Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биодеструктивной активности микроорганизмов при метаболизме токсичных соединений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование биодеструктивной активности микроорганизмов при метаболизме токсичных соединений"

На правах рукописи

ХОРКИНА Наталия Анатольевна

ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ МЕТАБОЛИЗМЕ ТОКСИЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

Автореф ер ат

диссгртапии яа соискание ученой степени кандидата биологических егух

Слсатоз -1998

Работа выполнена в Саратовском государственном университете им. Н.Г. Чернышевского и в Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской Академии Каук

í

, Научные руководители: -

засл. деятель науки РФ, профессор, доктор биологических наук Владимир Владимирович Игнатов,

старший научный сотрудник, кандидат биологических наук Олег Владимирович Игнатов.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Юрий Алексеевич Попов, кандидат биологических наук Сергей Владимирович Козулин Ведущая организация - Государственный научный Центр прикладной м[ифобиологии г.Оболенск

Защита состоится "_"_1998 г. в_часов

на заседании диссертационного совета Д 074.32.01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" (410005 г.Саратов, \д. Университетская, 46).

С диссертацией можно ознакомиться б библиотеке Российского научно-исследовательского противочумного института "Микроб".

Автореферат разослан "_"_ 1993 г.

Ученый секретарь диссертационного сове1а доктор биологических наук, профессор

Корнеев Г. А.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ.

Рост промышленного производства, а также использование устаревшего оборудования и технологий приводит к тому, что большое количество сырья, промежуточных и конечных продуктов химической промышленности попадают в сточные воды, а с ними и объекты окружающей среды. Среди применяемых в настоящее время способов борьбы с загрязнением окружающей среды наиболее перспективными являются методы биологичесхой очистки сточных вод, основанные на создании локальных очистных сооружений с использованием специально селекционированных высокоактивных микроорга-.низмов-деструкторов,- способных разлагать ксенобиотики без накопления

г

промежуточных продуктов.

В связи с этим представляет интерес создание методов оценки биодеструктивной активности микроорганизмов. Определение биодеструктивной активности микробных клеток обычно проводят, используя бесклеточные суспензии, аналогично анализу активности предварительно выделенного <Ьер-

л *

мента.

В нашей работе мы исследовали биодеструктивную активность микробных клеток при утилизации некоторых токсичных соединений как с помощью традиционных методов, то есть по убыли субс.рата, так и с помощью аналша их электрооптических, свойств микробной суспензии и специфической респираторной активности в отношении данных субстратов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью работы являлось исследование ферментативной активности микробных клеток в процессе метаболизма некоторых ксенобиотиков: В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования: 1. Исследовать амидазную активность микробных клеток в процессе их периодического культивирования на различных субстратах.

2. Развить методологию электрооптического метода для оценки ферментативной активности микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма акриламида и акриловой кислоты.

3. Изучить изменения электрооптических свойств микробных суспензий, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма п-нитрофенола, в процессе утилизации данного субстрата.

4. Исследовать возможность определения биодеструктивной активности клеток по отношению к «-нитрофенолу по их респираторной активности.

• 5. Провести сравнительное исследование спещ!фической респираторной активности клеток и электрооптических свойств микробных суспензий.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ.

Исследована амидазная активность микробных клеток при их культивировании на различных субстратах. Впервые показана возможность использования электрооптического анализа микробной суспензии для определения ферментативной активности -микробных клеток при метаболизме токсичных соединений.

Определены условия анализа специфической респираторной активности микробных клеток, обладающих фермеотами подготовительного метаболизма я-нитрофенола. Проанализирован респираторный отклик клеток в отношении других ароматических соединений. Построены калибровочные кривые для количественного определения «-нитрофенола по изменению специфической респираторной активное™ (CPA) клеток в отношении данного субстрата и по изменению электроогггических (ЭО) свойств микробной суспензии. -

Установлена прямая взаимосвязь изменений ЭО свойств микробной суспензии при. метаболизме токсичных соединений с активностью ферментов . подготовительного метаболизма.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ.

Разработанный способ определения ферментативной активности биокатализатора, защищенный патентом Российской федерации № 2103366, может быть использован в фармацевтической, микробиологической отраслях промышленности, а также для мониторинга активности микробных биокатализаторов в процессах очистки сточных вод. Кроме того, полученные результаты могут быть применены для создания нового класса биосенсорных систем.

Разработанный способ определения «-нитрофенола с помощью специально подготовленных микробных клеток и кислородного электрода типа Кларка может бьггь использован для индикации и количественного определения данного соединения в водных растворах.

Предложенный в работе метод определения ферментативной активности микроорганизмов-деструкторов по изменению электрооптических свойств микробной суспензии используется на лабораторных занчтиях студентов Кафедры биофизики Высшего Колледжа Прикладных Наук при Саратовском государственном университете.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ: ,

1. Использование электрооптического анализа микробной суспензии Вге\чЬааегшт эр. позволяет оценить ее амидазную активность.

2. Изменение электрооптических свойств микробной суспенз1ш АстеЮ-Ьааег сакоасеНалт А-122 при метаболизме л-нитрофенола связано с деструктивной активностью данного штамма.

3. Зависимость респираторной активности клеток Лсте1оЬас1ег са1-соасеИсит А-122 от концентрации л-нитрофенола имеет линейный характер а диапазоне концентраций последнего от 0.1 до 1.0 мМ и может быть использована для количественного определения п-шггрофенола в водных растворах.

4. Сравнительный анализ этекгрооптических свойств микробнмх суспензий и их специфической респираторной активности по отношению

к изучаемым субстратам показал, что существует зависимость изменений электрооптических свойств микробных суспензий и их специфической респираторной активности от активное™ ферментов подготовительного метаболизма ксенобиотиков. ' АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ.

Материалы диссертации были доложены на Международных симпозиумах и конференциях: Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques -in Environmental Analysis (Lund, Sweden, 1996); 8th European Congress on Biotechnology (Budapest Hungary, 1997); 17m International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (San Francisco, California, 1997). Диссертация обсуждена и одобрена на межкафедральной научной конференции (кафедра биохимии и биофизики СГУ, кафедра микробиологии СГУ, лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН. лаборатории биохимии ИБФРМ РАН, лаборатория микробиологической трансформации СНИИ Биокатализа) 9 июня 1998г.

ПУБЛИКАЦИИ.

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе получен 1 патент на изобретение. •

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. ч

Диссертация состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка •использованной литературы, включающего 110 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 34 рисунка, 2 таблицы и 2 фотографии.

♦

. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Микроорганизмы. В работе использовали штаммы микроорганизмов, полученные в лаборатории Саратовского НИИ "Биокатализа": шт. Brevibactefium sp. 13ПА (ВКПМ В-4987) [Пат. 1752727 РФ, 1992], щт. Acine-

1оЪас1ег са!соасеИсит А-122; и А~о$р1гШит ЬгаяИете эр.7 из коллекции ИБФРМ РАН. Микроорганизма хранились при 4° С на столбиках с 0,4 % агаризованной ЬВ-средой и пересевались каждые 3 месяца

Среды, В работе использоаали коммерческие среды отечественного и зарубежного производства: 1,5 % иясо-пептонпый агар (МПА); ЬВ-среда (г/л): триптон Вас1о - 10,0, дрожжевой экстракт Вас1о - 5,0, мгС1 -10,0.

Условия культитгрования микробных клеток. Вге\:Ьааепит Бр. 13ПА: Суточную культуру, выращенную на 1,5% МПА при 30°С, смывали с агара фосфатным буфером СЫа2НР04 / КН2РО4, 0,01 М, рН 7,6) и засевали на плотную среду следующего состава: 1,5% МПА, 5,0 г/л акриламвда, рН 7,5. Культзшфование проводили при температуре 29±1°С. Суточную культуру смывали фосфатным буфером (Мг2НР0.4 / КН "Ю4, 0,01 М, рН 7,6) и вносили в коническую колбу па 300 мл, содержащую 50 мл солевой среды (г/л): ЫазНРОч* 12НгО - 14.2, КН2Р04 - 13.6, МцБО, - 0.232, ЭДТА -0.394, рН 7.5±0.1, и 1.0 г/л ахрилгмида, до конечной концентрации клеток 1,0 г сухого веса /л. Инкубирование клеток осуществляли на круговой качалке при ни-' тенсивности перемешивания 160 об/мин при 29±1°С в течение 18-20 ч.

Аапе(оЬас(ег сакоасгИсит А-122: 24-х ч культуру клеток, выращенную на мясо-пептонном агаре (МПА) при 30°С, пересевали на плотную среду следующего состава: 15 мл МПА, 0.2 г/л «-нитрофенола, рН 7.5. Культивирование проводили при температуре 29±1°С. 2-х суточную культуру смывали с плотной среды 0.01 М К-Иа-фосфатным буфером (Ыа2НР04 / КН2Р04, 0,01 М, рН 7.8) и вносили в коническую колбу объемом 300 мл, содержащую 50 мл минеральной среды (г/л): Ма2НР04х 12Н20 - 17.375; КН2Р04-0.2; КС1 - 0.5; рН 8.2 и 2.8 мМ л-нитрофенола. Инкубирование клеток проводили на круговой качалке при интенсивности перемешивания .160 об/мии при 29±1°С п течение 24 ч.

А205р\гШит ЬгтПепхе эр. 7. Культуру, выращенную на плотной питательной среде ЬВ, высевали на жидкую без азотистую среду с мал атом (г/л): К2НР04 - 3; КН2Р04 - 2; МаС1 - 0.1; Мп50.,х7Н20- 0.01; Ыа2МоО<х2Н20 -0.002; N11(01 - 0.5; малат натрия - 1.35. Куяьтивировашю проводили на круговой качалке при интенсивности перемешивания 120 об/мин при 2а±1°С в течение 24 ч.

Концентрацию микробных клеток определяли по оптической плотности • клеточных суспензий при дайне волны 540 им на приборе «Бресо! 221» (ГДР) в кювете с толщиной оптического слоя 1 см и пересчитывали на сухой вес (г/л) по предварительно построенным калибровочным кривым. Для клеток ВгехчЬасгетт Бр. 13ПА 1 ед. ОД соответствовала 0,67. г сух.веса/ л; для Асте1оЬас2ег са1соасеИсит А-1221 ед. ОД соответствовала 1.4 г сух.вееа/ л.

Измерение ориектационных спектров клеток проводили на элекггрооп-тическом анализаторе ЕЬВ1С при длине волны света 670 нм (относительно вакуума). Условия анализа: объем измерительной ячейки 1 мл, концентрация клеток (в едшпшах оптической плотности) ОО670 = 0.45 - 0.50. Перед проведением анализа клетки отмывали трехкратным центрифугироБанием при 5500хз в течение 5 мин и затем ресуспецдировали в небольшом количестве деионизованной воды. Для устранения конгломератов суспензию клеток вновь центрифугировали при 1000х§ в терние 1 мин. и использовали суспензию, оставшуюся в надосадочной жидкости. Подготовленные таким образом клетки инкубировали с субстратами в различной концентрации в течение 30 мин при 35°С и затем проводили ЭО - измерения. Использовали дискретный набор частот ориентирующего электрического поля: 10;52;Ш4, 502; 1000; 5020 и 10000 кГц. Ориенгационный спектр (ОС) представлялся в виде • частотной зависимости разности значений оптической плотности суспензий 500, измеренных при распространении пучка неподяризованнэго света вдоль

и поперек направления ориентирующего поля. Эта разность была нормирована на значение оптической плотности при хаотической ориентации клеток.

Респираторную активность микробных клеток измеряли по известной методике [Методы общей бактериологии, 1984] с помощью кислородного электрода (тип Кларка) и полярографа Radelkis ОН-Ю5 (Венгрия). Условия анаъпа: объем измерительной ячейки 1 мл, концентрация клеток з ячейке -0.6 - 1.0 г сух. веса клеток/л, (Вrev ¡bacterium sp. 13ПА), 1.2 - 1.4г сух. веса клеток / л {Acinetobacter calcoaceticum А-122), температура - 35°С. Измерительная ячейка термостатировалась с использованием ультратермостгта МТА 657 и была снабжена магнитной мешалкой..

Для анализа респираторной активности клетки осаждали центрифугированием (центрифуга К-24, ГДР) при 5000 оо/мни в течение 5 мин, затем клетки ресуспегщгрозали в 0,01 М фосфатном буфере рН 6,3 - 7,6 п оезяеда-ли центрифугированием в тех же условиях, осадок ресуспендировали в небольшом количестве того же буфера

В измерительную ячейку, заполненную буферным раствором, последовательно вводили суспешшо шперобных клеток и водный раствор су бстрата, а с помещыо кислородного электрода регистр1фовали ¡вменение силы тока во времени. Разность значений респираторной активности клеток а присутствии исследуемого субстрата я без него, приведенную х массе использованных мшфоо!шх клеток, обозначали как специфическую респираторную ахтнз-ность (CPA) п выражали з мхА / мин х мг сухого веса клеток.'

Для оптимизации условий анализа CPA клеток варьировали концеитра-цию клеток в измерительной ячейке; рН среды (используя 0,01 М фосфатные буферные растзоры с различными значениями рН: (5.0 - 8.4); я температуру проведения анализа (20 - 70°С).

Исследовали влияние солей металлов. ПАВ на CPA клеток в -отношении определяемых субстратов, используя водные растзоры солей (хл., СССР):

CuS04x5H20, -ZnS04x7H20, FeS04x7H20, MgS04> Cc(N03)2x6- H20, Ni(N03)2x6 H20; и ПАВ (Rhone-Poulenc,Франция): Abcx EP-110, Rhodofac RE 710, Rhodofac RE 610, Rhodocal DS-10, lgepal NP-12. Определяли CPA клеток Brevibacteriuin sp. 13ПА в отношсшш акрнламида (1 г/л), клеток Acimtobacter calcoaceticum А-122 в отношении я-шпрофенола (1мМ) в буферных растворах, содержащих исследуемые соединения в концентрации 1 мМ, и сравнивали полученные значения с величиной CPA клеток в отношении соответствующих субстратов, измеренной в буферном растворе.

, Определего'.е концентрации акрнламида и акриловой кислоты проводили методом газо-жидкостной хроматографии на хроматографе Chrom 5 (Laborarcmi Pristroje Praha, Чехия) с иошвационво-плазменным детектором. Количественное определение шфшзамвда и акриловой кислоты проводилось методом абсолютной калибровки.

Концентрацию ионов аммония определяли с помощью фотометрического феколптохлоретного метода.[Метсды обшей бактериологии, 1984].

. Определение концентрации и-нитрофекола проводили по оптической плотности в зоне максимума поглощения - 400 нм на приборе «Specol 221» (ГДР).

Определение амидазаой активности ычхробиых клеток. Перед проведением анализа клгпш шгалсде Brevitactsrmm sp. 13ПА осаждали центрифугированием при 5000xg в течение 5 шш,, а затем ресусцендировалл в деионизо-ванной воде и осаждали центрифугированием в тех же условиях. Полученный осадок ресуспендирозали в небольшом количестве деконизованной доды до конечной концентрации клеток 1 г сухого веса/л. Подготовленные клетки инкубировали с ¿хриламидом (1 г/л) 30 мин. при 35°С. Затем с помощью ГЖХ-ипалгаа, как это было описано выше, определяли концентрацию акриламида. Амвдазиую активность клеток выражали в мг трансформированного акрила-ыида в расчете на один мг сухих веществ клеток за одну минуту.

Анализ содержания ^-нитрофенола в образцах реальных сточтгых вод по респираторной активности мн-робних клеток Acinetobacter calcvaceticim А-122 проводили в оптимачьных условиях: фосфатном буферном растворе, (0.01М, рН 6.8); концентрация клеток - 1.4 г сух.веса/л; температура Пробу сточной воды анализировали без предварительного разведения. В измерительную ячейку с буферным раствором и микробтыми клетками вводили пробу сточной воды и определяли CPA клеток з отношении анализируемого образца пробы. Полученное значение соотносили с величиной CPA клеток для стандартного раствора и-ншрофенола (1мМ).

Статистическую обработку результатов измерений проводили стандартным методом с использованием t-коэффицкента Стьюдента [Чарыков А.К., 1984].

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Определение биодеструктивной активности микробных клеток обычно проводят аналогично анализу активности предварительно выделенного фермента. Известно, что процессы ферментативного катализа, протекающие л 'бактериальной клетке, сопровождаются перераспределением зарядом внутри клетки и, следовательно, могут приводить к изменению ее .•электрофизических свойств. Регистрация этих изменений может осуществляться, с помощью ряда методов: клеточного электрофореза, метода измерения импеданса, электрооптики и др. В сйязи с тем, что электрооптический метод позволяет достаточно эффективно отслеживать изменения электрофизических параметр о з клеток [Мирсшннков А.И., 1988; Бунин Д.В., 1991], мы предположили, что существует возможность использования данного метода для оценки ферментативной ' активности микробных клеток.

Исследование электрооптических свойств микробных суспензий проводили на электрооптическом анализаторе ELBIC, измерительная я"ейка которого устроена таким образом, что позволяет определять оптическую плот-

ность суспензии клеток в двух взаимно перпендикулярных направлениях. Внутри ячейки расположены электроды, используемые для создания ориентирующего электрического поля. Первоначально клетки, помещенные в измерительную ячейку, находятся в неориентированном состоянии. Затем под воздействием электрического поля на клетках образуется индуцированный дипольный момент, и они начинают ориентироваться, что ведет к изменению оптической плотности суспензии. После выключения ориентирующего поля клетки приходят в исходное неориентированное состояние. ЭО измерения проводят одновременно в двух направлениях, и результат представляют в виде разности значений оптической плотности суспензии 50D, измеренных для двух перпендикулярных направлений, нормированной на значение оптической плотности при хаотической ориентации клеток. Ранее было показано [Брезгунов В.Н. и др., 1984], что измеряемая величина 50D соответствует ашоотропии поляризуемости клеток для данной частоты ориентсфуюшего поля. Таким образом, ОС представляет собой зависимость 80D от частоты ориентирующего поля.

Нами изучались электроогтгические свойства клеток Brevibacterium sp. 13ПА, способных осуществлять гидролиз ряда алифатических амидов. При проведении исследований ЭО свойств микробных суспензий принципиально важным является ко1гтроль за несиешфическими изменениями их ОС, связанными с воздействием изучаемого соединения на микробные клетки. В качестве независимого контроля исследовали слияние акриламида на ОС Azospirillum brasilense sp.7, неспособной утилизировать ахриламид. Бмло показано, что акриламид не оказывает влияния на ОС данной клеточной суспензии.

Известно, что адсорбция различных высоко или низкомолекулярных соединений на клеточной поверхности приводит к изменению электрооптического сигнала [Фомченков В.М. и др., 1983]. Контроль за сорбцией, акри-

ламида на поверхности хлеток осуществляли при шпсубации в деионгоован-ной воде и в деионизованно*. воле с акриламидом клеток ВгтЬааепит яр. 13ПА. ипактивировашшх этиловым спиртом (96-%). Было установлено, что акриламид не оказывал влияния на ОС полученной суспензш!.

Клетки, выращенные на полноценной среде (МПА), амлдазной активности не проявляли, и их ОС при ЗО-алализе не менялись.

Ранее был определен шщуцибедъный характер синтеза амилазы [Моисееза Т.Н. и др., 1991]. Поэтому для проявления микробными клетками амидазной активности было необходимо выращивать их на полноценной среде с акриламидом - з качестве индуктора амилазы. Клетки, выращенные таким образом, инкубировали я депонизовакной воде и я деионизовашюй воде с акриламидом, после чего определяли их ОС. ^ыло показано, что после инкубации клеток с акриламидом происходит изменение ОС на первых гати частотах (от 10 то ¡000 кГц), в то время ¡ел: на последних двух частотах изменения были менее выраже!гными <Рис.1).

Нами изучалась динамика изменения активности хлеток от времени т1-кубашш с субстратом (¡5, 30, 45, 60, 90 мин). Акт.'дшость кдетох з от пошетт акриламида оценивали по разности значений §00<о: кга ДЛЯ клеток, :гро-инкусяропащгах п деионизованной воде, и йОО<02 кГц для клеток, проинкубированных в денонилоБашюй воде с субстратом. Было .¡оказано, что при уве-личснщ! периода шпсубашш с субстратом активность ¡слеток п отношении акриламида линейно возрастала Полученные данные св>1дстельстзуют о специфическом изменении Э О слоиста микробной суспензии штамма ВгЫЪаскпигп зр. 13ПА при метаболизме акрил амида.

Известно, что амидазная активность широко распространена среди бактерий, и, как правило, амидазы обладают широким субстратным спектром [Мае5игаз51 М. й а1., 1984]. Поэтому мы исследовали амидазную активность

по изменению ЭО свойств микробной суспензии в отношении некоторых

а о

2000 -г

1500 -

1000 -

500 -

'I 1-1'ПП|-1—I ! И <! 11-1—ГТТТТТТ]

100 1000 10000 !г частоты, кГц

Рис.1. Влияние акриламида (1г/л) на ОС клеток БгшЬа^епшп эрЛЗПА, обладающих амидазной активностью 4- - клетки, инкубированные в деионизованной воде О - клетки, инкубированные в деионизованной воде с акриламидом

алифатических и ароматических амидов. .

Было показано, что клетки проявляли амидазную активность в отношении акриламида, бутирамвда, ацетамцда, пропионамида, бенззмида в следствии чего и менялись их ОС. Эти результаты соответствовали ранее полученным данным го изучению субстратной специфичности амидазы клеток

Brevibacterium sp. штамма 13ПА [Моисеева Т.Н., 1993] и CPA данных клеток [Игнатов О.В. и др., 1997].

Далее нами изучалась динамика проявления клетками Brevibacterium sp. амидазной активности в процессе периодического культивирования на различных субстратах. Во всех экспериментах использовали клетки, обладающие амидазной активностью.

Первоначально мы исследовали динамику изменения амидазной истинности клеток в процессе их периодического культивирования на минеральной среде с акриламидом в качестве единственного источника углерода Амидаз-ную активность клеток в процессе метаболизма акрил амида определяли по изменению ЭО свойств клеток при частоте ориентирующего поля 502 кГц и традиционным методом - по изменению концентрации субстрата в процессе микробного гидролиза акриламида до акриловой кислоты.' По изменению ЭО свойств и традиционным методом было зарегистрировано снижение амидазной активности клеток в процессе культивирования, которое могло быть связано с постепенным накоплением в среде ионов акриловой кислоты, ингиби-рующих ачидазу клеток штамма Brevibacterium sp. R312 [Maestracci et al., 1984,1988].

Поскольку процессы гидролиза акриламида и метаболизма акриловой кислоты протекают в клетке одновременно, то изменение ЭО свойств микробных суспензий могло быть связано, в принципе, как с изменением амидазной активности, так и с изменением активности ферментов, принимающих участие в дальнейшем метаболизме акриловой кислоты. Поэтому нам представлялось необходимым проведение специального эксперимента, позволяю-■*' щего разделить эти два процесса. Для этого клетки культивировали на минеральной среде с акриловой кислотой, используемрй в качестве единственного источника углерода. По данным традиционного анализа и ЭО анализа клетки

обладали некоторой амидазной активностью, которая практически не менялась в течение 48 часов культивирования.

Далее исследовали изменение амилаз ной активности клеток при культивировании на минеральной среде, не содержащей каких-либо источников углерода. С помощью традиционного анализа амид аз ной актизности и по изменению ЭО свойств клеток было показано, что максимальной амидазной ак-тив1юстью клетки облгд-лли на начшьном этапе культнвиэо&шия. Затем наблюдалось падение акт^ности в отношении акриламида. вероятно, связанное с отсутствием субстрата в среде культизировшам.

Таким образом, были выявлены характерные ¡вменения ЭО параметров микробной суспешии в зависимости от амидазнон активности клеток при нх КуЛЬТШИрС2аИ1Ш в различных условиях.

Мы предположили, что аналогичные изменения ЭО свойсгз, связанные с конформатгтсьта-струтсгурными гамгнег!>'л%5н молекул и перераспределением зарядоз в процессе метабоящмз. могут гоиъ место при метаболизме других субстратов в клетках других микробных штам.моа. Для прозерки этого предположения были выораны клетки Л са1с:.,.:г,гйалт А-122, обладающие инду-цибельной ферментативной системой подготовительного метаболизма п-яитрс-фенола [Сингирцев И.Н., 1996].

Было показано, что л-цитрофенол ■ не оказывал влияиш па ОС клеток, выращенных на полноценной питательной среде (МПА). Для индукции ферментативной системы клетки выращивала на МПА с л-нитрсфеиолсм (0.2 г/л) и шкубироваш иа гкижоЯ солегой среде с я-нигрофеаюлои (0.2 г/л) в течение суток при шггепс;шно11 ззраиж». Клетки, полеченные подобным образом, шгкуб1фОвали в деионизованной воде и в деионизозанпой воде с п-нитрофеиолом (1мМ). Наш! были зарегистр.чроваяы изменения ОС на первых пял! частотах (от 10 до 1000 кГц), в то время как на последних двух частотах изменения отсутствовали.

;

В качестве контроля за неспецифическим изменением ОС микробных суспензий под воздействием гс-нитрофенола использовали клетки Пгслп-Ьааепит Бр. Было показано, что инку баш и с л-нитрофенолом не оказывала влияния на их ОС. ;

На следующем з?апе работы изучали активность клеток А. сакоасеИсит А-122 в процессе периодического культивирования на жидкой солевой среде с л-нитрофенолом в качестве единственного источника углерода. ЭО алализ прозодили при инкубации клеток в деионизовгнной воде и в денонизоваиной воде с л-нитрофенолом. Было показано, что активность клеток в отношении я-нлтрофенолг возрастала по мере его деструкции и достигла мзкснмгльного значения через 6-8 часов после начала эксперимента, ког да субстрат б среде культивирования отсутствовал. Это можно обьясшпъ тем, что при культивировании клеток на минеральной среде с единственным источник-ом углерода -и-нитрофенолом - микроорганизмы вынуждены сгагтез1!ровать и поддерживать в актизком состояшш специальную систему ферментов подготовительного метаболизма данного субстрата. При дальнейшем инкубировании клеток ЭО актирчость з отношении «-нитрофенола сшгжалась. Полученные данные хорошо согласуются с представлениями об экономности клеточного метабо-лгама ,

Далее ?.ш нсследовати зависимость изменения ЭО свойств микробной суспензии от концентрации субстрата Клетки инкубировались с различными концентрациями ^-нитрофенола (0.1-1.0 мМ). Можно отмепгть, что на частотах 10 - 1000 кГц существует определенная зависимость величшш ЭО эффекта от концентрации субстрата, участвующего в ферментативной реак-"' ции (Рис.2).

1§ частот»!, кГц

Рис.2 ОС суспешшг клеток А. са1соасх::>:чт А-122 при инкубации с п-нитрофешлом

I "У* - клетки, инкубированные в деионизозанной воде

О - клетки, инкубированные в деионизовакяой воде с 0.' мМ л-нитрофенола

Ф - клетки, инкубированные в декоиизозаяной воде с 0.4 мМ г,-нитрофенола

О - клетки, инкубированные в деяошоованной воде с 0.6 мМ п-ншрофенола

О - клетка, инкубированные в деионизовашюй воде с 0.8 мМ п-нитрофенола

А - ¡слетки, инкубированные в деионизовашюй воде с 1.0 мМ п-нитрофенола

К сожалению, в настоящий момент мы не можем точно определить этап ферментативного кгтализз л-шггрсфенола, который наиболее сильно влияет ка изменение ЭО характеристик микробной суспензш!. Тем не менее, полученные данные могут быть использованы для оценки ферментативной активности штгмма-десГрухгора и, возможно, для определения концентрации я-нитрофенола в растворе.

Одним m ключевых вопросов при исследовании электрофизических' свойств клеток в процессе метаболизма субстрата является проблема интерпретации полученных данных. Поэтому, с нггягй точки зрения, принципиально важно было найти зависимость изменений ЭО свойств микробных суспензий от их метаболической активности. Поскольку в процессе метаболизма ряда токсичных ссггашений происходят реакции окисления, это привело нас к идее использовала сравнительного исследования специфической респираторной гкпонсстн клеток в отношек:-:п определенного субстрата и ЭО активности кдетох по отисшешЕо к том)' ;::е соединимо.

Нами были сятгопззирОБаны условия проведения анализа CPA клеток А. calcoaceHnm А-122 в отношении и-нитрефенола: температура, рН среды и микробная нагрузка. Оптимальные условия амалша ресгаграторной аетивно-сти: концентрация клеток 1.4 г сух. веса / л; фосфатный буфер 0.01 М, рИ 6.3; темпера?---.а 35°С.

Далее мы исследовали зависимость CPA клеток -в" отношешш п-шпрофенола от времени их культивирования на минеральной среде с субстратом. Было установлено, что максимальной CPA в отношении п-нитрофенола обладают клетки A. calcoaceticum А-122, полностью утилизиро-' завшие л-нитрофенол в процессе культивирования.

Используя оптимальные условия анализа респираторной активности, нами была построена концентрационная зависимость CPA клеток в отношении л-тпрофенола в диапазоне концентраций последнего 0.1-3.0 мМ. Завися-

мость имела линейный характер в интервале 0.! - 1.0 мМ и была использована в качестве калибровочной кривой при количественном определении п-шпрофепола в образце реальных сточных вод производства «Химпром» (г.Волгоград). Определенная по респираторной активности микробных клеток концентрация п-нитрофенола хорошо коррелировала с истинным значением. 1 [слученные результаты, вероятно, могут быть положены в основу разработки микробной биосенсорной системы для определения содержания п-ннтрофенола в водных растворах по CPA клеток.

Как уже упоминалось ранее, предварительная инкубация клеток А. caicoaceticum А-122 с к-нитрофенолом (0.1 мМ - 1.0 мМ) приводит к изменениям ЭО свойств микробной суспензии, причем, в диапазоне 0.1 мМ - 1.0 мМ зависимость SOD от концентрации л-шгтрафенола носит линейный характер.

Хотя условия определения респираторной активности клеток и их ЗО свойств чрезвычайно отличаются, ггреэдг всего, по составу среды, в которой находятся клетки при метаболизме субстрата, линейные диапазоны зависимости респираторной активности клеток по отношению к л-шггрофенолу и

зависимости величины 8OD502 *г„ клеток от концентрации /¡-нитрофенола i

чрезвычайно похожи (Рис.3).

С нашей точкн'зрения, полученные данные свидетельствуют о том, чгто изменение ЭО свойств клеток A. caicoaceticum штамма А-122 связано с ак-ткзностью ферментативной системы подготовительного метаболизма п-нитрофгшла • .

Кроме того, было проведено сравнительное изучение CPA клеток в от-ношеш! я-нитрофенола и ЭО своистз микробной суспензии при воздействии различных факторов. Нами изучалось влияние солей металлов, часто присутствующих в промышленных стоках, на CPA и на ЭО свойства клеток. А. ca'icocceticum А-122. Была отмечена определенная корреляция результатов, . толучешшл с-помощью 30 анализа н с помощью аиалша респираторной ах-

КсЕщептраниг, нМ

Концентрация, иМ

Рнс.З Концентрационная зависимость специфической респираторной активности клеток Л.сакоасгйсит А-122 в отношении и-нитрофенола (А) и зависимость разности значений 6ОБ502 «га (опыт - кошроль) клеток А. ссйсоасеИсит А-122 от концентрации и-нитрофенола (Б)

тивности. Так минимальная активность клеток в отношении л-шггрофеиола наблюдалась после инкубации клеток с солями меди, кобальта и мапшя, что может быть связано как с ингнбировадшем ферментативной системы подготовительного метаболизма л-нигрофенола, так и с тошгчным воздействием солей этюс металлов на клетку в целом. Известно, что соли меди нарушают

барьерные свойства цитоялазмгггяческих мембран клеток различного происхождения, при этом клетки теряют значительную часть внутриклеточного калия и происходит перераспределение протонов между цитоплазмой и окружающей клетку средой, а также уменьшение трансмембранного потенциала [Иванов А.Ю. и др., 1985; Лебедев B.C., 1986, 1987]. Присутствие солей никеля и шиша не оказывало значительного влияния ни на CPA клеток в отношении субстрата, ни на ЭО свойства микробной суспензии.

Нами шучалось влияние ПАВ на CPA клеток в отношении. п-нитрофенола и на ЭО свойства микробной суспензии. Предварительная инкубация клеток с Rhodofac RE-610, Rhodofac -710, Rhodocal DS-10 полностью ингибировата CPA клеток в отношении субстрата Это могло быть связано как с ингибйрующим воздействием данных веществ на ферментативную активность клеток, так и с повреждением клеточной поверхности.

Мы предположили, что взаимосвязь изменений ЭО сеойств микробных суспензий и их CPA в отношении субстрата характерна и для других штаммов, обладающих ферментахг.-ной системой подготовительного метаболизма

токсичных соединений. Поэтому провели аналогичные исследования длячеде-)

ток штамма Brev¡bacterium sp. 13 ПА. По литературным данным установлено, что амид азы, осуществляющие гидролиз алифатических амидов, содержат су льфгидр ильную группу в реакционном центре [MaesGacci М. et al., 1986]. Также известно, что ионы меди и кобальта оказывают ингибирующее воздействие на ферменты, имеющие сулъфгидрильную группу в активном центре. Поэтому мы изучали влияние солей меди и кобальта на амидазную активность к сток Brevibaciermm sp. 13 ПА с помощью ЭО-анализа и акатиза CPA. Было показано, что соли меди и кобальта ингибируют амидазную активность клеток Brevibacisrium sp. 13 ПА в отношении акрил амида.

При тучею«; влияния ПАВ на CPA клеток Brevibacterhim sp. 13 ПА в •тгношенни акриламида и на ЭО свойства микробной суспензии было от-

мечено, что предварительная инкубация клеток с Rhodofac RE-610, Rhodofac -710, Rhodocal DS-10 полностью ннгибировала CPA клеток в отношешш субстрата, и кроме того, были зарегистрированы незначительные изменения ЭО свойств микробной суспензии в отношении акриламида. Это могло быть связано как с ингибирующим воздействием данных веществ на ферментативную активность клеток, так и с повреждением клеточной поверхности.

Таким образом, на основании данных сравшпельного анализа спегнфи-ческой респираторной активности клегок в отношении определяемого субстрата и ЭО свойств микробной суспензии при их инкубации с тем же субстратом нами установлена взаимосвязь изменений ЭО свойств клеток с активными ферментативныш! системами подготовительного метаболизма микроорганизмов-деструкторов. Эти результаты свидетельствуют о принципиальной возможности использования ЭО свойств микробных суспензий для оценки их биодеструктивной активности и, соответственно, о возможности создания новой группы методов для оценки ферментативной активности микробных клеток в целом.

ВЫВОДЫ

1. Изучено изменение амидазной активности клеток В rev ¡bacterium sp. 13ПА в процессе периодического культивирования на различных субстратах.

2. Разработан метод определения амидазной активности клеток Brevibacte-rium зр. 13ПА по изменению электрооптических свойств микробных суспензий. . -

3. Разработан метод определения биодеструктивнсй активности клеток Acinetobacter calcoaceticum A-I22 в отношении л-шгтрофенола по изменению электрооптических свойств микробной суспешии в диапазоне частот ориентирующего поля от 10 до 1000 кГц. Установлена принципиальная возможность количественного определения л-нитрофенола при концентра-

ции от 0.1 до 1.0 мМ по изменению электрооптических свойств микробных суспензий.

4. Исследована возможность определения биодеструктивной активности микробных клеток штамма Acinetobacter calcoaceticum А-122 в отношении п-нитрофенола по их респираторной активности. Оптиматьными условиями анализа респираторной активности клеток являются: pH среды - 6.8, температура - 35 °С и концентрация клеток - 1.4 г сух. веса / л.

5. Установлена зависимость специфической респираторной активности клеток штамма Acinetobacter calcoaceticum А-122 от концентрации п-шггрофенола. Определен линейный характер в диапазоне концентраций п-шггрофенола: 0.1 - 1.0 мМ. Показана возможность количественного определения л-нитрофенола в образцах реальных сточных вод по респираторной активности.

6. Проведено сравнительное исследование специфической респираторной активности клеток Acinetobacter calcoaceticum А-122 и Brevibacterium sp. 13ПА и ах электрооптических свойств. Установлена прямая зависимость изменений электрооптических свойств клеток при метаболизме токсичных соединений от активности ферментов подготовительного метаболизма ксенобиотиков.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

i

1. Ignaíov O.V., Khorkina N.A., Shchyogolev S.Yu., Khíebtsov N.G., Rogacheva S.M., Bunin V.D. Electro-1"ptical properties of microbial cells as affected by acrylamide metabolism. Journal of Analytica Chimica Acta .1997. Vol. 347. p.

' 241 -247. - • •

2. Игнатов O.B-, Хоркина H.A., Ции плева О.М., Бунин В.Д., Щеголев С.Ю. Электрооптпческие свойства микробных клеток при метаболизме акрида-

''мила // Прикладная биохимия. 1998. №5. С. 583- 587.