Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование биодеструктивной активности микробных клеток при метаболизме токсичных соединений

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Хоркина, Наталия Анатольевна, Саратов

и^'/ , ь,./ к

д/

МИНИСТЕРСТВО ОБЩЕГО И ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО

ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ САРАТОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Н.Г.ЧЕРНЫШЕВСКОГО РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ И

МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

V О 0\ Л Г [ Д и ПТШ ТГТГ/Т А *Т^ПП/\ТТ1 ДГИТО

/\ у,' 1 ххл'лИА а 1 а I ал пя тлпа 1 ОЛЪьаиа

УДК 576.8: 577.15.08 У.082 ИССЛЕДОВАНИЕ БИОДЕСТРУКТИВНОЙ АКТИВНОСТИ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК ПРИ МЕТАБОЛИЗМЕ ТОКСИЧНЫХ

03.00.07. - микробиология 03.00.04, - биохимия

диссертация

на соискание ученой степени

папДпДа 1. а

I Ятуа ттг\г«тжтталт.^туV тто*гг?»

Засл^еятедь науки РФ,

поодаессоо.

доктор биологических наук В. В. Игнатов;

Старший научный сотрудник, кандидат биологических наук О. В. Игнатов

ауа

цклз, 1 у У О

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ................................................................................................5

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР .......................................................................9

ГЛАВА I. Биодеструктивная активность микроорганизмов в отношении токсичных соединений !. 1 Подготовительный метаболизм амидов в микробных клетках..........................................................................................9

1.2 Подготовительный метаболизм мононитрофенолов микроорганизмами.................................................................. 20

1.3 Методы определения ферментативной активности микробных клеток....................................................................26

ГЛАВА 2. Использование электрофизического анализа при

исследовании клеточных популяций.......................................31

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. Материалы и методы...............................................................38

ГЛАВА 4. Исследование амидазнои активности клеток штамма

сг\ 1 1П А Л I

С. ¿ДО/* ишь.......................................................,,-г/

ГЛАВА 5. Исследование амидазной активности клеток штамма ВгехчЬаеХетпгт врЛЗПА при периодическом

культивироваии........................................................................62

ГЛАВА 6. Ферментативная активность клеток штамма АапеюЬааег

сакоасеИсит А-122 при метаболизме «-нитрофенола............70

ГЛАВА 7, Респираторная активность микробных клеток,

обладающих системой подготовительного метаболизма

„ _________-1,.,..~ 0 1

п-пп 1 ри1рсп«./ла........................................................................о!

Г ГТ А М А V |~'г>апт1тдтг1илв и^лпатгАорииа ^ПршкЬрЧргеПЙ

1 -<- I / V1 > / Ч V,?. К^^дамш » V V иV^и^и.пуи

респираторной активности микробных клеток и их

электроошических свойств.....................................................94

ЗАКЛЮЧЕНИЕ ......................................................................................107

ВЫВОДЫ ................................................................................................123

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ..............................125

ПРИЛОЖЕНИЯ.....................................................................................135

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

CPA - специфическая респираторная активность

МПА - мясо-пептонный агар

ОС - ориентационный спектр

ЭО метод - эдектрооптическии метод

ЭО анализ - электрооптический анализ

ЭО свойства - элект^ооптические свойства

ВВЕДЕНИЕ

Рост промышленного производства, а также использование устаревших оборудования и технологий, в том числе и в нашей стране, приводит к тому, что большое количество сырья, промежуточных и конечных продуктов химической промышленности попадают в сточные воды, а с ними и объекты окружающей среды.

Среди применяемых в настоящее время способов борьбы с загрязнением окружающей среды наиболее перспективными являются методы биологической очистки сточных вод. Под биологической очисткой понимают удаление органических соединений из бытовых и промышленных сточных вод при помощи микроорганизмов, использующих эти вещества в качестве источника углерода. Через серию реакций, катализируемых ферментами подготовительного метаболизма, ксенобиотики включаются в основной метаболизм микробной клетки, где часть углерода, содержащегося в молекулах соединения, идет на синтез биогенных соединений, а часть окисляется до углекислого газа, давая микроорганизмам необходимую энергию.

Общеизвестно, что использование специально выделенных и селекционированных высокоактивных штаммов-деструкторов ксенобиотиков в биологических системах очистки является более эффективным, чем использование активного ила [Ротмистров М.Н., 1975], поскольку использование высокоактивных штаммов-деструкторов позволяет создать компактные, экономически рентабельные локальные очистные сооружения, способные полностью устранять основные загрязнители еще до поступления сточных вод на общие заводские и общегородские очистные сооружения.

Все вышеперечисленное определяет актуальность исследований по разработке микробных методов охраны окружающей среды на основе высокоактивных микроорганизмов-деструкторов различных ксенобиотиков, способных разлагать их без накопления промежуточных продуктов, и по созданию

методов оценки биодеструктивной активности микроорганизмов. Традиционно биодеструктивную активность микробных клеток, способных использовать токсичные соединения в качестве источника углерода, определяют по убыли субстрата при культивировании их на средах с единственным источником углерода. В нашей работе мы исследовали биодеструктивную активность микробных клеток при утилизации некоторых токсичных соединений как с помощью традиционных методов, то есть по убыли субстрата, так и с помощью анализа их электрооптических свойств и специфической респираторной активности в отношении данных субстратов.

Целью работы являлось исследование ферментативной активности микробных клеток в процессе метаболизма некоторых ксенобиотиков.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать амидазную активность микробных клеток в процессе их периодического культивирования на различных субстратах.

2. Развить методологию электрооптического метода для оценки ферментативной активности микробных клеток, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма акриламида и акриловой кислоты.

3. Изучить изменения электрооптических свойств микробных суспензий, обладающих ферментативной системой подготовительного метаболизма п-нитрофенола, в процессе утилизации данного субстрата.

4. Исследовать возможность определения биодеструктивной активности клеток по отношению к «-нитрофенолу по их респираторной активности.

5. Провести сравнительное исследование специфической респираторной активности клеток и электрооптических свойств микробных суспензий.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность использования электрооптического анализа микробной суспензии для определения ферментативной активности микробных клеток при метаболизме токсичных соединений. Исследована амидазная активность микробных клеток при их культивировании на различ-

ных субстратах. Определены условия анализа специфической респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма «-нитрофенола. Проанализирован респираторный отклик клеток в отношении других ароматических соединений. Построены калибровочные кривые для количественного определения «-нитрофенола по изменению специфической респираторной активности клеток в отношении данного субстрата и по изменению их ЭО свойств. Установлена прямая взаимосвязь изменений ЭО свойств клеток при метаболизме токсичных соединений с активностью ферментов подготовительного метаболизма.

Практическая ценность работы

Разработанный способ определения ферментативной активности биокатализатора, защищенный патентом Российской федерации № 2103366, используется на лабораторных занятиях студентов Кафедры биофизики Высшего Колледжа Прикладных Наук при Саратовском государственном университете с апреля 1998 года. Кроме того, данный способ может быть использован в фармацевтической, микробиологической отраслях промышленности, а также для мониторинга активности микробных биокатализаторов в процессах очистки сточных вод. Полученные результаты могут быть применены для создания нового класса биосенсорных систем. Разработанный способ определения «-нитрофенола с помощью специально подготовленных микробных клеток и кислородного электрода типа Кларка может быть использован для индикации и количественного определения данного соединения в водных растворах.

На защиту выносятся следующие положения:

1. Использование электрооптического анализа микробной суспензии ВгеуЖаыегшт эр. позволяет оценить ее амидазную активность.

2. Изменение электрооптических свойств микробной суспензии АстеЮ-Ьас1ег са1соасейсит А-122 при метаболизме «-нитрофенола связано с деструктивной активностью данного штамма.

3. Зависимость респираторной активности клеток Acinetobacter calcoaceti-curn А-122 от концентрации «-нитрофенола имеет линейный характер в диапазоне концентраций последнего от 0.1 до 1.0 мМ и может быть использована для количественного определения n-нитрофенола в водных растворах.

4. Сравнительный анализ электрооптических свойств микробных суспензий и их специфической респираторной активности по отношению к изучаемым субстратам показал, что существует зависимость изменений электрооптических свойств микробных суспензий и их специфической респираторной активности от активности ферментов подготовительного метаболизма ксенобиотиков.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Международных симпозиумах и конференциях: Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis (Lund, Sweden, 1996); 8th European Congress on Biotechnology (Budapest, Hungary, 1997); 17th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology (San Francisco, California, 1997). Диссертация обсуждена и одобрена на межкафедральной научной конференции (кафедра биохимии и биофизики СГУ, кафедра микробиологии СГУ, лаборатории физической химии клеточных структур ИБФРМ РАН, лаборатории биохимии ИБФРМ РАН, лаборатория микробиологической трансформации СНИИ Биокатализа) 9 июня 1998г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, в том числе получен 1 патент на изобретение.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 110 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста, включающего 34 рисунка, 2 таблицы и 2 фотографии.

Глава 1. Подготовительный метаболизм некоторых ксенобиотиков.

1,1 Подготовительный метаболизм амидов и кислот.

Характерной особенностью многих гетеротрофных микроорганизмов является способность синтезировать все низкомолекулярные соединения, необходимые для биосинтеза и функционально активного состояния биополимеров клетки, из какого-либо одного органического соединения.

Систему ферментов, главной или единственной функцией которых является последовательное превращение данного органического соединения в одно из соединений основного обмена, было предложено называть ферментами подготовительного метаболизма, а совокупность катализируемых ими реакций - подготовительным метаболизмом [Карасевич Ю.Н., 1982].

Количество органических соединений, утилизируемых различными микроорганизмами, велико и включает практически все природные и многие синтетические соединения. Разнообразие ферментов подготовительного метаболизма прослеживается в двух основных направлениях: во-первых, в зависимости от химической природы источника питания его подготовительный метаболизм катализируют ферменты различных классов; во-вторых, ферменты, катализирующие одинаковые этапы подготовительного метаболизма определенного соединения у разных видов микроорганизмов, могут заметно различаться по первичной структуре, молекулярному весу и основным энзим о логическим характеристикам [Карасевич Ю.Н., 1982].

Известно, что микроорганизмы, принадлежащие к различным таксономическим группам, могут обладать способностью использовать алифатические и / или ароматические амиды в качестве единственного источника углерода и энергии [Arnaud A., et al., 1976]. Активность мик-

робных клеток обусловлена наличием в них ферментов амидаз, разрушающих свободную амидную связь.

Механизм ферментативного гидролиза амидов до карбоновых кислот был предложен на основании кинетических исследований данной реакции, проведенных с использованием ацетамида и амидазы Brevibac-terium sp. R312 [Maestracci M. et al., 1986]. Авторы предположили, что амидаза, имеющая в активном центре по крайней мере одну SH- группу, атакует ацетамид по карбонильному атому углерода, образуя первый продукт -аммиак и ацил-ферментный комплекс. Последний подвергается гидролизу с образованием второго продукта реакции - уксусной кислоты (рис. 1.1).

Образующиеся в результате гидролиза амидов кислоты могут быть включены в основной метаболизм микробных клеток {Шлегель Г., 1987]. Метаболический путь акриловой кислоты в аэробных условиях изучался на клешах бактериальной культуры Alcaligenes denitriflcans [Andreoni V. et al., 1990]. Было показано, что утилизация акриловой кислоты происходит через последовательное образование молочной, пировиноградной и уксусной кислот (рис. 1.2).

Процесс микробной гидратации амидов и кислот представляет значительный интерес, так как лежит в основе биокаталитических процессов синтеза практически важных веществ. Поэтому изучению ферментов, катализирующих эти реакции, посвящено много работ.

Амидазы, катализирующие гидролиз амидов до карбоновых кислот широко распрос гранены среди микроорганизмов: бактерий, грибов и дрожжей [Thiery A. et al., 1986]. Впервые бактериальные амидазы были описаны в 1964 г. для клеток штамма Pseudomonas aeruginosa [Kelly J.L. and Kornberg H.L., 1964] и штамма Pseudomonas fluorescens [JakobyW. and Fredericks J., 1964]. Оба фермента получили классификационный номер ЕС 3.5.1.4 и систематическое название ациламид амидогидролаза.

Е-Б-Н (фермент - амидаза)

"СНз-СО-МШ (ацетамид)

{-Ю-ОМШ (фермент-субстратный комплекс) СНз

!ЧНз (аммиак)

Е-Б-СО-СНз

н2о

Е-Б,

•3 -й

< >0-С-0(+)-Н (фермент-субстратный комплекс)

•1«

СНз

►СНзСООН (уксусная кислота)

Е-8-Н (фермент - амидаза)

Рис.1 Л. Схема механизма гидролиза ацетамида амидазой Вге\чЬас1епит ер. Ю12.

СН2 = СН — СООН (акриловая кислота)

+ н2о

СНз — СНОН - СООН (молочная кислота)

[СНз — СО — СООН] (пировиноградная кислота)

+ Н20

-СО2 -2Н+

СНз — СООН (уксусная кислота)

Рис. 1.2. Схема метаболического пути превращения акриловой кислоты клеток Ака^епез с1ет1п/1сат.

Ферменты проявляли активность в отношении алифатических амидов с Ct-Сз углеводородной цепью.

Позднее в клетках Aspergillus nidulans были обнаружены 4 различных амидазы. Спектр субстратов каждого из ферментов включал или ароматические, или алифатические амиды с ограниченным количеством атомов углерода [Hynes M.J., 1975]. Амидазы Aspergillus nidulans [Hynes M.J., Pateman J.A., 1970] также как и алифатическая амидаза Pseudomonas aeruginosa [ Kelly М., Clark Р., 1962] подвергались катаболитной репрессии.

Linton Е.А. и Knowles C.J. показали, что штамм Nocardia rhodochrous LL100-21 способен расти как на алифатических, так и на ароматических нитрилах и амидах в качестве источника углерода и / или азота и на родственных кислотах в качестве источника углерода. Ацетонитрил превращается в ацетамид под действием фермента ацетонитрилазы, а аце-тамид подвергается превращению в ацетат под действием другого фермента - ацетамидазы. Причем эти ферменты не индуцируются при росте культуры на ацетате, но оба фермента индуцируются в присутствии аце-тамида или ацетонитрила в среде культивирования. Это позволило авторам предположить, что ацетонитри лаз а и ацетоамидаза могут синтезироваться структурными генами одного и того же оперона или регуло-на. Изучение активности клеток в отношении бензонитрила, бензамида и бензойной кислоты позволило авторам предположить, что существует раздельная индукция синтеза бензамидазы и бензонитрилазы. При изучении респираторной активности клеток, выращенных на различных субстратах, а также при определении фер м ентати в ной активности на-тивных клеток и экстракта было показано, что алифатические нитрилы и амиды и ароматические нитрилы и амиды утилизируются различными ферментативиыми системами [Linton Е.А., Knowles C.J., 1986].

Из клеток Arthrobacter sp. J-l, выращенных на ацетонитриле [Asano Y. et al., 1982], и клеток Brevibacterium sp. R312 [Thiery A. et al., 1986] были выделены амидазы, участвующие в гидролизе нитрилов совместно с нитрилгидратазами. Свойства амидаз, участвующих в двух-стадийном гидролизе нитрилов [Thiery A. et al., 1986], представлены а табл. 1.1.

Исследователи отметили, что амидазы отличаются друг от друга четвертичной структурой и субстратным спектром, в частности, амидаза

Arthrobacter sp. J-l обладала специфичностью в отношении ацетамида, акриламида, пропионамида, амидаза Pseudomonas aeruginosa - дополнительно в отношении формамида и гидроксиацетамида, а амидаза Brevibacterium sp. R312 катализировала гидролиз практически всех водорастворимых амидов. Алифатические амидазы Pseudomonas aeruginosa и Brevibacterium sp. R312 подвергались репрессии органическими кислотами, но не аммонием [Clark Р., 1970, 1984; Maestracci et al, 1984,1988]. В отличие от указанных ферментов, амидаза Methylophilus methylotrophus репрессировалась аммонием, а не