Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Респираторная активность микроорганизмов по отношению в акриловой кислоте и ее производным для использования в биосенсорах

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Респираторная активность микроорганизмов по отношению в акриловой кислоте и ее производным для использования в биосенсорах"

РГБ ОЛ * б шр тх

На правах рукописи

РОГАЧЕВА Светлана Михайловна

РЕСПИРАТОРНАЯ АКТИВНОСТЬ МИКРООРГАНИЗМОВ ПО ОТНОШЕНИЮ К АКРИЛОВОЙ КИСЛОТЕ Й ЕЕ ПРОИЗВОДНЫМ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ В БИОСЕНСОРАХ

^ г

03.00.07 - микробиология 03.00.04 - биохимия

Автореферат

диссертации иа соис;сл:1г ученой стег.гш; кандидата биологических КЗуП

Саратов -1993

Работа выполнена в Саратовском государственном университете км. Н.Г.Чсрнышевсхого и в Саратовском научно-исследовательском институте "Биокатализа".

Научные руководители: заслуженны.* деятель шуки РФ, доктор биологических наук, профессор Владимир Владимирович Игнатов; кандидат Снюлоги-чеаагснаук, старший научный сотруцшк Олег Влади;,щроаич Игнатов.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, доцент Валерий Иванович Панасенко: кандидат медицинских наук, старшин научный сотрудник Вячеслав Иванович Коржснгзич.

Ведущая организация - Саратовский научко-ксслсдесательсгам институт сельской гигиены, г. Саратов

Защита состоигся ^¿¿¿¿¿>/71^1 1593 г. в /З^касоз

на заседали! дасссртациошгого-совета Д 074.32.01 "при Российском иаучпо-исслгдоватсльском противочумном институте "Микроб" (410005 г.Саратов, ул.Уш;оерснтгтская, 46).

* о

Автореферат разослан 1998г.

С диссертацией мотаю ознакомип-ся б библиотеке Рс-хпГтаого каушо-исскедог&тсльското пропкочумпого глкплуга "Мш:ро5".

С г,

Ук"Гх:~лй с;;:пагарь дг;;сертгц::огщого ссиста,

дспор Кс^исез Г.А.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

АКТУЛЛЬНССТЬ ПРОБЛЕМЫ. В последние годы одни;,! нз наиболее развивающихся нлпразлеьпш в прикладной микробиологии и биохимии явлг.зт-ся создание аналитических прнбороз ноеого поколешь, основанных на использовании бнссенссроз.

Киосенссри представ ля;-^т собой комбинацию биологически чувствительного элемента я физико-химического датчика и предназначены ятя формирования сигнала, пропорционального концентрации химического соединения з анализируемой среде. В качестве биологически чувствительного элемента в бносскссрах пспо-1ьзуют не.иле организмы, ткани, клетки, ерганеллы, мембраны, ферменты. рецептор! , антитела. нуклеиновые кислоты. Преобразователи мо;ут быть потенциометрнческими. амперомегрпчеекпмн, ксидуктометриче-екпмн, оптическими. калориметрическими. ак%стнчес:снми и др.

Оь:сок:ш селективность и чувсттштельчость, возмо".п:ость определения елог.шых органических соединений в многокомпонентных ''мселх, пр~-стота и ¡¡ысокая скорость анализа. зозмолсность полной автоматизации и создания мн-нн-тюрпых датчикса дл.'! анализа химических веществ, а также достаточная дешезиз^ч метола - чсс зги свойства делают биосснсорпые системы перспех-тиаными для использования в медицине, сельском хозяйстве, пищевой н микробиологической промышленности, з охране окружаюше ;> среды.

Известно, что в биосеисорньгх системах для- экологического контролл з качестве биологически чувствительного элемента чгс;о используют чикроорга- . пизмы, которые облапают специфическим!' ферментными системами, катализирующими деструкцию или трансформацию ксенобиотиков. Микробные сенсссы ^акого типа созданы для определения фенолов, тр!1Хзорэтилена, ка-пролзстама, формальдегида, метана и других химических сседи!1сннй (Тум„.;оз А.А. н Коростылсза ЕЛ., 1990; Решетилов А.Н.. 1997].

Одной нз наиболее гскс)"шых i луп., поллютантов явл£.отся акрилонит-рил. акр: .ламид и акриловал кислота. которые широко производятся и применяются а химической промышленности для получения различных полимерных соединений. Остро стоит проблема непрерывного контроля их содерхса.'шя как в целевых пр дуктах синтеза (полимерах), i:sc и объектах окружающей среды [Акрилошгтрил., 1937; Акриламид., 1989].

Дяа количественного определения акрилонитрила, акриламнда и акрило-зой кислоты используются традиционные аналитические методы анализа, газо-зкндкостная хроматограф™, высоко-эффективная жидкостная хроматография, спехггрофогомстрия, (Зюто.\;егр;!л, и др. [Дмитриев МТ. и др , 1989; Уа!гауа-шипИу А. с! а!., 19б6, 1990: Айзенберг Л.В. и др.. 1989, Горцсва Л.В. и др., 1987]. Обладая несомненными достоинствами, данные методы анализа требуют применения дор<31 ^стоящего оборудована и его высококвалифицированного обслуживания. а татке не исключают предглрдтел'.шй сложной подготовки образца. Кроме ш;о, ссе эти способы не примсш;:.:ы для проведения анализа га 55 непрерывного МОШГГСрННГ.".. Поэтому пройгяыг: создания бисеоисорной системы для опредглглия акриловой ;:;;слотм I! ее производных яв.летсд весьма актуальной. ЦЕЛЬ II ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1дгль!0 длиной работы явилось: разработка и изучение микробных сенсорных систем ш оскоие кислородно!« элестрода для гаипкашш и количест-Егшгсго определения акриловой киглоты, ькрлдамнда и ахрялппшриАЗ г вод-г.!лм растворам.

В салзн с этим б шаг поставлены следующие задачи исследований:

1. Определить возмо-гГлслтъ ¡дс1;ол:.зо:>аил;: бастсриадиллх клеток, обладающих фермента." иг подгото^;пилыиго ыгтаба!шг.:з ахрнлонитрнла и скрлламша, и утилизирующих аэробных условиях акриловую кислоту, в качестве биологически чувствительного олемента сенсорной сие!екы па оспоес кислородного электрода.

2. Охшл.глзирогать усл.тзня культнвнрэианш микробных клеток для получения их (лакецмальпей респираторной а:гглзлссти в стномеппи акрилонитрила, акряламкдак актовой кислоты.

3; Откмтирсвагъ условия анализа респираторной активности микробных меток в отаотеш;:-: акрилошггрлц-с, аг.ршкмща и акрплопед кислоты.

4. Устаноь'.пь зависимость специфической респираторной акти^ност»; м;;кроб-ных клеток от концентрации акрнлошлрши, акрил:.мида н акриловой кяелочы.

5. Изуч;пъ возможность сохранения респираторной активности ¡слеток в отно-шешгл данных сосдшгешш.

6. Определить селективность респираторного ответа микробных клеток.

7. Провести колнчествешюе определение акрклоиитриьа, ахрлламнда н акриловой кислоты в ыодельиыхобразцах сточных вод.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые показана возмолшость определения акрштсшитрила, акриламида и акриловой кислоты по респираторной активности микробных клеток, обладающих различными гидролитическими ферментами подготовительного метаболизма нитрилов и амидов, н способных истользопать акриловую кислоту в качества единственного источника углерода. О

Опта мм з нрсг. зи.! услозия культивирования микробных клеток для получения их высокого респираторного ответа на ахрилишгрил, акриламнд и акриловую кислоту. Определены услозия анализа специфической респираторной активности микробных клеток. Изучены условия сохранения клетками респираторной активности в отношении определяемых соединений. Проанализирован респираторный отклик клеток в отношении других субстратов.

Установлена возможность лолнчественно! о определения акрилоиитрило, акриламида и акриловой кислоты, раздельно и совместно присутствующих в водных растгорзх. Проведено количественное определение данных веществ в модельных образцах сточных еод.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Разработан способ индикации и количественного определения акрилоасй . кислоты, .акриламида и акрилонитрила, раздельно присутствующих в еодных растворах, с помощью специально подготовленных микробных клеток к кислородного электрода - по которому получен патент Российской Федерации К 2033669, приоритет от 31.05.95. и решение о выдаче патента на изобретение по заявке № 97100253/13 (000163), приоритет от 06.01.97. Предложены условия селективного определения данных соединений е их смеси.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСИТСЯ СЛЕДУЮ 1ЦИЕ ПОЛОуХЕНИЯ:

1. Результаты исследований по разработке и оптимизации услознй полученил бактериальных клеток для их использования в качестве биологически чувствительного элемента сенсорной системы на основе кислородного" электрода.

2. Результаты исследовании по подбору и оптимизации условий анализа респираторной активности клеток в отношени чкрилоиитрила, акриламида и акриловой кис лоты и условий сохранения данной ахтпЕНости.

3. Результаты исследований по индикации и количественному определению ак-р.чловой кислоты, акриламида и акрклогаггпила в водных растворах с использованием респираторной активности мшеробчда клзтогс.

4. Результаты нзуче-шя селективности респираторного ответа микробных клеток.

5. Результаты исследований по анализу модельных сточных вод, содержащих акрилонитрил, акриламнд и акриловую кислоту.

АПГОБА1ЖЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации были доложены на Всероссийских и Мккдуна-родных симпозиумах и конференциях: 1П Межреспубликанская научно-техническая конференция "Процессы и оборудование экологических производств" (Волгоград. Россия, 1995); 3rd International Symposium on Environmental Biotechnology (Boston. USA, 1996); Second Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis (Lund, Sweden, 1996); European Conference on Analytical Chemistry "Euroanalysis IX" (Bologna, Italy, 1996); 1 Международная конференция "Микробное разнообразие: ссстсягае, стратегия сохранения, экологические проблемы" (Пермь, Россия, 1996).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 11 работ,*в том числе получены 1 патент и 1 решение о выдаче патента на изобретение. СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения, 9 глаз, заключения, выводов, списка использованной литературы, включающего 134 работы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация изложена па 1$Ч страницах машинописного тексте, включающего 33 рисунка и 12 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Микроорганизмы. В работе использовали шт. В rcvi bacterium sp. 13ПА (ВКПМ В-4987) [Пат. 1752727 РФ], шт. Pseudomonas pscudcalcaligenes КМ-6П (ВКПМ В-4418) [Пат. 1712407 РФ] и шт. Rhodococcus rhodochrous М8 (ВКПМ B-S926) [Пат. 1731814 РФ], полученные в СНГШ Биокагалнза. Микроорганизмы хранили при 4сС па столбиках с 0.4 % агаризованкой LB-средой и пересевали кожзые 3 месяца

Спелы. В работе использовали коммерческие среды отечественного и зарубежного производства: шео-пептонный бульон; LB-срсда (г/л) трпптон Bacto - 10,0, дрозскеьой экстракт Bacto - 5,0, NaCl -10,0. Для уплотнения ере.*' применялся агар в концентрации 15-20 г/л.

Для инкубтеозапт.'.ч микробных ¡слеток с цел! *о по.ту-'енпл высокого респираторного ответа л отношении изучаемых субиратоо использовали солевую спаду: 0.01 М Ыа:пРО,,' КП;Р04, 0,1 г/т Мя&О* рН 7.0 - 7.0. В среду добавляли лкрнлампд (1,0; 2,5; 5,0 г/л1 акрилонитрил (1.0; 2,0; 5.0 г/л), анстонитрнл (2.0 г/л1. Респираторную гктшшосгь микробных к..сток анализировали в буферном рютйоге: Мл^НРО^КН-РОд, 0.02 М. рН 7.0 -7.6: 6,0,- ии.рилгндрагазиуто и ами-дазную агггнгчюсть хлеток - я К,а:НРи.ЖН1.,04. 0.01 М. рН 7.2±0.2.

Осе химические соединсня. используемые в работе, были класса "х.ч." или "ч.д.а." произзолстза СССР, Россия.

Кульг.ч.рнгювз! ;ие клеток ВгегзЬасГсгшт ?р. 1311Л проводили з следе с.;е-ддтощего состава: 1,5% МИЛ, 5,0 г/л акриламнла. рН 7,5, в теченсо 20 ч ппн -•?мпературе 29±1°С. Клетки Рз. рясииоаюанцглея ХМ-6П культизиро?али на

МПЛ, рН 7.2. при 29±Г'С я течение 20-24 ч. Кугагивирозаипе клсгсх ЯЪ •• гюаосЬюиз МВ проводили при 29±1 С в течение 46-43 ч, используя ст>еды: 1) ХН:Р04 - 0.5 г/л; Х2ЬР04 - 0:7г/л; М^Ю4.7Н-.0 1.0 г'.т, СсС!2.6 Н-О - 0.02 г/л; г.гскоза - 20 г/.х мочевина - 15 г'л; дистилли, званная гола - ! /•; рН - 7,2±0.2. (Уозулин С.В..1994]; 2) 1,5% МПА. 2,5 г'л ацетамшг-С рН 7.1=0,1.

Инуубчрочзнио ¡слеток осуществляли а конических колбах на 250 мл. со ■ дгьлсащих 50 мл солевой среды или среды с субстратом, н.т круговой качалке .;рч интенсивности перемешивания 140-160 об/мин при темнепстуре 29±Г'С в г.г\яйк 14 -20 ч. Хонцедпрацин клсок а среде составляла для ВгстлЬайегют зо. I Э11А - 1,0 г сух. пееа / л; для Г^. р=еуск>а1еа!щспе8 КМ-6П - 0.2 г сух. веса /л, для Па. г.чососйгоцз МЗ - 0.6 г сух. веса/л.

Для анализа респир; тной активности клетхи осалс.али цен- ртфупгоо-запием (центрифуга Х-24, ГДР) при 8000 оо/мин з течение 10-15 мин, отмывали з 0,01 М фоеф-атном буфере рН 7,0- 7,6 и ссг.-.'утли центрифугированием з тех же условиях, осадок -•суспендировали в небольшом количестве буфера и определяли концентрацию клеток в сусгкнзин.

РеспиратсрКУ!' пк;'ивкос~ь клеток измеряли по известной методике [Методы общей бактериологии. 1984] помощью кислородно! о электрода (тип Кларка) и полярографа КааеНая ОН-'05 (Венгрия). Измерительная ячейка объемом 1 мл была снабжена магнити й мешалкой и термостатчропхтась с использованием ультратермостата МТА 657. Буферный раствор предварительно аэрировали. В ячейку, заполненную буферным рз^лзооом, последователыю вводили суспензию микробных клеток и водный раствор субстра. а и с помощью кисло-

родного электрода регистрировали изменение силы тока во времени. Разность значений респираторной астивности клеток в присутствии субстрата и без него, приведенную к массе клеток, обозначали как специфическую респираторную активность (CPA) и выражали в м':А/мин*мг сухого веса клетоп.

Для оптимизации условий анализа CPA клзток варьировали: концентрацию клеток в измерительной ячейке (Brevibacterium sp. 13ПА 0,2 - 5,2 r сух.веса/л, ts.pseudoalcaligenes К1Л-6П 0.02 - 0,24 г сух-веса/л, Rh. rhodochrous М8 ОД - 2,8 г сух.веса'л); рН среды (используя 0,05 М фосфатный (рН 5,0-8,0), NaOH-глкцшгозый (рН 9,0-11,0), HCl-глицшювый (рН 2,6-4,0) буферы) и температуру проаедгнна анализа (20 - 60 °С)

Коапситраци'го г.и..фобных клзток определяли по .оптической плотности ¡неточных суспензий при длине волны 540 им на фотоэлектрохолориметра КФК-2 (СССР) в кювете с толщиной оптического слоя 0,5 см и пересчитывали иа сухой вес (r/л) по предварительно построенным калибровочным ¡фпвым. Длл клеток Brevifcactsriurn sp. 13ПА 1 сд. оптической плотности соответствовала 0,67 г сух.вееа/ л: для Ps.pssudoalcaligcnca КК"-61Ъ- 0,16 г cyxxsca/л; для Rh. rhodochreu3 М8 - 0,4 г су.-_в;еа.;л.

Ко;;тле;1тра':"ьч £"рнлпгоптп1Л"~ акличамила п акрилогоп кислоты определил -л методом гозо-яс::;.состиой хроматографии на хроматографе Хром-4А (Чехсслогслкя) с пламаихо-кинхзсц-ис;^»* длхаггором. Для количественного опрздахяшя aiiijii;a;;pyc:,;L;x ездджгклл применяла метод сиугрснпг о стандарта. Длл каждого из компэп-итсз стродлн грэдуироьочный график глдисимо-стп егтнзлкпня пло^ищей пиков йиаллзг.русмого- и стандгггпюго веществ от концентрации вещества. 'Латематш;:и;.;ла оСраСот^у проводили методом нан-:ыа;тх квадратов. Для всех о::радс.г;дс.мых веществ грэдупроаочный график хорошо списывался ypasixciiiwuiu sinscJaio" регрзгепи.

Отт^.елялд.' me щггпнлпi.inm азкоп я тплюстн клеток Rhodosoccus rhodochrous MS проводили со реакции трансформации акрилогиграла 'в скри-л^лпщ. Для. этого клетки создали центрифугированием при £000 об/мин в течение 10-15 ки:-1, затсг,; рсеусиецдировали в фосфатном буфере до величины оптической плотности ОД-03- В пробы (1 мл) вносила акрилошггрил до конечной концентрации 20 г/л. Рс^сцпю проводили при температуре 20°С и постоянно;,! -перемешивании в течение 10 мин; останавливали внесением в реакционный растЕср 0,05 мл 2 N НС1. Концентрацию образовавшегося акриламида определяли методом ПКХ-анаЛиза. За единицу нитрилгидратазной {истивности

приникали количество фермента, катализирующее образование 1 мкМ акрила-мяла за 1 мин. Удельную нитрилгидратазную активность определяли как число единиц активности фермента, приходящихся на 1 мг сухого веса клеток (сд/мг).

Определение змидазной активности микробных клеток Rh. rhodcchrous М8 проводили аналогичным образом.

Изучение условий хранения активной биомассы. Биомассу каждого бактериального штамма, отмытую и отцентрифугированную, хранили во влажном виде в центрифужных пробир-ах при температуре -16°С и 4°С; и в виде клеточкой суспензю1 (концентрация клеток Brevibacterium sp. 13ПА -18 г сух.вееа/л; Ps.pseudoalcaiigcaes КМ-6П - 2,7 г сух.веса/л; Rh. rhodochrous М8 -10,5 г сух.веса/л) в том же буфере при 4°С. Анализ CPA клеток в отношении ак-рилошлрила, атфиламида и акриловой кислоты (1 мМ) проводили в течение 28-30 дней.

Влияние ионов металлов на специфическую респираторную активность клеток изучали, варьируя .концентрацию солей: CuS04-5H20, FeCl3-9H20, ZnS04-7H^D, и ЭДТА в анализируемой среде. Все соединения были класса "ч.д.а.", производетва СССР, России. v

Определение содержания зкридоиитрипа и акрнламида' в образцах мо- -дельных сточных вод проводили двумя способами. В .первом способе первоначально определяли эндогенную респиратор!гую актизность клеток, при их концентрации в ячейке - 1,0 г сух.веса/л, (Brevibacterium sp. 13ПА) и 0,10 г сух.веса/л (Ps.pscudcalcaiigencs КМ-6П). Пробу сточной воды разбавляли буферным раствором, контролируя рН среды; заполнял!: ячейку подготовленной пробой, вводили то >:се количество клеток и измеряли их респираторную актив-. нссть а отношении анализируемого субстраха. Полученное значение соотносили с величиной CPA клеток для стандартного раствора данного субстрата. Во втором способе пробу стет ной вода анализировали без предварительного разведения. В ячейку с буферным раствором и микробными клетками вводили . пробу сточной воды и определяли CPA клеток, голученное значение сравнивали с CPA клеток в отпошени« с тндарта.

Стагистачеекую обработку результатов измерений проводили стандартным методом с использованием t-критерим Стыодента. Кпивые на рисунках строились по средним значениям, полученным в результате нескольких (не менее 3-5) экспериментов.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Известны бактерией.,ные культуры, утилизирующие акрнлонитрил, акри-ламид и акриловую кислоту в качестве единственного источника углерода и энергии [Thompson LA. et al., 1988; Nanasawa Т. and Yamada !L. 1989]. Такая способность микроорганизмов обусловлена наличием в клетках определенных (¡»ерментов подготовительного метаболизма: шггрилгидратазы и амидазы, последовательно катализирующих гидролиз нитрилов до соответствующих амидов и кислот, и нитрилазы, осуществляющей гидре лиз нитрилов непосредственно до кислот. Акриловую кислоту данные микроорганизмы метаболизируст в аэробных условиях путем окислительных реакций [Andreoni V. ct ai., 1990]. Такие бактериальные к>льтуры используют в биокаталнтическом производстве ахрияамида из акрнлонитрила, а также их планируют к применению в локальных системах очистки промышленных сточных вод [Kobayashi М. et а!., 1990; Kobayashi М. ei а!.. 1992; Yamada Н. and Kobayashi М., 1995]. Нами изучалась возможность их использования для индикации и количественного определения производных акриловой кислоты в еодных растворах

Первоначально исследования проводились с клетками бактериального штамма Brcvibaetcrium sp. 13ПА - деструктора акриламида и акриловой кислоты. Клетки обладают нндуцнбельни: • ^«рмгнтом амидазой, катализирующим пщролиз шериламида до акриловой кислоты и ионов, аммония, конечным продуктом биодстрадации акриламида является гидратированиый бикарбонат а;л-мония [Моисеева Т.Н. и др., 1991]. Поскольку данная культура утилизирует ак-риламид в аэробных условиях, для его определения решено было использовать респираторную активность клеток и детекцию биологического сигнала проводить с помощью кислородного электрода Кларка.

Для получения максимальной респнраторн й активности клеток Вге-vibcctcrium sp. 13ПА в отношении акриламида нами оптимизировались условия их культивирования. Было установлено, что клетки данной культуры, выращенные на полноценной питательной среде с акриламкдом - индуктором амн-дазы, обладали амкдазной активностью и не проявляли респираторной активности ь отношении ежриламида. Вероятно, это г,:охз!о объяснить их высоким эндогенным дыханием, которое не позволяет определять изменение респираторной активности, связанное с утилизацией ксепобнотнха.

Респнраторнмй опеки: клеток да гкриламнд был получен в результате их инкубирования в сслиой У £ среда с данным субстратом в концентрации

!.0. 2,5 и 5.0 г/л, причем в условиях эксперимента максимальная респираторная активность клегек отмечалась после инкубирования клеток в среде с 1,0 г/л ак-риламнда.

Чтобы выяснить зависимость СЛ\ клеток з отношении аконламида от длительности те инкубирования в солевой сре ш с су острая ^м, нами была определена дг.памдаа утилизации акрнламида и акр«1.ио::он кислоты культурой ВтемЬайепит эр. 13ГГА (Рнс. 1.А) л про: мления клетками и отношении него респираторной активности (РисЛ.Б). В результате было установлено, что максимальной СРА в отношении а:ф:1Ламида обладают клетки ВгеутЬасТепигп зр. !ЗПА, которые в процессе инкубирования в солезой среде с акридамндом полностью пиролнзезали акрнла.миц н находятся ля стадии утилизации акрилозей кислоты. В дальнейших экспериментах мы нспелъзог.ал;! клетки, полученные таким образом.

5.

з

о

14

О

а 2

1.0 —

60

0.5

о.о Ч

N

20

60

!

Время, ч > ^Ги акуило

ления СРА в отношении акриламида (❖) клетками Втоуша^еггат эр. 13ПА.

Рттс. 1. Динамика утилизации ахриламида (»^м! акриловой кислоты (О) и прояв-

Далее нами и.-учалось влияние различных фактороз иа респираторную активности клеток Brevibafteriuai sp. 13ПА в отношении акриламида: Концентрации клеток в измерительной ячейке, рН-среды, температуры анализа.

Было установлсо, что определение респираторной активности клеток можно проводить при их концентрации в ячейке 0,6-2,8 г сух.веса/п, использование большего количества биомассы лимитировано ограниченным количеством кислорода в ячейке. Оптимальная концентрация клеток - 0,8-1,2 г сух. ве-са'л.

Оптимум рН находился в диапазоне значений 7,0-7,6, которые также являлись оптимальными для амидазной активности клеток и их культивирования.

Оптимальной для проведения анализа была признана температура 35 °С. Понижение температуры приводило к значительному уменьшению реепкра-торного отклика клеток на субстрат,, повышение до 40-50°С сказывалось ка характере эндогенного дыхашш микробных клеток. При 55°С клетки теряли респираторную активности в отношении акриламида, что, вероятно, связано с инактивацией ферментных систем.

Используя оптимальные условия анализа респираторной активности Клеток Brcvibactsrium sp. 13ПА, нами была построена концентрационная зависимость CPA клеток в отношении акрилтмида в диапазоне концентраций последнего 0,01-14 ,\:М (рис.2). Зависимость имела линейный характер в интервале 0,14 - 1,0 мМ и била использогана в качестве калибровочной кривой при количественном определении акриламида.

Селективность определения вещества в многокомпонг-июм растворе является вахеной характеристикой любого способа анализа. Поэтому нами изучался респмратсраып отклик клеток Brevibacierium sp. 13ПА в отношении различных субстратов (1,0 мМ). Било показано, что мп.ч-робпыг кяеткн проявляют респнратсрпуго активность в отпошгшщ амидов - с}'бстрашз фермента алнгда-зы (акриладшда, гцеташзда, г;рол;rosгамiщл, бупмамща) и в отношении соответствующих ни гаслот, сбразугсдахаа в результате ферментативного гидролиза. Причем. максимальная pecnnparopisaa а-епшность клеток зафиксирована в отношении акриламида и екр^дззал кислоты. Клетки не проявляли респираторной активности в отнсд:г:г>1Л акридошприда и бензамида, что объясняется в первом случае отсутствием ферментов, катализирующих гидролиз нитрилов, и во втором случае отсутствием сродства амндазы к аромагичеехим амидам.

0.0 4.0 S.O 1X0

Концентрата, мМ

Рис.2. Кшцентрзенонлая зависимость CPA хлетох

Brevibactermm sp. 13ПЛ в отношении акриламида

Одной из важных задач при создании биосснсорнс 1 системы является определение условий для сохранение ее свойств. Поэтому нами анализировалась респираторная активность клеток Brevibacterium sp. 13ПА в отношении пхрнлзмада в процессе храпения биомассы в различных условиях. Было показано, что СРЛ клеток в отношении акриламида исчезает через 5 суток при любом из указанных способов хранения биомассы, что может быть сзязано с инактивацией фермента амвдазь:.

Поскольку' клетки Brevibacterium sp. 13ПА не могут быть использованы для определения акрилоиитрила, г;ы исследовали респираторную активность

клеток штамма Paeudomocas pseudo.-.lcaligc:íes KM-6Ü - деструктора ахрн"оннт-рила н акрияопеП кислоты.

Известно, что клетки данного штамма осуществляют гидролиз акрнлоннт-рила до агрнлоьой кислоты с помощью констшугисного фермента интрилазы, акриловую кислоту клетки утилизируют в аэробных услопиях [Козулян С.В., 1994]. Для индуцирования респираторной активности в отношении акрнлонит-рила кле.И! инкубировала в солезой среде, в среде с акрклошприлом Cl.О, 2,0. 5,0 г/л) и ацетонктрилом (2,0 г/л). ИнкубнрсЕанке клеток з среде с последним проводили с целью выяснения возможности замены чрезвычайно токсичного дли человека ахрнлопитрила [Ахрплоялтрил, 19S7] i:a mckîw токсичный аце:о-ннтрил.

Было отмечено, что максимальной CPA в отношении акрилошггрнла и акриловой кислоты обладают клег-ш Ps. pacudoolcaligenes КМ-6П, проинкубированные в солевой среде с 1,0 г/л акрилэнпгрида. Данные клетки находились па стадии утилизации акриловой кислоты. Увеличение концентрации субстрата с 2,0 до 5,0 г'л прицедило к исчезновению респираторного ответа клеток на субстраты, хота клепи; ооладалп шггршш1юй asrusuocmo. Это ка:спо объяснить ингкбирушицчы воздействием гифопошприяи на аггшль.-сть цитохр'»: с-оксидазы [Акрнлон1Ггр:ш, 1987}.

Инкубирование с ацетопнтрагюм привело к зиа'^пелыгому увеличению респираторной активности клеток в отношении данного соедпнеж. что. дера--ятао, связано с активацией ферментов, участвующих в окислении уксусной кислоты - продукта гидролиза ац-зтонитрила.

Ü последующих охспгрнментах нами использовались клеп:и Ps. pser.doai-caligsnes КМ-6П с максимальной респираторной -активностью и отношении ají-рилоиитрила, а именно, проинкубированные s солсрсй среде с 1,0 г/л акряло-нитрчлд в течение 18-20 ч.

Было установлено, что анализ респираторной активности можно проводить при хепцйгггр'лцин клеток в ячейке 0,05-0,17 г сух-Ввса/'л. оптимальными являются ко;:це1пращя1 0,08-1,2 г сух-веас/л. Клетки проявляли высокую CPA « отношении ахрилгяштрила в широком диапазоне значений рН 5.0-7,0, максимум активности был зафиксирован при рН 6,0. Оптимальней для проведения . анализа респираторной активности, кис и в случае с клетками Brevibacicnum sp. . 13ПА. язилась температура 35°С.

Селективность респираторного ответа клеток Рз. ряеис1са1са]1пепез КМ-6П (рис. 3) проверяли в отношении некоторых нитрилов, кислот и а;ииламида (0,1 мМ и 1,0 мМ). Было показано, что ¡слетки проявляют респираторную активность в отношенин алифатических нитрилов и соответствующих им кислот и не проявляют отклика в отношении бяизошггрила, что, вероятно, связано с отсутствием сродства фермента нитрнлазы к ароматическим нитрилам. Максимальная чувствительность-определения получена для акрилонитрнла и акриловой кислоты. Небольшую респираторную активность клетки проявляли в отношении акрилэмида, чувствительность определегшя со тавляла 1,0 мМ. Последнее япляется следствием их слабой амидазной активности.

гКрЩККЭД н-бутапозгя к-та уксуспя к-та акрилома к-та

бсКЗОТПГГрИЛ

I пой упф огоггрял пропношггрга гцгтоиитрнл лкр;:ло:штрнл

0 20 40 60 £0 100 120

СРА, %

Рис.3. Селе:яив:юсть рйспиратсрпсго ответа клеток Рг.гаЗепюпах рсеиЗсак-д'лзгггез КМ-6П

□ 0,1 иМ

□ 1 мМ

Нами была построена концентрационная зависимость CPA клеток Ps. pseudoalcaliger.es КМ-6П в отношении акрилотггрила (рис.4) в диапазоне концентраций субстрата 0,005 мМ - 2,0 мМ. Она имела линейный характер в области концентраций 0,01 - 0,10 мМ, где клетки практически не проявляли респираторной активности в отношении других нитрилов и акриламида (рис.3). Это указывает на возможность использования клеток Ps. pseudoalealigenes КМ-6П для количественного определешш акрнлонитрила в растворах, содержащих эквивалентные концентрации других нитридов и акриламида.

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0

Концеггграцня, мМ

Ркс.4. Koraieirrpai^ioHEas зависимость CPA клеток Psaudotacoss pseudoalealigenes KM-6IT в отношении акрилошгчрила.

Для сохранения респираторной активности клеток Ps. poeudcslcnligcnes КМ-бП в отношении акрклонитрнла, нами предлолсено их хранение при 4°С, как во влажном виде, так и в виде суспенз.лгв буферном растворе.

Далее нами проводились исследовашш с клетками штамма Rhodococcus rhodochrous М8, который использовался в промышленности для бнокаталитн-меского получения акриламкда из акрилсннтрмда. Клетки данного штамма обладают ферментами щтгрнлтидратазой ц амндазоа, ггзтализнрующнми последовательный гидролиз акрилотггрнла до амида и к .слоты, биосинтез ферментов кокндуцнруют некотооые алифатические амиды [ Чстауроза О.Б. и др., 1991; Козулин C.B., 1994; Синолнцкий М.К. и др., 1997-]. Культура способна утилизировать акриловую кислоту в качестве едн.чстЕечнсго г'.стсчгаиса углерода в азр&бныхуслоз!!ях.

Для индуцпрованчя ресш;раторнсй ккпг-псета клеток Rh. rhodochrous МЗ, их культивировали по списанной методжг [Ксзулин C.B., 1994] в питательной среде с мочевиной и ионами кобальта и инкубировали в солегой среде. Тп\~;г клетки обладали максимальной нитрилгидратазпой, минимальной амн-дазпой актсганостыо и респираторного ответа па изучзе.мые субстраты практически не давали. Последнее, очевидно, связано с пшерпродухцией з ¡слетках, тппрнлгндргтазы, в результате чего скоростью гидролиза акрплоннтрмда до ак-рилаизда стагговится несоизмеримо выше скорости утилизации последнего.

Респиратсршлй ответ клеток данного штамма в отношении акриленитрн-ла и акрилзмида был получен г,рн six выраплгвинш на МПЛ с ацетачидом в качестве индуктора нитрилшдрзтазы и амндазы и инкубировании а солевой среде и среде с акрилонитрилом. В этом случае наблюдалась кшс нитрилгидра-тазная, тай и амидазная активность клеток. Максимальный респираторный ответ клеток в отношении субстратов был получен в солевой греде.

Изучение влиянип различных фактороз на респираторную активность ¡слеток в отношении шфиг.снитрила (1,0 мМ) и акрилзмнда (1,0 мМ) показало, что оптимальными для проведения анализа являются концентрация клеток 1.01,2 г сух.веса/'л; рН 7,0-7,4 (для определения акрилонитрнла) и рН 4,5-7.2 (для определения акрнлгмида); температура 35°С. Полученные результаты согласуются с данными по влиянию рН н температуры на активность ннтрилгидратазы [Sinolitsky М.К. et al., 1995].

При изучении селективности респираторного ответа клеток Rh. rhodochrous М8 нами использовались клетки, проинкубированные в солевой

среде и в среда с акргыозггридог'Л (1,0 г/л). Копцеитрацкл субстратов в измерительной ячейке составляла 0,1 м!'Л и 1,0 мМ.

Было установлено, что клетки, проинкубированные в солевой среде проявляют максимальную респираторную активность в отношении уксусной кислоты, ацетошпрнла и аиетамида. Относительно высокий респираторный отклик клеток отмечался в отношении акриловой и нропиоповой кислот, их нш-рплчв и амидов. Максимальная чустьптельногть была отмечена в отношешг производных уксусной и акриловой кислот. клетки не проявляли респираторной активности по отношению к изобутпрокитрилу, хлорацетонитрилу и бен-зонитр.ч..у, хотя данные соединения являются субстратами ннтрплгидрагазы [БшоНйку М.К. с! а1, 1995]. Позндимому, эго связано с отсутствием в клетках ферментов, окислхкчцзх мэтаболиты данных соединений. Беизампд гакже на оказывал вшшкиг на респираторную активность клеток.

Респираторный ответ клеток, проинкубированных в солевой среде с ахри-лонитрилом, отличался высокой селективностью по отношению к. производным ахр>.|довой кислоты, но низкой чувствительностью определения субстратов. Поэтому определ'-. лс содержит.*! акрмлонитрила и а крилям ида нами проводилось с помощью : юток, проинкубированных в солевой I ¿еде.

Билл получены лияейные зависимости СРЛ клеток от логарифма концентрация Ехрнлонктрнла и интервале кончен граций 0,01 - 0,5 мМ, и ог концен-тращш-акрнламнда-в диапазонз 0,01 -0,1 мМ.

Поскольку клег'.с: проявляли максимальную респираторную активность в отношении ацетон>1 гриля, нами бьыа проверена возмог.гность его количественного определения и получена линейная зависимость СРА клеток в отношении сцстонитрила от логарифма его концентраций в диапазоне 0,025 - 1,0 мМ.

Для сохранглия респираторной активности клеток в отношении акрило-шпрнл.- и ахрила^ида наиболее оптимальным явилось хранение при -16 "С.

На следующем эль,г исследований нами изучалась возможность количественного определен 'я акриловой кислоты по респираторной активности клеток бактериальных штаммов - Е.слЬасТепим эр. 13ПА, Рз. рзеиаоаЬаЬдепез КМ-6П, Шт. гЬоЛосЬгоиз М8.

Варьируя услогля ¡культивирования микроорганизмов для получения биомассы с высокой респираторной активностью в отношении акриловой кислоты, мы установили, что клетки Вгеу1Ьас1епат ар. 13ПА, проинкубированные в солевой среде, обладают высокой респираторной активностью п о 1 ношении

акриловой кислоты, и не проявляют таковой в отношении акрнламида (рне 5.). Этот феномен иенользозался нами впоследствии для селективного определения акриловой кислоты.

акриловой кислоты и шсрилхмнда от условий их культквнровашзя.

Для других штаммов нами не были обнаружены условия, при которых клегки проявляли бы активность исключительно в отношения акриловой кислоты. высокий респираторный ответ клеток был получек в условиях, аналогичных для возникновения такового на акрнламид или акрилонитрнл.

При изучении влияние температуры и рН кг респираторную активность кикроорггпизмов в отношении акриловой ¡си ело ты было установлено, что оптимальной температурой анализа, как и п предыдущих случаях, является 35°С. Оптимальными значениями рН явились: для Вге\тЬас:епиш кр. 13ПА - 6.0-8,0; для Рз. рвепгЗоэкаНдепея Ш-6П - 3,7-7.2, для НЬ. гЬойосЬгоия М8 - 5,0-7.2. Было отмечено, что клетки проявляю.- одинаковую респираторную активность в отношении акриловой кислоты н се производных только при рН, оптима.тт,г".гт для их культивирования.

В устанозлешых условиях были построены концентрационные зависимости CPA клеток в отношении акрилозой кислоты. Зависимости имели линейный характер в диапазоне концентраций 0,14-1,4 мМ (Brevibactcrium sp. 13ПА), 0,01-0,1 мМ (Ps. pseudoalcaligenes КМ-6П) и 0,01-0,1 мМ (Rh. rhodochrous M8). На основе полученных результатов мы. пришли к заключению, что для проведения количественного анализа акриловой кислоты более предпочтительно применять клгтхен Brevibacterium sp. 13ПА, проинкубированные в солевой среде и клетки Ps. pseudoalcaligenes КМ-6П.

Лучшими условиями для сохранения респираторной активности микробных iUBiOK в отношении акриловой кислоты явились следующие: -16°С - для клеток Brevibacterium sp. 13ПА и Rh. rhodochrous М8 (активность клеток сохранялась неизменной в течение 30 и 20 суток, соответственно); хранение в виде влажной биомассы при 4°С - для клеток Рз. pseudoalcaligenes KM-6II.

На заключительном этапе исследований нами изучалась еозмог.жость количественного определения акрнлонитрнла, акриламида и акриловой кислоты в модельных образцах сточных вод.

Анализ смеси н^ваиных соединений проводился нами поэтапно с использованием клеток Jrevibacierium sp. 13ПА, нроинк> бирс данных в сотсвой среде, клеток Brevibacterium sp. J3FIA, проишеубнрованных в среде с акрилами-дом и клеток Ps. pseudoalcaligenes КМ-бП, проинкубированных в солевой среде с акрилошггрилом. Это позволило последовательно определить и рассчитать • конценуацию акриловой кислоты, акр'<1ламида и акрилонитрияа и показать, что, комбинируя различшле м;пфобные клетки, можно проводить определение данных се единений в их смеси.

Кроме того, нами определен характер воздействия ионов Cu2+ Fe34" и Zn2+, присутствующих в промышленных стоках, на CPA микробных клеток и показано, что только ионы медк е концентрации выше 0,^3 мг/л могут оказывать ингибирующее влияние на респираторную активность клеток Ps. pseudoalcaligenes КМ-бП в отношении акрилоншрила и акриловой кислоты и в концентрации 12,0 мг/л - на активность клеток Brevibacterium sp 13ПА в отношении ак-риламщш. Для устранения ингибирующего эффекта в буферный раствор, используемый для анализа, необходимо добавлять ЭДТА в концентрации 0,1 -0,2 мМ.

В заключите нами были смоделкровглы стоки производства акр.хламида н цазнйкр;!лаг^ида н прозаден их анализ двумя способами. Определенные по

изменению респираторной активности микробных клеток концентрации акри-лонитрила и акриламида хорошо коррелировали с истинными знамениями.

Таким образом, нами была показан; возможность определения акрнло-нитрнла, акриламида и акрщзовой кислот;.!, раздельно и совместно присутствующих в водных растворах, гю респираторной активности микроорганизмов. Полученные результаты могут быть положены в основу технологической разработки микробной биодгнеорной системы для определения содержания вышена-зе .иных соединений в промышленных сточпг-гх водах и объектах окрухгающей среды.

ВЫЕОДЫ

1. Устскозлена возможность использования бактериальных клеток штаммов Brevibacteriam sp. 13ПА. Pseudomonas pseudoalcaiigenes KM-6II, Rhodococcus. rhodochrous M8, обладающих ферментами подготовительного метаболизма ак-рнлонитрнла, акрила?:нда и акриловой ¡-¡слоты в качестве биологически чувствительного элемента сенсорной системы на основе кислородного электрода.

2. Предложены и оптимизированы условна кульипирезания микробных клггсх цгтг.-гмоз Brevibacterium тр. 13 IIA, Pseudomonas pseudoalcaiigenes КМ-бП, Rhodococcus. rhcdochrous M8 для индуцирования максимальной респираторной активности л отношении зкрилонитрила, ахриламидз и якрнло.шн кислоты.

3. Определены оптимальные условия анализа респираторной активности микробных клеток штаммов Brevibacterium sp. 13ПА, Pseudomonas psendoalcaüge-nes КМ-6П, Rhodococcus. rhodochrous M8 в отношении данных соединений: pH среды, температура и концентрация ¡слеток в измерительной ячейке.

4. Изучена селективность респираторного ответа ч определены условия сохранения специфической респираторной активности клеток гттзммов Brevibscte-num Ер. 13ПА. Pseudomonas pseudcalealigenes КМ-6П, Rhodococcus rhcdochrous M3.

5. Установлены зависимости специфической респираторной активности микробных клеток от концентрации акрнлошприла, акриламида и акриловой кислоты. Показан их линейный характер в диапазоне концентраций акрилошгтри-ла: 0,01-0,1 мМ (Pseudomonas pseudoalcaiigenes КМ-6П), 0,01-0,5 мМ (Rh<>3ococcus. rhodochrous М8); акриламида: 0,14-1,0 мМ (Brevibacterium sp. 13ПА), 0,01-0,5 мМ (Rhodococcus. rhodochrous М8); акриловой кислоты: 0,14-

1,4 мМ (Brcvifcaeteriuni sp. 13ПА), 0,01-0,1 мМ (Pseudorconas pseudoaicaiigenes

КМ-6П), 0,01-0,1 мМ (Rhcdccoceus. rhodochrous M3).

6. Показана воамохотооть седгкпгемого определения акрнлонитрила, акриламн-

да и акриловой кислоты в модальных образцах сточных вод.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ignatov O.V., Rogateheva S.M., Khorkina N.A., Ko/.uiin S.V. Acryiamide and acrylic acid determination using respiratory activity of microbial ceils // Biosensors and Bioekctronies -1997. -Vol.12, N2. -P.105-111.

2. Ignatov O.V., Uogatchcvn S.M., Vasii'cva O.V., Ignatov V.V. Selective determination of aeiylonitrile, acryiamide and acrylic acid in waste waters using microbial ceils // Resources, Conservation and Recycle. -1996. -N18. -P.69-7S.

3. Игнатов О.В., Рогачсаа С.М., Хоркина Н.А., Козулнн С.В.. Игпатое Б.В. Определение акриловой кислоты, акриламида и ал-рядонктрпла с пемошыо микробных клеток // "Пржлади:биохимия ч микробиология", в печати.

4. Рогачеиа С.М., Игнатов О.В., Хоркина Н.А., Игнатов G.B. Изучение возможное]-!! определения акриламида и акриловой кислоты но респираторной активности микробных клеток // III мокресиубл. науч.-тех. коиф. "Процессы и оборудование экологических-производс'!!!''. Волгоград, Рисс;:;:, 5-6 декабря 1995 г. -Тез.докл., Волгоград. 1995. -С.150.

5. Игнатов О.В., Рогачева С.М., Хоркина Н.А., Игнатов В.В. Изучение респнра-' торной активности иггаммов-деструеторсв акрнлонитрила. акриламида и акриловой кислоты /ЛИ межреопубл. науч.-тсх. конф. "Процессы и оборудование экологических производств", Волгоград, Россия, 5-6 декабря 1995 г. -Тез.дскл., Волгоград, 1995. -С.149.

6. Ignatov О.V., Rogatchcva S.M., Ignatov V.V. The study of the selectivity of microbial sensor for acryiamide and acrylic acid for environmental control // 3rd International Symposium on Environmental Biotechnology, Northeastern University, Boston, USA, 15-20 July 1996. '- Program, Northeastern University, Boston, 1996. -P. 196.

7. ignatov O.V., R' gatcheva S.M., Ignatov V.V. Microbial-based determination of acrylorairile, acrylaraius and acrylic acid fcr the ervironmcntal control // Second

. Workshop on Biosensors and Biological Techniques in Environmental Analysis, Lur.d, Sweden, 11-13 September 1996. - Abstr. of papers, Lund, 1996. -P. P22.