Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Мини-производные бактериофага-транспозона D3112 Pseudomonas Aeruginosa: использование в качестве интегративных векторов и для генетического анализа псевдомонад

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Мини-производные бактериофага-транспозона D3112 Pseudomonas Aeruginosa: использование в качестве интегративных векторов и для генетического анализа псевдомонад"

Р Г 5 ОД - 8 МАЙ' 1995

На правах рукописи

МАРЬИНА

Ольга Владимировна

МИНИ-ПРОИЗВОДНЫЕ БАКТЕРИОФАГА-ТРАНСПОЗОНА D3112 PSEUDOMONAS AERUGINOSA: ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ ИНТЕГРАТИВНЫХ ВЕКТОРОВ И ДЛЯ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ПСЕВДОМОНАД

03.00.15 — Генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

■Москва — 1995

Работа выполнена в лаборатории генетических систем био-деградацни Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов

Научный руководитель - кандидат биологических наук 4 . A.C. Яненко

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук Т.А. Воейкова доктор медицинских наук, профессор Б.Н. Ильяшекко

Ведущая ррганивация - Московский государственный университет км. М.В.. Ломоносова, кафедра генетики

Зааита состоится 1095г. в ^^чзс. на заседании

Диссертационного совета Д 098.12.01 в Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промыаленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москва, 1-й Дорошзый проевд, д.1

С диссертацией мошю овнакомиться в библиотеке • ПШИгенетика

Автореферат раеосаан " ft^rf^/th 995г.

Ученый сегфетарь Двссартгадспного Оозета кандидат Окагогтескик Eaytt

B.K. Щербакова'

ОБОДЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность тэыи.

Умеренные фаги занимают важное место среди факторов, вызывающих изменчивость бактерий, благодаря двум процессам: интеграции своего генома в хромосому бактерий и трансдукции. Представляя собой своеобразный способ генетического обмена, трансдукция'эффективно используется для переноса хромосомных и плазмидных маркеров из одних штаммов бактерий в другие, для генетического картирования и клонировался генов. Бактериофаги, способные к транспозиции, а особенно их мини-производные, обладают некоторыми преимуществами перед другими умеренными фагами при использования в качестве инструментов для генетического анализа и молекулярного клонирования, Это обусловлено в первую очередь высокой частотой транспозиции геномов фагов-транспозонов в процессе литического развития, а также тем, что перед упаковкой в калсид их ДНК не вырезается из хромосомы клетки-хозяина. Кроме того, литическое развитие транд-позирующихся бактериофагов легко индуцируется в определенных условиях. Фаг-траиспозон Ми успешно применяется для генетического анализа знтеробактерий и генноинжёнерных манипуляций с последними. Однако, во многих видах псевдомонад, в том числе Pseudomonas aeruginosa фаг Mu экспрессируется неэффективно. В связи с этим представляется важным исследование фагов-транспозонов, для которых бактерии рода Pseudomonas являются естественными хозяевами. Такие исследования тем более актуальны, что некоторые методы генной инженерии in vitro для псевдомонад не отличаются высокой эффективностью. Кроме того; большинство методик манипулирования с генами in vitro достаточно материале- и трудоемки и не всегда могут обеспечить весь необходимый сЯектр операций (например, интеграцию чужеродных генов в хромосому бактерий).

К настоящему времени выделена и описана группа родственных бактериофагов-транспозонов Pseudomonas aeruginosa (Крылов В.Н. и др. 1980). Показано, что структура геномов и цикл развития этих фагов во многом сходны с таковыми у фага Ми.- Получена серия ми-нипроизводгаас одного из фагов-транспозонов Pseudomonas aeruginosa, обозначенного D3112 (Яненко A.C. и дрг; 1088), и изучены их свойства. Это открывает вовне перспективы в'использовании минифа-гов-транспозонгч для генетического анализа и клонирования генов в клетках псевдсмонад. ' •

Цель п задачи исследования.

Целью настоящей работы является изучение возможностей использования мини-производных фага-трансповона D3112 P. aeruginosa для генетического анализа псевдомонад и создание на основе мини-фага интегративного вектора. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

- исследовать способность минифага D3112ÄHcts (ДН) обеспечивать трансдукцию плазмид и плазмидных'маркеров в штаммах P. aeruginosa, проанализировав при этом зависимость эффективности и характера трансдукции от размеров трансдуцируеши плазмид;

- показать возможность делеционного укорочения плазмид, размер которых превосходит емкость капсида фага D3112, в процессе их трансдукции минифагом ДН;

- изучить способность минифага ДН обеспечивать транспозицию в другие репликоны и трансдукцию клонированных в нем генов;

- создать основанную на использовании ыинифага ДН систему для интеграции клонированных генов в хромосому Р. aeruginosa;

- проанализировать стабильность наследования в неселективных условиях и характер экспрессии генов, интегрированных в хромосому P.aeruginosa с помощью минифага.

Научная новизна и практическая зкачтосп работы.

Показана возможность и перспективы использования мини-производных бактериофага-транспозона D3112 Р.aeruginosa в качестве инструмента для генной инженерш in vivo. При комплементации функций, необходимых для транспозиции и формирования вирусных частиц, 'минифаг D3112AHcts обеспечивает трансдукцию плазмид и плазмидных «маркеров. Эффективность и характер трансдукции при этом зависят от соотношения величины плазмиды с емкостью капсида фага D3112. Минифаг 03112дНс1з (дН) может быть использован для переноса между клетками псевдомонад плазмид. размер которых не превышает ЗЗтпн. Это особенно актуальнб в том случае, если плаз-' миды не содержат областей, необходимых для коныогативной передачи (tra~ mob"). Если величина плазмиды превышает емкость вириона 03112, то в процессе трансдукции происходит ее делеционное укорочение, что мы продемонстрировали,: получив ряд делеционных производных плааивды RP4, в том числе - один из ее минимальных репли-■ конов (р№3). Анализ частота совместной трансдукции неселектируе-

- 3.- . ..

мых ыаркеров больших плаамид (в нашем случае - R151) позволяет судить об их взаимном расположении. Предложена основанная па принципе транспозиции и последующей трансдукции система, которая мояет быть использована для идентификации транспозирущихся элементов в составе крупных плазмяд псевдомояад.

Продемонстрировано, что млнифаг D3U2^Hxyl обеспечивает трансдукцию и' транспозицию в другие репликоны (из плазыиды PDT4.2::лНху1 в хромосому Р.aeruginosa и из хромосомы в плазииду PSP329) клонированного в нем гена катехол-2,3-диоксигеназы (xylE). Ген xylE внутри мини-дН играет роль удобного для идентификации в клетках многих видов микроорганизмов генетического маркера, что делает возможным использование структуры ¿Нху! в .качестве интегративного вектора. , . • ,

На основе плазмиды pSP329 сконструирована векторная плазми-да-носитель минифага дНху1. Она обеспечивает передачу мшшфага между клетка»«! E.coli и Р.aeruginosa, Еыделение его ДНК в достаточных количествах, содержит удобный для клонирования уникальный сайт чувствительности к эндонуклеазе BamHI внутри лКху1 .и может нести встройки большого (~40тпн) размера.

С использованием полученного вектора произведена интеграция фрагмента гена дельта-эндотоксина crylAa Bacillus thurlngiensis в хромосому P.aeruginosa. Показано, что полученные инсерции демонс-тр|{руют высокий уровень (1007.) стабильности в неселективних условиях и термоиндуцибельнуи экспрессию.

Агробанк рзбаш. '

Результаты работы были представлены на 1-ой иаучной конференции ВНИИгенетика (Москва, 1993 Г.).и научном семинаре лаборатории генетических систем биодеградации ГНИИгенетика (1995 г.).

. Пубгйсщкй, ■ ■

По материалам диссертации ■опубликовано две статьи.

Структура и объем {»бога. . •

Диссертация состоит из 7 разделов: "Введение", "Обзор литературы", "Материалы н методы", "Результаты je обсуждение", '.■Заключение", "Выводы" и "Список литературы". Работа изложена на 130 страницах маш ^писного текстэ/ вклшая 38 рисунков, 7 таблиц и список литературы, содержащий 150 ссылок. •

МАТЕРИАЛЫ И »CTQÖä

• Еаятеркахьиаэ штаыиа.

В работе использовали штаммы E.coli С600 и DH5d-, Р.aeruginosa РА01, РА08, PG2412, РТ06005, полученные из коллекции НЙИгене-тика и P.aeruginosa Pu21, полученный от доктора Жакоби (США).

Плазшда!.

Плазмвды RP4 й pRK20i3 получены из коллекции НИИгенетика; плаамиди pDT4.2 и pDT4.2^H получены из коллекции лаборатории генетики бактериофагов НИИгенетика; плазмида pSP329 получека от доктора Лори (США); плазмида R151 получена от доктора Жакоби (США); плазмида R388 подучена от Л. Чернина (институт химической физики); плазмида рКК23 получена из коллекции лаборатории химии белка НИИгенетика.

Бактериофаги.

Бактериофаги D3112ctsl5, D3112C5 и минифаг D3112^Hcts получены из коллекции лаборатории генетики бактериофагов (НИИгенетика), минифаг D3112üHxyl получен от Кирсанова Н.Б. (НИИгенетика).

Среди.

В качестве полноценных использовали среды Хоттингера и Лу-риа, а в качестве минимальной - среду Адамса (Биргер М.О. 1073г., Миллер Дж. 1976г.). Антибиотики применяли в следующих концентрациях: для селекции штаммов Р.aeruginosa - карбенициллин и стрептомицин * -. 250ЫКГ/ЫЛ, тетрациклин - ЮОмкг/мл, канамицин 400мкг/мл, триметоприм - 500мкг/мл; для селекции штаммов E.coli -карбенициллин - бОмкг/мл, стрептомицин - 250мкг/мл, тетрациклин -БОмкг/мл, канамицин - БОмкгАш. Сульфаниламидный препарат этазол натрия для селекции штаммов Р. aeruginosa использовали в концентрации 5мг/мл. ' '

... Иггодм. .

Работа с микроорганизмами в основном проводилась согласно руководству Да. Миллеру. ' . 1

Интеграция гибридного минифага лНху1-сгу1Аа п хромосому

P. aeruginosa PG2412.

Из штамма P. aeruginosa PG2412 (D3112cts, рНХ-cry) путем т.р-моиидукции получали лизат. Йаплю этого лизата (примерно 107 фаговых частиц /мл) смешивали на агариэованой среде Хоттингера с каплей суспензии клеток P.aeruginosa PG2412 и инкубировали 3 часа при 306С. Кусочек среды, на который наносили капли, вырезали и помеярли в 2мл физиологического раствора, интенсивно встряхивали и оставляли на 15мии. Серию разведений полученной таким образом суспензии высевали на чашки с агаризованой средой Хоттингера Еместе с 0,1мл лизата нелизогенизирующего мутанта С5 фага D3112 (примерно Ю9 фаговых частиц/мл) и инкубировали при 30°С ^.часов. Чашки, на которых выросло от 100 до 1000 колоний лизогенов, опрыскивали 0,1М раствором катехола и отбирали желтеющие (Ху1+) клоны, которые использовали для дальнейшего анализа и работы.

Определение активности катехол-2,3-диоксигеназы.

Культуры.псевдомонад выращивали в полноценной среде до середины экспоненциальной фазы роста при 30°С, в случае необходимости - индуцировали 40 минут при 37°С, концентрировали "центрифугированием (2мин, 12тис.об/мин, 4°С), двавды промывали и ресуспендиро-вали в 0,1М калий-фосфатном буфере (рН7,0). Клетки разруиали уль-' траавуком, центрифугировали и отбирали супернатант. 100 мкл полученного экстракта смешивали с 2,8т калтЬфосфатного буфера (IOOmM KH2P04+Ha0il до рИ7,0) и добавляли 100мкл свежеприготовленного 0,01% катехола. Сразу после добавления катехола анализировали изменение спектра поглощения излучения (длина волны л-375нм, Е-33.4ММ"1 см"1). .

Удельная активность катехол-2,3-диоксигеиазы выражается в микромолях потребленного субстрата или образовавшегося L-оксиму-конового полуальдегида в минуту на 1мг общего бактериального белка (Feist C.F. et.al. 1969). Белок определяли по Лоури.

Иммунологический скрининг-колоний с использованием антисыворотки кролика к набору дельта-эндотоксинов из подвида kurstaki, проводился, как описано ранее (Остерман А.Л.-и др, 1989).

Вестерн-блот-анализ проводили, согласно руководству под редакцией Д. Гловера (1989)- с использованием системы iiovablot (LKB-Pharmacla). ' ■

Работы с тщк. .

ДНК плазмид. выделяли методом щелочного или температурного

лизиса (Kado C.J., Lin S.T. 1981). В случае необходимости проводили очистку выделенной ДНК в градиенте CsCl.

• Хромосомную ДНК выделяли описанным ранее методом (Lewington j. et.al. 1987). ,

Перенос ДНК на фильтры проводили по методу Смита и Саузерна, ДНК/ДНК-гибридизацию - по методу Сау зерна.

результаты и овсУЕдашЕ.

1. Трапсдугарга алазш^ с помадь» шаиг^ага D3112*J! в клэтиаж Pseudoioonas aeruginosa.

1.1. Электронно-микроскопический анализ ДНК, выделенных из фаговых частиц смешанного лизата ыини-Р3112лН/Р3112.

Чтобы исследовать структуру молекул ДНК, которые упаковываются в вирионы D3112 после термоиндукции лизогеиов, содержащих фаг-помощник.D3112 и Mraui-D3112^fi (¿Ji), проводился электронно- микроскопический анализ гомодуплексных молекул ДНК.

В изученных препаратах, помимо типичных гомодуплексов D3112, были обнаружены гомодуллексы, содержащие короткий двунитевой участок с длинными однонитевыми концами (Рис. 1а). Длина двуните-вого участка (около 3.5 тпн) была постоянной и совпадала с размером генома мини-фага J1, расчитанным по результатам рестрикцион-ного анализа (3,5тпн). Образование таких молекул является, очевидно, следствием упаковки ДНК мини-лН по механизму заполнения головки. При этом увеличение фрагмента бактериальной ДНК в составе зрелой молекулы является следствием уменьшения размера фагового генома..

В препаратах были также обнаружены гомодуплексы, содержащие в своем составе два мини-элемента (рис.16). Образование таких молекул свидетельствует о высокой эффективности репликации и трансповиции мини-дК в клетках P. aeruginosa. Воамокно, при попадании в клетку, линейные молекулы, содержащие две копии ДНК мини- дН, будут рекомбинировать с образованием кольцевых молекул. Это может обеспечивать трансдукцню н, при определенных условиях, дедеционнсе укорочение плаэмвд. Чтобы проверить эту возможность, : с помощью мияи-йН была проведена традсдукция нескольких плазмид, отличающихся по размеру, и изучены свойства образующихся транс-дуктантов. ' ' '•■■

Рис. 1 а Электронно-микроскопический анализ гомодуплексных молекул ДНК, содердавдх одну копию мши-лН.

Рис.1 б Электронно-микроскопический анализ гомодуплексрых молекул ДНК, содержащих две копии мини-ДН: "

1.2. Трансдугадая с псмодью мини-ьН плазмид разумного размера.

• Учитывая то, что емкость калсида бактериофага D3112 ограничена и составляет ЗЭтпн, представлялось интересным проанализировать частоту и характер трансдукции с помощью мини-лН плазмид различной величины. Для этого были сконструированы штаммы P. aeruginosa, содержащие фаг-помощник D3112cts в хромосоме, ми-ни-лН и какую-либо из плазмид определенного размера (табл.1). Из таких штаммов получали дизаты, которыми инфицировали клетки штамма P.aeruginosa PG2412 (D3112cts). После этого производилась оценка частоты трансдукции соответствующих плавмидиых маркеров. Результаты таких опытов приведены в таблице 1. Наблюдается зависимость частоты трансдукции от размеров трансдуцируемых плазмид. Наиболее эффективно переносятся минифагом плазмиды, размеры которых значительно меньше величины ДНК, способной поместиться в кал-сид D3112: рН2 (получение и свойства которой будут описаны ниже) и R1162. Плазмвда R388, величина которой лишь немного меньше, чем размер ДНК, которую дН способен захватить в капсид, трансдуциру-ется с заметно меньшей частотой, чем pN2 и R1162. С наименьшей частотой переносится при трансдукции ДНК плазмид, размер которых превышает емкость головки фага D3112, то есть R151, Ripö4, pDT4.2::^H и PBS286.

Анализ ДНК полученных трансдуктантов позволил судить о том, что происходит с плаэмидной ДНК в процессе трансдукции. Мы показали, что плазмиды, размеры которых не превышают емкости вириона D3112 (pN2, RH02, R383) переносятся при трансдукции с помощью ДН целиком. Причем, если исследуемая плазмида исходно не содержала геном ЛН (R1162, R388), то часть плазмид трансдуктантов содержит инсерции минифага, а часть - нет. В случае трансдукции рН2, которая исходно несет геном ¿Н, все исследованные клоны трансдуктантов содержат ДНК дН.

Плазмида pBS286 представляет собой'производную NPL41, содержащую' встройку транспозона ТпА. По размеру она значительно превышает емкость головки D3112. Анализ ДНК. Cb-R трансдуктантов ptö286 показал, что практически все они содержат плазмиду, превышающую по величине pN2, которая использовалась в качестве носителя ми-ии-йН-. Маркер устойчивости к карбеющидлнну, по которому велась селекция трансдуктантов, принадлежит ТпА. Возникло предположение/ что ТпА транспозируется из pBS286 в рН2. После индукции лизогенов

Табл.1 Трансдукция плазмид с помощью мини-дН.

Штамм, из которого Исследуемая Размеры Селекти- Частоты

получали лизат плазмида плазмиды руемые трансдук-

(тпн) маркеры ЦИИ

Рв2412 (ЮНгсЬэ, рN2) риг 9 тс-гг 2х10-5

-//-(081 «сЛя. К11Б2 10 Би-Я 1,3х10"5

рОТ4.2::лИ, Шб2) Зп-!?

-//-([13112^5, рН2, К388 34 Би-И 1хЮ~7

К388) Тр-1?

-//-(йзпгс^з, рмг, И51 44 СЬ-Й ЗхЮ"7

И 51) Би-1?

-//-(03112015, рЬТ4,2::дН 66-60 Тс-!? ?.,5х10"7

рОТ4.2::лН)

-//-(03112с1з. риг, Rlpб4 179 СЬ-К 1x10"®

Ирб4) Би-З 1,2х10'"8

-//-(озигсЬэ, рмг. рвигеб 100 С!*-!?

рВБгвб)

Табл.2 Анализ СЬ-Я трансдуктантов, содержищих маркеры плаамиды Й151.

Присутствие неселекткруемьи Количество трансКлассы СЬ-Я маркеров дуктантов с- данным трансдуктантов Эп-Й Би-Я <Эт-1? Тс-1? фенотипом (2)

I + Ч; • + - 32

II + + - - - .17

III + - V . 24

IV - + - - 3

V . г; 24.

происходит упаковка pN2::TnA в головку вириона и вся структура может трансдуцироваться. Для доказательства этого проводилась проверка клонов трансдуктантов на устойчивость к тетрациклину (маркер pN2), а плазмиды трансдуктантов исследовались с помощью эндонуклеаз Pstl и Sacll. До ЗОХ проанализированных клонов несли детерминант устойчивости к тетрациклину (ген тетрациклин-резистентности может инактмвироваться, если встройка транспозона ТпА произошла в его кодирующую или регуляторную последовательности) и примерно S0Z содержали характерный для ТпА Pstl-фрагмент величиной 2,5тпн. Гидролиз эндонуклеавой SacII показал, что ТпА интегрирует по меньшей мере в два различных сайта pN2. Следовательно, плазмиды трансдуктантов представляют собой производные pN2, содержащие встройку транспозона ТпА.

Очевидно, частота транспозиции ТпА в pN2 и трансдукции этой структуры с помощью ¿Л значительно выше частоты трансдукции пдаз-ииды pBS286. Поэтому мы не можем оценить то, как происходит трансдукция pBS286 минифагом ДН.

Возможно, системы, аналогичные описанной выше, смогут быть использованы для идентификаций транспозирующихся элементов в составе крупных плазмвд. Кроме того, представляет интерес изучение возможности применения pN2::TnA или аналогичных ей плазмвд для разработки систем транспозонного мутаганеза.

Размер плазмиды R151 превышает емкость капсида бактериофага D3112. В отличие от плазмид меньшего размера, R151 не переносится при трансдукции с помощью мини-^Н целиком. Об этом свидетельствует анализ наследования неселектируемых маркеров в. клонах трансдуктантов . R151 , отобранных на среде с карбенициллином (табл.2). Среди Cb-R грансдуктантов не .было обнаружено ни одного «она, по-лучивиего все маркеры R151, Акзлиэ частоты совместной трансдукции неселектируемых маркеров позволяет судить об их взаимном расположении. Согласно данным таблицы, расположение маркеров антибиоти-корееистентности на плззмиде R151 можно" представить следующим об-' разоа:

an-R - Sm-R - Cb-R - Su-R

Более детально процесс трансдукции плазмвд, размер которых пребывает емкость вириона D3112, ш исследовали на примере транс* дукцин с помощью шши-дН плазкэды pDT4.S::ДН.

1.3 Трансдукция маркеров плазмиды рРТ4.2::лН.

Плазмвда pDT4.2::ДН представляет собой производную RP4, у которой делетирован район гена устойчивости к каяамицину и которая не содержит IS21 элемент. Кроме того, pDT4.2::ДН несет встройку мини-дН в районе 42тпн в такой ориентации, что 3-конец расположен ближе к EcoRI-сайту.

Из штамма PG2412 (pDT4.2::AH, D3112cts) путем термоиндукции был получен лизат, которым затем инфицировали клетки Р62412 (D3112cts) (гес+) и РГ06005 (гее-). В качестве контролей, не содержащих минифаг, использовали лизаты из штаммов PG2412 (pDT4.2, D3112cts) и PG2412 (pDT4.2::D3112cts). Отбор транедуктантов проводился по маркерам устойчивости к тетрациклину и карбенициллину независимо. Трансдукция наблюдалась только в случае инфицирования гес+ - реципиента смешанным лизатом (содержаалм D3112cts и мини-дН). Частота ее по маркерам Tc-R и Cb-R была почти одинаковой и составила 2х10"7 - ЗхЮ"7. Это говорит о том,' что, во-первых, фаг- дикого типа не способен осуществлять транедукцио плазмидных маркеров с поддающейся оценке частотой; во-вторых, мини-лН зффек- ' тивно переносит гены pDT4.2:в-третьих, трансдукция с помощью дН требует наличия в клетках реципиента системы общей гомологичной рекомбинации.

Анализ ста клонов транедуктантов на наличие перекрестной устойчивости к тетрациклину и карбенициллину показал, что эти маркеру переносятся совместно: всего один из ста клонов обладал фенотипом Tc-R Cb-S, а остальные были устойчивы к обоим антибиотикам (Тс и СЬ). Возможно, появление чувствительного к карбенициллину кяона связяно с тем, что детерминант карбенициллин-резистентности может утрачиваться вследствие зкецизии транспозона Tnl, которому этот маркер принадлежит.

Анализ ДНК ряда транедуктантов с помощью электрофореза в агарозном геле показал, что все они содержат плазмиды, которые меньше по размеру, чем исходная pDT4.2::дН. При этом варьируют и величины плазмид транедуктантов:, наименьшей оказалась pN2, ьевде-• ленная из клона с фенотипом Tc-R Cb-S.

,1.4. Свойства делеционных производных плазмиды pDT4.2: .y_H.

Рестрикционный анализ с использованием эндонуклеаз Hind III, SacII, Sphl и PstI позволил доказать, что плазмиды транедуктан-

тов,обозначенные pN2, pN7, pNQ и pN9 представляют собой делецион-ные производные pDT4.2::¿H (рис.2). Делеции затрагивают области между 14 и 40тпн карты RP4, что, по всей вероятности, является закономерным следствием упаковки ДНК фага по механизму заполнения головки. Помимо области между 14 и 40тпн карты RP4, делетирован участок ДНК между геномом ДН и SacII-сайтом RP4 с координатой 54,2. Делеции второго порядка, очевидно, необходимы для восстановления балланса генов kll и kör плазмиды RP4, нарушение которого приводит к гибели клетки- хозяина.

Размер полученных делеционных производных плазмиды рОТ4.2::лН был определен как сумма размеров рестрикционных SacII и SphI фрагментов. Он составляет примерно 25тпн для р№, 32тпн для рМЗ и 35тпн для pN7. Величина исходной pDT4.2::¿H - 55тпн. Тагам образом, у плазмиды pN9 удален участок размером около ЗОтг i, у pN8 - 23тпн, а у pN7.- 20тпн.

Плаямида рМ2 наименьшая из полученных с помощью мини-дН делеционных производных pDT4.2::ДН. Ее размер составляет всего Утик. Если учесть, что размер мини-ДН составляет 3,5тпн, то можно утверждать, что pN2 содержит лишь 5,5тпн от плазмиды RP4. Причем этот участок из 5,5тпн включает ген тетрациклин-резистентности, OriV и trfA-ген, необходимый для репликации плазмиды. Таким образом, pN2. представляет собой минимальный репликон плазмиды RP4.

Исходная плазмида рВТ4,2::дН трансмиссибельна и передается между клетками с частотой 10~2 нз клетку донора. Штаммы, содержащие pN7, pN3, рШ и pN2, не поддерживают рост бактериофага pRDI, который размножается только в клетках, несущих Trat-плазмиды. Утрата pRD-S признака согласуется с данными рестрикционного анализа, показавшего, что у перечисленных выше плазмид транедуктантов делетироваш области traB и ТгаС. Вместе с тем, pN?, pN8 и pN9 могут переноситься при конъюгации в присутствии соответствующей Тга+ плазмиды-помощника. Это свидетельствует о том, что в составе данных плазмид сохранился участок инициации конгюгативного 'переноса (orlT).

Плазмида pDT4.2::дН может поддерживаться в клетках P.aeruginosa и E.colí. Для того, чтобы проверить сохранили ли плазмиды транедуктантов это свойство исходной плазмиды, мы трансформировали штаммы E.coli К12 СБОО и Р.aeruginosa PG2412 плазмид-ной ДНК pNr, pN7, pN3 и pN9. Показано, что все, кроме pN2, плазмиды могут трансформировать и стабильно поддерживаться как в

I

г-* )

4

А /

4 ..........______..............»

IV.с. 2 Карты гггазмид КР4, рОТ4_2: :ЛН н их делецконкых производных.

1 - делеции

2 - границы точно ке установлены

рВТЧД::^// £Н

£ Н

?;о Щ

р«

лн

5>кэ гхт &

&и

рнг ~Е7~

псевдомонадах, так и в Е.coll. -Интересно, что рЯ2 утратила способность поддерживаться в Б.coll. хотя и сохранила (неизвестно, в неизменном ли виде) OriV RP4.

2. Использование шашфзга DSllB^Hcts в качество кихагразип-ного вектора в плотах l^seudoraonas aeruginosa.

2.1. Особенности поведения мини-Р3112ЛНху1 в клетках Pseudorr.onas aeruginosa.

Ранее Н.Б.Кирсановым был сконструирован мгашфаг 03112дНху1 (дНху1), содержащий ген катехол-2,3-диоксигеназы (xylE). Чтобы выяснить, способен ли гини-дНху! упаковываться и интегрироваться (а значит и обеспечивать интеграцию гена xylE) в хромосому P. aeruginosa, из клеток штамма Р62412 (D3112cts, pDT4.2::^Hxyl) полу-;чали лизат, инфицирбвали клетки штамма FG2412. и отбирали лиаоге-ны, содержащие функционально.активный ген xylE (при опрыскивании колоний 0,1М раствором катехола клетки, несущие экспрессирующийся xylE окрашиваются в мвтенсивш-желтый цвет). Анализ клонов транс-дуктантов показал, что они не содержат маркеров плазииди рОТ4.2, обладают иммунитетом к повторному заражению фагом D3112 и ЮГ. из них продуцируют фаг, то есть содержат D3112cts.

Чтобы исследовать способность ¿Hxyl транспозироваться и обеспечивать транспозицию- гена xylE из реплигона в репликой, плазмиду pSP329 конъюгативно (в присутствии Тга+ -. плазмиды-по-мощника pRK2013) вводили в стакм P. aeruginosa РЙ2412 (D3112cts, ¿Hxyl), из клеток pg2412 (D3112cts, дНху1, pSP329) получали лизат и инфицировали им культуру Р62412 (D3112cts). Отобранные клоны траяедуктангов с фенотипом Tc-R. (маркер pSP3?9) Ху1+ содержали плазмиду pSP329 со встройкой J!xyl (pSP329::AHxyl). В большинстве случаев интеграция дНху1 происходила в конец области lacZ плазмиды pSP329, что подтверждалось данными рестрикционного анализа, а также полным либо частичным исчезновением Ьас+-фенотипа- у клеток E.coli DH51, в которые pSP329: :Jlxyl была введена конъвгатшзно (с помощью Тга+ - плазмиды рОКЗЭ) или путем трансформации.

Таким образом, мы продемонстрировали, что ,минифаг D3112^Hxyl обеспечивает транедугадао и транспозицию в другие решшконы (из плазмиды pDT4.2::AHxyl в хромосому P. aeruginosa и из хромосомы в плазмиду pSFB29) клонированного внутри него гена xylE. Он может быть использован в качестве интегративного вектора в • клетках P.aeruginosa. Кроме того, ген xylE внутри минч-^Н .играет роль ге-

аетического маркера, удобного для идентификации минифага в клет- . ках'E.coli и Р. aeruginosa, и вся эта структура (дНху!) может в дальнейшем оказаться полезной в опытах по клонированию и обеспечению' стабильного поддержания генов в клетках Р. aeruginosa.

2.2. Конструирование вектора рНХ.

Чтобы получить векторную плазмиду-носитель ьшнн-дИху1 зге-/ ыента, из плазшда pSP329 удаляли сайт чувствительности к эндо-нуклеазе Banüll и in vivo, используя уже списанную стратеги», получали встройки минифага дНху1 внутрь такой плазмвды. Одна из полученных таким образом плавмнд (рНХ) в дальнейшем использовалась ' в качестве вектора-носителя мнни-лНху1. Она обеспечивает передачу минифага между клетками Р.aeruginosa к E.coli, выделение его ЛКК в достаточных количествах, содержит удобный для зонирования уникальный ВалШ-сайт внутри мини-¿.Hxyl и способна нести, встройки большого размера (~40тпн).

2.3. Интеграция гена эндотоксина Bacillus thuringiensls crylAa в хромосому Р. aeruginosa.

2.3.1. Конструирование плазмиды рНХ-сгу.

В качестве источника гена дельта-эндотоксина использовали плазмиду рКК23, которая представляет собой производную pUCi 18, содержащую Dral-Kpnl фрагмент crylAa, кодирующий 725 Н-концевых аминокислот эндотоксина под контролем 1ас- промотора и собственную .: область инициации трансляции (для токсичности существенны только 620 N-концевых аминокислот).

Для того, чтобы встроить фрагмент crylAa внутрь мгаш-дНху1, плазмиду рКК23 обрабатывали эндонуклеазой BamHI и лигировали с раскрытым по'BamHI вектором рНХ (рис.3). рКК23 содержит два сайта чувствительности к ВаиШ. Один из двух образующихся в результате рестрикции фрагментов несет полную инсерцию участка crylAa. Полученной после дотирования ДНК трансформировали клетки E.qoll DH5A и отбирали колонии трансформантов, имеющие Tc-R фенотип. По еду-ющая обработка катехолом показала, что все они обладают также и . Ху1+ фенотипом. Иммуноферментный скрининг 100 колоний грансфор-мантов позволил отобрать клои, содержащий экспрессирующийся ген эндотоксина. Рестрикционный анализ плазмидной ДНК этого клона подтвердил, что он несет встройку фрагмента crylAa в ,мииОД№су1 на векторе рНХ (рНХ-сгу). '

m - тни-J! m - xylE

СЗ - cryIAa

В - ВатИТ EI- EccPJ EV- EccW К - Kpnl P - Pvull Ps- PstI X - Xbal

<n 1

EV'p ' gK

Рис.3 Схема конструирования плазмиды рНХ-сгу.

-172.3.2. Интеграция мшш-дНху1-сгу IAa элемента в хромосому.

Pseudomonas aeruginosa.

Чтобы обеспечить иясерцию шши-дНху1-сгу1Аа (АНху1-сгу) в хромосому P.aeruginosa, мы применяли уже описанную стратегию селекции Ху1+ трансдуктантов, только, с целью обогащения популяции бактерий лиэогенами, проводили совместную с нелизогенигируюшдм мутантом С5 инфекцию (см. "Методы"). Если в аналогичном эксперименте не использовали нелизогенизирующий мутант D3112C5, частота появления Ху1+ трансдуктантов падала в среднем на два порядка. Иммукоскрияинг выращенных на твердой среде колоний продемонстри- ■ ровал, что 95Х клонов трансдуктантов продуцируют CrylAa эндоток-cira, но лишь после инкубации при 37°С, В случае, если тестировались выращенные при 30°С клоны, . иммувоскрининг не давал положительной реакции. Из всех проанализированных клонов Xyl+ Tc-S трансдуктантов всего один оказался монолизогеном, то есть не содержал фага-помощника D3112cts.

Для доказательства хромосомной локализации сгу1Аа-фрагмента проводили гибридизацию по Саузерну геномной ДНК, выделенной из клеток траисдуктанта P.aeruginosa PQ2412 (¿Hxyl-cry), с меченным Р32 сгу1Аа-фрагментом из плазмиды рКК23. ДНК/ДНК гибридизация подтвердила присутствие фрагмента гена crylAa в хромосоме исследуемого транедуктанта и позволила показать, что условия термоиндукции никак не влияют на количество копий crylAa в хромосоме мо-нолизогена, не содержащего фаг-помощник'(рис.4).

Чтобы оценить количество дельта-эндотоксина в клетках моно-и полилизогенов, подвергнутых и не подвергнутых термоиндукции, проводили Вестерн-блот анализ со специфическими антителами против CrylAa белков, выделенных из исследуемых клонов лизогенов. Он показал, что уровень продукции эндотоксина монолизогеном PG2412 (дНху1-сгу) после термоиндукции (50мин при 37°С, аерация) достигает 1г/л, а полилизогеиами Р62412 (D3112cts, ¿Hxyl -cry) - не превышает 0,5г/л. Без термоиндукции монолигоген продуц-оует 0,5г/л, а полилизогены - 0,05 -0,1г/л эндотоксина. Уровень деградации белка выле у клонов, подвергнутых термоиндукции (рис.5).

Термоиндукция синтеза эндотоксина позволяет предположить, что crylAa в системе дНхуЬсгу экспрессируется с фагового промотора, по некоторым данным (Герасимов В. и др. 1991) сохраниввего-ся у мини-дН. Очеввдно, на уровень синтеза эндотоксина влияет положение в,хромосоме и концентрация с-репрессора. . Этим могут ойъ-'

А 1 2 3 45 6tS 123456

Тч

-

I

lis

f ' fc

ivyj^. •

ill I

Рис. 4 ЛНН/ДНК гибридизация crylAa фрагмеш-a пдазады pKK23 с хршоссшой ДНК втамма P. aeruginosa PG2412 (дНху1-сгу).

A. Электрофэрбтическое разделение PvuII фрагментов плаз-шщы рНХ (2>, рНХ-сгу (3), хромосомной ДНК кз клеток ли-вогена Р62412 (дНху1-сгу) не подвергнутых (4) и подверг. syrat (5) уеръшздукцин. (6) - х.-скасомная ДНК PG2412,

(1) - ДНК фага Я + Hindlll.

B. Результат гибрндиаации по Сауаэрпу.

3 4 5 6 ?

■:•"<»'«■• •• -У'»—

KSSSf

Рис.б Результаты Вестера-блот анализа уровня продукции эндоток-сдаа дизогенами Р.еепщ11юза Йзг412 (лНхуЬсгу), содержащими и не содержащий фат-помощник ОЗИгсЬэ: 1 - Р02412 (¿НхуГ-сгу) после термоаадукции, г - РС32412 (дНху1-сгу) без термоиндукции, 3,5 Р02412(ОЗИгЛз, дНху1-сгу) после термоиядукции, 4,6 - Р02412 (БЗИгсЦ, ¿Нху1-сгу) без. термоющукции, 7 - белок Сгу1Аа.

ясняться различия в производстве токсина клонами ыоно- и полили-зогенов. Экспрессия гена xylE внутри Jlxyl элемента также термо-индуцибельна (у xylE в данной системе нет своего промотора). Об этом свидетельствуют результаты анализа активности кате-хол-2,3-диоксигеназы в бесклеточном экстракте из монолизогена PG2412 (_Нху1-сгу): наблюдалось примерно трехкратное (от 0,28 кМ/мин/мг до 0,8 мМ/мин/мг) увеличение активности катехол-2,3-ди-оксигеназы после термоиндукции адльтуры монолизогена при 37°С в течение 50 минут. Для анализа роли репрессора в проявлении термо-индуцибельного фенотипа , в клетки лизогенов Р.aeruginosa PG2412 (_Hxyl-cry) вводили фаг D3112C+ в составе плазмиды RP4 (RP4::D3112C+). Репрессор этого фага не чувствителен к температуре. Исследуя экспрессию гена xylE в системе _Нху1-сгу в присутствии репрессора С4" мы показали, что условия термоиндукции в данном случае . существенно не влияют на активность гена кате-хол-2,3-диоксигеназы. Это подтверждает участие фагового промотора в экспрессии гена xylE в составе-минифага.

Анализ стабильности наследования признаков Ху1+ и Сгу1Аа+ в клетках трансдуктантов показал, что инсерции мини-_Нху1-сгу!Аа в хромосому Р. aeruginosa демонстрируют высокий уровень (1002) стабильности в кеселективных условиях. Чтобы функционально проанализировать способность _Нху1-сгу-элементов к транспозиции и формированию вирусных частиц в присутствии или отсутствия фага-помощника, в клетки PG2412 (_Нху1-сгу) и PG2412 (_Hxyl-cry, D3112cts) была конъюгативно (с помощью помощника pRK2013) введена плазмида RSF1010. После термоиндукции трансконтагантов и инфицирования полученным лизатом штамма Р62412 (D3112cts) отбирали Sm-R (маркер RSF1010) Ху1+ трансдуктанты. -2n-R трансдуктанты удалось отобрать лишь в случае, если использовали смешанный лиэат. (D3112cts, _Hxyl -сгу) из клонов полилизогенов. Конализогены, как и следовало ожидать, вообще оказались неспособными продуцировать зрелый фаг. Анализ с помощью рестриктазы EcoRI продемонстрировал, что клетки Sm-R Xyl+ трансдуктантов содержат производные пл_ми-ды RSF1Ö10 с инсерцией _Hxyl-cry (RSF1010::_Нху1-сгу). Следовательно, мини-_Нху1-сгу элемент может транспозироват^ся из хромосомы Р.aeruginosa в другие решткош (RSF1010) и трансдуцировать-ся, но лишь в присутствии фага-помощника (D3112).

Таким образом, на основе минифага D3112_Hxyl получен интег-ративньй вектор и разработана система. Обеспечивающая интгерацкю

в хромосому P.aeruginosa, стабильное наследование и териоиндуци-бельную экспрессию клонированного в нем фрагмента гена дельта-эндотоксина cry 1Аа В. thuringiensis.

■ШЩН

1. На основе мини-производной дН бактериофага D3112 Pseudomonas aeruginosa получен вектор, обеспечивающий интеграцию генов в хромосому Pseudomonas aeruginosa, стабильное наследование и термоиндуцибельку» экспрессию клонированных в нем генов.

2. С помощью созданного вектора осуществлена интеграция гена дельта-эндотоксина (crylAa) в хромосому P.aeruginosa. После термоиндукции уровень синтеза токсина возрастал в 2-Ю раз.

3. В присутствии фага-помощника D3112cts миккфаг обеспечивает транспозицию в другие репликоны и трансдукци» клонированных в кем генов.

4. Ыинифаг Ш112дНсЬ5 способен трансдуцировать плагмиды и плазмид-ные маркеры в Rec+ реципиентные штаммы P. aeruginosa. Наблюдалась • зависимость эффективности трансдукци" от размеров трансду-цируемых плазмид. По частоте котрансдукции минкфатом ДН можно судить о сцеплении и взаимном расположении маркеров больших плазмид псевдомонад.

5. Показана возможность делеционного укорочения плазмид, размер которых превосходит емкость капсида фага D3H2, в процессе их трансдукщш ыинифагом дН. Получены делеционные производные плазмиды RP4, величина иаименьшей из которых составляет 5,5тпн. что соответствуем минимальному репликону RP4.

Спксок работ, ояублнксвдшшх во материалам хиссертацкк

1) Марьина О.В., Герасимова Т.В., Беккаревич А.О., Хренова Е.А., Яненко А. С. Трансдукция плазмид с помощью ыинйфага 133112дН в'клетках Pseudomonas aeruginosa//Генетика. 1992. т.28. N10. С.48-57

2) Кирсанов Н.Б., Марьина О.В., Яненко А.С. Использование миш-фага D3112AHcts в качестве квтегративного вектора в клетках Pseudomonas aeruginosa // Генетика. 1993. т.29. N 11. р.1806-1810.