Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Особенности выражения генома фага-транспозона D3112 в системе гомологичного хозяина P. Aeruginosa и гетерологичного хозяина E. Coli

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Особенности выражения генома фага-транспозона D3112 в системе гомологичного хозяина P. Aeruginosa и гетерологичного хозяина E. Coli"

МИНИСТЕРСТВО МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ СССР ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ГЕНЕТИКИ И СЕЛЕКЦИИ ПРОМЫШЛЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

На правах рукописи

ТРЕНИНА

Марина Анатольевна

ОСОБЕННОСТИ ВЫРАЖЕНИЯ ГЕНОМА ФАГА-ТРАНСПОЗОНА D3112 В СИСТЕМЕ ГОМОЛОГИЧНОГО ХОЗЯИНА P. AERUGINOSA И ГЕТЕРОЛОГИЧНОГО ХОЗЯИНА Е. COLI

03.00.03 — Молекулярная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена в лаборатории генетики бактериофагов Вс союзного научно-исследовательского института генетики и селе ции промышленных микроорганизмов.

Научные руководители:

профессор, д. б. н. Крылов В. Н., к. б. н. Ахвердян В. 3.

Официальные оппоненты:

профессор, д. б. н. Ильяшенко Б. Н.

к. б. н. Складнев Д. А.

Ведущая организация — кафедра генетики МГУ им. М. В. Лс моносова.

Защита состоится /Л. ноября 1991 г. в 14 часов на заседани Специализированного Ученого Совета Д.098.12.01 при Всесою; ном научно-исследовательском институте генетики и селекци промышленных микроорганизмов по адресу: 113545, Москвг 1-й Дорожный проезд, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИге петика. г-

Автореферат разослан Ц ееныбрм 1991 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета, кандидат биологических наук

в' и' Щер6аков£

оюа.ч г^\?лгш?пст1пса рапотн.

ишгаггьзасп» sena есшшзйзшш.

D пркрояэ яироко распространены мобильные генетические isiieimí. прокариотных организмов известны is-эленентн. •анспозонь' и Фагн-транспозоны. стимулируя реконбинационные 'oaeccu я вызывая мутационные изменения, они оказывают ■пественноз воздействие на генетическии материал клетки, особый ггерсс представляют Фаги-транспозоны, обладающие среди указанных ¡нетических элементов наиболее высокой частотой транспозиции, иное значение имеет использование их в качестве инструмента «етнческого анализа в генной инженерии, прекле всего m vivo, ¡следованния группы родственных умеренных Фагов

leudoBonas.aerugmosa сянэнко a.c.. цыганков ю.д., и др.,1979, гворляя в.3.1 Хгенова S.a. и ар..ши позволили предположить, ро они осуществляют транспозицию скрылов в.н., богуш в.г., лж. innPO.issOL наиболее изученным к началу настояиеи 'работы злялся одш1. ':з этих Фагов, Фаг юнг. Было показано, что он. в гаичке от известного Фага-транспозона ни Escherichia.cou, не »иводн? к возникновению мутантов по биосинтетическим генам, в 1стн0сти зуксотрофных мутантов, при лизогенизаиии бактерии, в ¡язи с этии ванное значение для доказательства транспозоннои ?ироды этого фага имело биохиническое изучение его развития.

введение генома фага-транспозона в разные виды бактерии эжно осуществлять с поноаыэ плазнид яирокого спектра, это эзволяет проводить опенку выражения большой группы генов в аетках гетерологичных- хозяев, экспрессия генона D3112 в клетках C011. НеСУОИХ ГИбРИДНУЮ ПЛаЗИИЛУ ЙР4::03112. приводит к тому, го они растут и делятся при 42°с, но при зо°с перестают »литься и образуют Филаненты. Указанное явление получило ивание тсз-эффекта (Крылов В.Н., Плотникова т.г. и др.,1982. аотникова т.г„ кулаков л.а. и дкл982]. в навей работе было рополяено-изучение гетерологичнои экспрессии генома. D3H2 в гктериях с.соп.

ПШ в конкгетнне задачи е

целью настоящей раьоты было изучить с поноаью биохоиическ: методов репликацию и транспозицию геноиа Фага 03112. а так: изучить особенности выражения геноиа данного Фага в систе; клеток гетерологичных бактерии е.соц. в связи с этим бы; сфориулированы конкретные задачи исследования:

- определить множественность сайтов интеграции ДНК ознз хроносону оактеряи р.аепшпоэа при лизогенизаиии и ш литическом развитии Фага:

- определить функции ранних генов, в той числе еыявить ген ответственные за процесс репликашш-транспозишш геноиа Ф&1

03112;

- выявить являются ли процессы репликации и транспозиции «а; озиг в системе клеток гомологичного хозяина Р.аегивхпо; сопряженными;

- выяснить имеется ли зависимость транспозиции геноиа Чага 031 от гена гесл

■- изучить особенности репликашщ-транспозшпш геноиа Фага 03112 бактериях Е.сои;

- изучить зависимость Фенотипа бактерии ксои. содержащих ген« фт В3112. от эффективности экспрессии фага.

новизна результатов.

1. показана множественность сайтов интеграции в системе бактеп Р5.аепшпо5а при литическои и лизогеннон развитии'фага озиг. г. изучена на биохииическон, уровне решшкаиия-транспозиция гено] фага 03И2 в системе гомологичного хозяина рлегивтоза' показана сопряженность и гесл-нез^висимость процессов репдикаш и транспозиции генома Фага 03112.

з. изучены особенности выражения фага-транспозона 03112 гетерологичннх бактериях Е.сои: а» эффективная реплккаци транспозиция в бактериях: Е.соц осуществляется только при зо°с только в присутствии плазниды ВР4; б) в'бактериях £.сои ! происходит созревания днк Фага 03112; в) показано образован! стр.уктуры к^чнтеграта гибриднои плазниды аР4::озпг бактериальной, хромосомы при транспозиции дню озиг в бакт^ри!

соц. а такзе образование делеции плазмиды йР4, входящей в )став коинтеграта; п показано повыпение устойчивости к знпературо зо°с бактерии Е.сои, содержащих геном Фага изиг, ?и уменьшении числа копии генона Фага на бактериальную клетку.

гаахшЕгая Еаишпь Еашкш.

получено доказательство на биохимическом уровне, что Фаг зиг Р.аепшпоза является Фагон-транспозоном. репликация-ранспозиция его генома осупествляется так же как и у фагов-ранспозонов Ми и Ш08. что позволяет считать сзиг членом знеиства Фагов-транспозонов.

изучены особенности репликаиии-транспозииии фага Бзпг в етерологичноя системе бактерии Е.сои. Показано, ■ что эффективная епликачия-тракспозипия генона изиа в бактериях е.сои возножна олько при зо°с к только в присутствии плазниды ВР4. по-видимому, ушествует продукт плазниды ЕР4, который сгинули! /ет репликацию-ранспозипио генона фага сзиз в бактериях Е.соц. представляет нтерес идентификация генов ЙР4, ответственных -за- этот процесс.

выражение генона БЗиг при 42°с в бактериях Е.сои не суаествляется. несмотря на отсутствие функционально-активного епрессо?а Фага {Плотникова Т.Г., кулаков л. А. и др.,19831. (кспрессия генона взиг з 'бактериях. .ехоц при зо°с и в [рисутстаии плазиилы КР4 осупествлйется сходно с экспрессией в ■онолопгчнои хозяине фзгоеого гоноиа мутанта озиг по гену с, в >боих случаях ароисхоапг эффективная репликация-транспозиция •еиома 1)3112 и ве. осупествляется пронейс созревания Фаговой лнк. :акин образок, регулпторные гены <сь С) и -поздние гены озиг шбо не выгаааются вовсе в сакториях е.сои, либо выражаются на сраине низком уровне, зто поено объяснить различной структурой 'анних а поздних проноторов генома г>3112 и специфической ютивапиеи только первых в бактериях Е.со11. изучение различии в уровне экспрессии генов, группы генов в 'гетерологичных системах 1Редставляет интерес для работ в области генной инженерии, юлученные нами результаты иогут быть использованы при создании зекторов с пелью выражения генов в бактериях разных видов.

плазнида вр4 с широким спектром действия, а '.сете саг-??анспо: являются удобными инструментами аая генетического конструировав таких векторов. ' *

в настоящей работе изучались процессы, ведувме к повыиен устойчивости к температуре '30°с клеток e.cou. содержащих геь Фага D3112. показано, что уменьшение числа копин Фагового гене в бактериях e.cou, приводит к улучшению роста бактерии при зо лаоораторные условия отбора клонов е.соН, получивн гибридную плазниду RP4::D3ii2. а также встроики генома озия хромосому Е.сои ■ таковы, что можно "предположить возможное аналогичных сооытии и в природа в настояиеи работе опис случаи, когда днк бактерии Е.соц приобретает функционально активным геном D3U2 и часть генов плазмиды RP4. чукеродная л никак не влияет на рост бактерии Exou и. таким осразон ног наследоваться и в дальнейшей. Обнаружение такого рода «акт является предпосылкой для изучения межвидового ооне генетической информацией.

дпташш гаг&т

натериалы. представленные в диссерта'ционнои раво; докладывались на семинаре отдела прикладной и иолекулярн генетики института вниигенетика ю июня !9Ш г.

¡Шлжкадим, '

по катериалан диссертации отшлаковано четыре статьи. -, . егтэшеа я о&ь&п шт

аиссертация состоит из разделов: -введение". "О631 литературы". "Натериалы и методы*. "Результаты". "Обсухдени! "Выеоды" и "список литературы". Работа изложена на страниц,

машинописного текста, включая/^рисунков. ' г таблицу и спио литературы, содержащий /J6 ссылок.

иатероалн П НЕТОЛН.

«ететоавмпгз пзаинн.

Pseudomcnas aeruginosa PAOt - получен от Е. холловея встралия). Escherichia соц ссоо г'п* - получен от ли лауро SA). ссоог'п* и HBioi гесл взяты из коллекции института мигенетика. Pseudomonas putida ppgi - получен от д-ра иапиро ЙА). ?U2HHP4) - получен от д-ра л. ниллера (США). ?GUEP4::D3ii2) и РАОНЗ - получены з работе скрылов в.к.. ютникова т.г.. кулаков л.а. и др.), PG2412 - получен в работе нвнко А.с., гороунова Крылов b.h.j, PAOi(D3ii2ctsi5tsi7>

sit мутация в гене A). PAOl(D3U2ctsi5ts7l) (ts7i нутация в ше В). PAOUD3U2atsi5tsi04) (tsi04 нутация в гене о, WHD3ii2ctsi5ts23) (ts25 нутация в позднем гене) - получены в 160TQ СЯНенКО А.С.. БОГУП В.Г.1 КИРСаНОВ Н.Б.), CR(D3112)

злучен в работе [Плотникова т.г.. яненко а.с., Кирсанов н.б.).

ишш б^атергго^ароз. •..•■'

D3U2 подучен от зазыкова и.. В39 получен от криинапиллаи Австралия;, PBDi получен от миндича. (СИЛ). D3U2ctsl5 получен ненко. . ' .

ешш.

Для вырапиваиня бактерии ' P.aeruginosa и p.putida спользовалц в качества полноценной жидкую и агаризованную срвду оттингера (справочник под редакцией Бригера и.о.). для E.cou --среду Св книге киллера д:::.}. концентрация антибиотиков для актериа p.aerusinosa. ■ p.putida и E.cou. шкг/мл) составляла для ананипина - 400/S0. тетрациклина - юо/зо. :сарбеницилина - 500, трептошшина - 250/100-200) (первое число , соответствует онцентрашщ. используемой , для Р.ае-азтоза, а второе для 'seudomonas.putida ц s.coii.)

¡сшашш аегшш еамгн с бакггагиедатш а бактериями по [етодикам. описанным в книге Ада::са.

Ш.СТ0ТУ 1ШШШЯЯ ишзшш определяли по нетопике, описаннои в :ниге киллера дзх.

отрог лизогенов PAOHD3H3 осупествляли по катодике. описанной книге Клауса р. и Хейса У.

выделениз Фаговоа zlhil элвктрофоряз б агарознои седе, ее^шз Еадиоактавноя нехки в лдк в днк-днк гибрипизяпио проводили как описано в книге т. маниатис, э. фрич. дж. сэмбрук. QXäQ£ бактерий ÏLCOLL утративвна оенотип ICS-

Клетки клонов TCS итаниов E.COU(RP4::D3ll2) HBioi(RP4"D3ii2) рассевали при температуре 42°с на твердой пит ельнои среде до отдельных колонии, затем по 100 независимо взят колонии каждого ттаниа рассевали и инкубировали при 30°с. частотой ю~4-ю"5 вырастали колонии, образованные клетка! утратившими фенотип Tes. отбирали по одной такой колонии каждого независимого рассева, подвергали ее трехкратному Пересе при зо°с и исследовали по ряду признаков-.

1) способность образовывать колонии как при 42°с. так и при зо*

2) стабильность (нестабильность проявлялась в образован секторов, сосочков вторичного ростак

3) наличие наркероЕ плазмиды КР4 (Тсг. к.тг. арг. ped'x

4) наличие, полосы плазниднои ДНК. выявляемой по методу .экхардт;

5) продукцию жизнеспособного Фага D3U2 н. морфологию е негативных колонии; .* Г.

6) наличие Фаговой и плазниднои днк" в автономной ш соста гибридном плазмиды) или в интегрированном в хроносоиу бактер состоянии; 7,

7). эффективность репликапии-транспозииии днк Фага С3112;

8) рост клеток E.COU. содержащих генон Фага .езиг в соста хромосомы, а также излеченных от Фага бактерий, проверяли опытах с изменением температуры инкубации с 42°с на зд< Анализируемые клетки инкубировали с аэрациеи при 42°с до тит ю7-ю8 кл/нл. затем понижали температуру до зо°с и продолка инкубацию в течение трех часов, пробы для титрования бактерии визуализации днк плазнид отбирали до и после изменен! температуры выраиивания. .

'бор сетстороз. сосочтсрп вторичного кила из клонов, оммашшх

рост бактерии тс1 поддерживали на среде хоттингера при 42°с. 1я отбора секторов вторичного роста клетки рассевали и [кубировалн в течение ночн при 30°с. а затеи при комнатной мпературе (М8-го°С) в течение 5-8 дней, на более прозрачном не колонии основного рассева наблюдали возникновение секторов ■оричного роста, который отбирали ц вновь рассевали при зо°с.

Э^ССПЕРтШГГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

гшказагашетз храпспозоиноп пишжн фага йзиз, . множественность саятод интеграции генона &ала Ш112 а ашЕссз шшпишзашш.

Фаг D3U2. 13 отличие от Фага ни, на вызывает образование гксотрофяых мутантов при лизогёнизации [Крылов в,н.. богуи в.г,. •л. папиродаео!. вместе с тек показана транспозиция его генома з пина гена плззнилп ер4 2 условиях вегетативного развития и в роиосону e.cgu СКРЫЛОЗ 8.н.. . ПЛОТНИКОВа Т.Г., и ДР.,1932, потниксза т.г., Яненко A.c. и др.лээз). напей целью было аределить• локализации генома. Фага D3H2 в бактериях .aeruginosa, .чтобы определить одно или несколько мест экализации профага D3U2 в хромосоме бактерии p.aerusxnosa мы иделили ДНК из независимо полученных лизогенов раошзп2) и осле рестрикции хромосомной дик эндонуклеазои ecori провели нк-днк гибридизацию- с Э2р-иеченнои лик ■ взиэ. Результаты редставленц на рксл. .йз опыта следует несколько выводов..

поскольку внутренние фрагменты нативнок днк" D3112 i, з и з, олученные в результате рестрикции энгонуклеазои ecori, те не, то при рестрикции днк зрелого фага гто доказывает -отсутствие вриутапиа шаговых геаов, а также to. что-аи-саит Фага Ьзпа ахопнтся на концах его генона '.данный ' вывоз был подтвержден езультатани рестрикции ДНК D3U2. другини эндонуклеазанш. i концевые Ecori Фрагменты встроенного з хромосому генона D3U2 иеют иную эяектрофоретическую подвижность, чем концевые рагиенты зрелой Днк. Увеличение молекулярного размера концевых

фрагментов происходит за счет присоединения i: кнн различных фрагментов бактериальной хромосомы, величина присоединенного участка хромосомы зпвисит от »лижаишего к Фаговому геному ecobi сайта е бактериальном днк. таким образом, при лйзогенизаиии интеграция генона d3h2 происходит в различные сайты хромосомы F.aerugmosa. таким образом единственной возможностью совместить Факт локализации проФага сзпг в различных участках хромосоны лизогенных бактерии с отсутствием ауксотроФных мутантов - это допустить, что сайты интеграции Фага взпг при лизогенизаиии находятся вне генов, контролирующих питательные потребности бактерии P.aerueinosa.

03113 " .......

1 i8!8!*!8.8!7! РИСЛ- Интеграция пры лизогенпзаани лнк d3i — в разные саяты хроносоны сактеп

_ p.aerusinosa. выделяли суммарную xpohocomhi

i _ лнк из независимо полученных яизоген<

■•• _ • PA0KD3U2). рестрииировали Фернентон £cofii

z- """ после электрофоретического разделен«

0 — — — — — П0ЛУЧеиных рестриктов проводили лнк-д!

гибридизацию с з2р.Неченноа лнк изпг : : i - рестрипированная лнк зрелого «ara D31:

■ ^ .__„___ 2,з,4,5.6,7-л>естриаиРованная суммарная лн

выделенная из независимо получении лизогеннов. -

1.2. Ауксотррфиые нутаппп. розппкаЯДДВ П£2 тсгидквДУДЯДП

такин образом, нами показано, что геном оага D3112 способен встраиваться в различные участки хромосомы P.aerueiiiosa при лизогенизаиии, однако при. этой не осуцествляя .инсервионныи мутагенез-1Крылов в.н., еогун в.г., лж. Еапиролэво): для оага ни Е.соц показано, что транспозиция его генома происходят различным способом при лизогенизаиии бактерии и ври литическон иикле Фага, не исключено, что специфичность интеграции d3u2 такие кокет изменяться в ходе развития, оказалось, что при тбрмозшдукщш лизогенов PA0i(D3ii2ct5i5), среди выживиих обнаруживаются ауксотрофные иутанты. так. частоты возникновения ауксотроФных

е

мутантов в разных опытах при термоиндукшш независимых лизогеноз составляют э-ш от числа выживпих бактерии., Анализ- питательных потребностей ауксотрофов показал- что ц условиях данного опыта отвираются нутанты. требУюиие для; роста тиамин ил.» -81/.. иетионин шео-Ш). иногда мутанты веь одновременно выделяют коричневый пигиент (мутация в гене «уш (в/.), пигментированных мутантов <ла не обнаружено. однако строгих доказательств инсерпионноп природы иутаторного эффекта Фага 03и2с1315 при вегетативном развитии после термоиндукции получено 'не было, поскольку не исключено влияние других причин, например, возможность делении участка бактериальной хромосомы за счет гоиологнчиои рекомбинации между двумя копиями геномов взиг.

и. псслеповангся пропессоя реплпкапип и шиз з внявлеаиа генов а саптоз. конггоямр 1.3.1. выявление генов, контролирующие тга!

ДНК Фага 03112.

Ранез были картированы ранние гены Фага йзиг А, в и с (яненко А.С., богуя в.г. и др.,1983). с использованием условно-детальных «5) путантоз мы изучили влияние этих генов на развитие Фага 1)3112. Анализировали пробы, полученные до и после териоиндукшш лйзогенов с соотйетствуюиими мутантными профагами. Разделенно Фаговой и * плазмиднои днк проводили с помощью электрофореза (рис.2).

рис.г.завясиность процессов реплнкапии-. 1.*7» « в в г в транспозиции и созревания днк озна от нутапий в ранних генах, электрофоретическое разделение и последуюшая гибридизация с 32Р-иеченнои днк озп2 хромосомной и Фаговой днк,

ПОЛУЧеННЫХ ИЗ ЛИЗОГЭНОВ РА01<П3112(Г<515<517) «517 нутация В гэне А). РА01т3112«5154571) «571 мутация в гене в),

РА01Ш3112С4515Ш04) (45104 мутация в гене г С),. РА01(03ИгС<5154525) (¿523 иутапия в ; поздкзн гзнег «а;: дор. 1,2; 3,4: 5,6; 7,8 соответстазнно.

—з

а

в случае нутаиии в генах А и в пор, с ] по 4) репликаиия: транспозиция Фага сзиг не наблюдалась. Если яе нутация была .£ гене с (дор.5 и 6), то репликация-транспозиция осуаествлялас! нормально, однако не происходило созревание " Фаговой дм (вырезание ее при упаковке из хромосомы).

Таким образон ранние гены айв необходимы для репликации транспозиции днк Фага Б3112, а раннии ген , с необходим для созревания Фаговой днк.

1.3.2. отсутствие пей гшкашдукдии проФага.

ИЗ SfQHPCPHH ИСХОДНОЙ КОПИИ &Ш E311Í

чтобы определить, вырезается' ли генон проФага озиг и:

хромосомы после индукции до начала репликации, как в случае Фага

\ (исходная копия лнк Фага не должна быть связана с хромосонои

или исходный геном D3H2 остается в интегрированном состоянии вс

время репликации мы провели следующий эксперимент, фрагнента

рестрицированнои эндонуклеазои ecorj хромосомной днк, полученной

из лизогенных бактерии PA0iD3H2rtsi5) до начала термоиндукции к

после 13, зо и 45 мин после индукции проФага разделяли с помощью

электрофореза и гибридизовали с 32Р меченной днк D3112. нами былс

показано (рис.3), что в пробах, отобранных после терноиндукции

электрофоретическая подвижность левого ' концевого фрагмента

Фагового генома остается такой же как была до начала

терноиндукпии. следовательно, вырезание:исходной копии генона

D3U2 ■ до начала его репликации не происходит, так ш

молекулярный размер концевого фрагмента вырезанной Фаговой днк

отличен от его молекулярного тазнера во встроенном в xpomocomv

состоянии. ......... ' . -

__рис.3. отсутствие вырезания из xpohocohi

исходной копии ДНК D3112 при терноиндукпи: проФага. препараты суммарной лнк. полученны до и после терноиндукции лизоген, PAO(D3ii2cf5i3). были рестрипирован)

эндонуклеазои ecoei и после разделения : агарозном гелё гибридизованы. с32Р-меченно: днк D3112. 1- рестрицированная днк зрелог Фага D3U2; 2.3.4 и 5 рестрипированна; суммарная днк. полученная из лизогенны бактерии после о\ 15*. зо1 и 45* поел iтерноиндукции. 4 - iO~

- —■ — —

— — — — sss

— — — —

— — _ as

1^3, Сопряженность процессов 23112^.

ц ХЕанспозишш х 4зха

нашей целью было выяснить являются ли процессы репликации и транспозиции генона Фага 03112 сопряженными или нет. лля этого ми тровели гибридизацию 'с неченнои днк 03И2 рестрицированнои •.уинарнои днк, полученной из лизогенов РА0Шзи2с1515) и ?А0ШЗИ2с4515(5Ю4). несуаего мутацию в гене с, блокирующую :озревание Фаговой днк (см. выие). из результатов опыта, тредставленного на ?ис.4, видно, что созревание лнк Бзиг в шзогене раошзи2С1515) начинается уже на 15 мин. после начала ¡•ерноиндукиии (наблюдается появление зрелой Фаговой дню. поэтому ш анализировали результаты, полученные в случае лизогена по Фаг/ 33112, нутантнону по гену с. оказалось, что после термоиндукции 1Р0ИСЮДИТ увеличение количества внутренних фрагментов Фагового 'енона, в то яе время отсутствуют фрагменты, обладающие шектроФоретическоя подвижностью соответствующей подвижности сонцевых фрагментов зрелой Фаговой днк. эти данные :видетельствуют о тон. что процессы репликации и транспозиции 'енома 1)3112 сопряжены.

13 3 4

рис.4. Сопряженность процессов репликации и транспозиции у Фага 03112. препараты суммарной ДНК. полученные до и после терноиндукции лизогена РА0шзи2сг515) и лизогена РА0ШЗП2С£5Ш2Ю4>, били

рестр'ицированы эняонуклеазои ЕсоЕП и после разделения в агарознон геле гибридизованы с32р-Неченнои лнк эзиг.

1,2 рестрииированная лнк из ттанна РАО(ОЗП2с4515); 3,4 - из. штамма РА0(133112с451545104) - соответственно О' и 30' после термоиндукции.

и

LЗЛ* Репликапия-транспозипия ai В2112 ШШ<ЖНа ЕЭДЫМ ПЕС сохранении интактаого девасо канда есд каша

Известно, что обязательней условием транспозиции большинства транспозонов и Фага Mu E.cou является наличие интактных концов • места леиствия транспозаз.

для того, чтобы установить необходимы ли для транспозиции d3112 att-саиты, мы использовали итами с плазмидои pdtib. v этой гибридной плазмиды EP4»D3ll2 делетирован левый конец генома от с до 1,3 тпн (т.е. удалены аиь-саит и ген с. контролирующий синте: репрессора, но сохранен полноценный ген а, который способен выражаться [яненко a.c., богуш в.г. и др.,1983)). в эксперинентг был использован штамм PAOUD3U2ci5i5; pdtjö). чтобь термоиндукииеи Фага d3u2ci5i5 создать условия ¡дополнительно« количество продукта гена а) для транспозиции генома, входяпего i состав гибриднои плазмиды pdt18). мы показали (рис.Э), что дш р3112 с указанной делеииеи не способна осуществлять репликацию транспозицию. в то se время, в ' штамме PAOUD3U2ctsl5 P;P4»d3h2), содержащем на плазмиде ЕР4 геном Фага d3í12 дикогс типа при тегмоиндукции внутрихромосомального геномг осужествляется эффективная репликация-транспозиция генома сзи; встроенного в НР4, приводящая к интеграции RP4 в xpohocomi бактерии, таким образом, присутствие интактного левого конце обязательно для транспозиции. . опыты: по выявлению роли правой att-саита гейма взиг не были поставлены, так как нам не удалоа выявить соответствуютие плазмиды с делециеи правого конш птоФЗга. .

Рис.5, рёпликапия-транспозиция генона D311; возможна только при сохранении ннтактногч левого конца, визуализация плазниды ЕР4 и ei гибридных производных - в бактерия: p.aeruemosa по нетоду экхардта и днк-дш гибридизация, перенесенной на НЯФ ДНК, < з2Р-неченнон лнк НР4.

1 - PAO(D3112C-tSI3; PDT18), 2 PA0(D3it2Cí5l5; EP4"D3U2) до термоиндукиии 3.4 - те же атамны после термоиндукиии.

i г о 4

- - - -

¡3S3 ввв

3=3

3JL доказательство гесл-незавнсиностп еёшшедяш^

ганспозитш шиша taxa ваш а вздг : завпсиная транспозиция

£1 в ХРОНОСОНУ Ш бактерий рлогооз.

транспозиция всех ранее охарактеризованных транспозонов. ключая Фаг ми. не зависит от гес-системы бактерии, мы изучали ависиность репликация-транспозиция генома Фага сзнг от гена •есл клетки хозяина, репликация-транспозиция генома Фага »3H2CÍ5J5 с высокой эффективностью осудествляется в гесл актегиях p.aeruemosa в штамне PA02003iD3ii2cí5i5). кроме того юказана Ю112-зависимая транспозиция генов плазмилы RP4 в ;ромосому гесл итамма бактерии p.aeruginosa. эти данные указывают ta образование структуры коинтеграта гибриднои плазмилы и ;роносомы вследствие транспозоннои активности фага D3H2.

!. пзученид экспрессии .ОТ D3112 S системе клеток гетерологичного

loaamia elcqjjl

m.c&flggímocih ешшшшш $1 наш в бактериях е.соп-;збисяиосхь репликаяип этого $ага ад температуря инкгоадии и мазиийн ES/L

Ранее была обнаружена специфическая особенность в экспрессии -енома D3U2 в клетках гетерологичного. хозяина £.соа исрияов з.н.. Плотникова т.г. и др..1982), Бактерии ■ e.cou(BP4::D3112) зроявляют Фенотип tcs: они образуют колонии на твердой 1итательнои среде.' а также растут й делятся в жидкои среде при *2°с, но не при 30°с. после переноса, растуиеи при 420с культуры слеток e.couirp4::d3»2) на зо°с клетки продолжают расти, но не зелятся. образуя филаменты [Плотникова т.е.. кулаков л.а. и 1p..1982J. Бактерии E.coU(RP4::D3ll2> не образуют живого Фага частиц при 42°с. несмотря, на отсутствие функционально активного шагового репрессора. при зо°С Наблюдается выход небольшого количества живого Фага D3H2 (от кг* до-- Ю'2) Фаговых частиц на клетку.

нани было показано, что для эффективной репликации гекон D3112 в бактериях e.coli необходимы те ' же' условия Чзо°с присутствие плазниды ЕР4), что и для проявления фенотипа тс: вместе с тен плазмида ЕР4 не оказывает влияния на уровен Фагопродукиии D3H2 в бактериях E.coii.

кроме того мы показали, что количество копии генома D3u; интегрирующих в хромосому бактерия e.cou при зо°с и присутствии плазниды ВР4 столь же велико, как и при репликапи его в ходе литического развития в гоиологичнон хозяине иотя гонологичном хозяине для достижения этого уровня репликапи достаточно зо мин. а в бактериях E.cou - 5 часов).

2.2. изучение заваснности Фенотипа бактерий elcqu, садегжаш! сепоя ¡23112. ох эффективности экспрессии Фага. г.2.1. выявление ееяндв утгаты зенотниа íes кдеткан; е.сршвр4::р3112}.

при рассеве бактерии E.cou(RP4::D3ll2). проявляющих феноти Tes, при зо°с на агаризованноя среде с частотой 10"4-I0"5 о1 числа посёяных вырастают колонии. . кы рассматриваем бактерш образующие эти колонии, как утратившие Фенотип tcs. для выявлени: причин, приводящих к возникновению клонов, утративших Феноти: Tes,- мы изучали независимо отобранные при зц°с клоны, получении из итаммов E.cou C600(RP4::D3112) и HB10URP4::D3U2 Большинство клонов утратили, гибридную плазмиду, кроме того mi обнаружили такие типы генетических, изменении, приводящих к утрат фенотипа tcs: '

1. Утрата Фагового генона.из состава гибридной плазниды 1рис.(

дор.8). . 1

2. инактивация существенных генов Фага D3U2 (рис.б, пор.З).

3. мутация в геноне Фага D3H2. влияющая на выражение ранни: функций фага D3U2 и блокирующая его репликацию-транспозицию : бактериях e.cou, но не в P.aerusinosa (рис.б, дор.4).

4. нутации в ранних генах Фага D3112. понижающие эФФективност его репликации-транспозиции как в системе гомологичного хозяине так и в бактериях E.cou. (рис.6, дор.б.Т).

>. интеграция фаговой и плазнианои днк в состав хромосомы е.сош три этом утрачивается автономно реплицируюшаяся гибридная 1лаэнида iphc.6, дор.1.2). возножно, что в последнем случае генотип tcs утрачивается из-за уменьшения числа копии генома Фага 53И2 в бактериальной клетке, такие клоны обозначены нани Tel.

£ в 4 в в 780 10 11

а

■ Рис.6. определение

" реплнкапЕИ-транспозншш дне Фага рзиг после инкуоааин при зо°с в различных клонах бактерии Е.сои, полученных в результате отбора

бактерии, выяивпнх при зо°с, из клона-1сз. визуализация плазмиды НР4; ■ хр-.:оаи2'.:йР4 или гисриднои плазниды НР4"03И2 в бактериях £.сои . и . последующая

► xp::D3112::RP4

»03112::RP4 — RP4

гибридизация с ¿2Р-неченныни днк D3U2 - (рис.а» и НР4 - <рис.б). 1.2 - £.С0ШСЬГ"2Р4"03И2Ь КЛОНЫ-tCl Нб,Н2; 3.4 S.COUIHP4-D3U2). клоны-tcr; 5,8 - E.C0IUSP4). делепии геномов D3U2 из состава гибридных.' плазнил; .6.7 - s.coii(EP4::D3112), нуташш в геноме Фага d3h2. пониженный • уровень репликации-транспозиции: 9 - s.coli; ю e.coikrp4); и

3.C0li(üP4::D3112). йЯОН-tCS.

Ö3112 3 составе

бактерия E.CQ1L

сеш <геноиы) $1 исданн ICH.

клоны Tel имеют следуюане свойства:*-. 1) способны образовывать колонии на твердой питательной среде как при 42°с. так и при зо°с с одинаковой эффективностью 1табл.1>. однако колонии клонов 'rci выращенные при зо°с мельче, чей при 42°с и после 1-2 дней после дальнейшей инкУбапии их при комнатной температуре становятся прозрачныни.

2) Продуцируют' Фаг D3U2," неотличимый от Фага дикого типа; i уровеню Фагопродукпии клоны Tel соответствуют 'клонан Tes.

3) отсутствует гибридная плазнида в автономном состоянии и>ис дорожки 1, 2).

4) наследуют различные участки плазмиды rp4. встроенные хроносому. по этому признаку выделенные клоны ножно разделить! три типа:

содержащие все проверяемые плазмидные маркеры арг. кшг. prd* (и hit), несущие мутацию (иутациш в генах, ответственных : чувствительность к prd (N33) и сохранившие только г« устойчивости к канамицину (N33. N6, N29) (исходная bctpohî генома D3U2 в плазмиду rp4 инактивировала ген. определяюсь устойчивость к тетрациклину).

5) способны образовывать сектора, вторичного роста при длительнс (5-т дней) инкубации дактерии при 30°С. „

2jl3. образование структуры коинтеггата гисгидной цааашш kp4-d3h3 и хроиосоиы £l££ii> а хакжв делеццд s состав встроенной t gairrергашгга spohqcpsiy длазнадн m.

число копив 03112 и структуры, образуемые е результат встройки гибридной плазмиды в хромосону бактерии, определяли помощью рестрикции хромосомной днк эндонуклеазами ecof EcoRi»pstl и гибридизацией рестриктов днк с меченными днк RP4 фрагментами' днк d3112. содержавшим левый <att L) и правый (att сайты, поскольку именно последние .ковалентно связываются с дн нишенью в ходе транспозиции (Ахвердян в.з., РеУлец h.a. др.лзбе). было показано, что, в клонах n2. nit и n35 ооразуютс коинтеграт гиоридной плазмиды и бактериальной хромосомы iphc а), поскольку в данной работе мы использовали бактерии штан> hbioi гесл, то разреиение данного коинтеграта не мог; происходить за счет рекомбинации по днк-лнк гомологии, в соста! хромосомы таких клонов находится два генома d3112 в одкнаковс ориентации (рис.7. дорЛ), а тйкже весь геном плазмиды RP4, о че свидетельствует наличие всех возможных фрагментов плазмиды_ пос: рестрикции ее эндонуклеазами ecori и Pstl (рис.7, дорл).

(te о e-a e-e

f S 0 4 9 9 1 О В 10 II 11 13 14

(• RD(R)

RP4 — SB

Ш ea =3

14.« RtXl) (CS)

И.5 KOILI fOl__ иг» im

8 BDtU |g) ~ ЯШ es» 33 =9 SS

SSE SS —я

« •

Рнс.7. лолеяулярпоо картагсзакио всггрсешшг и -хроносону гепонов Фага D3112 я азазнзли НР4. выделяли хроносонную лнк из клонов-tci. рестрицирозалп Ферментами ecori я psti и после электрофоретлческого разделения полученных рестриктов проводили лнк-лнк гибридизацию с згР-неченн.ыии днк нр4 дор. i, 4. 7, 10, 13. "а левин п правый гсонпевыни фрагментами D3Í12, обозначенными EDIL) лор. 2. 3- 3. И. 44, И ЯД(Й) пор. 3. Ö, S, 12

соответственно. ' •

S.2 - иолончс! Я2: 3.4.5 - клон-tcl N29; 6.7,8 - клон-tci ые; з.ю.и - клон-tci N8-3; 12,13.14 - клои-tci iíg-s.

fX гз за

u.

i ssîi %

-îf-Чзт^"

, ЫииаЛй «h

Рис.8. генетические перестройки, вызванные Фагои трагспозоио -. D3tl2 p.aerueinosa s хроиосона E.cwi.

а - схема коинтеграта гибридной плазмилы p.p4~D3it2 и хромосомы E.coli; б,в - образование делеции é клонах-tci Кб. ыаз к не.

обозначения:--геном rp-s: еа'-днк Фага сзнз! ■

"ьл^.. хромосомная лнк; 4" - сайт рестрикция есоп

эндонуклеазоя; ^ - сайт рестрикции Psti эндонуклеазои.

"г:::"!0 этого нами были обнаружены бактериальные клоны шб и -429). несуиие делении в составе встроенной в бактериальную хроносому плазмиды ЛР4. во всех случаях делении начинаются на левом конце генона 03112 и удаляют различные участки прилежашея к нему плазмидноя днк (рис.з, б.в.)

Образование делеиии. вызванное активностью фага-транспозона озиг. было описано и ранее как в системе гомологичного хозяина, так и в бактериях Е.соц и р.рииаа. возможным объяснением этого процесса является образование абортивных конечных продуктов транспозиции, так. транспозаза. правильно связавнись с сайтом на левом конце Фагового генома может ошибочно узнавать люоой другой сайт, находящийся либо в геноме плазмиды, либо в геноме Фага. .

г.гл. влияния копипностп шшда затд сзш на рост оактеряд В.С0Ц(СЬГг:ВР4';Р3112>" 0£Л

с целью выяснения влияния копииности гене на озиз на рост бактерии е.с011 при 30°с мы изучали клоны тс1 n2, n17, n35. n6, n29 и n33, а также клоны, полученные (как .описано в разделе материалы и нетодш в результате ' отбора секторов вторичного роста, клоки иг. Ш7, n35. n6 и n29 содержат в составе хромосомы две копии генома э3112 {рис.8,а.сл а клон n33 - одну копию генома Фага (рис.э.) *. * '." '

яы проанализировали по 20 клонов, полученных из секторов вторичного роста каждого аз этих клонов, оказалось, что в тех случаях, когда з составе хромосомы исходно было две копии генома Фага Ш2. N17. Н35. не.и' N29). образовывались клоны двух типов, одни сохраняли уровень Фагопродукции на тон зга уровне, что и в исходных клонах, а другие утрачивали способность продуцировать янвои Фаг. Клоны, полученные из секторов вторичного роста бактерии, содержащих только один геном озиг (N33). всегда утрачивали способность продуцировать Фаг. в тон случае, когда ны проводили следуюдия отбор секторов вторичного роста из тех вариантов, где в результате первого отбара сохранилась способность продуцировать Фаг и ■осталась в составе хромосомы только одна :сспия генона Фага (N6-3, нб-8. рис,7. дор.э.и и 12.14). все отобранные клоны утрачивали способность продуцировать Фаг, как и в случае клона мзз.

эти данные позволяют заключить, что постадийная утрата копип Фагового генона из состава бактериальной хромосомы приводит к улучшению роста бактерии при зо°с (таблЛ).

хотя в настояиее вреня неизвестно, результатов каких процессов является удаление из состава хромосомы геномов Фага сзиг, однако можно полагать, что это является следствием экспрессии каких-то генов Фага-транспозона.

КЛОНа Е.сои. содеркаыего в составл ХРОДОСОНЦ неартипиый сшан Фага ЩЩ,

как было описано выше бактерии клона нзз содержат в состава бактериальной хромосомы один генои 03112'н участок плазмшш р.р-5. включаюшии ген. контролируюшш Устойчивость к кананнаину. кы отеирали сектора вторичного роста из этого клона и анализировали полученные вариант«. оказалось, что часть из них сохрониди иаркер устойчиво« какакищщу. а часть - Утратили его. в то ке время все они, как было указано ранее, утратили способность продуцировать Фаг. • ни. взяли из них для. анализа . аза. клона, обозначенных пзз-5 к кзз-8 <рис.9. дор. &з>. в случаи клона изз-5 из состава хромосомы* .полностью утрачены «-аговнв-ч-Плазнидныа гены и>ис.9. дор.2). В случаа клона нзз-о произошла инактивапия генома Фага 03112 (тс.9, дор.з>; однако днк этого Фага, а такке участок генона плазмшш КР4. овУс^аБянваюа'кг: устойчивость к канамицину. рохранены в состава 'бактериально«

хромосомы.

1 г 9

си

рис.9. внактЕваивя генона- Фага ознг. встроенного в гроносоиу е.сси. е процессе отбора секторов вторичного роста из Елона-чс1. • рестрикция хромосомной днк есое! рестриктазои и гибридизация с 32р-иечэнными левым (а> я правый 16) Е.соР.1 фрагментами днк . 03112.

1 - ызз: в - кзз-5; з - нзз-б.

таелииа 1. влияния изменения темпера тури на эффективность роста (гпбояи) клонов £.сои. содерзапих геном Фага-транспозона рзиа р. аегаатоза.

обозначение клопов выяиваеность клеток

зо°с. 1 20 час. ) зо°С. зчас.вид.ср. и даяев 42°с. тв. ср.

С800ШР4::П3112) нсз) !Ш101ШР4::ПЗИ2) нзс) 1.4-103 0.7 10"' 8>10"2 4-Ю"2

НВ101(Е)ЗИ2> ПЗЗ НВ101Ш3112) ИЗ {1С1) 2-10"» 7<410"* 1.410-1 ,8 •! 0 *'

НВ10«ОЗН2) Йб-З -<1С1) 1 4

110101(03112) 8Н-3-1 1 1 3

ПВ101 (2.сои:ппкпй тап) 1 •1 4

2й

мы считаем, что передача гибридных плазмид и генетические изменения аналогичные наблюдаемым нами в лабораторных условиях могут происходить 'и в природе, наследование инактивированногс генона озиа Р.аегидшоза в составе хромосомы Е.соц являете* Фактом межвидового обмена генетической информацией, накопление такого рода Фактов является предпосылкой для изучения проблема "мол наших" хромосомальных генов.

ШШйШ.

1. доказана множественность сайтов интеграции генома Фага озпг е хромосому бактерии Р.аегиешоза как в процессе лизогенизацки, так и при литическои развитии Фага.

г. показано, что аи-саиты Фага 1)3112 совпадают с концами егс

генона,

3. доказана сопряженность и гесд независимость^ процессов репликации и транспозиции ДНК Фага ОЗИ2.

4. показано, что ранние гены Фага 03112' л и в необходима для репликации-транспозиции его днк. а ген с необходим для созревания фаговой днк. .

5. изучена репликация-транспозиция генона Фага озиг в Е.соц показано, что эффективная репликация-транспозиция днк 03И2 в этих бактериях осуществляется только при 30°С и в присутствии плазншш КР4. -

6. показано, образование структуры коинтеграта гибриднои плазмиды НР4::С3112 и бактериальной хромосомы при транспозиции ДНК 03112 в бактериях. Е.соц,; а такие образование делепип. плазиилы ЕР4< входяиеи в состав коинтеграта.

7. показано повышение устойчивости к тенпературе 30°с бактерии Е.соц, солеркажих геном Фага; озиг. при- уменьшении числа копия генома Фага на бактериальную клетку.

8. получен клон е.сои, несущий в составе бактериальной хроносоии полный, но неактивный генон БЗИ2, и способный расти такие как и бактерии дикого типа без утраты этого генома.

2E2HS3b РД60Т. ö -KQ20EH5 отрдиено СОДеР^гШКЙ 2Ш££2Е1ШХШ1.

Плотникова Т.Г., Ахвердян в.з., Реулец h.a., Горбунова С.А., рилов в.н. множественность сайтов • интеграции ми-подобных истериоФагов в хромосому и плазмиды Pseudomonas aeruginosa, знетика, 1983. т.19. N10. с. 1804.

Ахвердян В.э., реулец и.А.. Плотникова т.г.. Крылов в.н. >Фективная. зависимая от плазмиды RP4 репликация-транспозиция нк Фага-транспозона D3U2 Pseudomonas aeruginosa в гтерологичноц системе Escherichia coli, генетика. 1986. т.гг, з. с.2048. .

Ахвердян в.з.. Реулец H.A., яненко A.c., Крылов в.н. >пряяенность и гес-независимость процессов репликации и ?анспозиции фага пзиа Pseudomonas aeruginosa, влияние Фаговых шов. контролируоаих репликацию длк D3U2. генетика, 1986, т.22, 5. С.929.

Тренина h.a., Ахвердян в.з.,' колибаба л.г.. Крылов в.н. :обенности выражения генона Фага-транспозона D3H2 p.aer.ugmosa бактериях E.coll: зависимость Фенотипа бактерии от числа копии шона 03U2. генетика. 1991, t.2"?N8.

ПИК НПО «Медбиоэкономика». Заказ 3039. Тираж 100.