Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация D-плазмид штаммов рода Raoultella

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная организация D-плазмид штаммов рода Raoultella"

На правах рукописи

Жарикова Наталья Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Б-ПЛАЗМИД ШТАММОВ РОДА ЛАОШТЕЬЬА

03.00.03. - Молекулярная биология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Уфа 2005

Работа выполнена в Институте биологии Уфимского научного центра Российской академии наук

Научные руководители:

кандидат биологических наук Маркушева Татьяна Вячеславовна

кандидат биологических наук Журенко Евгения Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Чемерис Алексей Викторович

доктор технических наук, профессор Ягафарова Гузель Габдулловна

Ведущая организация: Институт экологии и генетики микроорганизмов

Пермского научного центра Уральского отделения РАН

Защита диссертации состоится «30» ноября 2005 г. в 14 часов на заседании Регионального диссертационного совета КМ 002.133.01. при Институте биохимии и генетики Уфимского научного центра РАН по адресу: 450054, г. Уфа, проспект Октября, 71

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Уфимского научного центра РАН

Автореферат разослан <¿3» октября 2005 г. Ученый секретарь Регионального

диссертационного совета, к.б.н.

Бикбулатова С.М.

июе-ч 1Щ0.97

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Известно, что микробная конверсия является основным процессом, приводящим к вовлечению в обмен веществ сложно утилизируемых синтетических производных. Высокий метаболический потенциал и пластичность бактерий загрязненных биотопов в значительной степени обусловлены наличием в их клетках экстрахромосомных генетических элементов. Отмечено, что на уровне плазмидных генов, контролирующих первичные этапы окисления субстратов, происходит формирование и эволюция новых субстратных специфичностей, в то время как гены центральных путей часто имеют хромосомную локализацию.

До настоящего времени исследования разнообразия молекулярно-генетических систем метаболизма хлорароматических соединений касались в основном плазмиды pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134 (Don et al., 1985; Plumeier et al., 2002; Trefault et al., 2004) и организация большинства катаболических плазм ид остается неизвестной.

Цель и задачи исследования.

Цель настоящей работы - выявить особенности структурно-функциональной организации плазмидных систем деградации хлорфеноксиуксусных кислот новых природных штаммов бактерий.

Задачи:

1. идентифицировать штаммы-деструкторы хлорфеноксиуксусных кислот согласно молекулярным критериям систематики;

2. исследовать пути метаболизма молекул хлорфеноксиуксусных кислот и получить количественные и качественные характеристики процессов конверсии субстрата;

3. выявить роль плазмид в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот; _

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ 1 БИБЛИОТЕКА 1

! ¿"-sra&j

4. изучить структурно-функциональные особенности плазмид катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, а именно:

4.1. установить размер и характер полиморфизма длин рестрикционных фрагментов плазмид;

4.2. показать плазмидное детерминирование процессов деградации хлорфеноксиуксусных кислот, а также устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов;

4.3. определить возможность горизонтального переноса плазмид и их экспрессии в разных бактериальных хозяевах;

4.4. выявить уровень гомологии плазмид с модельной плазмидой pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134.

Научная новизна исследования. Выделено 3 новых штамма бактерий-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Установлено, что последовательности генов 16S рРНК штаммов идентичны и наиболее близки к последовательности типового штамма рода Raoultella вида planticola. На примере штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T впервые описаны процессы использования молекул 4-ХФУК (4-хлорфеноксиуксусной кислоты), 2,4-Д (2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты) и 2,4,5-Т (2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты) в качестве источников углерода и энергии для представителей рода Raoultella. Среди метаболитов были выявлены хлорфеноксиуксусная, феноксиуксусная и 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислоты. Установлено, что деградация хлорфеноксиуксусных кислот R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T находится под контролем плазмид, которые получили следующие обозначения: pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T, соответственно. Эти плазмиды были классифицированы как новые D-плазмиды. Обнаружен полиморфизм вышеуказанных плазмид по ВатН I -, Hind III - и Pst I - сайтам рестрикции и определены их размеры, которые составили для pRP33-4ch и pRP36T - 110 тпн, а для pRP36D - 127 тпн. Выявлено, что на исследованных плазмидах также расположены детерминанты

резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Установлено, что плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T являются конъюгативными и способны экспрессировать катаболические функции, а также функции резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в различных бактериальных хозяевах. Выявлено, что плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T не имеют существенной гомологии с плазмидой деградации 2,4-Д pJP4 Ralstonia eutropha JMP134.

Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают особенности организации молекулярно-генетических систем катаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот и вносят вклад в понимание процессов функционирования путей деградации ксенобиотиков. Выделенные штаммы и их плазмиды могут быть применены для создания штаммов-деструкторов in vitro, а также в разработках перспективных технологий очистки окружающей среды.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы VIII-го Экологического конгресса (Корея, 2002), Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), конференции ELSO (Германия, 2003), 1-го Международного конгресса «Биотехнология -состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 2-го Международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Москва, 2004), 7-ой и 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2005), международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005).

Гранты. Работа была проведена при содействии Программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых», РФФИ №02-04-97911, и трех Грантов ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России», в том числе, исследовательского гранта Э0029, фанта № 3 4312 на проведение стажировки и гранта № Д 3278/12742003 для участия в работе Первого Конгресса европейских микробиологов (Словения, Любляна 2003 г).

Публикации. Результаты диссертации изложены в 10 печатных работах.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 20 рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 171 наименование, из них 12 отечественных и 159 зарубежных.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектами исследований служили природные штаммы бактерий, выделенные из смешанных популяций почвенных экотопов, подвергавшихся воздействию факторов нефтехимического производства.

Бактериальные культуры были идентифицированы согласно культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам (Определитель бактерий Берджи, 1997).

Для выявления основных морфологических и морфометрических характеристик клеток и их структурно-популяционных особенностей использовали современные методы электронной микроскопии. Работу проводили на электронном микроскопе Н-300 «Hitachi».

Идентификацию штаммов согласно молекулярным критериям осуществляли на основе секвенирования генов 16S рРНК с использованием универсальных праймеров (Edwards et al., 1989). Первичный анализ сходства нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК изучаемых штаммов был проведен с помощью сервера BLASTA. Последовательности были выровнены с соответствующими последовательностями ближайших видов бактерий с помощью программы CLUSTALW. Построение бескорневых филогенетических деревьев исследуемых бактерий производили с помощью методов, реализованных в пакете программ TREECON.

Анализ содержания хлорированных феноксиуксусных кислот в культурапьной жидкости проводили согласно руководству «Методы определения микроколичеств пестицидов» с небольшими модификациями.

Продукты метаболизма хлорфеноксиуксусных кислот идентифицировали методом хромато-масс-спектрометрии, анализируя совокупность данных о сроках удерживания соединений в хроматографической колонке и данных анализа масс-спектров, основанных на зависимости структура - характер распада. Работу проводили на хромато-масс-спектрометре NERMAG R-30-10 с хроматографом Carlo Erba MEGA 5360. Полученные данные интерпретировали, используя систему обработки данных MS HP ChemStation, содержащей библиотеку из 138000 масс-спектров Base Date WILEY138L.

Определение устойчивости исследуемых штаммов к антибиотикам проводили методом диффузии в агар с применением дисков (Лабинская, 1978).

Плазмидную ДНК выделяли методом щелочного лизиса, с небольшими модификациями. Ферментативное расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции и фракционирование методом электрофореза проводили по стандартным методикам (Маниатис и др., 1984). Элиминацию плазмид индуцировали акридиновым оранжевым (Герхард, 1990).

Для проведения трансформации использовали штамм Escherichia coli HB 101. Компетентные клетки готовили по традиционным методам (Sambrook et.al., 1989). Конъюгацию клеток бактерий осуществляли согласно принципам, изложенным в руководстве «Методы общей бактериологии» (1984), с небольшими модификациями.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Идентификация штаммов 33-4ch, 36D и 36Т на основе морфолого-морфометрических, фнзиолого-биохимических признаков и анализа последовательностей генов 16S рРНК. Выявление индивидуальных морфологических и морфометрических характеристик клеток исследуемых штаммов показало, что на момент анализа микробные популяции образцов 33-4ch (~88% от общего числа клеток популяции), 36D (~95%), 36Т (~93%) была представлена молодыми и зрелыми клетками правильной или слегка искривленной формы овалов и коротких палочек размерами 0,46-0,47/0,9-1,32

мкм, 0,46-0,47/0,72-1,16 мкм и 0,44/0,6-2,1 мкм, соответственно. Молодые клетки имели плотно упакованную структуру и высокую электроннооптическую плотность, в то время как для старых и лизированных клеток была характерна рыхлая цитоплазма и более низкая электроннооптическая плотность (рис. 1).

Рис. 1. Электронно-микроскопические изображения клеток микробных популяций штаммов (X 18000): А - 33-4ch, В - 36D, С - 36Т.

Установлено, что клетки исследуемых штаммов на плотных средах образовывали крупные гладкие блестящие колонии выпуклой формы слизистой консистенции. Оптимальный рост культур наблюдался в пределах от +22"С до +37°С, при значениях pH, близких к нейтральным. Окраска по Грамму отрицательная. Определено отношение штаммов к различным источникам углерода, оксидазная, каталазная и другие активности.

Первичный анализ секвенированных фрагментов, содержащих вариабельные участки нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК, показал, что штаммы принадлежат к филогенетической подгруппе энтеробактерий гамма-подкласса протеобактерий. Для окончательного анализа были секвенированы почти полные последовательности (не менее 1400 нуклеотидов, соответствующие позициям 42-1481 тпн по номенклатуре E.coli) генов 16S рРНК. На основании сравнительного филогенетического анализа изучаемых последовательностей с привлечением ресурсов GenBank бьшо показано, что последовательности генов 16S рРНК исследуемых штаммов

идентичны и входят в кластер видов рода ЯаоиНеИа р1апйсо1а, ЯаоиНеИа огпИЫпо1уиса и ЯаоиЬеИа ¡гехчзапи, в котором наиболее близким к ним является типовой штамм вида КаоиНеИа р1апйсо1а (99.8%). Такой уровень сходства соответствует внутривидовому для Я р1апИсо1а (99,8%) (рис. 2).

0.02

79

100

30 I Raouhella armthmolynca ATCC 31S98 ' Raaulitelln pltmncola 8433 Rooulttlla ormthtnolynca JCM 7251 Raouhella ornfthinohtica JCM609ST

CDaouhtUa ornithnolytka 590681

Rooulttlla planticata 4131 Rooulttlla crmiihmohnca FSK9555 Rooulttlla planf.cala ATCC 43176

Г. Raoultelk trexisami ATCC 3355ST Rooulttlla planncola DR3 Rooulttlla pkmticola 7444 Rooulttlla planncola 7 r- Raouhella plcmneola DSM 30»T

33-4ch = 36D=36T Rooulttlla temgata ATCC33257T Raouhella remgata SW4 Rooulttlla mrigtna га 5

100

¡RaoultiHa temgem m 30 99 ' Rooulttlla ttmgeno m 19

- Rooulttlla plantirola JCM 7251*

Рис. 2. Филогенетическое положение штаммов по последовательности гена 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее 2-м нуклеотидным заменам на каждые 100 нуклеотидов. Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью "bootstrap" - анализа (значащими признаются величины показателя "bootstrap" более 50).

Согласно совокупности морфолого-морфометрических, физиолого-биохимических и молекулярно-генетических характеристик исследуемые культуры были дифференцированы как штаммы рода Яаоике11а вида р1атко1а.

Динамика конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот R. р1апйсо1а 33-4сЬ, /У. р1апНсо1а 360 и Я. р1апйсо1а 36Т в периодической культуре. На рис. 3 представлены графики, отражающие динамику конверсии хлорфеноксиуксусных кислот и накопления биомассы штаммов в зависимости от времени их инкубации.

Рис. 3. Динамика роста штаммов R. planticola 33-4ch (А), R. planticola 36D (В) и R planticola 36Т (С) в условиях использования в качестве источников углерода и энергии 4-ХФУК (I), 2,4-Д (II) и 2,4,5-Т (III). Оценка остаточного количества хлорфеноксиуксусных кислот (%) в среде культивирования (D).

Из приведенных данных следует, что Я р1апИсо1а 33-4сЬ, Я р1апйсо1а ЗбО и Я р!апИсо1а 36Т могут быть отнесены к штаммам-деструкторам. Следует отметить, что ранее деструкторы хлорфеноксиуксусных кислот, принадлежащие к роду ЯаоиНеПа, выявлены не были.

Анализ этапов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов Яаоиие11а р1апйсо1а 33-4сЬ, ЯаоыКеИа р1апйсо1а ЗбО и ЯаоиНе11а р1апйсо1а 36Т. Исследование характера промежуточных продуктов превращения молекул ксенобиотиков, наблюдаемых в среде культивирования штаммов в периодической культуре, позволило идентифицировать среди ключевых метаболитов хлорфеноксиуксусную, феноксиуксусную и 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновую кислоты. Эти данные свидетельствуют о том, что конверсия хлорзамещенных феноксиуксусных кислот штаммами Я. р1апИсо1а 33-4сЬ, Я. р1апНсо1а 36Б и Я. р1апНсо1а 36Т осуществляется сходным образом и проходит через одинаковые промежуточные соединения (рис. 4).

Представляется интересным и то, что штаммы Я. р1апИсо1а 33-4сЬ, Я. р1агМ1со1а ЗбО и Я. р1апНсо1а 36Т полностью дехлорируют все три субстрата до открытия ароматического кольца. В отличие от 2,4,5-Т и 4-ХФУК, для которых подобный путь метаболизма известен, полное дехлорирование 2,4-Д до расщепления ароматического кольца ранее не описывалось. Кроме этого, образование молекул 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеноновой кислоты в ходе конверсии 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т, указывает на то, что у исследованных штаммов расщепление ароматического кольца происходит не по орто - пути, который характерен для деградации хлорароматических соединений, а по мета-пут, который был установлен для ограниченного числа микроорганизмов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот. Для бактерий, выполняющих диссимиляцию 2,4,5-Т, мета - путь до настоящего времени описан не был.

ОСН2СООН XI

ОСН2СООН С1

С1

II

ОСН2СООН

С1

С1

OCH2COOt

I

сон

:оон

IV

о

СН3

V

Рис. 4. Схема метаболизма 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т штаммов R planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R planticola 36T. I - 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота; II - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; III - 4-хлорфеноксиуксусная кислота; IV - феноксиуксусная кислота; V - 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислота.

Анализ плазмидного статуса клеток Raoultella planticola 33-4ch, Raoultella planticola 36D и Raoultella planticola 36T. С использованием метода щелочного лизиса из клеток штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T были выделены плазмиды, обозначенные pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T, соответственно. RFLP-анализ показал, что все три плазмиды имеют ВатН I Hind III - и Pst I -сайты рестрикции, при этом у плазмид pRP33-4ch и pRP36T обнаруживаются идентичные профили фрагментов ДНК, в то время как для pRP36D характерны существенные отличия (рис. 5).

На основании полученных данных были определены размеры плазмид, которые составили для рЯРЗЗ-4сЬ и рЯРЗбТ - 110 тпн, а для рЯРЗбЭ- 127 тпн.

т 1<№6

Рис. 5. Результаты электрофоретического разделения фрагментов плазмид рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ после обработки рестриктазами ВатН1 (А), Шп<й\\ (В) Ри\ (С). Условные обозначения: стрелками показаны фрагменты маркера, рамкой ~ область полиморфизма плазмид. 1,2 -маркеры, ДНК фага X, рестриктированная РвА, и ШгиЛИ; 3, 5, 7 - нативные препараты Р11РЗЗ-4сЬ, рЯРЗбО, рЯРЗбТ; 4,6,8 -фрагменты р11РЗЗ-4сЬ, рЯРЗбО, р11Р36Т после обработки соответствующими рестриктазами.

Участие плазмид рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбО и рИРЗбТ в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот. Для локализации генетических детерминант деградации хлорфеноксиуксусных кислот Я. р1апИсо1а 33-4сЬ, Я. р1апНсо1а 360 и Я. р1апйсо1а ЗбТ использовали метод дискриминации признака. Элиминацию плазмид из клеток бактерий индуцировали обработкой микроорганизмов ДНК-тропным агентом -акридиновым оранжевым.

Было установлено, что с потерей плазмид все исследованные штаммы утрачивали способность использовать 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что детерминанты катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот расположены на плазмидах рКРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбО и рЯРЗбТ. Поэтому данные плазмиды могут быть классифицированы как плазмиды деградаций или О-плазмиды.

Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмидах р11РЗЗ-4с11 рЯРЗбБ и рКРЗбТ.

Сравнительное тестирование клеток Я. р1апПсо1а 33-4сЬ, Я р1апИсо1а 36В и Л р1апЧсо1а 36Т и их бесплазмидных вариантов на селективных средах показало, что плазмиды рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ несут общие детерминанты устойчивости к антибиотикам: тетрациклину, хлорамфениколу и канамицину (табл. 1).

Таблица 1

Результаты тестирования признаков устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов Я. р1аШ1со1а 33-4сЬ, Я. р1ат1со1а 36Э, II. __р!апПсо1а 36Т__

№ Признак R. planticola 33-4ch R. planticola 36D R. planticola 36T

pRP33-4di+ pRP33-4ch~ pRP36D+ pRP36IT pRP36T pRP36T

1 tet + — + — + —

2 cat + — + — + —

3 kan + — + — + —

4 bio — — + — _ —

5 str — — + — — —

6 Cu2+ + — + — + —

7 Fe3+ + — + — + —

8 Cd2+ + — + — + —

9 Co2+ + — — — — —

10 Ag+ - — — — + —

И Cr2* - - + - - -

Условные обозначения: + - устойчив; - чувствителен; tet - тетрациклин; cat -хлорамфеникол; кап - канамицин; bio - биомицин; str - стрептомицин.

Плазмида рЯРЗбЭ содержит также дополнительные гены резистентности к биомицину и стрептомицину. Гены устойчивости к меди, железу и кадмию присутствуют на всех трех плазмидах. В то же время, устойчивость к кобальту характерна только для рЯРЗЗ-4с11, резистентность к серебру свойственна для рЛРЗбТ, а устойчивость к хрому - для рЯРЗбЭ.

Таким образом, плазмиды рЯРЗЗ-4сИ, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ имеют значительные структурно-функциональные различия относительно признаков устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов.

Горизонтальный перенос плазмид КРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбП и рЯРЗбТ и экспрессия функций катаболизма и резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам в других бактериальных хозяевах. Результаты исследования способности плазмид р11РЗЗ-4с11, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ к трансферу и экспрессии катаболических функций и функций устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов в различных хозяевах приведены таблицах 2 и 3.

Таблица 2

Результаты скрининга трансформированных штаммов Е. coli НВ101

Штамм-реципиент Плазмида Генотип трансформированных клеток

E.coli НВ101 pRP33-4ch tet+, kan+, cat+ сор+, iron+, cad+, cob+ tfd+, tft+, tcp+

pRP36D tet+, kan+, bio+, cat+, str+ cop+, iron+, cad+, chr+ tfd+, tft\ tcp+

pRP36T tet+, kan+,cat+ cop+, iron+, cad+, arg+ tfd\tft\tcp+

Условные обозначения: tet+ - детерминанты устойчивости к тетрациклину; cat+ - хлорамфениколу; kan+ - канамицину; bio+ - биомицину; str+ -стрептомицину; сор+ - гены устойчивости к катиону Cu2+; iron+- Fe3+; cad+ -Cd2+; cob+ - Co2+; chr+ - Cr2*; arg* - Ag+ , tfd - гены катаболизма 2,4-Д, tft - гены катаболизма 2,4,5-Т, tcp - гены катаболизма 4-ХФУК.

Как видно из данных таблицы 2, в трансформированных клетках Е соП НВ101 наблюдалась экспрессия функций деградации хлорфеноксиуксусных кислот, а также устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов, контролируемых плазмидами рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ.

Таблица 3

Результаты анализа конъюгативного переноса плазмид

pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T в условиях чистой культуры

Штамм-реципиент Штамм-донор Наличие трансконьюгантов Генотип трансформированных клеток

R. planticola 36T R. planticola 33-4ch + kan+ tfd+, tft+, tcp+

R. planticola 36D + bio+ cad+ tfd+, tft+, tcp+

Citrobacter hydrophila IBRB-36 4CPA R. planticola 33-4ch - -

R. planticola 36D - -

R- planticola 36T - -

Serratia marcescens 1BRB-22S R planticola 33-4ch - -

R. planticola 36D - -

R planticola 36T - -

Gluconobacter oxydans IBRB-2T R. planticola 33-4ch + tet+ cob+, cad+ tfd+, tft+, tcp+

R. planticola 36D + cat+ cad+ tfd+, tft+, tcp+

R planticola 36T + tet++ arg+ tfd+, tft+, tcp+

Условные обозначения: tet+ - детерминанты устойчивости к тетрациклину; cat+ - хлорамфениколу; kan+ - канамицину; bio+ - биомицину; cob+ - гены устойчивости к катиону Со2+; cad+ - Cd2+; arg+ - Ag+ .

Конъюгативный перенос плазмид pRP33-4ch и pRP36D в клетки родственного штамма R. planticola 36Т в модельной системе показал, что все трансконъюганты экспрессировали генотипы, соответствующие донорским плазмидам. Сходный результат был получен и для штамма Gluconobacter oxydans IBRB-2T, в то время как переход плазмид pRP33-4ch, pRP36D, pRP36T

в клетки штаммов Citrobacter hydrophila IBRB-36 4СРА и Serratia marcescens IBRB-22S не наблюдался.

Таким образом, результаты исследования показали возможность трансфера катаболических плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T в клетки других штаммов, при этом экспрессия катаболических генов деградации хлорфеноксиуксусных кислот и функций устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов в новом хозяине осуществлялась в полном объеме.

Дот-блот гибридизация препаратов плазмид pRP33-4ch, pRP36D, pRP36T и pJP4.

Принимая во внимание то, что к настоящему времени генетическая организация бактериальной деградации хлорфеноксиуксусных кислот достаточно подробно исследована только для катаболической плазмиды деградации 2,4-Д - pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134, была проведена оценка уровня гомологии между плазмидами pRP33-4ch, pRP36D, pRP36T и модельной плазмидой pJP4. Результаты представлены на рисунке 6.

Рис. 6. Результаты дот-блот-гибридизации препаратов плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T с зондом 32P-pJP4. 1 - контроль (pJP4), 2 - pRP33-4ch, 3 - pRP36D, 4 - pRP36T.

Плазмида pJP4 была любезно предоставлена для работы профессором Sabine Kleinsteuber (Centre for Department of Environmental Microbiology, Germany). Поиск гомологии нуклеиновых последовательностей выполнялся методом дот-блот гибридизации. В качестве зонда использовали плазмиду pJP4, меченную 32Р. Для достоверности опыт проводили в трех повторах, контролем в эксперименте служил препарат плазмиды pJP4.

На основании приведенных результатов, можно сделать вывод о том, что гомология исследуемых плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T с модельной плазмидой pJP4 является незначительной. Эти данные можно рассматривать как аргумент в пользу того, что плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T имеют существенные отличия от плазмиды pJP4.

ВЫВОДЫ

1. Выделены новые штаммы-деструкторы, отнесенные согласно молекулярным критериям систематики к роду КаоиНеПа виду р1апИсо1а.

2. Впервые установлены этапы метаболизма 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т для штаммов Я р!апИсо1а. Показано, что катаболизм 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т этих штаммов происходит с образованием хлорфеноксиуксусной, феноксиуксусной и 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновой кислот.

3. Впервые идентифицированы и определены размеры плазмид штаммов-деструкторов ЯаоикеИа р1апИсо1а 33-4сЬ, КаоикеНа р1стИсо1а 360 и КаоиНеПа р1апИсо1а 36Т, получивших следующие обозначения: рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбО и рЛРЗбТ, соответственно.

4. Показано, что на плазмидах рЯРЗЗ-4сЬ, рЛРЗбО и рЛРЗбТ расположены генетические детерминанты конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот, устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов, что позволило классифицировать данные плазмиды как новые Э-плазмиды бактерий.

5. Выявлено, что плазмиды рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ способны к горизонтальному переносу и экспрессии функций катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в других бактериальных хозяевах.

6. Установлено, что плазмиды рЯРЗЗ-4сЬ, рЯРЗбЭ и рЯРЗбТ имеют существенные структурно - функциональные отличия от плазмиды рДР4 ЯаШота еШгорИа ЖР134.

Список основных публикаций по теме диссертации

1. Markusheva T.V., Zhurenko Е. Yu., Galkin E.G., Korobov V.V., Zharikova N.V. Ecosystems exposed to anthropogenic pollutants action: biodiversity of soil bacteria - destructors //VIII Congress of Ecology. - Korea, 2002. - P. 19.

2. Коробов B.B., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Маджар В.В., Жарикова Н.В., Калимуллина Э.Р., Гафиятова Л.Р., Маркушева Т.В. Микроорганизмы для очистки окружающей среды // 1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития». - Москва, 2002. - С. 276.

3. Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова JI.P. Gluconobacter oxydans IBRB-2T - деструктор 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной кислоты // Биотехнология. - 2003. - № 6. - С. 67-71.

4. Жарикова Н.В., Гафиятова JI.P., Коробов В.В., Галкин Е.Г., Маджар В.В., Михалев А.А., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Плазмиды штаммов-деструкторов хлорфеноксиуксусных кислот бактерий рода Klebsiella // Тезисы докладов 7-ой Путинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». - Пущино, 2003. - С. 273.

5. Zharikova N.V., Korobov V.V., Zhurenko E.Yu., Gafiyatova L.R., Michalev A.A., Madjar V.V., Galkin E.G., Markusheva T.V. Bacteria-degrading phenol and its chlorinated derivatives // First FEMS Congress of European Microbiologists. - Slovenia, 2003. - P. 430.

6. Zharikova N.V., Gafiyatova L.R., Korobov V.V., Galkin E.G., Madjar V.V., Zhurenko E.Yu., Markusheva T.V. Plasmids of Klebsiella strains-degrading chlorophenoxyacetic acids // ELSO Meeting. - Germany, 2003, P. 264.

7. Маркушева T.B., Журенко Е.Ю., Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова JI.P. Идентификация и характеристика плазмиды штамма Aeronomas hydrophila IBRB-36-4CPA, несущей гены катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот // Генетика. - 2004. - Т. 40. - № 11. - С. 1469-1474.

8. Галкин Е.Г., Коробов В.В., Жарикова Н.В., Гафиятова JI.P., Журенко Е.Ю., Маркушева Т.В. Масс-спектрометрия в исследованиях процессов

биологической конверсии пестицидов // Материалы 2-го международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии». - Москва, 2004, - С. 265.

9. Гафиятова J1.P., Жарикова Н.В., Лубянов Е.А., Логинова А.Н., Ягудин P.A., Дремова А.Ю., Фатхиева Г.Р., Маджар В.В., Маркушева Т.В. Микроорганизмы промышленных экосистем: деструкторы хлорзамещенных ароматических кислот // Тезисы докладов 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века». -Пущино, 2005. - С. 196.

Ю.Маркушева Т.В., Жарикова Н.В., Коробов В.В., Ситдикова Л.Р., Журенко Е.Ю. Идентификация и сравнительный анализ D-плазмид бактерий-деструкторов рода Raoultella // Материалы международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды». - Саратов, 2005 - С. 86.

Г

Жарикова Наталья Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ D-ПЛАЗМИД ШТАММОВ РОДА RAOULTELLA

03 00.03 - молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Лиц. наиздат. деят Б848421 от 03.11.2000г. Подписано в печать 27.10.2005 Формат 60x84/16 Компьютерный набор. Гарнитура Times New Roman Отпечатано на ризографе. Усл.печ.л -1,5 Уч.-изд.л -1,7 Тираж 100 экз Заказ № 133

Издательство БГПУ 450000, г Уфа, ул. Октябрьской революции, За

»20 934

РНБ Русский фонд

2006-4 18861

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Жарикова, Наталья Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Плазмидные системы биодеградации хлорированных ароматических соединений

1.1. Плазмиды бактерий

1.2. Организация и эволюция путей катаболизма хлорароматических соединений

1.3. Ключевые гены и ферменты верхних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот

1.4. Ключевые гены и ферменты нижних путей катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот

1.5. Плазмида pJP4 - модельная плазмида деградации 2,4-Д

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Получение чистых культур штаммов-деструкторов

2.3. Идентификация штаммов 38 (* 2.3.1. Классификация штаммов по культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам

2.3.2. Определение морфологических и морфометрических характеристик клеток методом электронной микроскопии

2.3.3. Молекулярно-биологическая идентификация штаммов на основе секвенирования гена 16S рРНК

2.3.3.1.Выделение и характеристика суммарной ДНК

2.3.3.2. Амплификация, секвенирование и анализ последовательностей генов 16SpPHK

2.4. Рост культур в жидкой питательной среде и его учет

2.5. Определение количеств хлорированных феноксиуксусных кислот в культуральной жидкости

2.6. Идентификация продуктов метаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот

2.7. Выделение плазмидной ДНК

2.8. Фракционирование препаратов ДНК в агарозном геле

2.9. Обработка препаратов плазмид рестриктазами и определение размеров фрагментов ДНК

2.10. Элиминация плазмид, индуцированная акридиновым оранжевым

2.11. Определение устойчивости бактерий к антибиотикам и тяжелым металлам р 2.12. Трансформация штаммов

2.12.1. Приготовление компетентных клеток

2.12.2. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК

2.13. Конъюгация клеток бактерий

2.14. Гибридизация препаратов ДНК на фильтре

2.14.1. Получение радиоактивного зонда методом замещения нуклеотидов

2.14.2. Иммобилизация плазмидной ДНК на нитроцеллюлозном fa фильтре

2.14.3. Дот-блот гибридизация препаратов ДНК на нитроцеллюлозном фильтре

2.15. Физико-химические свойства и область применения хлорфеноксиуксусных кислот (4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1.Идентификация штаммов 33-4ch, 36D и 36Т на основе морфолого-морфометрических, физиолого-биохимических признаков и анализа последовательностей генов 16S рРНК и 3.1.1. Морфолого-морфометрические признаки штаммов

3.1.2. Физиолого-биохимические признаки штаммов

3.1.3. Анализ последовательностей генов 16S рРНК штаммов

33-4ch, 36D и 36Т

3.2. Динамика конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T в периодической культуре

3.3. Анализ этапов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T

3.4. Анализ плазмидного статуса клеток штаммов R. planticola 33-4ch,

R. planticola 36D и R. planticola 36T

3.5. Участие плазмид pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот

3.6. Локализация детерминант резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов на плазмид ах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T

3.7. Горизонтальный перенос плазмид RP33-4ch, pRP36D и pRP36T и экспрессия функций катаболизма и резистентности к антибиотикам и тяжелым металлам в других хозяевах

3.8. Дот-блот гибридизация препаратов плазмид pRP33-4ch, pRP36D, pRP36T и pJP

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Структурно-функциональная организация D-плазмид штаммов рода Raoultella"

Актуальность проблемы. В современном мире хлорированные ароматические соединения широко используются в качестве компонентов пестицидов, хладагентов, красителей, растворителей, лекарств, в их составе поступают в окружающую среду. Большинство таких соединений опасны для человека и животных, а некоторые из них, например, хлорфеноксиуксусные кислоты, применяемые в качестве пестицидов и гербицидов, используются именно вследствие своей токсичности.

Известно, что микробная деградация является основным процессом, приводящим к разрушению сложно утилизируемых соединений в природных условиях. Штаммы бактерий, изолированные из загрязненных биотопов, обладают высоким метаболическим потенциалом и генетической пластичностью, которая в значительной степени обусловлена наличием в их геномах внехромосомных элементов - плазмид. Автономно существуя в бактериальных клетках-хозяевах, плазмиды способны к длительному самоподдержанию, саморегуляции и самовоспроизведению. Конъюгативность или трансмиссивность многих плазмид, заключающаяся в их способности к переходу от одних клеток-хозяев к другим, является одним из важнейших свойств этих внехромосомных элементов. Представляется (* закономерным, что формирование и дальнейшая эволюция новых субстратных специфичностей у прокариот происходит, как правило, на уровне плазмидных генов, контролирующих первичные этапы окисления субстратов, в то время как гены центральных путей часто имеют хромосомную локализацию (Ribbons, Eaton, 1982).

До недавнего времени исследования разнообразия молекулярно-генетических систем катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот касались в основном плазмиды деградации 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты (2,4-Д) pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134 (Don et al., 1985; Kasberg et al., 1995; Plumeier et al., 2002) и ее гомологов. Вместе с тем, организация большинства [ плазмид катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот до сих пор остается неизвестной. Несомненно, что изучение структурной организации новых D-плазмид, выделенных из природных штаммов, будет способствовать более глубокому пониманию эволюционных процессов, лежащих в основе возникновения и становления путей биодеградации ксенобиотиков, в том числе, хлорфеноксиуксусных кислот. Кроме того, исследование микробиологических процессов деградации на молекулярном уровне имеет важное экологическое значение с точки зрения возможного целенаправленного использования бактерий и их генетического пула в технологиях очистки окружающей среды нового поколения. Цель и задачи исследования.

Целью настоящей работы являлось выявление особенностей структурно-функциональной организации плазмидных систем деградации хлорфеноксиуксусных кислот новых природных штаммов бактерий, выделенных из загрязненных биотопов.

Задачи:

1. идентифицировать штаммы-деструкторы хлорфеноксиуксусных кислот, в соответствии с молекулярным критериям систематики;

2. исследовать пути метаболизма молекул хлорфеноксиуксусных кислот и получить количественные и качественные характеристики процессов конверсии субстрата;

3. выявить роль плазмид в генетическом контроле деградации хлорфеноксиуксусных кислот;

4. изучить структурно-функциональные особенности D-плазмид катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, а именно:

4.1. установить размер и характер полиморфизма длин рестрикционных фрагментов плазмид;

4.2. показать плазмидное детерминирование процессов деградации хлорфеноксиуксусных кислот, а также устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов;

4.3. определить возможность горизонтального переноса плазмид и их экспрессии в разных бактериальных хозяевах;

4.4. выявить уровень гомологии плазмид с модельной плазмидой pJP4 штамма Ralstonia eutropha JMP134.

Объекты исследований. Объектами исследования служили природные штаммы бактерий, выделенные из почв, подвергавшихся длительному воздействию факторов нефтехимического производства.

Научная новизна исследования. Выделены новые штаммы бактерий-деструкторов 4-хлорфеноксиуксусной (4-ХФУК), 2,4дихлорфеноксиуксусной (2,4-Д) и 2,4,5-трихлорфеноксиуксусной (2,4,5-Т) кислот. Установлено, что последовательности генов 16S рРНК штаммов идентичны и наиболее близки к последовательности типового штамма Raoultella planticola. На примере R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T впервые описаны процессы использования молекул 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т в качестве единственного источника углерода и энергии для представителей рода Raoultella. Среди метаболитов деградации были выявлены хлорфеноксиуксусная (для 2,4-Д и 2,4,5-Т), феноксиуксусная (для 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т) и 3-метил-2,6-диоксо-4-гексеновая кислоты (для 4-ХФУК, 2,4-Д, 2,4,5-Т). Эти данные свидетельствуют о наличии общего пути деградации этих хлорфеноксиуксусных кислот. Установлено, что процесс деградации хлорфеноксиуксусных кислот у штаммов R. planticola 33-4ch, R. planticola 36D и R. planticola 36T находится под контролем плазмид, которые получили следующие обозначения: pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T. Поэтому плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T были квалифицированы как новые плазмиды деградации (или D-плазмиды). Обнаружен полиморфизм вышеуказанных плазмид по ВатН I -, Hind III - и Pst I - сайтам рестрикции и определены их размеры, которые составили для pRP33-4ch и pRP36T

• 110тпн, а для pRP36D - 127 тпн. Выявлено, что на исследованных плазмидах, помимо генов катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, локализованы детерминанты резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов. Установлено, что плазмиды pRP33-4ch, pRJP36D и pRP36T являются конъюгативными и способны экспрессировать катаболические функции деградации хлорированных феноксиуксусных кислот, а также функции резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в другом бактериальном хозяине. Выявлено, что исследованные плазмиды не имеют существенной гомологии с плазмидой деградации 2,4-Д pJP4 Ralstonia eutropha JMP134.

Практическая значимость работы. Полученные данные раскрывают особенности строения мо л екулярно-генетических систем катаболизма хлорированных феноксиуксусных кислот и вносят существенный вклад в понимание процессов формирования и эволюционирования путей биодеградации ксенобиотиков. Сведения о новых D-плазмидах расширяет представления о молекулярных механизмах адаптации бактерий к утилизации синтетических субстратов, которые ранее не присутствовали в окружающей среде. Выделенные штаммы и их плазмиды могут быть применены для создания новых штаммов-деструкторов in vitro, а также в разработках технологий очистки окружающей среды нового поколения.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались в ходе работы VIII-го Экологического конгресса (Корея, 2002), Первого конгресса европейских микробиологов (Словения, 2003), конференции ELSO (Германия, 2003), 1-го Международного конгресса «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), 2-го Международного Семинара-школы «Масс-спектрометрия в химической физике, биофизике и экологии» (Москва, 2004), 7-ой и 9-ой Международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2003, 2005), международной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005).

Гранты. Работа была проведена при содействии Программы Президиума РАН «Поддержка молодых ученых», РФФИ №02-04-97911, и трех Грантов ФЦП «Интеграция науки и высшего образования России», в том числе, исследовательского гранта Э0029, гранта № 3 4312 на проведение стажировки и гранта № Д 3278/12742003 для участия в работе Первого Конгресса европейских микробиологов (Словения, Любляна 2003г).

Публикации. Результаты диссертации изложены в 10 печатных работах.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов и их обсуждения, выводов, списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 114 страницах, содержит 20 рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 171 наименование, из них 12 отечественных и 159 зарубежных.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Жарикова, Наталья Владимировна

выводы

1. Выделены новые штаммы-деструкторы, отнесенные согласно молекулярным критериям систематики к роду Raoultella виду planticola.

2. Впервые установлены этапы метаболизма 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т для штаммов R. planticola. Показано, что катаболизм 4-ХФУК, 2,4-Д и 2,4,5-Т этих штаммов происходит с образованием хлорфеноксиуксусной, феноксиуксусной и 3-метил-2,б-диоксо-4-гексеновой кислот.

3. Впервые идентифицированы и определены размеры плазмид штаммов-деструкторов Raoultella planticola 33-4ch, Raoultella planticola 36D и Raoultella planticola 36T, получивших следующие обозначения: pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T, соответственно.

4. Показано, что на плазмидах pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T расположены генетические детерминанты конверсии молекул хлорфеноксиуксусных кислот, устойчивости к антибиотикам и солям тяжелых металлов, что позволило классифицировать данные плазмиды как новые D-плазмиды бактерий.

5. Выявлено, что плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T способны к горизонтальному переносу и экспрессии функций катаболизма хлорфеноксиуксусных кислот, резистентности к антибиотикам и солям тяжелых металлов в других бактериальных хозяевах.

6. Установлено, что плазмиды pRP33-4ch, pRP36D и pRP36T имеют существенные структурно - функциональные отличия от плазмиды pJP4 Ralstonia eutropha JMP134.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Жарикова, Наталья Владимировна, Уфа

1. Albiger В., Hubert J.C., Lett М.С. Identification of the plasmid-mobilization potential of the strain Klebsiella pneumoniae ozenae KIIIA isolated from a polluted aquatic environment I I Plasmid. 1999. - V. 41. - № 1.-P. 30-39.

2. Assinder S.J., Williams P.A. The TOL plasmids: determinants of the catabolism of toluene and xylenes // Adv. Microbiol. Physiol. 1990. -V. 31.-P. 1-69.

3. Bacterial ion transport / Eds. B.P. Rosen, S. Silver. New York: Academic Press. - 1987. - 125p.

4. Bagley S., Seidler R.J., Brenner D.J. Klebsiella planticola sp. nov.: a new species of Enterobacteriaceae found primarily in nonclinical environments // Curr. Microbiol. 1981. - V. 6. - P. 105-109.

5. Balajee S., Mahadevan A. Influence of chloroaromatic substances on the biological activity of Azotobacter chroococcum II Chemosphere. -1990.-V. 21.-№ 1-2.-P. 51-56.

6. Beadle C.A., Smith A.R. The purification and properties of 2,4-dichlorphenol hydroxylase from a strain of Acinetobacter species. // Eur. J. Biochem. 1982. - V. 123. - P. 323-332.

7. Bollag J.-M., Helling C.S. and Alexander M. 2,4-D metabolism. Enzymatic hydroxylation of chlorinated phenols // J. Agr. Food Chem. 1968.-№ 16. - P. 826-828.

8. Bouanchaud D.H., Scavizzi M.R., Chabbert Y.A. Elimination by ethidium bromide of antibiotic resistance in Enterobacteria and Staphylococci II J. Gen. Microbiol. 1968. - V.54. - Pt. 3. - P. 417.

9. Brenner D.J., Falkow S. Molecular relationships among members of the Enterobacteriaceae II Adv. Genet. 1971. - V. 16. - P. 81-118.

10. Broderick J.B., O'Halloran T.V. Overprodaction, purification, and characterization of chlorocatechol dioxygenase, a none-heme iron dioxygenase with broad substrate tolerance. // Biochem. 1991. -V. 30. - P. 7349-7358.

11. Broderiick J.B. Catechol dioxygenases // Essay Biochem. 1999. -V. 34.-P. 173-89.

12. Burlage R.S., Bemis L.A., Layton A.C., Sayler G.S., Larimer F. Comparative genetic organization of incompatibility group degradative plasmids // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 6818-6825.

13. Chang H.R., Loo L.H., Jeyaseelan K., Earnest L., Stackebrandt E. Phylogenetic relationships of Salmonella typhi and Salmonella typhimurium based on 16S rRNA sequence analysis // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - № 4. . p. 1253-1254.

14. Chen Y-C. J., Peoples O.P., Walsh C.T. Acinetobacter cyclohexanone monooxygenase: gene cloning and sequence determination // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - P. 781-789.

15. Christensen H., Nordentoft S., Olsen J.E. Phylogenetic relationships of Salmonella based on rRNA sequences // Int. J. Syst. Bacteriol. 1998. -V. 48.-№2.-P. 605-610.

16. Coenye Т., Henry D., Speert D.P., Vandamme P. Burkholderia phenoliruptrix sp. nov., to accommodate the 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid and halophenol-degrading strain AC 1100 // Syst. Appl. Microbiol. 2004. - V. 27. - № 6. - P. 623-627.

17. Dagley S. Catabolism of aromatic compounds by microorganisms // Adv. Microbiol. Physiol. 1971. - V. 6. - P. 1-76.

18. Danganan C.E., Shankar S., Ye R.W., Chakrabarty A.M. Substrate diversity and expression of the 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid oxygenase from Burkholderia cepacia AC 1100 // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - № 12. - P. 4500-4504.

19. Daubaras D.L., Saido K., Chakrabarty A.M. Purification of hydroxyquinol and maleylacetate reductase: the lower pathway of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid metabolism by Burkholderia cepacia

20. АС1100 // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - № 11. -P. 4276-4279.

21. Dauga C., Grimont F., Grimont P.A. Nucleotide sequences of 16S rRNA from ten Serratia species // Res. Microbiol. 1990. - V. 141. -№9. .p. U39-1149.

22. Dawson J.H. Probing structure-function relation in hemecontaining oxygenases and peroxidases // Science. 1988. - V. 240. - P. 433-439.

23. Don R.H., Weightman A.J. Transposon mutagenesis and cloning analysis of the pathways for degradation of 2.4-dichlorophenoxyacetic acid and 3-chlorobenzoate in Alcaligenes eutrophus JMP 134 (pJP4) // J. Bacteriol. 1985. - V. 161. - P. 85-90.

24. Edwards U., Rogall Т., Bloeker H., Ende M.D., Boeettge E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes, characterization of gene coding for 16S ribosomal RNA //Nucl. Acids. Res. 1989. - V. 17. - P. 7843-7853.

25. Eichhorn E, van der Ploeg J.R., Kertesz M.A., Leisinger T. Characterization of alpha-ketoglutarate-dependent taurine dioxygenase from Escherichia coli II J. Biol. Chem. 1997. - V. 272. - №37. -P. 23031-23036.

26. Entsch В., van Berkel W.J.H. Structure and mechanism of parahydroxybenzoate hydroxylase // FASEB journal. 1995. - V. 9. -P. 476-483.

27. Ferragut С., Izard D., Gavini F., Kersters K., DeLey J., Leclerc H. Klebsiella trevisanii: a new species from water and soil // Int. J. Syst. Bacteriol. 1983. - V. 33. - P. 133-142.

28. Fetzner S., Lingens F., Bacterial degalogenases: biochemestry, genetics, and biotechnological applications // Microbiol. Rev. 1994. -V. 58.-№4. - P. 641-685.

29. Frantz В., Chakrabarty A.M. Organization and nucleotide sequence determination of a gene cluster involved in 3-chlorocatechol degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V. 84. - P. 4460-4464.

30. Friedrich В., Meyer M., Schlegel H.G. Transfer and expression of the herbicide-degrading plasmid pJP4 in aerobic autotrophic bacteria // Arch. Microbiol. 1983. - V. 134. - P. 92-97.

31. Fukuda K., Nagata S., Taniguchi H. Isolation and characterization of dibenzofuran-degrading bacteria // FEMS Microbiol. Lett. 2002. -V. 208.-№2.-P. 179-185.

32. Fukumori F., Hausinger R.P. Alcaligenes eutrophus JMP134 "2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase" is an alpha-ketoglutarate-dependent dioxygenase // J. Bacteriol. 1993a. - V. 175. - № 7. - P. 2083-2086.

33. Fukumori F., Hausinger R.P. Purification and characterization of 2,4-dichlorophenoxyacetate/alpha-ketoglutarate dioxygenase // J. Biol. Chem. 1993b. - V. 268. - № 32. - P. 24311-24317.

34. Fulthorpe R.R., McGowan C., Maltseva O.V., Holben W.E., Tiedje. 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid-degrading bacteria are mosaics of catabolic genes //Appl. Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. - P. 3274-3281.

35. Gavini F., Leclerc H., Lefebvre В., Ferragut C., Izard D. Etude taxonomique d'enterobacteries appurtenant ou apparentees au genre Klebsiella II Ann. Microbiol. (Inst Pasteur). 1977. - V. 128B. - P. 45-49.

36. Ghosal D., You I.S., Chakrabarty A.M. Microbial degradation of halogenated compounds // Science. 1985. - V. 228. - №4696. -P. 135-228.

37. Gisi M.R., Xun L. Characterization of chlorophenol 4-monooxygenase (TftD) and NADH:flavin adenine dinucleotide oxidoreductase (TftC) of Burkholderia cepacia AC 1100 // American Society for Microbiology. 2003. - V. 185. - № 9. - P. 2786-2792.

38. Haggblom M. Mechanisms of bacterial degradation and transformation of chlorinated monoaromatic compounds // J. Basic. Microbiol. 1990. -V. 30.-№2.-P. 115-141.

39. Haghes E.J., Shapiro M.K., Houghton J.E., Ornston L.N. Cloning and expression of pea genes from Pseudomonas putida in Escherichia coli //J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 2877-2887.

40. Harada H., Oyaizu H., Ishikawa H. A consideration about the origin of aphid intracellular symbiont in connection with gut bacterial flora // J. Gen. Appl. Microbiol. 1996. - V. 42. - P. 17-26.

41. Harayama S., Кок M., Neidle E.L. Functional and evolutionary relationships among diverse oxygenases // Ann. Rev. Microbiol. -1992.-V. 46.-P. 565-601.

42. Harayama S., Rekik M. Bacterial aromatic ring-cleavage enzymes are classified into two different gene families // J. Biol. Chem. 1989. -V. 264.-P. 15328-15333.

43. Harayama S., Rekik M., Bairoch A., Neidle E.L., Ornston L.N. Potential DNA slippage structures acquired during evolutionary divergence of Acinetobacter calcoaceticus chromosomal benABC and98

44. Pseudomonas putida TOL pWWO plasmid xylXYZ genes encoding benzoate dioxygenases // J. Bacteriol. 1991. - V. 173. - P. 7540-7548.

45. Harwood C.S., Parals R.E. The р-ketoadipate pathway and the biology of self-identity // Ann. Rev. Microbiol. 1996. - V. 50. - P. 553-590.

46. Hauben L., Moore E.R., Vauterin L., Steenackers M., Mergaert J., Verdonck L., Swings J. Phylogenetic position of phytopathogens within the Enterobacteriaceae II Syst. Appl. Microbiol. 1998. - V. 21. -№3.-P. 384-397.

47. Haugland R.A., Schlemm D.J., Lyons R.P., Sferra P.R., Chakrabarty A.M. Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4-D and 2,4,5-T by pure and mixed bacterial culture // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - № 5. - P. 1357-1362.

48. Heesche-Wagner K., Schwarz Т., Kaufmann M. Phenol degradation by an enterobacterium: a Klebsiella strain carries a TOL-like plasmid and a gene encoding a novel phenol hydroxylase // Can. J. Microbiol. -1999. V. 45. - № 2. - P. 162-171.

49. Hofrichter M., Gunter Т., Fritsche W. Metabolism of phenol, chloro-and nitrophenols by the Penicillium strain Bi7/2 isolated from contaminated soil // Biodegradation. 1992/1993. - V. 3. - P. 415-422.

50. Hogan D.A, Auchtung T.A, Hausinger R.P. Cloning and characterization of a sulfonate/alpha-ketoglutarate dioxygenase from Saccharomyces cerevisiae II J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - № 18. - P. 5876-5879.

51. Hogan D.A., Buckley D.H., Nakatsu C.H., Schmidt T.M., Hausinger R.P. Distribution of the tfdA gene in soil bacteria that do not degrade 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) I I Microb. Ecol. 1997. -V. 34. - № 2. - P. 90-96.

52. Horvath R.S. Microbial cometabolism of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid // Bull. Environ. Contam. and Toxicol. 1970. - V. 5. - P. 537-541.

53. Hotopp J.C.D., Hausinger R.P. Alternative substrate of 2,4-dichlorophenoxyacetate/a-ketoglutarate dioxygenase // Journal. Molecular. Catalysis. B: Enzymatic. 2001. - V. 15. - P. 155-162.

54. Hughes E.J., Shapiro M.K., Houghton J.E., Ornston L.N. Cloning and expression of pea genes from Pseudomonas putida in Escherichia coli II J. Gen. Microbiol. 1988. - V. 134. - P. 2877-2887.

55. Ibrahim A., Goebel B.M., Liesack W., Griffith M., Stackebrandt E. The phylogeny of the genus Yersinia based on 16S rDNA sequences // FEMS Microbiol. Lett. 1994. - V. 112. - P. 435-438.

56. Izard D., Ferragut C., Gavini F., Kersters K., DeLey J., Leclerc H. Klebsiella terrigena, a new species from soil and water I I Int. J. Syst. Bacteriol.- 1981.-V. 31.-P. 116-127.

57. Jain K., Radsak K., Mannheim W. Differentiation of the Oxytocum group from Klebsiella by deoxyribonucleic acid hybridization // Int. J. Syst. Bacteriol. 1974. - V. 24. - P. 402-407.

58. Kahnert A., Kertesz M.A. Characterization of a sulfur-regulated oxygenative alkylsulfatase from Pseudomonas putida S-313 // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - № 41. - P. 31661-31667.

59. Karhammer В., Kukor J.J., Olsen R.N. Regulation of tfdCDEF by tfdR of 2,4-dichlorphenoxyacetic acid degradation plasmid pJP4 // J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - P. 2280-2286.

60. Karhammer В., Olsen R.N. Cloning and characterization of tfdS, the repressor-activator gene of tfdB, from the 2,4-D catabolic plasmid pJP4 //J. Bacteriol. 1990. - V. 172. - № 10. - P. 5856-5862.

61. Kasberg Т., Daubaras D.L., Chakrabarty A.M., Kinzelt D., Reineke W. Evidence that operons tcb, tfd, and clc encode maleylacetate reductase, the fourth enzyme of the modified ortho pathway // J. Bacteriol. 1995. -V. 177.-P. 3885-3889.

62. Kaschabek S.R., Reineke W. Maleylacetate reductase of Pseudomonas sp. strain B13: specificity of substrate conversion and halide elimination // J. Bacteriol. 1995. - V. 177. - № 2. - P. 320-325.

63. Kilpi S., Backstrom V., Korhola M. Degradation of 2-methyl-4-chlorophenoxyacetic acid (MCPA), 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), benzoic acid and salicylic acid by Pseudomonas sp. HV3 // FEMS Microbiol. Lett. 1980. - V. 8. - P. 177-182.

64. Kinkle B.K., Sadowsky M.J., Schmidt E.L., Koskinen W.C. Plasmids pJP4 and pR68.45 can be transferred between populations of bradyrhizobia in nonsterile soil // Appl. Environ. Microbiol. 1993. -V. 59.-P. 1762-1766.

65. Kivisaar M., Kasak L., Nurk A. Sequence of the plasmid-encoded catechol 1,2-dioxygenase-expressing gene, pheB, of phenol-degrading Pseudomonas sp. strain EST 1001 // Gene. 1991. - V. 98. - P. 15-20.т>

66. Kuhm E.P., Townsend G.T., Suflita J.M. Effect of sulfate and organic carbon supplements on reductive dehalogenation of chloroanilines in anaerobic aquifer slurries // App. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. -P. 2630-2637.

67. Kukor J.J., Olsen R.H., Slak J.S. Recruitment of chromosomally encoded maleylacetate reductase for degradation of 2,4-D by plasmid pJP4 // J. Bacteriol. 1989. - V. 171. -№ 6. - P. 3385-3390.

68. Kwon S.W., Go S.J., Kang H.W., Ryu J.C., Jo J.K. Phylogenetic analysis of Erwinia species based on 16S rRNA gene sequence // Int. J. Syst. Bacteriol. 1997. - V. 47. - P. 1061-1067.

69. Lawrence J.C., Roth J.R., Selfish operons: horizontal transfer may drive the evolution of gene clusters // Gen. 1996. - V. 143. - P. 1843-1860.

70. Leahy J.G., Batchelor P.J., Morcomb S.M. Evolution of the soluble diiron monooxygenases // FEMS Microb. Rev. 2003. V. 27. - P 449479.

71. Leveau J.H., Konig F., Fuchslim H., Werlen C., van der Meer J.R. Dynamics of multigene expression durihg catabolic adaptation of

72. Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4) to the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate // Mol. Microbiol. 1999. - V. 33. - P. 396-406.

73. Leveau J.H., van der Meer J.R. Genetic characterization of insertion sequence ISJP4 from Ralstonia eutropha JMP134 // Gen. 1997. -V. 202.-P. 103-114.

74. Leveau J.H., Zehnder A.J.B., van der Meer J.R. The tfdK gene product facilitates uptake of 2,4-dichlorophenoxyacetate by Ralstonia eutropha JMP134 (pJP4) // J. Bacteriol. 1998. - V. 180. - P. 2237-2243.

75. Madsen Т., Licht D. Isolation and characterization of an anaerobic chlorphenol-transforming bacterium // Appl. Environ. Microbiol. -1992. V. 58. - № 9. - P. 2874-2878.

76. Markus A., Klages U., Krauss S., Lingens F. Oxidation and dehalogenation of 4-chlorophenolacetate by a two-component enzyme system from Pseudomonas sp. strain CBS3 // J. Bacteriol. 1984. -V. 160.-P. 618-621.

77. Markus A.D., Krekel A., Lingens F. Purification and some properties of component A of the 4-chlorophenylacetate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas species strain CBS3 // J. Biol. Chem. 1986. - V. 261. -P. 12883-12888.

78. Marr J., Kremer S., Sterner О., Anke H. Transformation and mineralization of halophenols by Penicillium simplicissimum SK9117 // Biodegradation. 1996. - V. 7. - № 2. - P. 165-171.

79. Martin G., Dijols S., Capeillere-Blandin C., Artaud I. Hydroxylation reaction catalyzed by the Burkholderia cepacia AC1100 bacterial strain involvement of the chlorophenol-4-monooxygenase // Eur. J. Biochem. 1999.-V. 261.-P. 533-538.

80. Mason J.R., Cammack R. The electron-transport proteins of hydroxylating bacterial dioxygenases // Annu. Rev. Microbiol. 1992. -V. 46. - P. 277-305.

81. Massey V. Activation of molecular oxygen by flavin and flavoproteins // J. Biol. Chem. 1994. - V. 269. - № 36. - P. 22459-22462.

82. Matrubutham U., Harker A.R. Analysis of duplicated gene sequences associated with tfdR and tfdS in Alcaligenes eutrophus JMP134 // J. Bacteriol. 1994. - V. 176. - P. 2348-2353.

83. Moiseeva O.V., Belova O.V., Solyanikova I.P., Schlomann M., —-^.Golovleva L.A. Enzymes of a new modified ortho-pathway utilizing 2chlorophenol in Jlhodococcus opacus 1CP' //Biochemistry. 2001. V. 66. - P. 548-555.

84. Nakatsu C.H., Wyndham R.C. Cloning and expression of the transposable chlorobensoate 3,4-dioxygenase genes of Alcaligenes sp. strain BR60 // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - V. 59. - P. 3625-3633.

85. Ngai K.L., Ornston L.N. Abundant expression of Pseudomonas genes for chlorocatechol metabolism // J. Bacteriol. 1988. - V. 170. - № 5. -P. 2412-2413.

86. Nomura Y., Nakagawa M., Ogawa N., Harashima S., Oshima Y. Genes in Pht plasmid encoding the initial degradation pathway of phthalate in Pseudomonasputida И J. Ferment. Bioeng. 1992. - V. 74. - P. 333-344.

87. Novick R.P. Extrachromosomal inheritance in bacteria // Bacteriol. Rev. 1969. - № 33. - P. 210-263.

88. Nurk A., Kasak L., Kivisaar M. Sequence of the gene (phe A) encoding phenol monooxygenase from Pseudomonas sp. EST1001: expression in Escherichia coli and Pseudomonas putida II Gene. 1991. - V. 102. -№ l.-P. 13-18.

89. Overhage J., Sielker S., Homburg S., Parschat K., FetznerS. Identification of large linear plasmids in Arthrobacter spp. encodingthe degradation of quinaldine to anthranilate // Microbiology. 2005. -V. 151. - Pt. 2. - P. 491-500.

90. Partridge S.R., Hall R.M. Complex multiple antibiotic and mercury resistance region derived from the r-det of NR1 (R100) // Antimicrob. Agents. Chemother. 2004. - V. 48. - № 11. - P. 4250-4255.

91. Perkins E.J., Gordon M.P., Caceres O., Lurquia P.F. Organization and sequence analysis of the 2,4-dichlorophenol hydroxylase and dichlorocatechol oxidative operons of plasmid pJP4 // J. Bacteriol.1990.-V. 172.-P. 2351-2359.

92. Plumeier I., Perez-Pantoja D., Heim S., Gonzalez В., Pieper D.H. Importance of different tfd genes for degradation of chloroaromatics by Ralstonia eutropha JMP134 // J. Bacteriol. 2002. - V. 184. - P. 4054-4064.

93. Powlowski J., Shingler V. Genetics and biochemistry of phenol degradation by Pseudomonas sp. CF600 // Biodegradation. 1994. V. 5.-P. 219-236.

94. Radjendirane V., Bhat M.A., Vaidyanathan C.S. Affinity purification and characterization of 2,4-dichlorophenol hydroxylase from Pseudomonas cepacia // Archives of biochemistry and biophysics.1991. V. 288. - № 1. - P. 169-176.

95. Reineke W., Knackmuss H-J. Microbial degradation of haloaromatics // Annu. Rev. Microbiol. 1988. - V. 42. - P. 263-287.

96. Reineke W., Knackmuss H-J. Microbial metabolism of haloaromatics: isolation and propertiees of a chlorobenzene-degrading bacterium // App. Environ. Microbiol. 1984. - V. 47. - P. 395-402.

97. Saari R.E., Hausinger R.P. Ascorbic acid-dependent turnover and reactivation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid/alpha-ketoglutarate dioxygenase using thiophenoxyacetic acid // Biochemistry. 1998. -V. 37. - № 9. - P. 93035-93042.

98. Santacruz G., Bandala E.R., Torres L.G. Chlorinated pesticides (2,4-D and DDT) biodegradation at high concentrations using immobilized

99. Pseudomonas fluorescens I I J. Environ. Sc. Health. B. 2005. - V. 40. -№4. P. 571-583.

100. Sayler G.S., Hooper G.S., Layton A.C., Henry King J.M. Catabolic plasmids of environmental and ecological significance // Microb. Ecol. 1990.-V. 19.-P. 1-20.

101. Schlomann M. Evolution of chlorocatechol catabolic pathways // Biodegradation. 1994. - V. 5. - P. 301-321.

102. Schlomann M., Schmidt E., Knackmuss H-J. Different types of dienlactone hydrolase in 4-fluorobenzoate-utilizing bacteria // J. Bacterial. 1990.-V. 172. - P. 5112-5118.

103. Schmidt E., Knackmuss H.J. Chemical structure and biodegradability of halogenated aromatic compounds. Conversion of chlorinated muconic acids into maleoylacetic acid // Biochem. J. 1980. - V. 192. -№ 1. - P. 339-347.

104. Schweizer D., Marcus A., Seez M., Ruf H.H., Lingens F. Purification and some properties of component В of the 4-chlorophenylacetate 3,4-dioxygenase from Pseudomonas species strain CBS3 // J. Biol. Chem. -1987. V. 262. - P. 9340-9346.

105. Seibert V., Stadler-Fritzsche K., Schlomann M. Purification and characterization of maleylacetat reductase from Alcaligenes eutroophus JMP134 (pJP4) // J. Bacteriol. 1993. - V. 175. - P. 6745-6754.

106. Short K.A., Seidler R.J., Olsen R.H. Survial and degradative capacity of Pseudomonas putida induced or constitutively expressing plasmidmediatet degradation of 2,4-dichlorophenoxyacetate (TFD) in soil // Can. J. Microbiol. 1990. - V. 36. - P. 821-829.

107. Sikka R., Sabherwal U., Arora D.R. Association of R plasmids of Klebsiella pneumoniae with resistance to heavy metals, klebocin andbeta lactamase production and lactose fermentation // Indian. J. Pathol. Microbiol. 1989b. - V. 32. - № 1. - p. 16-21.

108. Sikka R., Sabherwal U., Arora D.R. Resistotyping as a new epidemiological marker for Klebsiella pneumoniae // Indian. J. Med. Res. 1989a. - V. 89. - P. 95-99.

109. Silver S., Phung L.T. Bacterial heavy metal resistance: new surprises // Ann. Rev. Microbiol. 1996. - V. 50. - P. 753-789.

110. Singhal N., Rog D. Modeling kinetics of 2,4-D degradation by two new Pseudomonas isolates // The Chemical Engineering Journal. 1988. -V. 39. - P. 37-45.

111. Sparnins V.L., Chapman P.J., Dagley S. Bacterial degradation of 4-hydroxyphenylacetic acid and homoprotocatechuic acid // J. Bacteriol.- 1974.-V.120. P. 159-167.

112. Sproer C., Mendrock U., Swiderski J., Lang E., Stackebrandt E. The phylogenetic position of Serratia, Buttiauxella and some other genera of the family Enterobacteriaceae II Int. J. Syst. Bacteriol. 1999. -y. 49.-№4.-P. 1433-1438.

113. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. 1994. - V. 44. -P. 846-849.

114. Streber W.R., Timmis K.N., Zenk M.N. Analysis, cloning, and high-level expression of 2,4-dichlorophenoxyacetate monooxygenase gene tfdA of Alcaligenes eutrophus JMP134 // J. Bacteriol. 1987. - V. 169.- P. 2950-2955.

115. Tamura A., Ohashi N., Urakami H., Miyamura S. Classification of Rickettsia tsutsugamushi in a new genus, Orientia gen. nov., as Orientia tsutsugamushi comb. nov. // Int. J. Syst. Bacteriol. 1995. -V. 45.-№3.-P. 589-591.

116. Tonso N.L., Matheson V.G., Holben W.E. Polyphasic characterization of a suite of bacterial isolates capable of degrading 2,4-D // Microb. Ecol. 1995.-V.30.-P. 3-24.

117. Top E.M., Holben W.E., Forney L.J. Characterization of diverse 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degradative plasmid isolated from soil by complementation // Appl, Environ. Microbiol. 1995. - V. 61. -P. 1691-1698.

118. Top E.M., Maltseva O.V., Forney L.J. Capture of a catabolic plasmid that encodes only 2.4-dichIorophenoxyacetic acid: a-ketoglutaric acid dioxygenase (TfdA) by genetic complementation // Appl. Environ. Microbiol. 1996. - V. 62. - № 7. - P. 2470-2476.

119. Van Berkel W.J.H., Miiller F. Chemestry and Biochemestry of Flavoenzymes / Ed. Miiller F. Boca Raton: CRC Press. - 1991. -603p.

120. Van der Meer J.R, de Vos WM, Harayama S, Zehnder A.J.B. Molecular mechanisms of genetic adaptation to xenobiotic compounds // Microbiol. Rev. 1992. - V. 56. - P. 677-694.

121. Van der Meer J.R, Zehnder A.J.B., de Vos W.M. Identification of a novel composite transposable element, Tn5280, earring chlorobenzene dioxygenase genes of Pseudomonas sp. strain P51 // J. Bacteriol. -1991.-V. 173.-P. 7077-7083.

122. Van der Meer J.R. Evolution of novel metabolic pathways for the degradation of chloroaromatic compounds // Antonie van Leeuwenhoek. 1997. - V. 71. - № 1-2. - P. 159-178.

123. Vandamme P., Pot В., Gillis M., de Vos P., Kersters K., Swings J. Polyphasic taxonomy, a consensus approach to bacterial systematics // Microbiol. Rev. 1996. - V. 60. - № 2. - P. 407-438.

124. Vollmer M.D., Fischer P., Knackmuss H-J., Schlomann M. Inability of muconate cycloisomerases to cause dehalogenation during conversion of 2-chloro-cis,cis-muconate // J. Bacteriol. 1994. - V. 1764. -P. 4366-4375.

125. Watanabe T. Evolutionary relationships of R-factors with other episomes and plasmids // Fed. Proc. 1967. - № 26. - P. 23.

126. Wayne L.G., Brenner D.J., Colwell R.R. International Committee on Systematic Bacteriology. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics // Int. J. Syst. Bacteriol. 1987. - V. 37. - P. 463-464.

127. Weisburg W.G., Barns S.M., Pelletier D.A., Lane D.J. 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study // J. Bacteriol. 1991. -V. 173.-№2.-P. 697-703.

128. Woese C.R. Bacterial evolution // Microbiol. Rev. 1987. - V. 51. -№2.-P. 221-271.

129. Wong P.K., Yuen P.Y. Decolourization and biodegradation of N,N'-dimethyl-p-phenylenediamine by Klebsiella pneumoniae RS-13 and Acetobacter liquefaciens S-l // J. Appl. Microbiol. 1998. - V. 85. -№ l.-P. 79-87.

130. You I.S., Ghosal D., Gunsalus I.C. Nucleotide sequence analysis of the Pseudomonas putida PpG7 salicylate hydroxylase gene (nahG) and its 3'-flanking region//Biochemistry. -1991. V. 30. - № 6. - P.l 635-1641.

131. You I-S., Ghosal D. Genetic and molecular analysis of a regulatory region of the herbicide 2,4-dichlorophenoxyacetate catabolic plasmid pJP4 // Mol. Microbiol. 1995. - V. 16.-P. 321-331.

132. Zylstra G.J., Olsen R.H., Ballou D.P. Geneticn organization and sequence of the Pseudomonas cepacia genes for the alpha and beta subunits of protocatechuate 3,4-dioxygenase // J. Bacteriol. 1989. -V. 171.-P. 5915-5921.

133. Воронин A.M., Цой T.B. Генетические системы биодеградации: Организация и регуляция экспрессии // Генетика. 1989. - Т. 25 -С. 581-594.

134. Козырева А.П., Финкелыитейн З.И., Шурухин Ю.В., Баскунов Б.П., Головлева JI.A. Nocardioides simplex ЗЕ деструктор хлорфеноксиалкановых кислот // Тез. докл. V конф. РФ «Новые направления биотехнологии». - Пущино, 1992. - С. 158.

135. Кочетков В.В., Балакшина В.В., Наумов А.В., Грищенков В.Г., Воронин A.M. Выделение и характеристика бактерий-деструкторов пестицидов // Прикл. биохимия и микробиология. -1997. Т. 33.-№3.-С. 310-313.

136. Кудлай Д.Г., Чубуков В.Ф., Оганесян М.Г. Генетика лекарственной устойчивости бактерий. М.: Медицина, 1972. - 255с.

137. Лабинская А.С. Микробиология с техникой микробиологических исследований. М.: Медицина, 1978. - 394с.

138. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. / Под ред. А.А. Баева. М.: Мир, 1984. - 480с.

139. Маркушева Т.В, Журенко Е.Ю., Кусова И.В. Бактерии-деструкторы фенола и его хлорированных производных. Уфа: Гилем, 2002. -108с.

140. Мейнелл Г. Бактериальные плазмиды: Пер. с англ. / Под. ред. Ю.Н. Зографа, В.Г. Никифорова. М.: Мир, 1976. - 234с.

141. Методы общей бактериологии: в 3-х т. / Под. ред. Ф. Герхарда и др. -М.: Мир, 1990.

142. Методы определения микроколичеств пестицидов / под ред. М.А. Клисенко М.: Медицина, 1984. - 256с.

143. Определитель бактерий Берджи: в 2-х т. / Под ред. Дж. Хоулта и др. М: Мир, 1997. - 799с.

144. Прозоров А.В. Конъюгация у бацилл // Микробиология.- 2003. -Т. 72.-№5. -С. 581-593.т