Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Микробная деструкция нитрофенолов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Микробная деструкция нитрофенолов"

г г Б од

1 3 ММ 12£5

Государственный комитет ло санитарно-эпидемиологическому надзору Российской Федерации НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ПГОТИВОЧУМКЫЯ ИНСТИТУТ "МИКРОБ"

На правах рукопись'

СЙНГИРЦЕ8 Игорь Николаевич

МИКРОБНАЯ ДЕСТРУКЦИЯ НИТРОФЕНОЛОВ

03.00.0? - Микробиология

•А В-Т О Р Е Ф Е Р А Т

диссертации на соискание ученей степени кандидата биологических наук

Саратов. - 1993

Работа.выполнена в Саратовском Научно-исследовательском институте биокатализа (Саратовском филиале государственного научного центра РФ генетики к селекции промышленных микроорганизмов) и з Саратовском государственном ордена Трудового Красного Знамени медицинском университете.

Научные руководители - действительный член Российской

академии естественных наук, доктор медицинских наук, профессор Г.М.Шуб; кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник З.И. Корхеневич.

Официальные оппоненты -

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор медицинских наук, профессор Самойлова Любовь Владимировна

- кандидат биологических наук Игнатов Олег Владимирович

Ведущая организация - Волгоградская' медицинская

академия

Защита диссертации состоится ССЬОИ-^- 1985 г.

в часов на заседании специализированного совета Л 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (41С071, г.Саратов» ул. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РНКПЧл "Микроб",

Автореферат разослан "3" МСХ^Я, 1983 г.

Ученый секретарь Специализированного совета * доктор биологическкх наук

I1. А. Корнеед

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Рост промыкшениого производства сопровождается загрязнением скрухагацей среды продуктами деятельности человека. Большие количества псллютантов вносятся s природные биоценозы с неочищенными промышленными сточными водами, негодный сброс которых достигает 70Q млрд. куб. метров, и песа-яци^ами, мировое производство которых превышает 1,5-. млн. тонн -(Лукъяненко 8.И., 1979). В связи.с этим проблема защиты окружающей среды становится поистине глобальной'- и требует от человечества сосредоточенных усилий по предотвращению самоуничтожения.

- Рост объёмов производств, а также использование устаревших технологий и. оборудования, в.тем числе и .в нашей странеприводит к тому, что всё большее и большее количество сырья, промежуточных и конечных продуктов, ка предприятиях химической.промышленности попадают в сточные.воды,.а с ними - и в объекты окружающей среды.

Особенно пагубно-сказывается на биосфере попадание в водоемы, атмосферу и почву веществ, чуждых живей природе.--ксенобиотиков. Бее больший удельный вес среди них приобретают нитроарсматические соединения. В почву большинство этих веществ попадает.в виде пестицидов, а в водоёмы - с промышленными сточными водами (Наумова Р.П., 1985). Так, при производстве взрывчатого вещества, -состоящего на 70% из 2,4,6-тринитрсфекола-(ТН<1>) и ка.30%- из 2,4-динитрофенола (2,4-ДКФ), с каждой тонны продукции-со сточными ведами теряется до 130 кг готового продукта (Петру А., 1955).

Нитроарсматические соединения характеризуются достаточно высотой токсичностью для всех организмов. Нитробензолы и нитротолуола указывают токсическое: - воздействие на рыб при концентрациях 0,008 -3,02 г/я, а на Человека - при 0,01 г/кг {Груш® Я..М., 1S82). Токсичность моионитрсфенслов. возрастает'.'по 1«ере.удаления нитрогруппы от 'едроксильнсй и . является максимальной-: :для" п-нитрофенола (п-НФ) СГ-рушко Я.М., 1932).- Минимальные леталькые концентрации нитрофенолов ;ля рыб'составляют: 0,004-0,006 т/л для п-НФ,. 0,009-0,01 г/л для нитрофенола- (м-НФ) и 0,014-0,018 т/л для о-нитрофенола <о-КФ).--05о для белых крыс равны, 0,25 г/кг для-п-НФ и 0,33 г/кг для о- и j-НФ. На основании изучения токсических, свойств мононитрофенолоэ для «екопитявдих были установлены следующие лимитирующие концентрация: >,25*1а"4 г/л для п-тй и 0,б*Ю~4 г/л для м-НФ (Махиня А.Я., 1569). ЗК для водоемов, установленные по сакитарно-токсикологическому ¡ризнаку, составляют 0,2*10~4 г/л для n-Bf и 0,6*10"^ г/л для о- и При этом в сточных водах, направляемых на биологическую очист-гу, 1ЩК составляют 0,1, 0,3 и 1 г/л для п-, м- и- о-НФ соответств<?н-:0.

Существуювде физико-химические методы очистки промышленных сточных вод (СБ) от нитроароматических веществ характеризуются технологической сложностью,.. энергоёмкостью, требуют большого количества расходуемых материалов и реактивов. При этом далеко не всегда достигается полная очистка, тая как нередко 'образуются токсичные промежуточные продукты и твёрдые остатки (Шевченко .4.А. и др., 1931, Вей-сенСаез O.K. и др., 1992, Adams E.G., Barker R.B., 1990). ,

Наиболее перспективными в настоящее время считаатся биологические методы очистки сточных, вод. - Под биологической очисткой понимают удаление органических соединений.из бытовых и промышленных, сточных вед при пемоаи микроорганизмов, использующих эти вещества в.качестве источника углерода.' Через серию реакций, катализируемых ферментами подготовительного метаболизма,, ксенобиотики включаются в основной метаболизм микробной клетки, где часть углерода, содержащегося в молекулах соединения, идет на синтез биополимеров бактериальной клетки, а часть окисляйся до углекислого газа, давая микроорганизмам необходимую энергию.

Общеизвестно; что использование специально выделенных:и селек-щюнировйняых высокоактивных штаммов-деструкторов ксенобиотиков в биологических системах очистки является более эффективным, чем использование активного ила (ЛИ) (Ротмистров М.Н., . 1975, Очистка.... 1987, KroGS H., 1S82). íf, хотя на основе последнего разработано множество достаточно простых и дешёзых технологий очистки сточных вод от ароматических веществ, некоторыми исследователями вполне обоснованно ставится под сомнение пригодность активного ила для очистки сточных год о? китрсгроматических соединений, в том числе и от нит-рсфенелов, (Вгкуленко В.Ф. и др.,. 1987). Так, 2,4-динитрофенол уже в концентрации 0.СО5 г/л через 2,5. часа пркзодит к полной потере активности ада очистных сооружений ■ (Bringrnann G., Kuhn R. ,• 1959). Использование высокоактивных штаммов-деструкторов позволяет . создать компактные, экономически рентабельные локальные очистные сооружения, способные полностью устранять', основные токсичные загрязнители, в первую очередь ароматические, - ещё до поступления сточках вод на: общие заводские к общегородские очистные сооружения. Таким образом, выделение и характеристика активных ытаммов-деструкторов китрофено-лов про^ог^лт оставаться актуальной задачей. • -

Процессы микробной деградации п-, .о- я м-КФ изучены достаточно хорошо (Eundersen К., Jensen H.L., 1S56, German1er ß., Wuhrmann К., 1953, Jensen H.L.Lautrup-LarsenG., 1957, Munnecke D.M., Hsieh O.P., -1574, Sudh&kar-Barik, Siddaramappa R.Sethunathan N., 1S76, 2eyer J.. Kocher H. P., 1S88, Dimkov R., Topalova Y., 1993). Однако

, - 5 -

сведения об утилизации 2,4-ДВФ и ТН2> носят единичный и весьма противоречивый характер (Lenke H. et al., 1992, Lenke H., Knackmiss H.J., 1992, Rieger P.-6. et al., 1994).

Отсутствуют также сведения- к о возможности пршенения штаммов-деструкторов для очистки промышленных сточшгх вод от нитрофено-лов.

Известно, что для повышения эффективности работы очистных сооружений целесообразно использовать клетки микроорганизмов-деструкторов, иммобилизованные на различных носителях (Егоров' Н.С. и др., 1984, Гвоздяк ÏÏ.U., Дмитриенко Г.Н., Куликов Н.й., 1985, Очистка.... 198?, Klein J., Wagner.F., 1978). Иммобилизация позволяет создать высокую концентрацию клеток штаммов-деструкторов, предотвращает их вымывание из реактора, .защищает, хотя бы частично, от воздействие высоких концентраций токсических компонентов сточных вод и, таким образом, обеспечивает более высокую удельную спедафическую деструктивную активность микрофлоры. Для очистки сточных вод от ароматических соединений/ наиболее распространённым является использование простых и относительно дешёвых методов адсорбции на различных носителях, в первую очередь на химически и биологически инертных, нерастворимых в воде синтетических полимерных волокнах (Никозская Г.Н., Гордиенко A.C., Глоба А.И., 1986, Синицкн А.П., Райникз Е.И.. Ефремов A.B., 1986). Однако, вопросы адсорбции на поверхности носителя тех им иных конкретных штаммов требуют самостоятельного решения. . ■

Таким образом, изучение распространённости микроорганизмов, способных утилизировать различные нитрофенолы, определение связи между загрязнённостью биоценозов и количеством етэмуов-деструкторов, а также разработка микробных методов охраны окружающей среды от загрязнения нитрозамещенными фенолами, основанных на создании коллекции высокоактивных микроорганизмов-деструкторов этих соединений, способных разлагать их без накапливания промежуточных продуктов, и на изучении оптимальных условий проявления биодеструктивной активности в синтетических средах и в реальных сточных водах как в свободном, так и в иммобилизованном виде, является важной задачей.

.- ПЕЛЪЮ НАСТОВДЕЗ РАБОТЫ ЯВИЛОСЬ:

Создание коллекции высокоактивных штаммов-деструкторов различных нитроФенолов, изучение оптимальных условий проявления их деструктивной активности, создание биореактора и изучение условии использования выделенных штаммов для очистки сточних вод конкретного производства от п-нитрофёнола.

■В~соответствии с поставленной целью были определены следугтае

е-

конкретные задачи исследований. .,

■ Л. Определить:распространённость в ■; объектах окружающей г^еды штаммовмикроорганизмов,. способных использовать в качестве единственного источника, углерода и азота различные китрофенолы,-

. 2. Провести селекцию • наиболее активных штаымов-дестругсгоров; оптимизировать условия. проявления их. активности; . определить спектр утилизируемых субстратов; изучить.этапы подготовительного метаболизма нитрофенолоЕ;.' подобрать условияпредотвращающие накопление промежуточных продуктов. ¿ . ,

, 3. Изучить биологические характеристики- отобранных штаммов . и идентифицировать их. ' 'V . . , -

4.- Выбрать, оптимальный носитель для иммобилизации штаммов-деструкторов. ; ,.' :. .'.'• /-'■'-- ' . •

5. Изучить деструктивную - активность "селекц>юнироБанных штаммов в образцах реальных сточных вод-как-в свободном, так и з иммобилизованном на выбранном носителе состсйнии. •

6. Создать действующую лабораторную модель биореактора .для очистки сточных вод конкретного, производства от нитрофенолов и. разработать регламент его работы.

Б работе получены следующие ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ. Исследована С конструктивная активность -658 шггм.моз грампслсжн-тельных к: грамотрицательньдх бактерий,, выделенных из 93 • проб почв промышленных.предприятий, 'сельскохозяйственных, площадей, лесов, лугов, сточных вод к вод'прудов-накопителей. Отобраны 34 штаммов микроорганизмов Í2Z)способных утилизировать различные" ннтрозамещённые фенолы в качестве единственных источников углерода и азота. .;,

Изучены морфолога-культурадькые и . физиолого-бкохимичесгае характеристики выделенных втаммов к ; проведена * их идектазмкашя.. 6 штаммов были идентифицированы как Pseudomonas put ida, 2 как Pseudomonas sp., 2 как Acínetobacter calcoaceiicuT. к 4 как Corynebacterim sp. Штаммы Corynebacterium sp.-ЕЧК-2, Pseudornonas pulida С-11 и Pse-uooraonas putíaa БА-11 депонированы во Всесоюзной коллекции' прошв-ленных микроорганизмов ..ВНИИ генетики и. селекции промышленных микроорганизмов,.'.-. IV Москва. Получено положительное решение на выдачу патента R& на изобретение о? 05.03.95. . по заявке Н S3G21733 - "Етамы Оактерий СогупеЬас*.ег1ш sp. В-543? - деструктор ароматотесккх .соединений". - /.- -

Подобраны оптимальные "условия проявления Сиодеструктквной активности втаммов-деструктороз (рН среды 7.2-8.4. t»30'C, интенсивная аэрация, безазотистая среда). , _ • _

Среди. деструкторов кзгдого соединения отобраны гта.ммы, обладав

- f -

wis максимальной-деструктивной активностью.

•Изучена деструктивная активность итаммов в образцах реальных сточных вод как в свободном, так и в иумобидизовачнсм (адсорбцией на волокнах) состоянии.

Создал лабораторный бисреактор с противотоков воды и воздуха и неподвижной загрузкой длят очистки сточкьи вод производства мета1ос.г от n-нитрофенола, разработан регламент его работы с учетом возможности прерывания функционирования.

Показана высокая эффективность использования микроорганизмов- деструкторов для очистки образцов реальных сточйых вод. Сточнк-воды, содержащие п-нитрофенол в концентрация 0,8 г/л, полностью очищались от основного загрязнителя за 2 суток. Пр*длсх»ны рекомендации по их использовании в промышленных условиях. ' "

НАУЧНАЯ нпьиг<нд проведенных исследований.

Показана се*зь медду каличесгвсм~'микрооргаяизмов-деструктс;:оа и степень» загрязненности почвы.

Показано, что среди «икрсфлорн природного происхождения чреэвы-чайно низко распространены микроорганизмы, способные разлагать нит-розамеценние фенолы.

Впервые/путем селекции создана коллекция высоюэф{>окти8ных штаммов-деструкторов различных нитрон-колов, д.-.ча их биологическая характеристика, изучены пути метаболизма субстратов. Показана возможность микробного разделения п-НФ 8 концентрации до 0.8 г/л. о-Н+> - до 0,9 Г/Л, - до 0.2 Г/Л, 2,4-Д№,> - ДО 0.6 Г/Л ».WJ - ДО 0.9 г/л. На один из штаммов получено положительное ревеиие на задачу патента *

На защиту выносятся следующие положения.

1. Результаты исследований по изучений распространенности микроорганизмов, способных уталиьировзть нитрс*}»нсаы, среди бг.чтеркй различных природных оиоценозов: биодеструктивной активности выделенных втаммов; путей подготовительного метаболизма нитрсФекапоа .наиби* лее активными-селекционированными штаммами.

2. Регламент использования полученных йтйммоз-деструкторов зля очистки сточных вод от нитроароматичесюк ксёнобкотикса при помоем свободных и иммобнлигоы ннкх клеток.

НАУЧНО-П?АКТИЧг>ЖАЯ ЗНАЧИМОСТЬ.

- согд.чна коллекция грампололителк-шх и гр.\чотри:и\то ль:¿х STAVr моа бактерий, способных утилизировать различии* r.irrpo^Kaw э ка-

■■• •' - .. ■ ■ - "■"•..'..' ' - 8 - .. Л.,:. '

честве единственных источников углерода и . аэота в концентрациях 0,9 г/л; . • '-;'-'

'. - • - етаммы Cor/nebacterium sp. ПНК-2, Pseudcrronas puticia C-il v Pseudomonas putida BA-ll депонированы во Всесоюзной коллекции про-«ывденных микроорганизмов ВНИИ- генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г. Москва;

• - подучены микробиологические и биохимические характеристики процессов биодеградации различных нктрофенояов, утилизируемых селекционированными штаммади- деструкторами; *

- отработан' способ иммобилизации втаммов-деструкторов . нитрофе-нолов на волокнистых синтетических носителях; , ;

. - • создан лабораторный биореактор для очистки сточных вод производства м^та+юса от п-нитроййкала, разработан лабораторный регламент процесса очистки, о •' . . . '

АПРОРАЩЯ РАБОТЫ.' Материалы исследования и основные положений работы обсу:здались на V конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологий" (Пущино, 1992); на Российско-Германском рабочем совещании по проблеме защиты окружающей среды (Пущино,, 1992); на Международной научно-практической конференции ."Биология и биотехнология очистки воды" (Киев, 1993); на VI Европейском конгрессе по биотехнологии (6th Eur. congr. Biotechnol. (ЕСБ 6), Flrenze. Italy, 1993); на VI конференции Российской Федерации "Новые направления биотехнологии" (Путано. 1У94); ; на конференции РАН и PMQ "Интродукция микроорганизмов в окружающую среду" (Москва, 1994); на Международном симпозиуме - рабочее совещании по экологической биотехнологии (International Syrep. / Workshop on. Dwiron. Biotechnol. . Waterloo, Canada, 1994); на Международных ^конференциях "Загрязнение окружаю- : щей среди" и "Нейроиммунные взаимодействия и окружающая-среда" (The 1995 International Co-Conferences on.'Environmental Pollution (ICEP'95) and Neuroiitmuno 'Interactions ■'& Environment (1C0NE*95). Сачкт-Петребург, Россия, 1995): на Международном семинаре по 6i;o-сорбвди и биоремедиации ( International Seminar "Biosorption and Bio' remediation", Meriri, Czech Republic, 1995); на Всемирном конгрессе no окрудзюаей среде (Vorld Environ. Congr. (WORLD*95), London. Canada. 1995):

ПУКЯИКАЩ.- • . ; -,

По теме диссертации опубликовано 13 работ, в том числе 6 в зарубежных изданиях, 2 приняты к опубликованию. Имеется положительное' •.гРевенне на выдачу патента на изобретение от 05.03.95. по заявке U

33021733.

СТРУКТУРА И ОРЪг.М РАБОТЫ.

Диссертационная работа состоит из введения, 10 Глаз, заключения. еыводоь и списка использованной литературы, включающий 79 работ отечественных и 116 зарубежных авторов, и.содержит 167 страниц машинописного текста. включавшего 30 рисунков, 4 таблицы и 15 схем.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ <-

В работе использованы 65Э штаммов грамотрицательных и грампато-жительных.бактерий, выделенных из 93 объектов окрулающ-й среды. Выделение микроорганизмов-деструкторов осуществлялось методом. недлительного культивирования (Шлегедь Г., 1987). Для этого 10 г починной пробы суспензировали в 100 мл стерильного Физиологического раствора и встряхивали ь течение б часов ня" круговой качалке при 1Ш ос/мин. После этого суспензии давали отстояться в течение 30 мкн н 10 мл жидкости из верхнего слоя переносили в колбу Эрлемейера на 2Ь0 мл, содержу« 100 мл стерильной среды Ы9 (Миллер Д.. 1У?6) следу»-цего состава (г/л): NarHP04-6,0; КНгРО-гЗ.О; NH4CI-I.O; NaCl-OÄ рН-7,0, или синтетической минеральной безуглеродной среды 1 (СМС-1) состава (г/л) -j NacHP04-6,26; КН2РО4-О.9;. NaCl-0,5; рН-7,7Ю, I. В качестве единственного источника углерода и азота в среды добавляли соответствующе нитрофенолы в концентрации 0,1 г/л.

При изучении распространенности деструкторов китрофенолоз сред« микрофлоры сточных вод. и вод прудов-накопителей в колЬы Е^лемейера на 250 мл вносили 100 мл исследуемых вод к добавляли соответствуюсий нитрофенол в концентрации 0.1 г/л.- • „

При изучении распространенности деструкторов нитрофенояов среди . ынкрофлоры активного кла в колбу Эрлемейера на 250 мл 'со 100 мл среды Ш или синтетической минеральной среды I, содержащей состветству-таций нитрофенол в концентрации 0.1т/л. вносили 10 мл верхнего слоя,, отстоявшегося свехеотоСранкого (не позже 4-часов) активного ила.

Через 7 суток инкубирования при ?0"С в условиях ограниченной аэрации 10 мл кудътурагьнои жидкости переносили в яоауо порцл» стерильной среды с добмелением нитрофенола, откуда ese через. 7 суток делали высев из серийных г»ведений на среду №9 или СМС-1, уплотненные агар-агаром в концентрации 15 г/д и содержаще 0,1' г/л соответствующего нитго}>енола и 0.5 г/л глхкозы иди сукшшата в качества дополнительного источника.углерода. Для дальнейших исследойанкй-.отби-рались колонии бактерий бсльоого диаметра 1*_ги колонки, аокруг кото-рск проигходи^о обесцзечивание кедтой окраски субстратов.

Кулвтивирование отьммоь-деструкторов- ~Ш< осуществляли на сред Ш о«з добавления хлорида аммония.

- „ - Культивирование штаммов-деструкторов 2.4-ДН-*ч а такае за- » о-К осуществляли ва OJC-1.

Культивирование штатов-деструкторов п-Bi осуществляли на син твтичеекой минеральной безуглеродной среде 2 (QSC-2) состава (г/л) иааКР04-?,01; KHaPOvG.S; KC1-0.S; pH»S.2*0,1.

При кухьтиьиронании на агаризовашшх средах к этим средам до йаыши агар-агар в концентрация до 15 г/л.

Изучение спектра субстратной активности штаммов проводили, оц^ кивая us способность к росту на агаризоваяной и жидкой среде Ш i соотьйтстьушлмй субстратами в качестве единственных источников углерода а энергии в концентраций о.2 г/л. Культивирование осуществлялось 20'С. Результаты учитывали через ?2 часа.

Динамику роста микробной популяции определяли путем измерение оптической плотное?« кугьтур&дьной жидкости при 600 им.

Концентрат» ароматических субстратов в среде культивировали: определяли по оптической плотности в .зоне- максимума поглощения ) . ультрафиолетовой » виййюй облгдстях спектра после осаадениа биомасс* .центрифугировании« ка центрифуге ОПН-а в течения 10 шшут при 800С

Об/МИН. - .,--'*'

Максимум« оптической плотности составляли дда:

Фенола - 270 ш;

о-нитрофенола - 415 »ш; .

м-йитрс4вкода - 256 ш;

. п-нитрофенола - 400 к»;

2,4-дикитрй£*яола - 360 км; '.-. -

2.4,б-тринитро!^нода - 354 кн.

В работе быда йспйцьэованм спектрофотометра OS-26 (СССР) и Spa-col 11 (ГДР), а таю» регистрирующий спектрофотометр Spacord Ы4( (Г.1Р).

Изучение. uop^osoi-o-культуральник свойств штаммов проводили- i пос^ьях на чайках Петри с шео-петюкаа» агаре-/. (ША) и мазках пс Грамму.

Идентификация микроорганизмов проводилась стандартными методам* на основе тестов, продлокенккх з определителе Бэрги. а такхе на основании иден^факационщк схем, опйсаиных в литературных источникам (Аристархова В.Й., i&39), Щендероз Б.А., Серкова Г.П., 1980), Sergey's MarmuaL.., 19-74), Hendrie M.S., Shewan J.M., 1979, Star.er R.J.. Palleroni К.1., Domioroff M., 1966).

Аналитические методы.... '

1. Определение ХПК осуществляли по стандартной методике (Лурье Ю.Ю.. 1984).

2. Определение нитритов в культуральной жидкости осуществляли фотоколориметрическим методом по реакции с сульфалиловой кислотой к а-нафтиламином (Лурье Ю.Ю., 1984).

3. Определение аммиака в культуральной иидкости осуществляли фотоколориметрическим методом с помощью реактива Несслера (Лурье Ю.Ю., 1984)..

4. Определение белка в грубых клеточных экстрактах осуществляли биуретовым методом (Кочетов Г.А., 1980).

5. Окрашивание на фенолы осуществляли диазотированной сульфани-ловой кислотой по методу Брея. Для этого хрсматограмму опрыскивали смесью 25 мл О.ЗХ р~ра сульфаниловой кислоты и 1,5 мл 5£ р-ра МаЫОз, а затем еще и 20% р-ром МагСОз.

Хранение штаммов осуществляли как традиционным методом - на столбиках полужидкой среды следующего состава (г/л): пептон-Ю; дрожжевой экстракт-5-, ЫаС1-5; агар-агар-6; рН=7,2±0,1. так и в селективных условиях - на столбиках М9. СМС-1 или СМС-2 с соответствующим нитрофенолом в концентрации 0,2 г/л и добавлением агар-агара до конечной концентрации 7,5 г/л. В обоих случаях хранение осуществляли под слоем стерильного вазелинового масла при 4*С, с пересеьсм два раза в год.

Определение влияния рН среды на утилизацию нитрофенолов проводили в колбах Эрлемейера на 250 мл. содержащих 100 мл 0.05М На-К-фосфатного буфера с различными значениями рН и 0,2 г/л соответствующего нитрофенола. Все эксперименты проводились в условиях ограниченной аэрации при £<0'С. Бремя наблюдения составляло 72 часа.

Определение влияния интенсивное?!: аэрации на утилизацию нитрофенолов осуществлялась при культивировании штаммов при оптимальном значении рН и температуре 30 *С без пергиеаздваякя (условия ограниченной аэрации) к при перемешивании на кругозой качалке при IеО об/мин (условия интенсивной аэрации).

Определение. рл:.чн;-.ч допатяигелгных источников азота проводилось гри кудыивирозаяии штаммов на среде МЭ без азота, а так»? на средах СМС-1 и СМС-2, в которые добавляли КН4С1 кг.и ККО^ в кзяцеатргзй I -г/л. Культивирование прозе; ялось яри олтималышых значениях р-Н к •аэ-'— ргдкн для каждого зтькма. - .

Лхя получения больших количеств бисмзесы ьтачмов-деетрукторов клетки гыращньал/.сь на средах НЭ, СМС-1 и СМС-2 с добавлением Ю г/л гептсна, Ъ г/л дрелкезого экстракта и 0,1 г/л соответствующего ннт-ро$евола з -зч-ст^е якхуктерз.

— 12 -

Для определения активности стационарной популяции клеток биомасса наращивалась в больших количествах, как указано выше. Через 24 часа клетки.осаждались центрифугированием на рефрижераторной центрифуге РС-б при,6000 об/мин. и 5*С в течение ,30 минут и дважды отмывались 0.05М Na-K- фосфатным буфером. Осаждённые клетки суспензировались в концентрации, 10-15 т/л в 50 мл 0.05М Na-K-фосфатного буфера (рН 7,6), содержащего необходимые количества субстратов, по отношению к которым определялась деструктивная активность. Клетки культивировались в обычных условиях. Через каждый час отбирались пробы, з которых измеряли концентрацию субстрата. В ряде случаев делали тонкослойную хроматографию. ,

Для приготовления грубых ' клеточных • экстрактов индуцированные клетки ктаммов суспензировались в минимальном объёме 0,05М фосфатного буфера и разрушались на ультразвуковом дезинтеграторе UD-ll.c охлаждением в ледяной бане. После этого неразрушенные клетки и крупные клеточные фрагменты осаждались центрифугированием при 18000 об/мин. на рефрижераторной центрифуге К-24 в течение 40 минут при 5'С. Су-пернагант использовался в качестве клеточного экстракта.

Определение пирокатехазной активности грубого клеточного экстракта прозодилось по методу Hayaishi (Hayaishl 0. 1957): Для зтого з 1,85 мл Трис-HCl буфера с рН 8,0 добавляли 0,05мл 0,33-Ô,67mM раствора пирокатехина и 0,05мл 2,67 Ш раствора ЭДТА. Реакцию запускали добавлением клеточного экстракта. Ферментативная активность определялась по выходу цис.цис-мукоковой кислоты.(Л=257 нм). Если экстракт содерзсал металирокатехазу, пробу предварительно инкубировали с 50 тМ перекиси водорода в течение 30 минут.

Расчёт.ферментативной активности (А) вёлся по формуле: о _ Е/мин*у ммоль/мил/мг белка, Ео*сМэ

где v - сбъёк реакционной смеси (мл); Е - экстинкция проба при 257 нм; Ер - коэффициент молярной экстинкцин; b - содержание белка в пробе (мг); d - толщина ¡советы (см).

Для определения ферментативной активности грубых клеточных экстрактов по"отношению к оксигидрохинону в 0.05М Na-K-фосфатаый буфер добавляли раствор оксигидрсхинона. Реакцию запускали 'добазление,\ клеточного экстракта. Активность к сксигидрохинону определяли по изменениям спектра поглощения реакционной смеси.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) проводилась на пластинах SI lu-fol UV-254. Для зтого пробу подкисляли 1к НС1 и экстрагировали орга-

ническую фракцию равным объёмом смеси хлороформ:дюймовый эфир. Экстракт осушали безводным МагЭО^ и упаривали на водяной бане до конечного объёма 0,1-0,05 мл. Концентрат наносили на хроматографичес-кую пластину и разделяли в системе органических растворителей.

Иммобилизация клеток штаммов на ягутах нитрона или капрона осуществлялась путем обрастания волокон носителя биомассой при периодическом культивировании штаммов на синтетических минеральных средах М9 без азота, а также СМС-1 и CMC-2 с соответствующими нитрофенолами в концентрациях до 0,2 г/л, до полной утилизации субстрата. Свободные клетки отмывали стерильной, водопроводной водой, а носитель с иммобилизованными на нем клетками перекосили в новую порцию среды. Через несколько аналогичных'пассажей увеличивали концентрацию субстрата в среде культивирования и изучали деструктивную активность иммобилизованных клеток.

Среди различных, образцов реальных сточных вод были выбраны и использовались сточные воды производства метафоса, содержащие п-кит-рофенол в. концентрации, до 8 г/л и,-имеющие химическое потребление кислорода до 9 г/л. В процессе исследований в случае необходимости получения конкретных концентраций п-НФ образца реальных сточных вод разводились дехлорированной водопроводной водой.

Лабораторный биореактор имел свободный объём 0,4 л. Суммарный объем загрузки,, в качестве которой были выбраны жгуты нитрона, составил 17. от рабочего объёма реактора. • Подача среды з реактор осуществлялась с помощью перистальтического насоса НП-3 с постоянней скоростью разбавления 0,04 у-1. Подача воздуха противотоком осуществлялась микрокомпрессором АЭН 3-2.

■ Иммобилизация клеток штаммов-деструкторов на носителе осуществлялась при работе 'биореактора в условиях периодического культивирования на CMC-2 с добавлением 0,4 г/л п-НФ з качестве единственного источника углерода и азота. Через двое суток культивирования, после полной утилизации субстрата, производили замену среды. После трех пассахей биореактор переводился на проточное культивирование со скоростью разбавления 0,04 ч"1.

Определение дегкдрогеназкой активности (ДАИуд) микроорганизмов активного ила проводили по модифицированной методике Лекардз (.Хазиев Ф.Х. 3990).

Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом с использованием t-критерия Стьюдента (Грановский В.Д., Сирая Т.Н., 1S90). Кривые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате нескольких (не менее 3-5) экспериментов. . - —

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Известно, что поиск штаммов-деструкторов ксенобиотиков наиболее перспективен среди микрофлоры биоценозов, подверженных постоянному воздействий того или иного вещества, и прежде всего среди микроорганизмов почв промышленных предприятий (Наумова Р.П., 19&5).

Нами были изучены две группы биоценозов. Первую составили объекты, подвергавшиеся в большей или меньшей степени химическому загрязнению. Это были почвы с территории химических предприятий различного профиля (36 проб) и сельскохозяйственных площадей, обрабатываемых ядохимикатами (18 проб). Изучались также биоценозы активного ила (8 проб), сточных вод (13 проб) и прудов-накопителей очистных сооружений производственного объединения "Нитрон" г.Саратов и "Химпром" г.Волгоград (3 пробы). Вторую группу биоценозов, не подвергавшихся интенсивному антропогенному воздействию, составляли 15 образцов лесных и луговых почз.

Из всех этих проб были выделены чистые культуры 658 штаммов грамполахительных и грамотрицательных бактерий, способных расти в присутствии нитрозамещенных. фенолов, и отличавшихся друг от друга морфологией колоний. 14 из них могли использовать различные нитрофенолу з качестве единственных источников углерода, азота и энергии.

При изучении наличия штаммов-деструкторов нитрофенолов среди микрофлоры различных биоценозов (табл.1) удалось выявить следующую закономерность. Объекты, наиболее загрязнённые продуктами промышленной деятельности человека, наиболее бедны микрофлорой. Так, в образцах сточных вод, воды из прудов-накопителей, почв . промышленных предприятий среднее количество штаммов микроорганизмов составляло 0,3 - 3,2 на одну пробу. Однако, именно среди этих штаммов чаще всего- обнаруживались' деструкторы китросоедикений (25; 12,5 и 4,47. соответственно). Объекты, .в меньшей степени подверженные загрязнение продуктами промышленной деятельности (почвы лесов, лугов, полей), содержали большее количество микроорганизмов (10 - 20 штаммов "в про-', бе), но деструкторов нитросоединений сррди них или не было вообще, или они составляли весьма незначительную величину (1,7%). '

Несколько обособленно стоит в этом ряду активный ил очистных сооружений. Этот объект по самой своей природе достаточно богат микроорганизмами (6,8 штамма в образце), однако деструкторов нитросоединений среди них не найдено.

• - 15 - .

. - : Таблица 1.

' Количества штаммов микроорганизмов, устойчивых к нитрофенолам. и деструкторов этих соединений в исследованных объектах различного происхождения.

н Среднее Z штаммов - ;

Объект количество деструкторов ]

пУп штаммов, устойчивых к нитрофенолам нитрофенолсв ;

1. Почвы полей 9,5 1,72

2. Почвы прем, предпри-

ятий а.?; 4,4

3. Почвы лесов и лугов 20.1 , о •

4. Сточные воды 0.3 25

5. . Активный ил . 6,8 о

• 6. Вода из прудов-нако-

пителей 2,6 12,5

Большая часть (11 из 14)•штаммов-деструкторов была выделена из образцов почв, взятых на территории промышленных предприятий, т.е. объектов/ постоянно и з значительной степени загрязняемых. По одному штамму было выделено из проб сточных вод, образцов воды из пру-доз-накопителей и проб почв обрабатываемых пестицидами полей. Из 305 штаммов, выделенных из почв лесов и лугов, ни один не был способен к деструкции ни одного из исследованных нитрозачещённых фенолов. Таким образом, с одной стороны, можно сделать вывод о чрезвычайно низкой распространённости признака деструкции нитрозамещённых фенолов среди природных биоцекозоз. С другой - что отношение числа штаммов-деструкторов нитрофенолоз к общему.числу бактериальных штаммов биоценоза может служить зесьма объективным критерием антропогенного загрязнения окружающей среды.

Как указано выше, в результате проведённых исследований выделено 14 чистых культур мккроорггнизмоз-дёструкторов различных нитрофенолоз. По своему таксономическому положению они относились к трём родам - Pseudomonas, Acinetobacter и Corynebacterlum. Считаем необходимым отметить, что наибольшее количество штаммов-деструкторов (572) были, отнесены к роду Pseudomonas, что подтверждает достаточно

известную способность бактерий этого рода утилизировать большой круг субстратов, в том числе и ароматических (Скрябин Г.К., Головлева М.А., 1Ö76, Юровская Е.М. 1984,' Haller H.D., Finn R.K., 1978, Schmidt. S.К., Scow K.M., AléxenderM., 1987, Spain J.С., Gibson .D.I., 1988).

Шире всего в нашей коллекции были представлены деструкторы п-НФ (8 штаммов из 14), при этом ? из них были отнесены к роду Pseudomonas, а 1 - к роду Acinetoyacter. Эти штаммы могли утилизировать п-НФ в концентрациях до 0,8 т/М. Два штамма, отнесенные к роду Corynebacterium, были способны разрушать о-НФ в концентрации до 0,9 г/л. Ы-НФ в концентрации 0,2 г/л могли утилизировать по одному представителю родов Pseudomonas и Acinetobacter. Наконец два штамма, относящиеся к роду Corynebacterium, были способны к деструкции 2,4-ДНФ (0,6г/л) у. ТНФ (0,9 г/л).

После проведённой селекции наиболее активные деструкторы п-НФ ■ Pseudomonas putida БА-lî и Pseudomonas putida C-ll - были депонированы во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов■ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, г.Москва, и получили обозначения В-6707 и В-6703 соответственно. Там же, под номером В-5439, „ был депонирован штамм-деструктор 2,4-ДНФ и ТНФ - Corynebacterium sp. ПНК-2. На этот штамм получено положительное решение на выдачу патента РФ от 05.03.95. по заявке N 93021733.

. Определение, оптимальных условий проявления биодеструктивной'активности микроорганизмов-деструкторов показало, что наиболее активно процессы утилизации всех изученных нитрофенолов идут в безазотистой среде при 30'С, интенсивной аэрации и слабощелочных значениях ЪН -7,6-8,4. Однако, штаммы Corynebacterium sp. В-5439 и Т-2 с наибольшей скоростью утилизировали ТНФ при pH среды 7,2.

При изучении начальных путей метаболизма нитрофенолов и возможности накопления промежуточных продуктов в процессе их разяокени; штаммами нашей коллекции было установлено' следующее.

Метаболизм п-НФ штаммами Ps. putida В-5707 и В-6708 начинаете непосредственно с элиминации нитрогруппы, как это было описано pai-je; для штаммов Moraxella sp. и Pseudomonas sp. В результате этого отщепления образуется гидрохинон, который, в свою очередь, Окисляетс! в оксигидрохинон с дальнейшим разрывом ароматического ко&ца (Mun-necke D.M.. Hsieh D.P., 1974, Spain J.С., WyssO., ß'ibson D.T. 1970). ,

В отличие от этого, метаболизм п-НФ штаммом A.d'alcoaceticuj А-122 начинается с непосредственного окисления ароматического кольц с образованием 4-нитропирокатехкна (-4-НШ). Затек от 4-НПК отщепля-

ется нитрогрупра, что приводит к образованию сксигидрохинона, который подвергается дальнейшему распаду с разрывом ароматического кольца. Подобный руть также ранее был описан в литературе (Rokesh J.K., Dreisbach J.H.j, Spain JiC., 1994, Siddaramappa S.-B.R., Wahid P.Д., Sethunathan N.. 1978).

Т.о., метаболизм п-НФ штаммами Ps.putida B-6707 и B-67ÖS отличается от его метаболизма штаммом A.calcoaceticum А-122 лишь на начальном этапе. В дальнейшем эти пути совпадают. Нам представляется, что деструкция•п-КФ, связанная с прямой■элиминацией нитрогруплы и образованием гидрохинона, является энергетически более еыгоднон. Это подтверждается.тем, что итачмы Ps. putida В-6707 и В-6708, разрушающие субстрат по этому пути, могут утилизировать его в концентрациях в 4 ра^а выше, чем штамм A.calcoaceticum А-122, у которого начальный метаболизм п-НФ связан с окислением в 4-НПК.

Метаболизм с-НФ штаммом Ccrynebacterium sp. 0-31 начинается с гидролитической элиминация яитрогруппы и образования пирокатехина. В дальнейшем пирокатехин подвергается полной' утилизации с разрывом ароматического кольца по срто-пути,

В отличие от метаболизма я- и о-НФ, метаболизм ТНФ штаммами Со-rynebacteriii-n sp. В-5439 и Т-2-начинается с куклеофильной атаки ароматического кольца и образования гидрид-Мейзеяхеймер комплекса-ТНФ с его последующей трансформацией в 2,4-ДНФ. Последний, прёдлоложитель-но, подвергается дальнейшей деструкции с прямым раскрытием ароматического кольца и образованием 4,б-динитрогексаксвой кислоты, как это было описано для штамма Rhodococcus erythrcpolis HL РМ-1 (Lenke Н., Knackniuss H.J., 1962).

Как уже указывалось выше, для очистки сточных зод различных производств, в целях предотвращения .выноса биомассы из реактора, обеспечения более стабильного режима его функционирования и повышения г&рективнссти очистки сточных вод, предпочтительным является использование иммобилизованных клеток "микроорганизмов-деструкторов (Вебб К., 1980).

Адсорбция является наиболее простым и дешёвым способом иммобилизации штаммов на различных носителях (Никовская Г.Н., 19S9).

■Сравнительное изучение в качестве носителем двух тияоз синтетических волокон - нитрона и капрона - показало, что штаммы A.calcoaceticum МЫ-21, Corynebacterium sp. 0-31 и В-5439 проявляют большую активность ири адсорбции на волокнах,капрона, в то время как штаммы putida B-6707, 8-6708 и Corynebaeterium sp. Т-2 одинаково активны и в свободном состоянии, и при иммобилизации на обоих типач носителей. В ряде случаев штаммы, иммобилизованные на волокнах капрона.

. - 18 -

могли утилизировать более высокие концентрации субстрата (штамм А,са1соасеИсит МН-21) или же иммобилизация приводила к уменьшению сроков полного разруаеняя вещества (штаммы СогупеЬас1ег1шл Бр. 0-31 и Б-5435). Для утилизации таких трудно разлагаемых соединений, как нигроззмецённые фенолы, эти преимущества использования иммобилизованных клеток являются довольно существенными, так как позволяют гарантировать более успешную .иди эффективную работу штаммоз в условиях очистки реальных сточных вод. Только два штамма - Рг.раИс1а В-670? и 3-6706 - проявляли одинаковую активность при адсорбции как на волокнах капрона, гак и на волокнах нитрона, и с одинаковой скоростью утилизировали п-К<5 как в синтетической минеральной среде, так и в подготовленных образцах реальных сточных вод. Однако, применение Жгутов нитрона было более доступным, т.к. их производство осуществляется на Саратовском п/о "Нитрон". Кроме того, они более технологичны, так как не требуют, в отличие от жгутов капрона, предварительного прядения. В связи с этим в качестве материала носителя при конструировании лабораторной модели биореактора для очистки сточных вод нами были выбраны именно они.

Для Испытанна возможности практического использования селекционированных нами Еташов-деструкторсз были изучены процессы очистки сточных вод производства ыетафоса, содержащие в качестве основного загрязнителя п-НФ в концентрации до В г/л. При очистке .сточных вод различного происхождения наиболее конкурентоспособными, по сравнению с аэротенкями и реакторами с лсевдосапаенным слоем, являются Сиоре-атгорьз с неподвижной загрузкой .и противотоками веды и воздуха., Они просты н надежны в эксплуатации, способны выдерживать значительные перегрузки по загрязнителя« ж не требуют больших энергетических затрат. (Гвоздяк Л.И., Дмитриенко Т-Н.. Куликов .fl.iL , 1585, Ековлез С.§., Скирдов-U.fi.. ЛЪецов В. й.,, 1.935)., .

После инокуляции биереактора жтаташ 'Р5.*рии<3а Ъ-6707 ж £-5702 и выгода его к а рабочий режим, .при .скорости разбавления 0=0,04-0., 05с ч"1 и концентрами -п-НФ на входе 0.4 т/л. на выходе :кз '.устачовк* субстрат в сточкой йоде не определялся. £ дальнейшем ¡концентраций п-НФ на.входе :а биореыгтер -удалось довести да 1..5 т/л 'при лостоянас* скорости протока. При этом ечнегка сточной зады от -основного загрязнителя была -полюй, и п-НЗ> на выходе .из установки :не <сщредехялсг. Снижение ХЕЧ сточной воды в процессе биологической очистки .составляло 63,27. (С 1,8.:Д0 0,122 Г/£).

Б:подобней режиме биереатор стабильно работал г течении 8 ¡месяцев (конец срока наал?данкя). Шдвлируя уславкл :процесса "прс^кз-¿еккой - эксплуатации, кы сстаизвшш регк?зр Сез ¡-.акой-глоз тредьюи-

тельной консервкции. В течение четырёх месяцев он находился при комнатной температуре без аэрации и протока, т.е. микроорганизмы поддерживались в >-жиме полного истощения субстратов в среде, после чего биореактор ьновь был запущен'в работу. Для реактивации биокатализатора, т.е. перевода микробной популяции в активное состояние, оказалось необходимым культивирование в течении трёх суток на синтетической минеральной среде CMC-2, содержащей 0,2 г/л п-НФ. После этого биореактор вновь был переведён на режим проточного культивирования при прежней скорости разбавления 0=0,СГ4 ч"1 и начальной концентрации п-НФ в сточной йоде на входе 0,2 г/л. В течение. 3 недель' концентрация п-НФ на входе вновь была доведена до 1,6 г/л при полной очистке сточной воды от основного загрязнителя на выходе. Снижение ХПК составляло 93,2%. Т.о., после 4-месячного перерыва прежняя высокая эффективность очистки сточной воды предложенным биореактором была восстановлена через 3 недели.

Еиореактор функционировал в режиме, не предусматривающем поддержания стерильности внутренней среды. В этих условиях существует реальная возможность вытеснения штаммов-деструкторов Ps. putida В-670? и В-6708- посторонней микрофлорой сточных вод. Однако, пояуля-ционный анализ состава микробного сообщества действующего биореактора показал, что в течение нести месяцев после повторного запуска.85%. всех микроорганизмов бкоре&ктора составили.микроорганизмы, по своим' морфологическим и физиодого-биохимическим характеристикам . тождественные исходным птачмач - Ps putida В-6707 и В-6708, и способные "разрушать п-НФ. 15% биоценоза реактора составили штаммы, отличающиеся от исходных по морфологическим (кокки, коккобациллы), культураль-ным- (формой, цветом и консистенцией колоний), гинкториальным (грач-положитедьные) или деструктивным (неспособные утилизировать л-НФ в качестве единственного источника углерода на плотных или жидких средах в концентрации 0,1 г/л) свойства).

В процессе биологической очистки сточных' вод может происходить накопление промежуточных метаболитов, .более токсичных, чем исходное соединение (Wyman J.F. et al., 1979). В связи с этим нами было про-зедено изучение токсичности сточных вод.производства метафоса до и после их очистки селекционированными штаммами. Как критерий токсичности был использован показатель ингибироваяия дегидрогеназной активности смешанных тест-культур микроорганизмов активных илов п/о "Нитрон" и нефтеперерабатывающего завода (НПЗ) г.Саратова. Установлено, что удельная дегидрогеназкая активность активных илов составляла 11,86 мг/г и 69.03 мг/л для активных-;илов НПЗ и п/о "Нитрон" соответственно. После воздействия на них неочищенной сточной еоды

производства метафоса, она снижалась до 0,534 мг/г для активного'ила НПЗ и незначительно увеличивалась до 88.83 мг/г для активного ила п/о "Нитрон". ■ После обработку/активных илов сточной водой, очищенной в биореакторе, ДАИуд в обоих/случаях, резко увеличивалась и составляла 30,94 мг/г для АН НШ и ?32,8.мг/г для АИ п/о "Нитрон". Подобный ?Ф$ект резкого возрастания, ¿дегидрогеназной активности активных илов при обработке их очищеннрй в используемом нами биоре&чторе сточной водой свидетельствует о том, что селекционированные штаммы-деструкторы п-НФ Ps. putida В-6707 и В-6708 полностью утилизируют все токсические компоненты СБ, что делает их-вполне пригодными для практического использования в процессах биологической очистки сточных вод производства метафоса. _ . .

Таким образом, штаммы Ps. putida В-6707 и В-6708 образовывали » лабораторном Сиореакторе устойчивое саморегулирующееся, активно действующее сообщество, позволяющее эффективно очищать сточные вод« от п-НФ. Биореактор сохранял свою активность при достаточно длителтЛ кой эксплуатации в условиях проточного культивирования и легко вводился в рабочий режим после продолжительных перерывов в работе.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой активности-селекционированных штаммов-деструкторов китрофенолов и эФФективн^ти разработанного регламента работы биореактора, что позволяет рекомендовать их для применения в системах.локальной биологической очистки различных производств, сточные воды которых содержат эти соединения.

... выводы . V/ .

1. йз ' 658 штаммов грамполокительных .м-гранотрицательных бактерий, выделенных:из 93 проб почв промышленных предприятий, десбв, лугов. сельскохозяйственных площадей, обрабатываемых пестийидами. сточных . вод > и прудов-накопителей отобраны 14 штаммов микроорганизмов, способных утилизировать различные нитрозамеценные фенолы в качестве единственных источников углерода и азота. . •

2. распорастранентость среди . естественных биоценозов штаммов-деструкторов китрофенолов может служить показателем к* антропогенного загрязнения.

3. На основании изученных морфолого-.культуралькых и физиоло-го-биохимических характеристик 7 выделенных штаммов был^ йдентифици-рованны как Pseudomonas putida, 1 как Pseudomonss sp.,2 как Aclne-tobacter calcoaceticum и 4 как Corynebácteriurn sp. Два,штамма Ps.putida, отличавшихся максимальной активностью по отношбнгоо к п-нитрофенолу, били депонированы во Всесоюзной коллекции пгФмыпленннх мик-роорганизиов ВШШ генетккк и селекции промыаленкых микроорганизмов

г.Москва, и поручили обозначения В-6707 и В-6708. Штамм СОгупеЬас^е-г1ш 5р., спичный к деструкции 2,4-динитро- и 2.4,6-тринитрофено-лов, был деповирован там же и получил обозначение В-5439.

4. Максимальная деструктивная активность штаммов проявлялась на синтетических минеральных безазотистых средах при температуре . 30'С. концентраций субстратов до 0,9 г/л и рН 7,2±0,1 для 2,4,6-тринитро-фенода, 7,7±0И для м- , о-нитро- и 2,4-динитрофенолов и 8,3±0,1 для п-нитрофенола

5. Изучены пути подготовительного метаболизма некоторых нитрофенол ов. Установлено, что метаболизм п-нитрофенола штаммами Ps.put.i-й& В-6707 и 8-6708 начинается с гидролитической элиминации нитрог-руппы и образования гидрохинона, а штаммом А.са1соасеисит А-122 - с окисления ароматического кольца и; образования 4-нитропирокатехина. Метаболизм о-нитрофенола втаммом СогупеЬас1ег1ит эр. 0-31 также начинается с элиминации нитрогруппы и образования пирокатехина, который впоследствии расщепляется по'орто-пути. Метаболизм 2,4,6-тринит-рсфенола штаммом СогупеЬас1ег1цш йр. Т-2 начинается с прямой нуклео-^ильнсй ' атаки ароматического кольца и образования гидрид-Мейзенхей-«ер-комплекса 2,4,6-тринитрофенола. который впоследствии переводится з 2.4-динитрсфенод. .

6. Изучены процессы иммобилизации клеток штаммов на синтетических волокнистых носителях. Установлено, .что адсорбция штаммов на жгутах капрона приводит к увеличению биодеструктивной активности, ■¡то проявляется в уменьшении времени утилизации субстрата.

7. Исследована - пригодность штаммов- Ps.put.ida В-6707 и В-6708 1ля очистки от л-нитрофенсша образцов реальных сточных вод производства- метафоса в созданном лабораторном биореакторе. Штаммы Рз. 2иИс5а В-6707 и В-6708 образовывали в нём устойчивое сачорегулирую-. хееся, активно действующее сообщество,^позволяющее эффективно и пол-юстью счищать сточные воды от п-нитрофенола при скорости разбавле-!ия 0=0,04-0,053 ч"1 и концентрация субстрата-на входе 1.6 г/л. Сни-:екие ХПК сточной воды при этом составляло 83,2Х.

■:' • ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ 0ПУ&'£«К0ВАЬ'Ы СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТЫ: ^

1. Сингирцев И.Н/. Фёдоров А.Ю., Крестьянином В.Ю. Микробная еструкция нитрофенолов. // Новые направления ■ биотехнологии: Тез. ;окл. V конф. РФ -Пувшно, 1992г. -С. 179.

2. Бактериальные штаммы для аэробной очистки сточных вод. /Син-ирцев Й.Н., Волченко Е.В., Корженевич В.И., Федоров А.Ю. // Биоло-ия и биотехнология очистки воды: Тез. докл. меддунар.конф. - Киев,

1993г. - С.47. - - *

3. Bacterial strains for aerobic wastewater treatment / Feodo-i rov A.Ju., Singlrcev J.N., Ydltchenko E.V., Kor2henevich V. 1. // 6th' Eur. congr. BiotechnoL, jfECB 6): Abstr. books. - Firenze, 1993. V.1V. - P.253.

4. Сингирцев K.H., кбрженевич В.Й., Крестьянинов В.Ю. Биологи-; "ческая деструкция 2,4-динитрофенода. и Прикл. биохимия и микробиол. -1994 г.. -Г. S3, N2. -С. 250-255.

5. Сингирцев И.Н.. . Корженевич В.И., Шуб Г.М. Утилизация нитро-феколов различными микроорганизмами.. // Новые направления биотехнологии. Тез. докл. VI конф. РФ -Пущине, 1994г. -С. 46.

Б. Влияние микробной очистки промышленных сточных вод на микрофлору активного ила / Сингирцев И.Н.. Волченко Е.В., Романова Т.А., Абрамова Т.В., Федоров А.Ю.// Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: Тез. докл. конф. РАН и FMO. - Москва, 1994. -С."Я*.

7. Зкологическое взаимодействие селекционированных шташовдеЬт-рукторов ■ ксенобиотикоз и микроорганизмов активного ила. /Сингирцев И.Н., Волченко Е.В.. Романова Т.А.. Абрамова Т.В., Федоров А.Ю. //Интродукция микроорганизмов в окружающую среду: Тез. докл. конф. РАН и PMQ. - Москва, 1994. -С.S3. ; ' :

, 8. Intensification of biological wastewater treatment by selected strains introduction. Ecological aspects 7 Slngircev I.N.. (Volc-henkoE.V., Abramova T.V., Romanova T.A., Feodorov A.Yu., Morosov V.N. //Int. Syrop./ Workshop on Environ. Biotechriol.: Abstrs. jbf Pa-rers.- Waterloo, Ontario, Canada, 1994. - WP-3. 4

9. Singircev l.N., Korshenevich V.I.. Shoob G,M. Microbial waste purification of nitrosubstituted phenols. // Int. Symp./ Workshop on Environ. Biotechnol.: Abstrs. of Parers.- Waterloo, OntaHo, Canada, lS94i - WP-6

10. Перспективы применения селекционированных микроорганизмов в экологической биотехнологии / Воронин С.П., Волченко Е.Б.Ф Дубровская Е.В. , Козулик С.П., Козулина Т.Н., Муратова а.ю.. Панченко Л'.В.. Романова Т.А..\ Сингирцев И.Н., Турковская О.В., Федоров а/ю. // логич. вестник Чуваши. 1995. - Вып.5. - С.99.

И. Fedorov A.Yu.. Slngircev l.N., Volchenko E.V. Self-purification potentialities of aqueous ecosystems. The resul^ats of model experiments // Int. Syrap. /Blosorpt. and Biarem, :Abstr. books. - Merin, Czech Rep., 19Й5. -P 4-4.

12. Microbial patheds for Industrial wastewater pretreatment: their effect cn active sludge ecosystems / Fedorov ¿JYu.. Yolchenki E.V., Sinsircev I.II., Rcxranova T.A., Shoob G.!,i./ Uorozoy V.H

. - 23 - -

/World Environ. CongT. (World'95); Abstr. booL?. - London, Ont., Canada, 1995. - P.298. :

13. Prospects of specially selected microorganisms application in environmental biotechnology / Dubrovskaya E., Fi'dorov A., Kosulin S., КоьмИпаТ., to'oaov V., .-.Wuratova A., PanchenkoL., Slnglrcev L, Turkovckaya 0., Volchenko E., Vorcmn S. // Int.Co-Conf. Environ. Pollut. (ICEP'95), Neuroirrjnuno Interact. 6 Environ. (ICONE'55): Abstr. books. - St.Petersburg, Russia, 1995. - P.9.

14. Сингирцев И.H,, Корхекевич 8.Й.Шуб Г.М. Бактерии, раэру-иашие п-нитрофенол в сточных водах производства метаФоса.' // Хим. и технол. воды. -1995. -Т. 17 (в печати).

35. Волчевга Е.В. ; . Сингирцев И.Н., йедороз А.К). Перспективы применения синтетического жгута."нитрон" как.носителя при очистке сточных зод // Хим. и технод. воды. -19S5. -Т. 37 (в лечнм)

ИЗОБРЕТЕНИЯ .

■ 1. Сингирцев И.К., Корл-зневич В.К., Крестьянине« В.Й. Штамм бактерий Corynepact iriuw sp. В-5439 - деструктор ароматических соединений., //Затека на патент N 93021733 от 26.04.94, положительно? решение ст 05.03.35.