Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Респираторная активность микробных клеток по отношению к н-алканам и нефтям

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гречкина, Елена Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1 Микроорганизмы-деструкторы углеводородов, их роль в биодеструкции нефти.

ГЛАВА 2 Нефти: состав, воздействие на окружающую среду, токсичность. Нормирование нефтяных загрязнений, методы контроля.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3 Материалы и методы

ГЛАВА 4 Изучение респираторной активности микробных клеток при метаболизме отдельных алканов нефти.

ГЛАВА 5 Микробные биокатализаторы на основе иммобилизованных алканокисляющих бактерий.

ГЛАВА б Исследование респираторной активности микроорганизмов по отношению к нефти.

ГЛАВА 7 Возможности практического применения метода определения углеводородов по респираторной активности микробных клеток. 115 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 135 ВЫВОДЫ 147 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

МПА - мясо-пептонный агар

МПБ - мясо-пептонный бульон

НПЗ - нефтеперерабатывающий завод

ПАВ - поверхностно-активное вещество

ПДК - предельно допустимая концентрация

CPA - специфическая респираторная активность

УВ - углеводороды

Введение Диссертация по биологии, на тему "Респираторная активность микробных клеток по отношению к н-алканам и нефтям"

Актуальность проблемы

Одними из наиболее распространенных загрязнителей окружающей среды в наше время являются углеводороды (УВ). Интенсификация добычи и переработки горючих полезных ископаемых, в первую очередь нефти и газа, представляющих собой углеводородные смеси, ведет к глобальному загрязнению обширных земельных и водных пространств. Это представляет большую опасность для экологических систем, особенно водных. Поэтому весьма важной является задача разработки новых подходов к определению УВ и создания на этой основе методов для применения в мониторинге нефтяных загрязнений в водных средах.

Известно, что многие гетеротрофные микроорганизмы способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии определенное органическое соединение. Различные микроорганизмы обладают ферментными системами, катализирующими деструкцию или трансформацию тех или иных соединений, в том числе и ксенобиотиков. Клетки таких видов эффективно применяют во многих биотехнологических процессах, а также для очистки и биореме-диации загрязненных природных объектов. В последнее время микроорганизмы обладающие специфическими ферментными системами все шире применяются в качестве биологически чувствительного элемента при создании биосенсоров - аналитических приборов нового типа, в которых сочетаются биологически активный материал и физический преобразователь сигнала. К настоящему времени признано, что приборы, основанные на использовании биосенсоров, обладают такими свойствами как высокая селективность и чувствительность, возможность определения сложных органических соединений в многокомпонентных смесях, простота и скорость анализа. Все это, а также возможность создания миниатюрных датчиков и достаточная дешевизна метода обуславливают внимание к данному направлению прикладной микробиологии и биохимии, разработку биосенсоров на самые разнообразные природные и синтетические соединения.

Способность использовать в качестве единственного источника углерода и энергии углеводороды довольно широко распространена среди микроорганизмов. Это свойство обусловлено наличием оксиге-назных ферментных систем, осуществляющих подготовительный метаболизм субстрата путем окисления с использованием молекулярного кислорода. Штаммы-деструкторы углеводородов используются для ремедиации нефтезагрязненных почв и водоемов. Однако сведений об использовании ферментативной, в частности, респираторной активности микробных клеток для детекции и анализа нефти или нефтепродуктов в известной авторам литературе не найдено. В связи со всем вышесказанным, весьма интересным представляется исследование возможности создания биосенсорного метода, пригодного для использования в экологическом мониторинге нефтяных загрязнений.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы явилось изучение респираторной активности микробных клеток при метаболизме н-алканов и содержащих алкановую фракцию нефтей и создание методических подходов для определения нефтяных загрязнений в водных объектах при помощи микробных биосенсорных систем.

В связи с этим были поставлены следующие задачи исследования:

1. Изучить возможность использования бактериальных клеток штаммов Acinetobacter calcocicelicus ТМ-31 и Mycobacterium .sy?.SL-5, обладающих способностью окислять н-алкановые углеводороды, в качестве биологически чувствительного элемента сенсорной системы на основе кислородного электрода.

2. Оптимизировать условия анализа респираторной активности микробных клеток при окислении малорастворимых в водных средах углеводородных субстратов с целью получения максимального респираторного отклика клеток в отношении н-алканов.

3. Установить количественную зависимость респираторной активности микробных клеток штаммов Acinelobctcter calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp.SL-5 от концентрации н-алканов.

4. Исследовать возможность иммобилизации алканокисляющих микробных клеток и разработки на их основе микробного биокатализатора.

5. Определить возможность использования сенсорной системы с алканокисляющими микробными клетками в качестве биологически чувствительного элемента для определения углеводородных смесей: сырых нефтей разных типов и продуктов переработки отдельных нефтяных фракций (бензина, дизельного топлива, индустриального масла).

6. Исследовать возможность применения других штаммов-деструкторов нефтепродуктов в сенсорной системе на основе кислородного электрода.

7. Установить возможность определения нефти в концентрациях, содержащихся в реальных сточных водах и в присутствии сопутствующих загрязнителей, встречающихся в иефтесодержащих стоках.

Научная новизна работы

Впервые показана возможность определения н-алканов, нефти и нефтепродуктов при помощи респираторной активности микробных клеток. Модифицирована методика определения респираторной активности микроорганизмов с помощью кислородного электрода типа Кларка применительно к малорастворимым в водных средах и обладающим большой адсорбционной способностью углеводородным субстратам. Оптимизированы условия культивирования и анализа специфической респираторной активности микробных клеток, обладающих ферментами подготовительного метаболизма н-алканов. Установлена респираторная активность клеток в отношении н-алканов с длиной цепи Сб-С17, алкилароматических соединений, сырых нефтей различной плотности и нефтепродуктов: бензина, дизельного топлива, индустриального масла. Показана возможность количественного определения вышеперечисленных субстратов по изменению респираторной активности нефтеокисляющих клеток. Впервые получены микробные биокатализаторы, проявляющие специфическую респираторную активность по отношению к н-алканам. Определено время сохранения свободными и иммобилизованными на носителе клетками респираторной активности в отношении определяемых соединений при хранении их в различных условиях.

На защиту выносятся следующие положения

1. Респираторная активность клеток miаммов Acinetobacter cal-coaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5, обладающих системой подготовительного метаболизма н-алканов количественно зависит от концентрации в среде н-алканов.

2 Клетки штаммов A. calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5 могут быть использованы в качестве биологически чувствительного элемента сенсорной системы на н-алканы со средней длиной цепи. Разработанная методика позволяет измерять респираторную активность микробных клеток в отношении малорастворимых в водных средах и обладающих большой адсорбционной способностью углеводородных субстратов при помощи кислородного электрода типа Кларка. Подобранные условия культивирования клеток позволяют получить максимальный ответ системы на вышеназванные соединения.

3 Клетки штаммов A. calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5 сохраняют свою специфическую респираторную активность в отношении углеводородного субстрата при иммобилизации их на поверхности носителя. Подобранные оптимальные носители природного происхождения и условия иммобилизации позволяют получить биокатализаторы на основе данных клеток.

4 Изменение респираторной активности клеток алканокисляю-щих штаммов A. calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5 может служить показателем присутствия в среде не только данных отдельных соединений, но и углеводородных смесей разного типа, таких как сырые нефти или нефтепродукты: бензин, дизельное топливо, индустриальное масло.

5 Зависимость респираторной активности от количества нефти в среде характерна не только для клеток штаммов A. calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5, но и для клеток ряда других штаммов-деструкторов нефтепродуктов.

6 Методика измерения респираторной активности углеводоро-докисляющих клеток, включающая предварительное концентрирование субстрата на целлюлозе, позволяет определять нефть в образцах модельных сточных вод в диапазоне 0.77-1 ООмг/л (что соответствует концентрациям в реальных стоках), в присутствии различных сопутствующих загрязнителей.

Практическая ценность работы

Разработан способ определения н-алканов и содержащих их нефтепродуктов в водных средах с помощью специально подготовленных микробных клеток и кислородного электрода типа Кларка. Разработаны способы иммобилизации микробных клеток, сохраняющие биодеструктивную активность последних по отношению к определяемым субстратам. По результатам работы был оформлен патент на изобретение (заявка на получение патента РФ №2000128187/13(029813)), материалы работы используются при проведении практических занятий на филиале кафедры органической химии химического факультета Саратовского государственного университета, кафедре экологии Саратовского государственного технического университета, кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией Саратовского государственного медицинского университета, кафедре микробиологии и ветсанэкспертизы Института ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И.Вавилова.

По результатам диссертации были изданы методические рекомендации по определению н-алкановых углеводородов и содержащих алка-новую фракцию нефтей с помощью респираторной активности микробных клеток в водных объектах для студентов старших курсов и аспирантов, специализирующихся в области микробиологии и биохимии, рекомендованные учебно-методической, комиссией ветеринарного факультета СГАУ им. Н.И.Вавилова (протокол № 61 от 20 сентября 2001 г.)

Апробация работы

Материалы диссертации были изложены на конференциях: Научной конференции, посвященной двадцатилетию создания ИБФРМ РАН (Саратов, ноябрь 1999); Всероссийской заочной конференции «Перспективы развития Волжского региона» (май 2000, Тверь); International Symposium on Environmental Biotechnology 2000 (Kyoto Japan July 2000); Семинаре-презентации инновационных научно-технических проектов «Биотехнологии-2000» (сентябрь 2000, Пущи-но); Международной научной конференции «Экологические и гидрометеорологические проблемы больших городов и промышленных зон» (октябрь 2000, Санкт-Петербург); 5ой путинской конференции молодых ученых «Биология - наука 21 го века» (Пущино, апрель 2001); Всероссийской научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты функционирования водных экосистем: проблемы

10 и перспективы гидробиологии и ихтиологии в 21м веке.» (Саратов, август 2001).

Работа была поддержана грантом Президента РФ 01-15-99421 и фондом CRDF грант REC-006.

Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ. Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, 7 глав, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 160 работ отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена на 163 страницах машинописного текста, содержащего 38 рисунков и 9 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Гречкина, Елена Владимировна

Выводы:

1 Установлена возможность использования микробных клеток Acine-tobacter calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5, окисляющих н-алканы нефти с использованием молекулярного кислорода, в качестве биологически чувствительного элемента сенсорной системы. Диапазон зависимости респираторной активности клеток вышеназванных штаммов от количества н-гексадекана составляет 0.03-0.5% (об.). Показано, что клетки, обладающие ферментными системами окисления н-алканов, проявляют близкую по значению респираторную активность в отношении ряда н-алканов с длиной цепи Св-Сп.

2 Подобраны условия культивирования и разработана методика анализа респираторной активности микробных клеток применительно к малорастворимым в воде н-алканам с помощью кислородного электрода для штаммов-деструкторов алканов Acinetobacter calcoaceticus и Mycobacterium sp. Показано, что вышеперечисленные штаммы проявляют высокий уровень специфической респираторной активности в отношении углеводородных субстратов при выращивании на полноценных средах. Определены оптимальные условия анализа: рН, температура и концентрация клеток в среде инкубации.

3 Показана возможность иммобилизации клеток алканокисляющих штаммов. Созданы биокатализаторы на основе хроматографической бумаги и носителя «Лессорб», оптимизированы условия иммобилизации: время, рН среды, плотность исходной клеточной суспензии. Определены количественные зависимости специфической респираторной активности иммобилизованных разными способами клеток указанных штаммов от количества н-гексадекана Показано, что иммобилизация снижает специфическую респираторную активность клеток на 30-40%, однако позволяет расширить диапазон определяемых количеств субстрата на 40-60%.

4 Показано, что сенсорная система на основе клеток, способных окислять н-алканы, может быть использована для детекции нефти, содержащей алкановую фракцию. Установлена зависимость специфической респираторной активности микробных клеток исследованных штаммов от количества добавленной в среду нефти в диапазоне 0.03-0.7% (об.).

5.Установлена специфическая респираторная активность клеток ряда неидентифицированных штаммов-деструкторов нефтепродуктов в отношении нефти. Для всех исследованных штаммов оптимизированы условия культивирования и анализа и показана зависимость специфической респираторной активности от количества нефти.

6. Для штаммов Acinetobacter calcoaceticus и Mycobacterium sp. показана зависимость респираторного отклика от количества различных углеводородных субстратов, содержащих алкановую фракцию: к ч нефтей трех типов плотности: легкой (р =0.813г/см ), утяжеленной

1 С 1 Л Г П р1 =0.842г/см0 и тяжелой (р1 =0.886г/см0, а также нефтепродуктов: бензина, дизельного топлива, индустриального масла И-20.

7 Показана возможность определения нефти в модельных сточных водах в присутствии сопутствующих загрязнителей, встречающихся в реальных нефтесодержащих сточных водах: солей NaCl, ЫагСОз, Fe(N03)2, Na2B4C>7; синтетических неионогенных ПАВ (оксифоса и неонола), а также акриламида.

8 Разработана методика, позволяющая определять малые концентрации нефти (0.0001-0.012% (об.)), а также снижающая воздействие водорастворимых сопутствующих загрязнителей на результаты анализа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нефть играет одну из ведущих ролей в мировой энергетике, являясь преобладающим во всем мире видом энергоресурсов. Она относительно легко добывается, транспортируется и перерабатывается в широкую гамму продуктов различного назначения. В последние 25-30 лет быстро растет использование нефти на нужды органического синтеза. На основе нефти производят основную массу полимерных материалов, поверхностно-активных и моющих средств синтетических волокон и пр. При этом от добычи до потребления нефть соприкасается с окружающей средой и загрязняет ее. Попадая в среду, нефть оказывает вредное воздействие, обусловленное различными механизмами: изменением физического состояния среды, нарушением водно-воздушного режима; токсическим воздействием на биоценоз. Поэтому контроль загрязнений нефтью и нефтепродуктами природных объектов является одной из серьезнейших задач современной экологии.

Чрезвычайно сложное и многообразное строение нефтей обуславливает трудности при их анализе. Существующие методы определения нефтепродуктов обязательно включают последовательное проведение трех этапов: концентрирование и выделение нефтепродуктов, отделение углеводородной части от посторонних веществ и количественную оценку выделенных веществ. Наиболее точными на сегодняшний день методами являются гравиметрический, ИК-спектрофотометрический и газохроматографический. При соблюдении всех условий они дают достаточно достоверные результаты и приняты в качестве арбитражных. Существуют также методы, основанные на измерении косвенных параметров, таких как концентрация паров влаги над жидкостью, электрический потенциал системы и пр. Эти методы, обладая большей или меньшей точностью, требуют периодической сверки с арбитражными. Все методики используют сложную дорогостоящую аппаратуру и реактивы, требуют длительной подготовки пробы и высококвалифицированного персонала.

В последнее время все больше внимания уделяется разработке нового класса методов - биосенсорных, основанных на сочетании биологически активного материала (ферменты, антитела, клетки), и физико-химического детектора биологического сигнала (оптического, колориметрического, электрохимического и пр.). Эти методы отличаются от традиционных относительной дешевизной, простотой, часто более высокой чувствительностью и селективностью, а также быстротой и возможностью проведения анализа in situ. Разработан целый ряд методов такого типа, чувствительных к различным соединениям как природного так и синтетического происхождения. Биосенсоры активно внедряются в практику экологического мониторинга:для определения общей токсичности стоков или отдельных загрязнителей (пестицидов, нитратов, фенолов и др.). Однако до сих пор в известной авторам литературе нет сведений о создании биосенсорных методов определения нефтей и нефтепродуктов.

Микроорганизмы, способные использовать УВ в качестве источника углерода для жизнедеятельности, широко распространены в природе. Такими свойствами обладают многие виды бактерий, грибов, дрожжей и некоторые водоросли. Присутствие в среде нефти вызывает усиленное развитие специализированных микроорганизмов, способных подвергать деструкции те или иные ее компоненты.

Микробная деструкция большинства УВ начинается с окисления, которое катализируется оксигеназными ферментными системами, при этом используется чаще всего молекулярный кислород. Для большинства УВ, в частности, алканов, нафтенов и относительно простых аренов, биодеградация может быть полной, с образованием микробной биомассы, воды и углекислого газа. Микроорганизмы, деградирующие нефтяные УВ, применяются для очистки нефтезагрязненных сточных вод и в препаратах для биоремедиации загрязненных нефтью территорий. Сведений об использовании нефтеокисляющих микроорганизмов в качестве биологически чувствительного элемента биосенсорных систем в литературе не найдено.

С целью разработки методических подходов для анализа нефтяных загрязнений при помощи микробных клеток, нами исследовались бактериальные культуры, способные использовать в качестве единственного источника углерода и энергии н-алканы со средней длиной цепи: Acinetobacter calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5. Клетки обоих штаммов обладали конститутивными ферментами для окисления алкильных групп. Поскольку процесс окисления является аэробным, мы исследовали респираторную активность клеток в отношении н-алканов, а в качестве детектора биологического сигнала использовали чувствительный к кислороду электрод типа Кларка.

С помощью кислородного электрода нами определялась респираторная активность микробных клеток в буферном растворе в присутствии субстрата и без него. Разность значений респираторной активности, приведенная к массе использованных клеток, обозначалась как специфическая респираторная активность (CPA) и выражалась в нА/мин. *мг сухого веса клеток. CPA определялась с целью установления возможности детекции и количественного анализа вышеназванных субстратов в водных средах при помощи микробных клеток.

Поскольку в качестве модельного субстрата нами использовался н-гексадекан С[бН34, обладающий большой адсорбционной способностью и малорастворимый в водных средах, первым этапом нашей работы была модификация методики измерения респираторной активности. Были разделены процессы инкубирования клеток с субстратом и измерения активности кислорода в среде реакции, а также проведена иммобилизация субстрата на хроматографической бумаге. Внесенные изменения позволили уменьшить влияние адсорбции углеводорода на приборе на результаты измерений.

Далее нами подбирались условия культивирования микробных клеток для получения максимальной респираторной активности в отношении н-гексадекана. Было показано, что клетки исследуемых штаммов, выращенные на минеральной среде с добавлением н-гексадекана в качестве источника углерода и энергии, проявляли высокое эндогенное дыхание и небольшую респираторную активность в отношении субстрата, которая увеличивалась после инкубирования клеток в минеральной среде без субстрата. Вероятно, это связано с накоплением УВ в клетке и сохранением их в гидрофобных зонах мембран и в виде включений в протопласте в течение некоторого времени после поглощения соединения из среды. Лишь после утилизации накопленного субстрата, клетки становятся чувствительными к добавлению последнего в среду. Клетки, выращенные на полноценной среде без добавления углеводородного субстрата, проявляли высокую респираторную активность в отношении н-гексадекана Это подтверждает конститутивную природу оксигеназ, имеющихся у бактерий-деструкторов алканов. Таким образом, для проведения дальнейших экспериментов нами использовались клетки, выращенные на полноценной среде. Для поддержания высокого уровня активности культура периодически (раз в две недели) пассировалась на минеральной среде с 0,5% н-гексадекана в качестве единственного источника углерода.

Далее мы оптимизировали условия проведения процедуры анализа с целью получения максимального респираторного ответа клеток на исследуемое соединение. Было изучено влияние рН среды, температуры и концентрации микробных клеток в среде реакции.

Первоначально для каждой культуры была определена оптимальная для анализа CPA концентрация клеток в при инкубации с субстратом. Она составила 0.13 г сух.веса/л для штамма A. calcoaceti-cus ТМ-31 и 0.07 г сух.веса/л для Mycobacterium ,y/?.SL-5.

Изучение влияния рН на CPA клеток Mycobacterium 5/7.SL-5 показало, что они проявляют сходную респираторную активность в отношении н-гексадекана в диапазоне рН 7,4-8,6 в фосфатном буфере, однако при рН 8,2 активность заметно выше. Клетки штамма A. cal-coaceticus ТМ-31 показали большую чувствительность к уровню рН, проявляя высокую респираторную активность лишь при рН 8,4.

Изучение влияния температуры на CPA клеток показало, что возрастание респираторной активности происходит при увеличении температуры до 30°С для штамма Mycobacterium sp. SL-5 и 35°С для А. calcoaceticus ТМ-31. Далее CPA падает, что связано, очевидно, с влиянием температуры на стабильность ферментов. Нужно отметить, что диапазон температур 30-35°С является оптимальным и для роста данных культур [Муратова, 1997].

Используя оптимальные условия культивирования клеток и анализа их респираторной активности, мы исследовали динамику потребления клетками кислорода при добавлении в среду различных количеств н-гексадекана. Было установлено, что до 30 минут инкубирования CPA клеток невелика, независимо от количества добавленного углеводорода. Вероятно, это связано с тем, что для проникновения в клетку достаточно большой водонерастворимой молекулы субстрата и включения соответствующих ферментных систем требуется определенный промежуток времени. Через 30-45 минут инкубирования наблюдается четкая зависимость количества поглощенного клетками кислорода от количества внесенного субстрата. Через 60 мин. зависимость становится менее заметной, что связано, видимо, с лимитирующим воздействием малых концентраций кислорода на активность ферментов первых этапов утилизации алканов. Через 90 минут клетки практически полностью потребляют кислород, растворенный в объеме среды инкубирования. Таким образом, для определения количества алкана в среде по респираторной активности микробных клеток, требуется инкубирование их с субстратом в течение 30-45 минут. Для обоих исследованных штаммов нами были построены калибровочные кривые определения количества н-гексадекана по CPA клеток в диапазоне количеств субстрата 0.03-0.5 об.%.

Поскольку известно, что монооксигеназные ферментные системы способны окислять субстраты, близкие по строению, нами был исследован респираторный ответ клеток на ряд н-алканов со средней длиной цепи (цепи Сб - Сп). Клетки обоих штаммов проявили близкую респираторную активность в отношении алканов как с четным, так и с нечетным числом углеродных атомов в цепи. Респираторный ответ на различные алканы отличался не более чем на 15% для штамма A. calcoaceticus и в пределах 40% для Mycobacterium sp. Был зафиксирован также небольшой отклик на алкилароматические соединения, имеющие не менее двух метальных остатков в составе алкиль-ных структур (амилбензол, ксилол, диэтилбензол). Вероятно, это обусловлено именно наличием в них алкильных групп. В отношении других ароматических соединений (фенол, бензол, толуол) клетки респираторной активности не проявляли. Таким образом, было показано, что монооксигеназы исследованных штаммов обладают специфичностью в отношении н-алканов и алкильных структур. Это согласуется с ранее установленным субстратным спектром данных клеток и является положительным фактом для нашей работы, если учесть что конечной ее целью являлось определение нефтепродуктов, содержащих целый ряд алкановых структур, объединенных понятием «алкановая фракция».

Согласно исследованиям последних лет, наиболее предпочтительным для использования как в биотехнологических процессах так и в сенсорных системах биологическим материалом являются иммобилизованные клетки, которые обладают рядом преимуществ как перед иммобилизованными ферментами, так и перед свободными клетками. К преимуществам относятся прежде всего упрощение операций с используемым биокатализатором (таких как внесение биологического элемента в среду, разделение по окончании процесса, хранение), а в некоторых случаях также повышение специфической ферментативной активности клеток и устойчивости их к воздействию неблагоприятных факторов. В частности, известно, что биодеструкция нефтей иммобилизованными нефтеокисляющими микроорганизмами протекает интенсивнее. Задачей следующего этапа нашей работы было установить возможность иммобилизации алканокисляющих клеток штаммов Mycobacterium sp. SL-5 и A. calcoaceticus ТМ-31, подбор оптимальных условий иммобилизации и носителей, а также сравнительные исследования CPA свободных и иммобилизованных разными методами клеток в отношении н-алканов.

В ходе работы было установлено, что предпочтительным методом иммобилизации исследуемых клеток является адсорбция на поверхности носителя. В качестве носителей были выбраны материалы природного происхождения, доступные и удобные в работе: хромато-графическая бумага и адсорбент на основе мха и древесины «Лессорб». Было показано, что при обоих способах иммобилизации респираторная активность клеток в отношении н-гексадекана снижается (максимум на 40%), однако количественная зависимость между CPA клеток и концентрацией субстрата в среде сохраняется, а диапазон определяемых концентраций алкана увеличивается на 40-60%. Таким образом, была установлена возможность создания биокатализаторов на основе клеток алканокисляющих штаммов,

Задачей следующего этапа работы было исследование возможности использования микробных клетока обладающих специфической ферментативной активностью в отношении одного из типов нефтяных углеводородов, для детекции нефти, представляющей собой многокомпонентную смесь. Исследуемые нами штаммы микроорганизмов обладали CPA в отношении алканов, которые составляют до 88 % (мае.) в составе различных нефтей. Нами были проведены исследования CPA клеток в отношении легкой нефти (плотность при 20°С 0.813 г/мл), которые показали, что для клеток обоих штаммов имеется количественная зависимость между CPA и количеством нефти в диапазоне 0.03-0.7 % об.

Клетки, иммобилизованные на носителе «Лессорб», снижали респираторную активность не более чем на 30% для штамма А. calcoaceticus и не более 14% для Mycobacterium sp, при этом максимально определяемое количество нефти увеличивалось до 0.8-1%(об.).

Иммобилизация на хроматографической бумаге влияла на клетки штамма A. calcoaceticus аналогично предыдущему способу. Активность штамма Mycobacterium sp. в данном случае уменьшалась незначительно (не более чем на 7%). Диапазон определения нефти составил 0.03-0.8 об.%.

Была исследована способность клеток сохранять свою специфическую активность в отношении нефти. Свободные и иммобилизованные клетки хранились при +20, +4 и -16°С. Было показано, что у обоих штаммов активность несколько возрастала через одни сутки при всех способах хранения. Клетки штамма A. calcoaceticus теряли 50% активности через 5 суток и далее активность их оставалась примерно на одном уровне до 60 суток хранения, полностью пропадая через 90 суток. Клетки штамма Mycobacterium sp. теряли 50% активности через 17 суток хранения при 20 и 4°С и на 90% дезактивировались через 40 суток хранения при данных условиях. Быстрее всего терялась активность клеток хранимых при -16 °С. Исследование биокатализатора на основе «Лессорба» показало, что активность клеток A.calcoaceticus при всех способах хранения падает до 20-30% за пять суток и далее сохраняется примерно на одном уровне до 10 суток, полностью пропадая через 15 суток. Клетки Mycobacterium sp. сохраняли активность выше 50% до 10 суток, далее же быстро инактивировались полностью. Лучше всего активность сохранялась при температуре 4°С. При иммобилизации на хроматографической бумаге активность клеток A.calcoaceticus падала в первые трое суток до 60-40%, а далее сохранялась примерно на одном и том же уровне до 100 суток. Клетки Mycobacterium sp. сохраняли высокую активность (около 70%) в течение 20 суток при всех способах хранения, а ниже 50% активность падала после 30 суток. Лучше всего сохранялась активность биокатализатора при комнатной температуре (выше 50% до 60 суток). Полная потеря CPA происходила за 60-100 суток хранения.

Для того чтобы установить, является ли найденная нами зависимость респираторной активности клеток от количества нефти в среде характерной для нефтеокисляющих микроорганизмов, нами были исследованы неидентифицированные штаммы-деструкторы нефтепродуктов, выделенные из нефтесодержащих стоков и накопительной культуры. Все четыре исследованных штамма проявили CPA в отношении нефти, причем оптимальные для анализа условия имели близкие значения для всех штаммов, включая изученные ранее A.calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5 (температура 30-35°С; рН 7.5-8.5; микробная нагрузка 0.044-0.13 г сух.веса/л. Уровень активности и диапазон определяемых количеств субстрата различался для всех штаммов, составляя от 0.4 до 0.8 об.%, минимально определяемое количество составило 0.03 об.%. .

Установив возможность определения нефти по респираторной активности микробных клеток, далее мы рассматривали возможности применения данного метода на практике.

Поскольку из литературных данных известно, что биодеструкция одних и тех же компонентов нефти идет с разной скоростью в легких и тяжелых нефтях, мы исследовали CPA клеток штаммов А. calcoaceticus ТМ-31 и Mycobacterium sp. SL-5 в отношении нефтей разной плотности. Было показано, что свободные клетки проявляли наибольшую активность в отношении средней по плотности нефти

15 3 р =0.842г/см), несколько меньшую в отношении легкой (рь=0.813г/см3) и наименьшую в отношении тяжелой (р15=0.886г/см3), причем разница CPA составила около 80%. В аналогичных измерениях с использованием биокатализаторов на основе данных штаммов разница была гораздо меньшей и составила в пределах 16% для обоих штаммов.

Далее мы проводили изучение CPA микробных клеток в отношении разного рода нефтепродуктов, так как известно, что последние представляют не меньшую, а иногда и большую опасность для окружающей среды, чем сама нефть. В качестве субстратов продукты переработки разных фракций нефти: бензин, дизельное топливо и индустриальное масло. В данном случае также был получен респираторный отклик свободных клеток на субстраты в диапазоне 0.03-0.6 об.% для штамма^, calcoaceticus ТМ-31 и 0.03-0.8 об.% для штамма Mycobacterium sp. SL-5. Активность иммобилизованных клеток была как и во всех предыдущих случаях ниже, однако разница респираторного ответа на разные нефтепродукты составляла не более 25 и 30% для А. calcoaceticus и Mycobacterium sp. соответственно (по сравнению с 60% для свободных клеток). Минимальное определяемое количество составило 0.03 об.%, а максимальное от 0.6 до 1 об.%. Наибольший респираторный ответ клеток обоих штаммов во всех случаях вызывало добавление бензина марки А-95, а наименьший - дизельного топлива.

Далее нами изучалось влияние возможных сопутствующих загрязнителей, присутствующих в нефтесодержащих стоках предприятий разных профилей, на CPA клеток в отношении нефти. При определении концентрации солей в модели учитывалось, что перед этапом биохимической очистки в прудах или на биофильтрах концентрация растворенных солей не должна превышать 10 г/л. Синтетические не-ионогенные ПАВ (оксифос и неонол), а также акриламид и его полимер, добавляли в концентрациях 0,2 г/л, характерных для стоков предприятий машиностроения и металлообработки. Было показано, что штамм A. calcoaceticus более чувствителен к воздействию посторонних веществ. Добавление к суспензии соды в концентрации 10 г/л уменьшает CPA клеток на 33%, а добавление 0,2 г/л буры - на 45%. Остальные исследованные соединения (1,5 г/л NaCl 0,2 г/л ПАВ (неонол, оксифос); 0,2 г/л Fe(N03)2; 0,2 г/л акриламид; 0,2 г/л полиакри-ламид) увеличивают респираторный отклик клеток в отношении нефти на величину от 21 до 73%. На клетки штамма Mycobacterium sp. посторонние соединения воздействуют в гораздо меньшей степени. Лишь 10 г/л соды уменьшают активность, клеток на 33%. Добавление других веществ усиливает активность клеток максимум на 21%. Действие ПАВ вероятно, объясняется его эмульгирующим действием на субстрат, что облегчает поглощение последнего клетками. Увеличение CPA клеток при добавлении солей, таких как NaCl или Ре(ЪЮз)2;вероятно, связано с оптимизацией концентрации в среде элементов, необходимых для ферментативной активности клеток.

Известно, что практически все методики определения нефтепродуктов предусматривают отделение их; от посторонних веществ и концентрирование, что требует особых реактивов и материалов и увеличивает продолжительность анализа. Нами исследовалась возможность концентрирования образца и отделения его от мешающих водорастворимых соединений (например, солей или ПАВ, влияющих на активность клеток) при помощи недорогого и доступного сорбента -целлюлозы. В качестве модельной среды использовали дистиллированную и водопроводную воду, содержащую нефть и различные сопутствующие вещества. Для наилучшей сорбции нефти на необходимом нам материале в исходный образец добавляли 0.2 г/л ПАВ. Было показано, что пропускание модельного образца через сорбент и последующее определение количества осевшей на нем нефти незначительно увеличивает продолжительность процедуры анализа, однако позволяет определять субстрат в диапазоне 0.77-100 мг/л (по сравнению с диапазоном 250-8000 мг/л без предварительной подготовки образца). Минимально определяемая концентрация снизилась практически на два порядка и составила 0.77 мг/л, что соответствует концентрациям нефтепродуктов в сточных водах после их очистки и, соответственно, расширяет возможности применения данного метода на практике. Кроме того, было установлено, что при такой методике проведения анализа существенно снижается воздействие сопутствующих водорастворимых веществ. Так, если в предыдущих экспериментах внесение 10 г/л ИагСОз снижало CPA клеток A.calcoaceticus на 29,8% а клеток Mycobacterium sp. на 33% , то при пропускании образцов, содержащих ту же концентрацию соды, через сорбент и последующем определении CPA, разница составила 1.5% и 0.7% соответственно. 0.2 г/л буры снижали CPA A.calcoaceticus на 45.5%, а в модельных стоках разница составила 2,8%. Добавление ПАВ увеличивало респираторную активность клеток, при этом зависимость респираторного отклика от концентрации в среде нефти сохранялась. Данное влияние, с нашей точки зрения, имело положительную сторону, так как увеличение скорости дыхания клеток дало возможность зафиксировать четкий отклик на малые концентрации субстрата и тем самым повысить чувствительность системы.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гречкина, Елена Владимировна, Саратов

1. Акимова А.А., Володина Т.Н., Маракушкин Л.А. Описание изобретения к патенту RU 97110826/12 МПК В09С1/08 Способ нейтрализации загрязнений почвы нефтью и нефтепродуктами. 0публ.20.06.2000.

2. Алексеева Т.П., Терещенко Н.Н. Бурмистрова Т.Н., Перфильева В.Д., Савиных Ю.В., Стахина Л.Д. Описание изобретения к патенту RU 2137559 МПК В09С1/10, В09С1/08 Способ Очистки почвы от загрязнения нефтью и нефтепродуктами. 0публ.20.09.1999.

3. Алиев С.А., Гаджиев Д.А. Влияние загрязнения нефтяным органическим веществом на активность биологических процессов почв. / Изв. Академии наук Азерб.ССР. 1977. Вып.2. С.46-49.

4. Аммосова Я.М., Орлов Д.С., Садовникова Л.К. Охрана почв от химического загрязнения. М. 1989; 94 с.

5. Арчаков А.И. Оксигеназы биологических мембран. М. Наука. 1983. 54с.

6. Барковский А.Л., Миронов А.Д., Корженевич В.И., Игнатов О.В., Кривопалов Ю.В. Способ получения иммобилизованных микроорганизмов, разрушающих ксенобиотики. Бюл. Изобр. №2, 1992. А.с. №1705345

7. Беляков В.Л., Беляков А.В., Белякова Н.В. Описание изобретения к заявке RU 94023387Al G 01 N 27/00 Способ измерения содержания нефти в воде заяв.20.06.94, опубл. 10.05.97

8. Бирштейн Т.М. Состояние и роль воды в биологических объектах. М.Наука. 1967. 115 с.

9. Боголицын К.Г., Айзенштадт A.M., Почтовалова А.С. Описание изобретения к патенту РФ 2126965 МКИ G 01 N 33/18, 1/10, 27/26 Способ определения содержания нефтепродуктов в воде, заявл. 16.04.96, опубл.27.02.99

10. Ю.Бруевич Т.С. Бластомогенность продуктов переработки нефти. М. 1980. 272с.

11. И.Варфоломеев С.Д. Биосенсоры. //Соросовский образов.журнал. 1997. Вып. 1.С.45-49.

12. Вассоевич Н.Б. Источник нефти биогенное углеродистое вещество. / Природа. 1971. Вып.З. С.58.

13. Веселовский В.А., Вшивцев B.C. Биотестирование загрязнения среды нефтью по реакции фотосинтетического аппарата растений.// Восстановление нефтезагрязненных экосистем. М. 1988. С.99-112.

14. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М. 1988. 150с.

15. Гигиенические аспекты охраны окружающей среды. Научные труды. М. Ин-т общей и коммунальной гигиены. 1976. Вып.4. 138 с.

16. Глазовская М.А., Пиковский Ю.И. Комплексный эксперимент по изучению факторов самоочищения и рекультивации загрязненных нефтью почв в различных природных зонах.//Миграция загрязняющих веществ в почвах и сопредельных средах. Ленинград. 1985. С.185-191.

17. ГОСТ 17.1.4.01-80 Методы определения нефти и нефтепродуктов в водной среде. 1980.

18. Готтшалк Г. Метаболизм бактерий. М.Мир. 1982. 312 с.

19. Гусев А. Г. Влияние сточных вод, содержащих нефть и нефтепродукты, на рыб и обоснование нормирования при сбросе сточных вод в рыбохозяйственные водоемы./Произв.сточные воды. 1960. Вып.5. С.34.

20. Гусев А.Г., Сенцова О.Ю., Коронелли Т.В. и др. Функционирование микроорганизмов в водных экосистемах. Науч. докл. высш. школы. Биол. науки. 1977.Вып.8. С.110.

21. Давидова Е.Г., Белов А.П., Рачинский В.В. Накопление н-алканов клетками дрожжей. //Докл. АН СССР. 1977. Вып.235. С.1189-1192.

22. Давидова Е.Т., Рачинский В.В. Поглощение н-алканов дрожжевыми клетками. //Успехи современной биологии. 1979. Т.88. Вып.2(5). С. 198

23. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. Т.1. /Пер. с англ. М. Мир. 1982.

24. Долинский Е.Ф. Обработка результатов измерений. М, Изд-во стандартов. 1973. 192 с.

25. Измайлова В.Н., Ребиндер П.А. Структурообразование в белковых системах. М. Наука. 1974. 45 с.

26. Ильченко А.П., Василькова Н.Н., Тихонова Е.Б. Влияние уровня растворенного в среде 02 на динамику активностей алкогольоксидазы и НАД-зависимой дегидрогеназы в процессе адаптации дрожжей Torulopsis Candida к гексадекану. //

27. Микробиология. 1991. Т.60. Вып.З. С.454-460.

28. Ильясов П.В., Емельянова Е.В., Ерошин В.К., Решетилов А.Н. Определение глюкозы в ферментационных средах с помощью микробного сенсора при культивировании грибов рода Mucor.// Прикл.биохимия и микробиология. 1996. Т.32. Вып.1. С.94т99.

29. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы. Пер.с англ. /Под ред. Дж.Вудворда. М. Мир. 1988. 216 с.

30. Инструментальные методы исследования нефти. /Под ред. Иванова Г.В. Новосибирск. Наука. 1988. 133 с.

31. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв.// Восстановление нефтезагрязненных экосистем. М. 1988. С.42-56.

32. Камьянов В.Ф., Аксенов B.C., Титов В.И. Гетероатомные компоненты нефтей. Новосибирск. 1983.

33. Капотина JI.H., Морщакова Г.Н., Дедовец С. А. Описание изобретения к заявке RU 97102054/13 C12N1/26, C02F3/34, В09С1/10 Способ очистки объектов окружающей среды от углеводоодов нефти и масел. 0публ.20.07.1998.

34. Караев А.И. Нафталанская нефть, ее биологическое действие и лечебное применение. М. Изд-во МГУ. 1959. 89 с.

35. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. М. Наука. 1982. 144 с.

36. Квасников Е.И., Клюшникова Т.М. Микроорганизмы-деструкторы нефти в водных бассейнах. Киев. Наукова думка. 1981. 115с.

37. Квасников Е.И., Кривицкий И.П. Некоторые закономерности распространения микроорганизмов, усваивающих углеводороды, в почвах нефтяных месторождений.// Микробиология. 1968. Т.37. Вып.2. С.321.

38. Квасников Е.И., Писарчук' Е.Н., Артробактер в природе ипроизводстве. Киев. Наукова думка. 1980. 218 с.

39. Керстен Д.К. Отношение микобактерий, окисляющих углеводороды, к различным . источникам углерода. //Микробиология. 1964. Т.ЗЗ. Вып.1. С.'37-40.

40. Кирпатовский И.П. Охрана природы. М. Химия. 1980. 376 с.

41. Конторович А.Е., Стасова О.Ф. Типы нефтей осадочной оболочки земли. /Геология и геофизика. 1978. Вып.8. С.3-13.

42. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Семененко М.Н. Родококки как природный сорбент углеводородов. //Микробиология. 1986. Т.55. Вып.4. С.683-686.

43. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Игнатченко А.В. Роль эмульгирования в процессе поглощения углеводородов клетками Pseudomonas aeruginosa. //Микробиология. 1983. Т.52. Вып.1. С.94-97

44. Корпан Я.И., Ельская А.В. Микробные сенсоры: достижения, проблемы, перспективы. // Биохимия. 1995. Т.60. Вып. 12. С. 19881998.

45. Красильников Н.А., Цыбань А.В., Коронелли Т.В. Усвоение нормальных алканов и сырой нефти морскими бактериями. Океанология. 1973. Т.13. Вып. 15. С.877.

46. Кулик Е.С., Сомов Ю.П., Розанова Е.П. Динамика выноса клеток при бактериальном окислении гексадекана в протоке через пористую среду.//Микробиология. 1985. Т.54. Вып.5. С.842-847.

47. Кулис Ю.Ю., Разумас В.Й. Биоамперометрия. Вильнюс: Мокслас.1986.215 с.

48. Курдюков Ю.Н., Дубоший А.Н., Дергачева Н.Е., Сигал И.Я. Описание изобретения к авторскому свидетельству SU 1265608А1 G 01 N 33/18 Способ контроля появления нефтепродуктов в потоке воды, заяв.02.08.84, опубл. 23.10.86.

49. Лурье Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод. М. Химия. 1984. 448 с.

50. Мазманиди Н.Д. Исследование действия растворенных нефтепродуктов на некоторые гидробионты Черного моря. Рыб. хоз-во. 1973. Вып.2. С.5.

51. Мазманиди Н.Д., Бажашвили Т.Р. Действие растворенных нефтепродуктов на эмбриональное развитие черноморской камбалы-глоссы. Гидрол. журнал. 1975. Т.П. Вып.5. С.56.

52. Методы общей бактериологии. Пер. с англ./ Под ред. Ф.Герхардта и др. М. Мир. 1983.T.3. С 187.

53. Миллер Дж., Эксперименты в молекулярной генетике. М. Мир. 1976. 280 с.

54. Миронов А. Г. Взаимодействие организмов с нефтяными углеводородами. Ленинград. 1985. 128 с.

55. Морозов Н.В, Николаев В.Н. Влияние условий среды на развитие нефтеразлагающих микроорганизмов. Гидробиол.журнал. 1978. Т.14. Вып.4. С.55-57.

56. Муратова А.Ю. Микробная деструкция минеральных масел. Дис. к.б.н. Саратов. 1997. 186 с.

57. Нельсон-Смит А. Загрязнение моря нефтью. Л. Гидрометеоиздат. 1973. 127 с.

58. Нефти и газы месторождений зарубежных стран. Справочник. /Под ред. Высоцкого В.И., Гусевой А.Н. М. 1977.

59. Нефти СССР. Справочник./ Под ред. Дриацкой З.В., Мхчиян М.А., Жмыховой Н.М. М. 1971-74. Т. 1-4.

60. OCT 38. 01.378-85. Определение нефтепродуктов в сточных водах методом ИК-спектроскопии. 1985.

61. Перт С.Дж. Основы культивирования микроорганизмов и клеток./Пер. с англ. М.Мир. 1978.

62. Петров Ал.А. Химия алканов. М.Наука. 1974. 243с.

63. Петров Ал.А. Углеводороды нефти. М. Наука, 1984. 264 с.

64. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. М. Изд-во МГУ. 1993. 208 с.

65. Плешакова Е.В. Биодеградация ПАВ и минеральных масел и ее генетическая природа. Дис. к.б.н. Саратов. 1998. 168 с.

66. Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В. Деградация минерального масла штаммом Acinetobacter calcoaceticus. II Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т.37. Вып.4. С.398-404.

67. Полякова А.А. Молекулярный масс-спектральный анализ нефтей. М.Недра. 1973. 181 с.

68. Полякова А.А., Тевдорашвили М.Н. и др. Изучение ароматических углеводородов норийской нефти методами масс-ихромато-масс-спектроскопии. / Сообщ. АН СССР. 1982. Т. 105. №1. С.65-68.

69. Правила и инструкции по технической эксплуатации металлических резервуаров и очистных сооружений. М. Недра. 1977. 464 с.

70. Практикум по физико-химическим методам в биологии. Практическое пособие. М. Изд-во МГУ. 1981. 240 с.

71. Решетилов А.Н. Модели биосенсоров на основе потенциометрических и амперометрических преобразователей для использования в медицине, биотехнологии, мониторинге объектов окружающей среды (обзор). //Прикл. биохимия и микробиол. 1996. Т.32. Вып.1. С.78-93.

72. Рогачева С.М. Респираторная активность микроорганизмов по отношению к акриловой кислоте и ее производным дляиспользования в биосенсорах. Дис.канд.биол.наук. 1998. 154 с.

73. Роев Г.А. Очистные сооружения газонефтеперекачивающих станций и нефтебаз.М. Недра. 1981. 240 с.

74. Роев Г.А., Юфин В.А. Очистка сточных вод и вторичное использование нефтепродуктов. М. Недра. 1987. 224 с.

75. Розанова Е.П. Ферментный аппарат углеводородокисляющих микроорганизмов и модели механизмов соокисления углеводородов. //Успехи микробиологии. 1975. Вып.10. С.1-26.

76. Розанова Е.П., Кузнецов С.И. Микрофлора нефтяных месторождений. М. Наука. 1974. 197с.

77. Саксон В.М., Кузнецов С.А., Кретов А.В;, Хромых Д.П., Бойкова И.В., Новикова И.И., Конев Ю.Е. Описание изобретения к патенту RU 2138451 C02F3/34, В09С1/10 Биопрепарат для очистки объектов окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Опубл. 27.09.1999.

78. Сафонова Г.И. Реликтовые структуры в углеводородах нефтей различных стратиграфических подразделений. М. Недра. 1980. 260с.

79. Сергеенко С.Г. Высокомолекулярные соединения нефти. М. Гостоптехиздат. 1964. 115с.

80. Синицин А.П., Райнина Е.И., Лозинский В.И., Спасов С.Д. Иммобилизованные клетки микроорганизмов. М.МГУ 1994. 125с.

81. Солнцева Н.П. Общие закономерности трансформации почв в районах добычи нефти (формы проявления, основные процессы,модели)// Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем. М. 1988. С.23-42.

82. Схерс A.M., Слейкерман В.Ф. Авторское свидетельство ЕР МКИ G 01N 23/08 Способ и измерительный прибор для измерения состава мноофазной жидкости. Заявл. 12.02.1998. 0публ.27.09.2000

83. Тарасова Т.Н. К вопросу об изучении бактерий, окисляющих углеводороды нефти.// Назем, и водн. экосистемы. 1978. Вып.2. С.136.

84. Тиссо Б, Вельте Д. Образование и распространение нефтей. М. Мир. 1981.501с.

85. Тульбович Б.И., Борсуцкий З.Р., Неретин В.Д. Авторское свидетельство SU 1185974 МКИ G 01 N24/08 Способ анализа воды и нефти в водонефтенасыщенных. образцах горных пород. 3аявл.23.02.1984 Опубл.27.04.2000

86. Туманов А.А., Коростылева Е.А. Биосенсоры в анализе объектов окружающей среды.//Анал.химия. 1990. Т.45. Вып.7. С.1304-1312.

87. Химия нефти./Под ред. Сюняева З.И. JI.,1984. :

88. Химия нефти и газа. Учебное пособие для вузов./Под ред.В.А.Проскурякова, А.Е.Драбкина.Л.Химия. 1989. 424 с.

89. Химическая энциклопедия в 5 томах.Т.З. Изд-во «Большая российская энциклопедия». М.1992.

90. Хоркина Н.А. Исследование биодеструктивной активности микроорганизмов при метаболизме токсичных соединений. Дис. к.б.н. 1998. 135 с.

91. Хромов В.М. Влияние нефтепродуктов на планктонное сообщество.//Проблемы изучения действия загрязнений на экосистемы Северных морей. М. Наука. 1978. С.44.

92. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. Л. Химия. 1984. 164 с.

93. Черкинский С.Н.// Гигиена и санитария. 1973. №11. С.9-11.

94. Шабад Л.М. О циркуляции канцерогенов в окружающей среде. М. 1973. 368 с.

95. Шицкова А.П., Новиков Ю.В. и др. Охрана окружающей среды в нефтеперерабатывающей промышленности. М. Химия. 1980. 174 с.

96. Шлегель Г. Общая микробиология. Пер. с нем. /Под. ред. Кондратьевой Е.Н. М. Мир. 1987. 566 с.

97. Штина Э.А. Особенности почвенной альгофлоры в условиях техногенного загрязнения.// Почвоведение! 1985. Вып. 10. С.97-106.

98. Юнкявичус Н.Н., Янкявичус Н.К. Самоочищение северной части залива Куршю-Марес от нефтепродуктов. /Физиолого-биохимические основы развития планктонных организмов залива Куршю-Марес. Вильнюс. 1977. С.128.

99. Яковлев B.C. Хранение нефтепродуктов. Проблемы защиты окружающей среды. М. Химия. 1987. 152 с.

100. Янкявичус Н.К., Баранаускене А.Ю., Грибаускене В.Ю. и др. Прогнозирование уровня самоочищения водоемов, загрязненных нефтепродуктами.//Биофизические аспекты загрязнения биосферы. М. Наука. 1973. С.170.

101. Anderson J.W., Neff J.M., Сох В.А., et al. Characteristic of dispersions and water- soluble extracts of crude and refined oils and their toxisity to estuarine crustaceans and fish. //Mar. biol. 1974. T.27. N.2. P.75.

102. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons: an environmental perspective. //Microbiol.reviews. 1981. V.45. N.l. P. 180209.

103. Atlas R.M., Bartha R. Biodegradation of petroleum in sea water at low temperatures. Can.J.Microbiol. 1972. V.18. N.12. P.1851.

104. Bartha R., Atlas R.M. The microbiology of aquatic spills. Adv.Appl.Microbiol. 1977. N.22. P.225-266.

105. Beam H.W., Perry JJ. Co-metabolism as a factor in microbial degradation of cycloparafinic hydrocarbons. //Arch. Microbiol. 1973. V.91. P.87-90.

106. Beam H.W., Perry J.J. Mycrobial degradation and assimilation of n-alkyl-substituted cycloparaffins. //J. of Bacteriol. 1974. V.118. P.394-399.

107. Cameotra S.S., Singh H.D., Baruah J.N. A hydrocarbon solubilizing/pseudosolubilizing factors in microbial cells. //Biotechnol. Bioeng. 1984. V.26. P.554-556. '

108. Cameotra S.S., Singh H.D., Hazarika A.K., Baruah J.N. Pseudosolubilization in hydrocarbon uptake by yeast cells. //Biotechnol.Bioeng. 1983. V.25. P.2945-2950.

109. Cantwell S.G., Lou E.P., Walt D.S., Fall R.R. Biodegradation of acyclic isoprenoids by Pseudomonas species. //J. of Bacteriol. 1978. V 135. P.324-333.

110. Cavanagh, J.A.E; Nichols, P.D; McMeekin, T.A; Franzmann, P.D. Hydrocarbon degradation by antarctic bacteria.// National Meeting -American Chemical Society, Division of Environmental Chemistry.1996. V.36. N.2. P.285-287.

111. Choo-Seng G., Hing S.,' Grace N.S. Distribution of n-parafins in selected marine bentic organisms. Bull.Environ.Contam. and Toxicol. 1976. T.16.N.1.P.37.

112. Clark R.C., Patten B.G. Observation of a cold-water in tertidol communiti after 5 years Dc.Nike Edward of a low-level, persisten oil spill from the General М.С/ Meigs. J.Fish Res. Board Can. 1978. T.35. N.5. P.754.

113. Draper, W.M; Dhaliwal, J.S; Perera, S.K; Baumann, F.J. Determination of diesel fuel and motor oil in water and wastes by a modified diesel-range organics total petroleum hydrocarbon method.// Journal of AOAC International. 1996. V.79. N.2. P.508-519.

114. Ellis R., Adams R.s. Contamination of soils by petroleum hydrocarbons. //Advances in Agronomy. 1961. Vol.13. P.197-215.

115. Goswami P., Singh H.D. Different modes of hydrocarbon uptake by two Pseudomonas species. // Biotechn.Bioeng. 1991. V.37. P. 1-11.

116. Gutierrez J.R., Erikson L.E. Two mechanisms of hydrocarbon uptake by Candida lipolitica.il Biotechn.Bioeng. 1978. V.20. P.1833-1839.

117. Hanson KG, Nigam A, Kapadia M, Desai AJ., Bioremediation of crude oil contamination with Acinetobacter. sp. A3.// Curr Microbiol1997. V.35(3). P. 191-193.

118. Herbes S.E., Schwall M. Microbial. Transformation of polycyclic aromatic hydrocarbons in pristane and petroleum- contaminated sediments. //Appl.Environ.Microb. 1978. V.35. P.306-316.

119. Higgins I.J., Best D.J., Hammond R.C., Scott D. Metane-oxidizing microorganisms. //Microbiol. Rev. 1981. V.45. N.4. P.556-590.

120. Holliger C. Anaerobic biodegradation of hydrocarbons.// Curr Opin Biotechnol. 1996. V.7(3) P. 326-30.

121. Jobson A.M., Cook F.D.,Westlake D.W. Microbial utilisation of crude oil. Appl.Microbiol. 1972. V.23. N.6. P. 1082.

122. Kappelli O., Finnerty W.R. Partition of alkane by an extracellular vesicle derived from hexadecan-grown AcinetobacterJ J. of Bacter. 1979. V.140. N.2. P.707-712.

123. King D.N., Perry J.J. The origin of fatty acids in the hydrocarbon-utilizing microorganism, Mycobacterium vaccae. J.Microbiol. 1975. V.21. P.85-89.

124. Lai B, Khanna S., Degradation of crude oil by Acinetobacter calcoaceticus and Alcaligenes odorans.ll J Appl Bacteriol 1996. V.81(4). P.355-362

125. Malee F.M., Blanch H.W. Different modes of hydrocarbon uptake by yeasts cells. // Biotech.Bioeng. 1977. V.19. P. 1793-1797.

126. Margesin R, Schinner F. Low-temperature bioremediation of a waste water contaminated with anionic surfactants and fuel oil.// Appl Microbiol Biotechnol. 1998. V.49(4). P. 482-486.

127. Mateles R.I., Baruah J.N., Tannenbaum S.R. Growth of a thermofhilic bacteria on hydrocarbons: a new source of singlecell protein. Science. 1967. N.157. P.1322-1323.

128. McGill W.B. Soil Restoration Following Oil Spiels A Rewiew.// J. of Canadian Petroleum. 1977.P.60-67.

129. McKlown B.A., March G.L. The acute effect of buncer C-oil and oil dispersant on serum glucose, serum sodium and gill morfology in bothfreshwater and seawater assimilated rainbow trout. Water Res. 1978. T.12. N.3. P.157.

130. Mikesell M.D.,Kukor J.J., Olsen R.H. Metabolic diversity of aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from a petroleum-contaminated aquifer.//Biodegradation. 1993/94. V.4. N.4. P.249-260.

131. Perry J.J. Microbial cooxidations involving hydrocarbons. // Microbiol. Rew. 1979. V.43. P. 59-72.

132. Piehler M.F, Paerl H.W. Enhanced biodegradation of diesel fuel through the addition of particulate organic carbon and inorganic nutrients in coastal marine waters.// Biodegradation. 1996. V.7(3) P. 239-247.

133. Pierce R.H., Cundell A.M., Traxler R.W. Persistence and biodegradation of spilled residual fuel oil on an estuarine beach. //Appl. Microbiol. 1975. T.29. P.646-652.

134. Pirnic M.P. Microbial oxidation of methyl branched alkanes. Crit. Rev. Micr. 1977. V.5. P.413-422.

135. Pirnic M.P., Atlas R.M., Bartha R. Hydrocarbon metabolism by Brevibacterium erythrogenes: normal and branched alkanes.// J.Bacter. 1974. V.119. P.868-878.

136. Reddy P.G., Singh H.D., Pathak M.G., Bhagat S.D., Baruah J.N. Mycrobial uptake of hydrocarbons.//Biotech.Bioeng. 1983. V.25. P. 387.

137. Reisfild A., Rosenberg E., Gutnick D. Microbial degradation of oil: factors affecting oil dispersion in seawater by mixed and pure cultures. //Appl.Microbiol. 1972. V.24 P.363-368.

138. Rosenberg M., Rosenberg E.// J.of bacteriology. 1981. V.148. P.51.

139. Sammut M., Nickless G. Petroleum hydrocarbons in marine sediments and animals from the island of Malta. Environ. Poliut. 1978. T.16. V.1.P.17.

140. Sextone A.J., Athlas R.M. Response of populations in arctic tundrasoils to crude oil. Can.J. Microbiol. 1977. V.23 P.1327-1333.

141. Shaeffer T.L., Cantwell S.G., Brown J.L., Watt D.S., Fall R.R. Microbial growth on hydrocarbons: terminal branching inhibits biodegradation.// Appl Environ. Microbiol. 1979. V.38. P.742-746.

142. Soli J., Benz E.M. Selectiv substrate utilisation by marine hydrocarbon clastic bacteria.// Biotechnol. and Bioeng. 1973. V.15. N.2. P.285.

143. Swannell R.P, Lee K, McDonagh M. Field evaluations of marine oil spill bioremediation.// Microbiol Rev. 1996 V.60(2) P.342-365.

144. Teal J.M., Burns K., Farrington J, Analysis of aromatic hydrocarbons in intertidal sediments resulting from two spills of N 2 fuel oil in Buzzards Bay, Massachusetts. J. Fish. Res. Board. Can., 1978, T.35. N.5. P.510.

145. VROM. Concept Leidraad Bodemsanering. Leidschendam. 1988. P.ll-4.

146. Walker J.D., Petrakis L., Colwell R.R. Comparison of the biodegradability of crude and fuel oils. //Can.J.Microb. 1976. V.22. P.598-602.

147. Walker J.D., Colwell R.R., Petrakis L. Biodegradation rates of components of petroleum. //Can.J.Microb. 1976. Y.22. P.1209-1213.

148. Wang Z, Fingas M, Blenkinsopp S, Sergy G, Landriault M, Sigouin L, Foght J, Semple K, Westlake D.W. Comparison of oil composition changes due to biodegradation and physical weathering in different oils.// J. Chromatogr. 1998 T.5. V.809(l-2). P.89-107.

149. ZoBell C.E. Action of microorganisms on hydrocarbons. //Bacter. Rev. 1946. V.10.P.1-49.