты, клетки итаммов Pseudoacnas pseudoalcaligenes MU11 и Pseudoaonas cepacia SM9 имевт конститутивнка моно- и диоксигеказние ферментативные система. В к* числе находятся З-оксибензоатмокооксиген^за, 4-оксибензоатмоноокси-геназа и 3,4-диоксибензоатдиоксигеназа (протокатехоатдпоксигеназа), которые, по-видимому, могут катализировать превращение ароматических соединений другим, альтернативным путем, который может иметь место в определенных условиях.

Этапы подготовительного метаболизма нитропроизводных бензойной кислоты у изучаемых штаммов имеют ряд характерных особенностей. Известно, что утилизация нитровроматичвских соединений у р-г-.гичных

видов микроорганизме начинается либо с прямого гидролитического отщепления нитрогруппы íCarturtgbt N.3., Cain R.B,., 1959; Zeyer 3., Kearney P., 19Gfi), либо с ее восстанивления до аминогруппы (Cain R.B., 1966),

В предварительных экспериментах были установлено, что процесс утилизации орто- и нараннтробензойных кислот втаммами Pseudoncnas cepacia и Pseudosonas psei'doalcaligenes сопровождается выделением в с f. лду культивирования ионов аммония, а накопления нитритов, в среде не отмочено. Образовавшийся аммиак в процессе роста клеток обоих штаммов не накапливается в среде, а используется в качестве источника азота (в Оезаэотистгй среде). Выросшие клетки способны к редукции неорганических нчтратов до нитритов и далее - до аммиака, хотя в экспериментах по идентификации выделенных штаммов было установлено, что бактериальные культуры KUH и SM9 не способны к денитриаикации. Следовательно, первыми этапами метаболизма нитробензойных кислит у штаммов Pseudomonas pseudoalcali genes MUI! и Pssudoionas cepacia SMS является восстановление нитрогруппы до аминогруппы. Зтот процесс катализируется индуцибелькой нигроредуктззой с широкой субстратной специфичностью. Таким образом, при утилизации орто- и паранитробензойных кислот у исследуемых штаммов, первыми образовавшимися соединениями должны быть антраниловая и 4-амикобгнзойная кислоты. Однако, анализ данных, полученных при изучении ферментативнной активности покоящихся клеток обаих штаммов, выращенных на среде с 2-нитро- и 4-нитробензойными кислотами, а также ферментативной активности бесклето'.ных экстрактов, показал, что ферментативная активность по отношению к антраниловпй и 4-нитроОензоАной кислотам полностью отсутствует. В связи с этиы, были предприняты попытки поиска и идентификации прсмвкугочнах продуктов начальных этапов подготовительного метаболизма нитробен^оЛнцх кислот у изучаемых штаммов. При помощи высокоэффективной «идкостиой" и тонкослойной хроматографии якс1,.акг(1в, полученных из культуральной «идкости растущих клеток, " было установлено, что ч°.рез 24 часа культивирования в среде инкубации появляется соединения, имеющие хроматографические характаристики. совпадающие с характеристиками, полученными для чистых препаратов антраниловий и 4-аминобенаойных кислот. Через 2-3 часа концентрация этих веществ в среде инкубациь резко снижалась и oOHripysMTb их s дальнейшем" не удавалось. (Io-видимпму, в данном случае, имеет м?сто явление катлболитной репрегии. 'когда сиг;;ин-ни-з. KfTupue образуются ю «мтрлнпяовой и 4- аминобйн.-юйной

кислот полностью ингибирувт синтез и активность антранилат- и 4-амицибеизойтмониоксигемаз. Наибольвуи активность клетки втакмов Pseudomonas pseudoalcalifienes ÄUil и Pseudoaonas cepacia SM9, выраценнае на шыцЫальной среде с нитробензойники кислотами проявляли к 3- и 4-окси- и 3,4-диоксибензоймым кислотам. Реакция Ротера, позволявшая oßiiapyiHTt> 3-кетоадипиновуш кислоту в обоих случаях была полаяительной, Полученные данные позволяет предположить, что подготовительный метаболизм нитробензойных хислот у итаммов Pseudomonas pseudoalcaligenes Htfll. и Pseudoaonas cepacia SM9 начинается с восстановления нитрогруппы в аминогруппу с образованием соответствующего ариламина. Промевуточным этапом .является гидрокс.иирование ароматического кольца в мета-полояении, с последующим отщеплением аминогруппы и Формированием протокатеховой (3,4-диоксибеизойной) кислоты, которая затем расщепляется по OpTO-I.jth.

Таким образом, подготовительный метаболизм фенола, бензойной н антраниловой кислот у штамма Pseudoaonas pscUdoalcaligenes HU 11 осуществляется по мета-нут при помощи системы ннл.уцибельных Серпентов, Ключевшс интермедиатом деградации фенола является пирокатехин, а бензоата н антрапиловой кислоты - пирокатехоат (2, 3-диоксибензойная кислота).

Утилизация этих соединений итаммаы Pseudoaonas cepacia SH9 идет по орто-пути. Ключевым интермедиатом в данном случае является пирокатехин.

ß процег.св биодоградации указанных ароматических соединений образования и накопления токсичных проиезуточных. продуктов не происходит, т.к., конечными лроцуктами метаболизма являются^ пнровиноградная и ангарная кислота, ацетальдегид и ацетил-КоА -классические метабс^иты основного обкенэ'бактериальной клетки.

Результаты изучения биологической активности итаммов Pseudomonas cepacia и Pseudosmnas pseudoaJcaligenes в модельных и реальных сточных водах продемонстрировали, что выделенные наг?

итакнц-деструкторн вполне пригодны для эффективной очистки сточных

о

вод промышленных предприятий. 0 качестве модели промышленных сточных вод, содераащих амине- и питропроизводнав бензойной кислоты использовали стоки 1.'араговского биохимического завода, в соторкв вносили 5 000 .мг/л лнтраниловой и 1 ООО мг/л 2-нитробензойноЯ или 4-1штробензойной кислот. Кило установлено, чтоантранияовую кислоту клетки изучаемых штаммов полностьв утилизирует за <¡4 часа инкубации, iE та мм Prieudosunas cepacia SM Я tajpyj.joi 4-нитробензойнуч кислот:; в

концентрации 1000 мг/л за 36 часов инкубации на 38, ТА, а штамм Pseudoaonas pseudoalcalieeues KVll утилизировал 1000 мг/л 2-нитробензойной кислоты за 48 часов на 97,5Z.

Биологическую активность изучаемых штаммов псевдомонад в реальных о,'очных годах определяли на образцах локальных стоков производства фенола и ацетона-п/о "Нитрон" г, Саратова. В результате химического анализа било устан9влено, что в состав этих стоков вхт.ят фенол, бензойная, 4-оксибензойная кислоты и следовые количества . ацетофчнона, мзтилстирола и0 ацетона. Проведенные исследования показали, что свободные клетки обоих штаммов псавдомонад активно и быстро утилизировали бензоат и 4-оксибензойнув кислоту, содержащиеся в стоках. Деградация фенола осуществлялась намного медленнее, а степень его утилизации была невысокой. Применение иммобилизации клеток в геяь агар-агара позволило значительно активизировать этот процесс. Концентрация фенола, равная 1200 мг/л снималась за 43 часов практически до нуля.

Полученные результаты свидетельствует о высокой активности' -тамиов Pseudoaonas pseudoalcallgenes Hüll и Pseudomonas cepacia SMS -no отношению к различным соединениям ароматической природы, что позволяет рекомендовать их для применения в системах локальной биологической очистки, а такве при формировании и улучмении активного ила обцих очистках соорукений.

ВЫВОДЫ

1. Изучена биидеструктивная активность 530 штаммов грамотрицательных аэробных и факультативно-анаэробных бактерий, выделенных из объектов окружающей среди. Из них отобрано 2 штамма бактерий, способных утилизировать „ от 14 до 22 соединений ароматического ряда в качестве единственного источника углерода и энергии. Эти штоммм идентифицированы как Pgeudpnonas pset' 'oalcdiigenes и Pseudomonas cepacia. <?

2. Максимальная деструктивная активность штаммов проявлялась в минимальной синтетической срг-е при температуре 30°С, pH 7,0^0,2, принудительной аэрации и концентрации, оптимальной для данного ароматического субстрата (в пределах ит S00 до 2000 мг/л).

3. Изучены этапы подготовительного i. ,та0олизма фенола, бензойной кислоты и ее амино- и нитропроизводных, Установлено, что их утилизация осуцествляется по мета- и орто-пути при помоци сгстем консти.утивных и индуцибельных Ферментов.

4. Исследована активность «таймов в модельных и реальных промышленных сточных водах, содержащих фенол, бензойнуп кислоту и ее окси-. амино- и нитропроизводнче. Установлено, что выделенные зтаммы активно разрушали ароматические компоненты сточных вод: бензойную. 4-оксибензойнуш, 2- и 4-нитробензойные кислоты. Деградация фенола осуществлялась менее активно.

5. Разработан метод иммобилизации клеток штаммов-деструктороз в полисахаридные геля. Установлено, что иммобилизованные клетки способны полностью удалять все ароматические конпоненти из сточных вод со значительно больней активностьп и за меньший промеауток времени, чем свободные клетки. Это позволяет рекомендовать полученкие втаыыи бактерий для промышленного применения в локальных очистных соорузениях или для улучшения биоценозов активного ила систем общей очистки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Деградация амино- и ьитросодераащих соединений почвенными бактериями// Экологические проблемы Волги: Тез.докл.зон.хонф.-Саратов, 1989,- С,149 - (в соавторстве с Й.Л Барковским., В.Ю.Крестьяниновым., И.Я.Евтушенко).

2. Утилизация компонентов фенолькнх сточных вод бактериями// Обезврезивание и регенерация твердых органических отходов и растворителей: Тез.докл. зон.конф,- Пенза,- 1990,- С. 10-11 ( в соавторстве с А.П.Гуменвкои, В.И.Корхеневичеи, В.Б.Крестьяниновым,-й.й.Сингирцевыы, й.Я.Федоровым).

3. Влияние компонентов.сточных вод фенольнога производства на, биоконверсии фенола микроорганизмами// Биотехника и биотехнология (ПиБ-90): Тез. дотл.нзучно-техн.конф.- Тамбов, 1990,- С.117-118 (в соавторстве с В.Ю.Крестьякинозыа, И.Н.Сингирцевыи, й.В.Федоровым, Т.В,Плац)'.'

4. Активность штаммов-деструкторов ароматических соединений иммобилизованных в гранулы агарового геля// Прикладная биохимия и микробиология.- 1991.- Т. 27, выг. 3,- С.366-370 ( в соавтопства с В.И.Коркеневичем, 0.В.Игнатовым, Я.Л.Барковским, Й.В.Кривопаловым).

5. Деструкция 2-нитробенэойной кислоты и других ароматических соединений штаммом, Рйеийопопаз рзеийоа1саПеепез// Прикладная биохимия и микробиология,- 1591.-Т.27, вып.4,- С.110-115 (в соавторстве с В.Ю.Крестьяниновым, В.И.Коряеневичем, Я.Л.Барковским, И.Я,Евтушенко). - ■ ' >

S, Metabolism of aronatic compounds by soil bacteria// Abstr. 20th FEEBS Meeting, Budapest, Kung.. august 19-24,1390; Budapest, 1990.- P.Th 649 (co-authors - tf.I.Korgzenevitch, U.Ju.KrestJaninov).

7. Bacterial utilization of cooponents of phenolic wastes// flbstr. 8th 'intern. Biodeterior. and Blodegrad. SyiaposiuB, Univer. of Windsor, Canada, August 26-31, 1990. Windsor, 1990,- Ps. 23 (co-authors - U.I.Korgzenevitcli? li.3u,Krestjaninov, fl.Ju. Fetfdorov).

л 8, Klcrobial degradation of benzoic acid and its derivatives by soil bacteria// flbstr. 8th Intern. Bioileterior. and Biodegrad. Syaposiun, Univer. of Windsor, Canada, August 26-31, 1990, Windsor, 1990 (co-authors - U.I.Korgzenevitch, U.Ju.KrestJanlnov, fi.Ju.Feodorov).

9. ' Авторское свидетельство Но 159734В "Итамм бактерий Pseudoaonas pseudoalcallgenes, используемый для очистки сточных вод от ароматических соединений" (соавторы - В.И.Корненевич, А.Л.Барковский ).

10. Авторское свидетельство на заявку Но 4618803 " Способ иммобилизации микроорганизмов, способных разрушать ксенобиотики " (соавторы - В.И.Кораеневич; О.В.Игнатов, В.В,Кривопалов, А.Л.Барковский).