Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Конструирование гибридных плазмид RP4: TOL и экспрессия XVL генов в азотфиксирующих бактериях

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Конструирование гибридных плазмид RP4: TOL и экспрессия XVL генов в азотфиксирующих бактериях"

РГВ с л

■I Л ...г, ^ АКАДЕМИЯ НАУК БЕЛАРУСИ

ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ и цитологии

йа правах рукописи

КОКШКЕВИЧ Лариса Николаевна

КОНСТРУИРОВАНИЕ ГИБРИДНЫХ ПЛАЭМВД КР4::Т01, И ЭКСПРЕССИЯ ХП ГЕНОВ В АЭОТШСИРУЕЩИХ / БАКТЕРИЯХ

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Минск - 1993

Работа выполнена в Ийстктуте генетики и цитологии Академии наук Беларуси.

Научный руководитель - кандидат биологических наук ПЕРЕБИТШ А.Н.

Официальные оппоненты; доктор биологических наук ПРОКУЛЕВИЧ В. А.,

кандидат биологических наук ВОРОНИНА E.H.

Ведущая организация: - Институт молукулярной биологии и генетики

АН Украины

Запита диссертации состоится „мая___ 1993 года в

"1Л£-Ю часов на заседании Специализированного совета К 006.02.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 "Генетика" в Институте генетики и цитология АН Беларуси по адресу: 220734 г. Минск, ул.Скорины, 27.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ик. Я. Коласа.

Автореферат разослан __апвеД8__ 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат биологических наук ^Zflja—____ E.B. ЛОБАНОК

©

Институт генетики и цитологии АН Беларуси, 19S-.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследование структурной и функциональной организации катаболических систем плазмид биодеградации бактерий рода Pseudomonas представляет несомненный интерес, как в плане изучения процессов эволюции генетических систем биодеградации, так и с точки зрения конструирования новых метаболических путей.

В последние годы все большее -подтверждение находит факт транс-позонподобной организации катаболических систем данных плазмид и их отдельных структурно-функциональных, блоков С Воронин А., Цой Т 198Э 3. Показано, что катаболические гены T0L плазмиды pWTO, контролирующей деградацию толуола и ксилолов, организованы в виде сложного комплекса транспозонных структур С Tsuda М. ,Iíno Т., 1989 ). Однако механизмы и степень специфичности транспозиции xyl генов в гетерологичньге репликоны изучены недостаточно.

Дальнейшего изучения требует также вопрос о возможности функциональной экспрессии катаболических генов плазмид биодеградации в бактериях, таксонсмически далеких от Pseudomonas. В качестве объекта в этом плане несомненный интерес представляют азотфиксиру-ющие бактерии. Бактерии рода Azotobacter, как свободноживущие азотфиксаторы, могут служить модельной системой для изучения возможностей совмещения в клетке энергоемкого процесса азотфиксации и катаболизма ароматических соединений. Представители этой таксономической группы обладают отдельными сходными с Pseudomonas путями катаболизма простых ароматических соединений.

Поскольку, для T0L плазмиды pWWO, избранной в качестве модельной в данной работе, существует различие между репликативным и функциональным кругом хозяев, для введения xyl генов в клетки азотобактера необходимо использование векторной плазмиды, содержащей катаболические гены в составе репликона плазмиды с широким кругом бактериальных хозяев.

Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы явилось конструирование гибридных плазмид РР4:: T0L и изучение экспрессии xyl генов в бактериях ^ода Azotobacter.

В соответствии с основной целью были поставлены следующие конкретные задачи-

1. Методом рекомбинации in vivo получить коллекцию гибридных плазмид RP4:: T0L.

2, Физически и генетически охарактеризовать полученные плазмиды, изучить характер наследования и стабильность в новом генетическом окружении.

3. Изучить механизмы экспрессии xyl генов плазмиды pWWO в составе гибридных репликонов в Azotobacter chroococcum.

Научная новизна и практическая ценность результатов. В ходе выполнения исследований получена уникальная коллекция гибридных плазмид RP4: : T0L С pANP ). образованных в результате транспозиции Тп4651, несущего катаболические гены pV/WO, на репликон RP4. Наличие 17 сайтов интеграции Тп4651 и равномерное их распределение m репликоне RP4 свидетельствуют о низкой специфичности данного китаболического транспозона. Ряд плазмид с нарушенной в результате инсерции Тп4651 стабильностью наследования представляют интерес в качестве исходного материала при создании векторных систем для транспозиции катаболических генов.

При изучении стабильности гибридных плазмид наряду с плазки-дами Р.Р4: : Тп4652, образованными в результате вьпцепления фрагмента T0L ДНК, содержащего оба xyl оперона, обнаружена гибридная плазмлда, содержащая указанный фрагмент, тандемйо дуплицирован-ный в составе Тп4651.

С использованием плазмид pANP показана принципиальная возможность экспрессии катаболических генов T0L плазмиды в клетках азогфиксирующих бактерий A. chroococcum. Установлено, что уровень экспрессии xyl генов, достаточный для энергообеспечения функционирования нитрогеназного комплекса, достигается в штаммах A.chroococcum, обладающих собственной системой катаболизма катехола.

Показана также широкая субстратная специфичность фермента первичной атаки пути деградации бензоата у A. chroococcum.

Результаты проведенных исследований могут быть использованы для конструирования штаммов азотфиксирующих бактерий, способных к деградации и трансформации неприродных ароматических субстратов.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на X, XI рабочих совещаниях по программе "Плаз-мида" С Пущино, 1983, 1986 ); У1 Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" С Москва, 1987 ); У съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров С Москва, 1987); I Республиканском рабочем совещании по генетической «i клеточной инженерии и биотехнологии растений С Минск, 1990 ); У1 съезде Белорусского общества генетиков и селекционеров С Горки, 1992 ).

Публикации, Основное содержание диссертации отражено в 8 пе чатных работах, список которых приводится в конце автореферата.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех глав - "Обзор литературы", "Материалы и методы", "Результаты исследований и из: обсуждение" - заключения, выводов и списка литературы, вкяючаюаего 154 библиографических названия. Работа изложена на ICS страницах машинописного текста, включает 12 таблиц, иллюстрирована 23 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактерии. В работе использовали штаммы бактерий P.putida, Е.coli, A. chroococcum, полученные из коллекций различных лабораторий, а такке серко гибридных плазуид pANP, полученных нами.

Среды. Бактерии E.coli и Р.putida выращивали в бульоне LB и минимальной среде М9 С Миллер Дж., 1976 ). Для культивирования А.chroococcum использовали среду Барка С Hadrisson С., Sala-Tre-pat J., 19S9 ).

Скрещивание бактерий в зависимости от конкретной задачи осуществляли в жидкой питательной среде, на мембранных фильтрах, на плотной питательной среде.

Анализ способности бактериальных культур к росту на ароматических субстратах проводили ауксанографически.

Идентификации клонов E.coli, содержащих в составе плазмид pANP xyl гены T0L плазмиды, проводили согласно Chakrabarty А. с соавт. С 1978 ) по окрашивании в желтый цвет колоний, отрепли-цированных на полноценную среду с бензоатом Na С 5 мМ ).

Стабильность наследования плазмид определяли путем высева клеток после трехкратного пассирования на полноценную агаризован-ную среду с последующим реплицированием не менее 100 клонов на селективные среды.

Активность толуат-1,2-диоксигенази, катехол-2.3-оксигеназы. бензоатоксидазы определяли полярографически по изменению поглощения Og интактными клетками.

Удельную активность катехол-2,3-оксигеназы штаммов A. chrococ-cum определяли спектрофотометрически согласно Schmidt Е.( 1987 ).

Нитрогеназную активность штаммов . А. chroococcum определяли методом ацетиленредукции.

Изолирование плазмидной ДНК проводили по методу Kieser Т.

С 1984

Гидролиз плазмидной ДНК рестриктазами, электрофорез в агароэ-ном геле проводили стандартным методом С Маниатис Т. с соавт. , 1984 ). Использованные в работе эндонуклеазы рестрикции EcoRI, Sali, Pstl, Bgll, Kpnl изолировали по известной методике С Green Р. et al., 1978 ). Рестриктазы Xhol, Smal, HindIII получены от НПО "Фермент" С г. Вильнюс ).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Конструирование и физический анализ плазмид RP4::T0L. Ко-интегративные плазмиды RP4::T0L С pANP ) были получены методом рекомбинации in vivo. В качестве доноров в скрещиваниях использовали штамм Р. putida PAW340CRP4), содержаний xyl гены в составе хромосомы, и PpGlCT0L,RP4). Реципиентами служили штаммы Р. putida BS394 и АС13.

При селекции на м-толуате образовывались трансконъюганты, наследовавшие и маркеры RP4 С Табл. 1 ).

Таблица 1.

Получение гибридных плазмид RP4::T0L

Скрещивание бактерий Р.putida . Селектируемый маркер Частота образования трансконъюгантов Частота наследования неселектируемых маркеров, У.

АРГ ! Кшг ! Тсг

Р. putida PAW340CRP4) u-Tol+ 5,lxl0~ö 100 100 70

х BS394 1,2х10-4

PpGlCTOL, RP4) м-То1+ 100 100 100

х АС13

Анализ наследования неселективных маркеров позволил выделить 2 фенотипических класса трансконъюгантов: наряду с клонами, несущими все маркеры плазмид ИР4 и 701 С 70'/. ), присутствовали также клоны с нарушением устойчивости к тетрациклину С 30% ). При использовании клонов трансконъюгантов в качестве донорных в изо-генных скрещиваниях с Р. рииба ВБ409 наблюдался ЮОК-ныЯ копере-нос признака м-То1+ и маркеров антибиотикорезистен.ности, что свидетельствует о существовании плазмид Т01, и БР4 в данных клонах в качестве единого гибридного репликона. При этом были обна-

ружены клоны траноконьюгантов третьего фенотипического класса с нарушением функция трансмиссибелькости С 35% ).

С цель» изучения структуры образовавшихся гибридных плазкиц плазмидная ДНК из 40 отдельных клонов трансконъюгантов была проанализирована с использованием ряда рестриктаэ. Идентифицировано 17 плазмид, содержащих ¡гасерции ДНК T0L плазмиды в различных областях генома RP4 С Рис. 1 ).

На следующей стадии картирования рекомбинантных плазмии бил проведен их анализ с использованием EcoPJ, HindIII и Xhol ферментов с известккмя сайтами рестрикции на физической карте плаз-миди pWWO С Рис. 2 ). В результате установлено, что все реком-бинантные плазмиды содержат фрагмент ДНК pWWO в 56 т. п.н. С32 — 88 т.п.н. на физической карте, рис. 2 На основании этих данных можно сделать заключение о том, что полученные рекомбинантные плазмиды содержат участок ДНК T0L плазмиды pWWO, несущий гены катаболизма толуола и обозначенный в настоящее время как транспо-зон Тп4651 С Tsuda М., lino Т. „ 1989 3.

Наличие 17 сайтов инсерции Тп4651, разномерное их распределение по репликону RP4, а также относительно высокая частота получения трансконъюгантов С Табл. 1 ) позволяет сделать вьгвод о низкой, по крайней мере в случае RP4, специфичности катаболичес-кого транспозона Тп4651.

2. Генетический анализ серии гибридных плазмид pANP. Семнадцать плазмид pANP, различающихся по сайтам инсерции Тп4651 на репликоне RP4, были подвергнуты детальному генетическому анализу: изучена их способность передаваться в штаммы P.putida, Е. coli, A. chroococcum, а также стабильность в новом генетическом окружении. В результате конъюгационных скрещиваний обнаружено, что плазмиды pANP2, pANPS, pANPIO и pANP12 отличаются существенными нарушениями трансмиссибельности при передаче в указанные штаммы С Табл. 2 ), что в случае плазмид pANP9 и pANPIO является, очевидно, результатом встраивания транспозона Тп4651, соответственно, в ТгаЗ и Тга2 области РР4.

Плазмиды pANP наиболее эффективно воспринимаются клетками P.putida 3S394 и Е. coli НВ101, CS00. Частоты конъогационной передачи данных плазмид в А. chroococcum 7/831 несколько снижены, однако остаются достаточно высокими, что позволяет использовать их для передачи и изучения экспрессии xyl генов в данных бактериях.

"ж

О о

С* С а о. а.

х

ф. го ^

и> < Е — Е'

I

2

а а.

ХЬо! БошН! Вд10Ш —.-■ Л_> Н ,1, I „I

ХЬо! 5о11 ЖпсЩ ■ ■ » ■ *' ■

ЕсоИ

Л_I_I_I_I_I

ТЛ.Н.0

10

28,0(1)

5таГТ~ 115(5) Т" КрпГ 3°г5(,) ♦ . 'Ч-5

30

* 60(5) *,

АО

50 28,0(1)

60

16.0(2) _¿_

♦ адй)

13.0 (2)

1,5«)

ЛЛ-

25,0(1) 30,5(1)

Т

16

1

25 7

34

8 10 13 12 17

1 I, ,|П -| ♦ I I II

Л—I-1—¿1—^—I

11

15

Рис.. 1. Физическая и генетическая карта плазмиды ИМ.

Стрелками указаны сайты рестрикции, цифрами - молекулярная масса фрагментов в т.п.н., в скобках - номера фрагментов в порядке убывания молекулярной массы.

сайты инсерции Тп4651 и номер плазмиды рАЯР; ^ - ориентация Тп4К1: 32 т.п.н. -- 88 т.п.н. и 4 : 88 т.п.н. — 32 т.п.н.

opi ïv/ic a a

□ mr

30 7 т.пн. l_i_i

4-

50

_i_i_

-1_L.

0P2 D Ь E Gfj HSR

Il 1 i \ \f-m—m a a

6Û 70 * 80 ' ' '_i_I_i_i_i_i_1_i_i_i—i—1—

7 9Û

_i_' ■ »

EcoRI

5,5 , 5,1 .1.6, 2,5 ,V<

#

15,6

6,8

,15,

10,1

J 35 3,2

Xhûi

7 1 S T 51,0 , 2,7

'21 47

42

16.0

16 * 5 1

6,5

23

W M

1

â

Hindi—ТГ-

6 ' 7

9.8

Ю 9 23,5

6.9

2

5.1

,2,1 .

H

12-15/7

1

11

Рис. 2. Физическая и генетическая карта плазмиды pWWO.

Указаны сайты рестрикции, цифрами - молекулярная масса фрагментов в т.п.н., нихние цифры - номера фрагментов в порядке убывания молекулярной массы. 7 ~ области, фланкирующие транспозируияийся фрагмент ДНК pWWO С Тп4651 3, А - области, фланкирующие фрагмент pWWO, делецирующийся С вылеплявшийся 3 в Toi" производных.

Таблица 2.

Частоты конъагационной передачи плазмид pANP из P.puLida BS394 штаммам E.coli, P. put ida и A. chroococcum *

Плаз- : миды ! Частота передачи в E. coli НВ101 ¡Частота передачи ! в Р. pulida АС749 ¡Частота передачи в ¡A.chroococcum 7/831

pANPl 7,3 x 10"3 9,0 x 10"á 5.2 x 10"4

pA!íP2 2,5 x 10"6 . 1,2 x 10"6 2.0 x iO"7

pAÍIP4 2,9 x 10"3 1.5 x 10"3 4,1 x 10~4

pANPS 7,3 x 10"3 8,2 x 10"3 6,2 x 10~S

pAffP6 9,8 x 10"3 1,3 x 10~2 8,6 x IO""4

pAHP7 7,2 x 10"3 1.2 x 10"2 8.2 x IO"4

pAIIPS 9,0 x 10"3 1,2 x 10"2 6,1 x 10~4

pAfjpg < 10~8 < 10"8 < 10"8

pAMPIO < 10~8 1.0 x 10"7 < 10"8

pAÍÍPll 5,3 x 10"3 6.8 x 10~3 1,2 x 10"4

PANP12 1,2 x 10"8 2.0 x 10"7 < 10"8

Р.АНР13 6,2 x 10"3 5,8 x 10"3 3,5 x IO-4

pAUPl4 2,8 x 10~3 1,5 x 10"3 1,4 x 10"5

pANPÍS 8.7 x 10"3 1.1 x 10~2 9.1 x 10"4

pAfJP16 4,9 x 10"3 6.5 x 10"3 9,8 x 10"5

pANP17 4,0 x 10"3 6.2 x 10~3 4.5 x 10"4

* селектируемый маркер - Ктг.

Исследование стабильности наследования плазмид pANP в клетках P.putída, E.coli, A.chroococcum показало, что большинство из них не способны стабильно поддерживаться в штамме P. putIda BS394 I Табл. 3 ). Вместе с тем, в штаммах E.coli С600, НВ101 С Табл. 4) и A.chroococcum 7/831 все изученные плазмиды наследовались с высокой эффективностью.

Высокий процент утраты репликонов pANPll, pANPIS, pANP13 в P.putída BS394, коррелирующий с некоторым нарушением их стабильности в E.coli С600, по-видимому, определяется инсерцией Тп4651 в области . par RP4 С Рис. 1 ). Как результат ограничения круга хозяев RP4 вседствие нарушений в kil/kor системе данной плазмиды, вызванных инсерцией Тп4651, можно рассматривать низкую стабильность наследования плазмид pANP3, рАНР5, pANP15 С Рис. 1 ). Трудно объяснимой по имеющимся данным генетической организации RP4 является низкая стабильность наследования pANP17, pANPl4, содержащих иксерцию Тп4651 в областях, не контролирующих рассматривае-

Стабильность наследования ллазмид

Плазтлды

частота утраты реп-л'/кона рА!<? (У. }

Таблица 3.

pANP клеткаш: Р. putid,i HG

rgfä *о~5рапЗган;Тл . ç£-aûT;moB С îi )

594

"1—ср.7

pAÎIPl рА,\'Р2 оа:;?з banp4

рА|..-3

pÄKP7 pANP8

nA;jpQ

рА"?10 pAiiPii pANP12 pANP13 pАКР14 pANP15 pAKP16 pANP17

7 4

ZG г

70 à 2ö

о 45 IT

?

10 3

2 1

О о

23

82 18

32 7

21 8

70 20

30 9

2 2

78 11

* R+ - наличке маркеров плазмиды R?4; Toi" - неспособность к катаболизму м-толуата.

мкй функции С л il ci h. о это mosho объяснить дистальным эффектом ïn46Sl на экспресс«!! г&поз, отвечасздх за стабильности решшкона RP4.

Таблица 4.

:ледования плаз),ад pANP клетками Е. coli, т

Стабильность нас

Бактерии- ; Плаз- ; Частота утоаты реп- ; Частота образования хозяева мили ' ликона pXNP С % ) ' R Toi фенотипов ( У. )

Е. coli С300

Е.coli НВ101

pAÎ<?3 0 16

рА;;?4 1 14

рА!\РЗ 0 10

pANPS 0 1

pANP7 0 0

pANTS 0 2

DAiiPll 1 2

ЬА:.?12 2 3

PANP13 2 8

PANP14 0 1

PANP17 1 2

pAf!P3 0 0

r-, Л ^p^ 0 0

0 0

pAN?8 0 0

uANPll 0 0

pAN'Pj 3 1 0

p AiNPl 4 0 0

pAi\?17 0 0

* R* - наличие маркеров плазмиды RP4; Toi - неспособность к катаболизму м-толуата.

Установлено, что наряду с элиминацией всего репликона pANP при выращивании клеток в неселективных условиях происходит образование клонов, содержащих генетические маркер?! RP4, но утративших То1+ фенотип С Табл. 3, 4 что, по-видимому, связано с делецией кластера катаболических генов из состава гибридных плазмид.

На осногании анализа частот образования Toi" фенотипов в штаммах Е.coll С600 и НВ101 можно предположить, что делеция xyl генов является гесА зависимой С Табл. 4 3. Разница между отдельными плазмидами в частотах утраты xyl генов объясняется, по-видимому, только различиями в локализации . Тп4651 на репликоне RP4.

Таким образом, генетический анализ показал существенное различие рекомбинантных плазмид pANP по функциям трансмиссибельности, стабильности наследования в представителях различных таксономических групп бактерий и по характеру наследования кластера xyl генов в зависимости от сайта интеграции Тп4651. Полученные результаты позволили отобрать плапмиду рАЯРб для изучения экспрессии xyl генов в клетках A.chroococcum.

3. Физическое картирование плазмид pANP с То1~ фенотипом. Анализ фрагментов ДНК гибридных плазмид, утративших xyl гены pWWO, полученных после обработки EcoRI, показал, что произошла делеция участка плазмидной ДНК размером 37 + 0,6 т.п.н. в границах 40+1 т.п.н. — 77 + 0,6 т.п.н. по физической карте pWWO, содержащего все катаболические гены данной плазмиды С Рис. 2 ). В результате сравнительного анализа продуктов гидролиза ДНК делеционных производных pANP установлено, что делеция происходит в результате ре-ципрокнсй рекомбинации между прямыми повторяющимися последовательностями, расположенными на левом фланге фрагмента EcoRI-17 и в районе 77 т.п.н. ( Рис. 2 ). Таким образом, все полученные делеци-онные производные представляют собой полный решшкон Р.Р4 с инсер-цией в различные районы транспозона Тп4652.

Далее был проведен физический анализ плазмиды pANP18, выявленной в клоне штамма P.putlda BS394, обладающем u-Xyl7 м-Toi4" фенотипом. В результате инсерция Тп4651 была локализована в точке 13,5 т.п.н. на физической карте RP4 С Рис. 1 ). Вместе с тем, в составе Тп4651 в районе 42,2 - 45,2 т.п.н. на физической карте pWWO, что соответствует области xylA гена, обнаружена инсерция криптического фрагмента в 1,1 т.п.н.

Определенный интерес представляет плазмида pANP18-2. Сравни-

тельный рестрикционннй анализ ее ДНК с рАЫР18 позволил установить, что в данном случае произошла тандемная дупликация фрагмента Тп4651, выцеплявщегося при образовании делециснных производных рекомбинантных плазмид рА№. Таким образом, впервые показано, что наличие пря!лтх повторяющихся последовательностей обеспечивает и амплификацию кластера ху1 генов рШ) в составе Тп4651.

4. Характеристика катаболизма ароматических соединения коллекционными штаммами А.сЬгоососсит. С целью последующего отбора реципиентных штаммов для изучения экспрессии ху1 генов р'ЛО в составе плазмиды рАМРЗ был проведен анализ способности коллекционных штаммов А. сЬгоососсит к катаболизму ряда ароматических соединений. Оказалось, что почти все изученные штаммы разлагают п-гидрок-сибензоат через протокатехатную ветвь /3-кетоадипатного пути, половина из них метаболизирует бензоат, и ни один из изученных штаммов не способен расти на ы-толуате.

В результате в качестве реципиентных были отобраны штаммы А. сЬгоососсит 7/831, 17/35, 90/М-1 и К/3, различающиеся по способности использовать бензоат в качестве единственного источника углерода и энергии. Так штаммы А. сЬгоососсит 17.'35 и 90/М-1 не способны катаболизировать бензоат вследствие отсутствия бензоатокси-дазной и катехол-2,3-диоксигеназной активностей С Табл. 5 3.

Таблица 5.

Оксидазные активности реципиентных штаммов А. сЬгоососсит С по поглощению Од интактными клетками )

Штаммы А. сЬгоососсит

Индуктор

С

Скорость поглощения 0? кмоль 02/мин/мг белка)

мкмоль

субстраты

м-толуат

бензоат

катехол

7/831

17/35 й/З 90/М-1

сукцинат 0 2 6

бензоат 126 . 651 792

м-толуат 6 40 64

сукцинат 2 4 12

бензоат 0 0 0

м-толуат ингибир. 0,9 0,7

сукцинат 0 102 0

бензоат 70 165 21

м-толуат 58 66 20

бензоат 0 2 9

м-толуат 0 0 4

В клетках штамма R/3 происходит лишь трансформация бензоата до катехола, который накапливается в культуральной среде в результате низкой активности катехол-2,З-диоксигеьазы. Штамм A.chroococcum 7/831 использует бензоат в качестве единственного источника углерода, разлагая данное соединение через оксалокротонатную ветвь "мета"-пути расщепления катехола.

В экспериментах по изучению оксидазных активностей катаболичес-кой системы A. chroococcum было установлено также, что бензоаток-сидаза штаммов A,chroococcum 7/831 и 11/23 при использовании в качестве индуктора бензоата способна окислять кроме бензоата и м-толуата такие соединения, как 3-хлорбензоат и 2,4-дихлорфеноксиук-сусную кислоту, что свидетельствует о широкой субстратной специфичности данного фермента.

5. Изучение экспрессии ху! генов T0L плазмиды в штаммах A- chroococcum. Xyl гены pWV.'O были перенесены в клетки реципиент-ных штаммов A. chroococcum 7/831, 9/М-1, 17/33 и R/3 путем конъюгации в составе гибридной плазмиды pANP6. В скрещиваниях Р.ри-tida BS394 С pANPB ) с указанными реципиентами при селекции по ка-намицину были получены трансконъюганты, значительно различающиеся по способности метаболизировать м-толуат и бензоат. Клоны A. chro-coccum 7/831, содержащие плазмиду pANP6, росли на безазотистой среде Барка с такими T0L-специфическими субстратами, как м-толуат, м- и п-ксилолы, что позволяет говорить о функциональной экспрессии обоих катаболических оперонов TOL плазмиды pWWO в данном штамме A.chroococcum. Штаммы A. chroococcum 90/М-1 и 17/33 не образовывали на безаэотистых средах с м-Толуатом и ксилолами изолированных колоний, а при выращивании в жидкой среде с м-толуатом в качестве источника углерода давали лишь незначительное увеличение титра клеток. Однако, при наличии в среде минерального азота данные штаммы также приобретают способность использовать м-толуат в качестве единственного источника углерода и энергии. Наблюдаемое различие, вероятно, объясняется тем, что в случае роста A.chroococcum в отсутствие связанных форм азота основным лимитирующим фактором является энергообеспечение функционирования нитрогеназно-го комплекса, и большое значение приобретают уровни синтезируемых катаболических ферментов.

Данное предположение подтверждается в опытах по изучению окси-

дазных активностей реципиентннх штаммов A.chroococcum и штаммов, несущих xyl гены в составе плазмиды рАНРб С Tadл. 5, 6 ).

Таблица 6.

Оксидазные активности штаммов A. chroococcum ( pANP6 )

С по поглощению 0-, интактными клетками )

Штаммы ; i Индуктор ; Скорость поглощения 0 С мкмоль Og/мин/мг белка

i с убстраты

; м-толуат ! бензоат ! катехол

7/851 СрАКРб) сукцинат м-толуат бензоат 6 750 654 3 680 600 332 970 - X

17/35 CpANPB) сукцинат м-толуат бензоат 10 273 144 6 260 340 52 760

90/M-l CpANP6) сукцинат м-толуат 12 400 10 380 27

R/3 CpANPB) сукцинат м-толуат бензоат 26 483 750 40 490 480 100 1112 940

* - измерение не производили

В случае штаммов, не обладающих собственными бензоатоксигеназой и катехол-2,3-оксигеназой, индуцированные уровни ферментов, обеспечиваемые ху! генами рЩ), оказываются недостаточными для обеспечения роста бактериальных клеток в условиях наличия энергоемкого процесса азотфиксации. Следует отметить, что в клетках Р. риИба сравнимые уровни активности изофункциональных ферментов обеспечивают использование м-толуата и ксилолов в качестве единственных источников углерода и энергии.

При определении нитрогеназной активности клеток А. сЫ-оососсит 7/831 С рАИРб ) в условиях использования ароматических источников углерода в концентрации 5 мМ С 2 г/л ) и сахарозы С 20 г/л ) было установлено, что клетки азотобактера сполсобны фиксировать молекулярный азот, используя в качестве углеводородных субстратов и-то-луат и бензоат. Однако уровни ацетиленредуктазной активности А. сЬгоососсит 7/331 С рАШЗ 3 при росте на ароматических субстратах были в полтора раза ниже, чем на сахарозе. Очевидно, в данном случае необходимо учитывать разницу в концентрациях углеводородных субстратов, поддерживающих рост бактериальной клетки.

Таким образом, в клетках А. сЫ-оосоесит 7/831 происходит полно-

пенная экспрессия катаболической системы TOL плазмиды, обеспечивающая использование м-толуата в качестве единственного источника углерода и энергии и поддерживающая эффективную работу нитрогеназ-ного комплекса.

ВЫВОДЫ

1. Методом рекомбинации in vivo получена серия гибридных пггазмид РР4:: T0L С рА!,'Р ). Проведенное картирование показало, что гибридные плазмиды содержат фрагмент ДНК T0L плазмиди в 56 т. п. н., представляющий собой катаболический транспоэон Тп4651.

2. В результате физического анализа плазмидной ДНК из 40 отдельных клонов трансконъюгантов идентифицировано 17 плазмид pANP, отличаюаихся по месту встройки Тп4651 в репликон RP4. Относительно высокая частота получения трансконъюгантов, равномерное распределение сайтов транспозиции свидетельствуют о низкой, по крайней мере в случае RP4, специфичности Тп4651.

3. Генетический анализ серии плазмид pANP позволил выявить существенные различия изученных рекомбинантных плазмид по функциям трансмиссибельности, стабильности наследования в штаммах Р. put i -da, Е.coli, A.chroococcum и по характеру наследования кластера xyl генов в составе Тг\4651 в зависимости от сайта интеграции данного транспоэона.

4. Установлено, что делеционные производные плазмид pANP образуются в результате выщепления из Тп4651 фрагмента T0L ДНК в 37 + 0,6 т.п.н.. ограниченного прямыми повторяющимися последовательностями, и содержащего оба катаболических оперона pWWO. Наряду с этим, при анализе плазмиды pANP18-2 впервые обнаружена тан-демная амплификация указанного фрагмента в составе Тп4651.

5. При исследовании активностей ферментов пути катаболизма бензоата у коллекционных штаммов А. chroococcum обнаружено, что фермент первичной атаки данного пути — бензоатоксидаза способна окислять бензоат, м-толуат, 3-хлорбензоат и 2,4-дихлорфеноксиук-сусную кислоту, что свидетельствует о ее широкой субстратной специфичности.

6. С использованием гибридной плазмиды pANP6 впервые показана принципиальная возможность экспрессии xyl генов T0L плазмиды pWWO в клетках А. chroococcum. В результате изучения ацетиленре-дуктазной и оксидазных активностей установлено, что уровень синтеза катаболических ферментов, контролируемых xyl генами, достаточ-

Hirt для энергообеспечения функционирования нитрогеназноги номплрч са, достигается в штаммах A.chroococcura, обладающих собственной системой катаболизма катехола.

1. Перебитюк А. Н. , Епифанова А. Л. , Конюшкевич Л, Н. Метаболизм ароматических соединений ь культурах различных штаммов AzoUbao-ter chroococcura // Бал. ВНИИ с. -х. микробиологии. - 1383. - î< 39, С. 26-29.

2. Конюшкевич Л. Н., Перебитюк А. Н. Получение и характеристика гибридных плазмид RP4:;T0L // Материалы X рабочего совет, по прог рамме "Плазмида". - Пущино, 1985. - С.84.

3. Перебитюк А. Н., Конюшкевич Л. Н. Делеция и амплификация ху] генов в составе гибридной плазмиды RP4: :T0L // Материалы XI рабочего совещ. по программе "Плазмида". - Пущино, 1985. - С. 92.

4. Конюшкевич Л. Н. Транспозиция xyl генов в плазмиду RP4 // V съезд БелОГиС: Тез. докл. - Горки, 1986. - С.49-50.

5. Перебитюк А. Н., Конюшкевич Л. Н. Изучение уровня специфичности интеграции T0L транспозонл в геном RP4 // Молекулярные механизмы генетических процессов: Материалы VI Воесоюз. симп. - М. , 1987. - С. 185.

6. Перебитюк А. Н. , Конюшкевич Л. Н. Экспрессия xyl генов плазмиды T0L в Azotobacter chroococcum // Бюл. ВНИИ с. -х. микробиологии. - 1987. - N 47. - С. 51-55.

7. Конюшкевич Л.Н. Механизмы образования гибридных плазмид RP4: : T0L // V съезд ВОГиС: Тез. докл. - М. , 1987. - Т. 5. -

С. 44-45.

8. Конюшкевич Л. Н. Экспрессия генов биодеградации в азотфикси-

рухдах бактериях // VÏ съезд БелОГиС: Тез. докл. - Горки, 1992. -С. 101.

список работ. опубликованных по теме диссертации