Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональный анализ умеренных фагов в гомологичных и гетерологичных системах хозяев (на моделях эрвиний и бацилл)

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональный анализ умеренных фагов в гомологичных и гетерологичных системах хозяев (на моделях эрвиний и бацилл)"

Я1у

АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК СССР

НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЭПИДЕМИОЛОГИИ ИМЕНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н. Ф. ГАМАЛЕИ

На правах рукописи ДАНИЛЕЙЧЕНКО Валерий Васильевич

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ АНАЛИЗ УМЕРЕННЫХ ФАГОВ В ГОМОЛОГИЧНЫХ И ГЕТЕРОЛОГИЧНЫХ СИСТЕМАХ ХОЗЯЕВ (НА МОДЕЛЯХ ЭРВИНИЙ И БАЦИЛЛ)

03.00.07 — микробиология

АВТОРЕФЕРАТ ДИССЕРТАЦИИ

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

МОСКВА— 1991

Работа выполнена во Львовском ордена Дружбы народов государственном медицинском институте.

Официальные оппоненты: доктор меднцннскнх наук, профессор В. Г. Лиходед доктор биологических наук, профессор А. А. Прозоров доктор медицинских наук, профессор Ю. К. Фомичев Ведущая организация -^Ленинградский медицинский институт им. И. П. Павлова. /?,/ ¿)

Защита состоится «/."х».....т. /..... 199|?Сг. в.......часов

на заседании Специализированного совета Д 001.07.01 в Научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалеи АМН СССР по адресу: 123098, Москва, ул. Гамалеи, 18.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ им. Г - "--------

Ученый секретарь Специализированного совета доктор медицинских наук

Е. И. КОПТЕЛОВА

Актуальность проблемы. Полилизогенность — состояние множественного носительства клеткой умеренных фагов — явление еще крайне малоизученное в бактериофагии. Тем не менее оно представляется исключительно интересным и важным в научно-теоретическом плане н, безусловно, имеет существенное практическое значение в определении внешних феноптических свойств как отдельной бактериальной клетки, так и популяции бактерий — штамма в целом. Тезис теоретической значимости носительства умеренных фагов убедительно продемонстрирован на хорошо изученных мо-нолизогенных системах энтеробактернй, содержащих профаги К, Ми, Р22, Р1 и др., для которых показан весь широкий диапазон тех преобразований свойств клетки, которые может вносить в природную генетическую информацию бактерии геном умеренного фага. В широком охвате это звенья единой цепи, имеющие различные проявления: от спонтанной индукции профага, ведущей к лизису отдельной клетки, но к фагоустойчнвости по иммунитету популяции в целом, до трансдукции и транспозиции хромосомных генов как формы генетического обмена в пределах вида и в более широких межвидового обмена рамках. Изучение взаимодействия фагового н бактериального геномов содействовало пониманию рекомбина-цнонных механизмов, определяющих конечный результат феноти-пического выражения свойств отдельной клетки, и возможные преобразования свойств их популяций. Но, если даже на основе моно-лизогении может строиться такое многообразие схематических форм взаимоотношений геномов, то, естественно, в полилизогенных бактериальных системах они многозначно усложняются и конечный результат становится еще более трудно прогнозируемым. Очевидно, он должен строиться на основе исчерпывающего определения количественной специфики полилизогенизирующих фагов, качественной индивидуальной характеристики каждого из них, и, наконец, максимально возможной оценки их интегральной функции во всем многообразии между собой и с геномом клетки в целом.

Все сказанное выше определяет в общих чертах теоретическую значимость проблемы полилнзогешш, но за этим скрывается еще емкое практическое содержание явления. Здесь представляется целесообразным остановиться лишь на двух практических аспектах проблемы. Первый — это фаговая конверсия, определяемая геномом (и) умеренных фагов, начиная от детерминирования профага-мн токсинообразовання, как у возбудителя ботулизма, и охватывая специфику антигенной структуры, как у сальмонелл. Едва ли есть необходимость обосновывать практическую значимость этих и других проявлений фаговой конверсии, но совершенно очевидна зависимость выражения этих свойств на таком сложном генетическом фоне как полилизогения.

Второй актуальный практический аспект — это излечивание по-лилизогенной системы от профагов. Его приложимость особенно остра для бактериальных продуцентов биологически активных веществ, культивирование которых в производственных условиях чревато потенциальной возможностью спонтанного фаголизиса. Практическая реализация этой задачи на основе применения ин-

теркалирующих соединений и воздействий, апробированных на мо-нолнзогенных системах, едва ли окажется эффективным приемом для полилизогенных систем, ввиду очевидной необходимости многократных обработок продуцента,, в результате которых, вероятно, можно утратить саму продуцирующую способность бактерий. Можно предположить, что транспозонный мутагенез, инактивнрующнй функциональную активность профагов, явится более приемлемым способом разрешения проблемы.

Объектом исследования настоящей работы выбрана полилизо-гениая система Erwinia carotovora. Как условно патогенный возбудитель заболеваний человека он представляет интерес для медицинской микробиологии, обладает выраженными фнтопатогенными свойствами, а штамм 268 этого вида, в частности его селекционированный производный 268 R используется в микробиологическом производстве фермента L — аспарагиназы — лечебного антилейке-мнческого препарата. Сочетание этих свойств с иолилизогенностыо открывает возможность моделирования в разработке актуальных вопросов полилизогенни на практически значимом объекте.

Целью представляемой работы явилась разработка нового системного подхода к выявлению и пониманию взаимодействия и функциональной экспрессии бактериофагов в гомо-и гетерологичных бактериальных хозяевах.

В соответствии с этим при выполнении работы поставлены следующие задачи:

— идентификация умеренных фагов модельной полилизогеннон культуры Е. carotovora — продуцента L-аспарагиназы, а также выяснение межфаговых взаимоотношений в полилизогеннон системе с расширенным дифференцированным изучением биологических и физико-химических свойств резидентных фагов 59 и Е105 и их геномов. Использование фага-транспозона Ми для воспроизведения Ми — зависимого мутагенеза в полилизогенной системе эрвшшй с функциональной инактивацией ее резидентных профагов, как приема делизогенизации системы;

— изучить поведение фага-транспозона в прнродно-резистент-ных и генетически отдаленных от естественного хозяина видах бактерий-бацилл, а также изучить возможность наследования и переноса его среди разных видов бацилл в составе гибридного комплекса с плазмидой RP4.

Научная новизна и практическая значимость. Оригинальными результатами работы являются следующие:

— в полилизогенной системе Е. carotovora 268 идентифицированы 4 умеренных фага (59, 49, 69, Е105), которые характеризуются неравномерностью количественной продукции. Все фаги обладают способностью вызывать состояние конверсии клетки, выражающееся в утрате способности адсорбировать гомологичный фаг;

— установлены основные биологические параметры взаимодействия фагов с клетками индикаторных культур, выяснены процессы их репродукции и внутриклеточного морфогенеза, установлена кинетика их термоинактнвацин;

— впервые построены модели молекулярно-структурной организации белковых капсидов вирионов 59 и Е 105;

— впервые показано, что ДНК фага 59 представлена линейными пермутированными молекулами с м.м. 31 МД с концевой избыточностью и транспозоподобным элементом. ДНК фага Е 105 — линейная непермутированная молекула с м.м. 29 МД, содержащая канонические односпиральные нити;

— впервые построены физические линейная и кольцевая карты генома фага 59, а также линейная карта генома фага Е 105;

— получены трансконьюганты эрвиний в скрещивании с кишечной палочкой с частотой 1,5—5Х Ю-7, лизогенизированные Muets 62, которые обеспечивают полноценное развитие фага Mu;

— трансконьюганты эрвиний в условиях термоиндукцин сегрегируют плазмиду RP4::Mucts 62 и способны к транспозиции фага Mu, сопровождающейся ауксотрофными мутациями и инактивацией профага 59 и частичной и полной делецией профага Е 105. Использованный прием выступает в виде альтернативы общепринятым способам элиминации профагов;

— осуществлен коньюгативноподобный перенос плазмиды RP4:: Muets 62 в бациллы, транецнпненты которых как гетерологичные хозяева фага Mu не продуцируют полноценные фаговые частицы, но экспрессируют детерминируемые геномом фага функции. Транс-ципиенты бацилл менее жизнеспособны, претерпевают ускоренный аутолитический распад, характеризуются замедленной скоростью роста и размножения, нарушением клеточной стенкн;

— в условиях селективного давления возможен отбор стабильных трансципнентов, с протяженными делециями плазмиды RP4:: Muets 62 и показана возможность ее интеграции в хромосому бацилл;

— система клетка-вирус (эрвиния и ее фаги) использована для апробации новых препаратов группы имидазола. Установлены антивирусная и антибактериальная активность препаратов этой группы, а также иммуностимулирующее действие. С использованием препаратов этой группы предложены питательные среды для выращивания грамотрицательных бактерий и для изучения гемолитических свойств микроорганизмов.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

Полилизогения — сложная интегративная система взаимодействия составляющих ее профагов между собой и с генетическим аппаратом бактериальной клетки, с многообразными формами фе-нотипнческого выражения этого взаимодействия.

Полилизогенная система может продуцировать одновременно и близкородственные и существенно различающиеся фаги по биологическим свойствам, морфологии вирионов, полипептидному составу капсидов и физической структуре их ДНК.

При условии полноценной реализации в полилизогенной системе транспозирующейся способности гетерогенного фага транспозонный

мутагенез может служить эффективным путем функциональной н структурной делизогеиизации резидентных профагов.

Обоснована концепция шнрокодиапазонной активности гетерогенного фага — транспозона по кругу хозяев, включая генетически отдаленные от естественного хозяина виды при отсутствии в них репродукции фага.

Полилизогенная система явилась основой для апробации новых препаратов группы имидазола с антимикробной и иммуностимулирующей активностью.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на I и И Всесоюзных конференциях по вирусам микроорганизмов (Пущи-но, 1981 г., Ташкент, 1986 г.); на X и XII конференциях ГДР по электронной микроскопии (Лейпциг, 1981 г., 1988 г.); на Международном симпозиуме «Биофизика нуклеиновых кислот и нуклео-протеинов». (Таллцн, 1981 г.); на XII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии (Сумы, 1982 г.); на VI и VII съездах Украинского микробиологического общества (Донецк, 1984 г., Черновцы, 1989 г.); на II Всесоюзном совещании «Современные вопросы биотехнологии» (Днепропетровск, 1989 г.); на Международном симпозиуме «Молекулярная организация биологических структур» (Москва, 1989 г.); на Всесоюзных конференциях «Фитонциды. Бактериальные болезни растений» (Ужгород 1985 г., Львов, 1990 г.); , на конференциях Львовского медицинского института и Львовского института эпидемиологии и гигиены (Львов, 1990 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 32 работы, получено 2 авторских свидетельства, 3 положительных решения Государственной научно-технической экспертизы на авторскую заявку.

Структура и объем диссертации. Диссертация включает введение и главу обзора литературы. 6 глав содержат результаты собственных исследований. Последняя глава посвящена общему заключению. В отдельной главе представлено описание использованных методов. Диссертацию заключают выводы п список цитируемой литературы. Работа изложена на 265 страницах машинописного текста н иллюстрирована 71 рисунком и 19 таблицами. Список литературы содержит 390 наименований.

Экспериментальные результаты, представленные в диссертации, получены как лично диссертантом, так и в соавторстве с сотрудниками института микробиологии и вирусологии АН УССР, а также сотрудниками кафедры микробиологии Львовского медицинского института, работавших под руководством диссертанта.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор посвящен знакомству с двумя вопросами. Во-первых, рассматриваются особенности лизогешш микроорганизмов. Отмечается четкая связь между нммуностью к суперинфек-цни и репрессией ранних генов профага у всех изученных лизоген-нух систем, а также приведены имеющиеся в литературе данные по характеристике фагов эрвиний.

Во-вторых, рассматривается группа умеренных бактериофагов, отличающихся от других способностью к транспозиции своего генома — фаги-транспозоны. Эти фаги представляют интерес с позиций возможности их эффективного воздействия на генетический аппарат клетки-хозяина и изменения ее свойства как в ограничении, так и в пополнении генетической информации клетки-хозяина. Поэтому в литературном обзоре излагаются наряду с основными положениями по биологии фагов-транспозонов, ФТ-опосредованные геномные перестройки как основа генетической инженерии in vivo.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культуры бактерий, фаги и плазмиды. Исходные культуры эрви-ний и бацилл, а также фаги и плазмиды были получены из музеев \ института микробиологии и вирусологии АН УССР и института эпидемиологии и микробиологии им. Н. Ф. Гамалея АМН СССР. Штаммы В. mesentericus, В. polymyxa получены от А. А. Прозорова, штаммы Е. coli GA 120 получены от Г. И. Алешкина.

Циклы одиночного размножения бактериофагов, вычисление констант скорости нейтрализации антисывороткой, а также определении констант адсорбции определяли стандартными методами (Адаме, 1961).

Электронномикроскопическое исследование очищенных суспензий фагов проводили по методу Киселева (1965). Изучение морфологии бацилл проводили на клетках, фиксированных по методике Гайер (1974). Препараты ДНК фагов для электронной микроскопии готовили согласно Davis, Davidson (1968). Изучение частичной денатурации ДНК по Inman (1967). Препараты гомодуплексной ДНК получали согласно Туе et al. (1974). Наличие когезивных концов определяли по Jamagichi (1972). Выделение ДНК фагов эрвиннй проводили модифицированным фенольно-детергентным методом, ДНК фага Ми по методике Bukhari et al. (1977). Плавучую плотность ДНК определяли согласно Менделю (1970). Константу седиментации определяли методом зональной седиментации по Studier (1965). Плазмидную ДНК из бактерий семейства Entero-bacteria-сеа выделяли по модифицированному методу Birnboim et al. (1979).

Рестрикцнонный анализ фаговых и плазмидных ДНК, их физическое картирование осуществляли как описано в руководстве по генной инженерии (Маниатнс с соавт., 1984). При выделении отдельных фрагментов ДНК был разработан специальный метод, позволивший получать их без дополнительной очистки для дальнейшего анализа. Трансконьюгаты эрвиний получали на мембранных фильтрах, смешивая и фильтруя равные объемы донорской и реци-пиентной культур. Инфицирование рецнпиентных штаммов бацилл фагом Ми в составе плазмиды RP4::Mucts 62 осуществляли путем совместного их культивирования в течение 72 часов.

Характеристика полилизогении Е. carotovora 268

Изучение культуры.Е. carotovora 268 (продуцента L-аспараги-назы) показало, что при определенных условиях имеет место эндогенный лизис клеток этой культуры (Кишко, 1980; Кишко с соавт., 1981), сопровождающийся выходом свободных бактериофагов и бактериоцинов. Умеренные бактериофаги были получены методом лизогенной индукции (Вочек, Ryan, 1973). В качестве индикаторных культур служили Е. hortícola 450, Е. hortícola 60, Е. hortícola 43-1. Характер негативных колоний, образующихся на индикаторах, указывал на наличие в культуре нескольких типов фагов. Проведенные исследования позволяют заключить: имеет место иоснтельство четырех умеренных фагов, чистые линии которых были обозначены как 49, 59, 69, El05. Установлено, что ни один из фагов не способен к адсорбции на родительской культуре.

По количеству фаг 59 превышает все остальные и составляет 85 %, тогда как остальные представлены 5 %. Вирус-вирусные взаимоотношения исследовали с помощью искусственных лизогенов: Е. hortícola 450 (59), 450 (59, 49), 60 (59), 60 (59, Е105).

Показано, что фаги 49 и 69 инфицируют культуру, лнзогенизи-рованиую вирусом 59 так же эффективно, как и исходную; важно отметить, что эффективность лизогенизации Е. hortícola 450 фагами 49 и 69 не зависит от наличия в ее клетках профага 59. Фаг 69 не титруется на двойном лизогсне Е. hortícola 450 (59, 49), что четко свидетельствует о перекрывании иммунных областей фагов 49 и 69.

Исследовано проявление фаговой конверсии у искусственно лн-зогенизнрованпых индикаторов к способности адсорбировать гомологичные фагн. Полученный результат свидетельствует о том, что индикаторные культуры теряют свойство адсорбировать лизогени-зировавшие их фаги, в то время как эффективность адсорбции ге-тероиммунных фагов не изменяется.

Была изучена степень родства выделенных бактериофагов. Изучение морфологии показало, что фаг El05 полностью обособлен (морфотип Ci) от других фагов, тогда как фаги 49 н 69 аналогичны друг другу (морфотип В]) и отличаются от фага 59 строением ба-зальной пластинки (таблица 1).

Таблица 1

Физические характеристики умеренных фагов Е. carotovora 268

Фаги Константа седиментации 520 Диаметр головки, им Характеристика хвостового отростка

диаметр, им длина, им тип базисной пластинки

59 409 57,0 13,0 168 3 в, .

69 409 57,0 9,0 170 3 в,

49 409 57,0 9,0 170 3 В,

Е105 475 60,0 — 8,0 2 с,

Отличие фагов 49 и 69 состоит в морфологии негативных колонии. Характерный для фага 69 с1еаг-фенотип, можно объяснить только мутацией, приводящей к появлению подобного фенотипа,-

Сходные результаты получены и при изучении степени антигенного родства между фагами. Фаги 49 и 69 оказались антигенно идентичными, а также имеют незначительное родство с фагом-59, тогда как фаг Е105 антигенно обособлен.

Дальнейшее установление степени родства бактериофагов проведено с помощью рестрикционного анализа эндонуклеазами Eco H 1, Hind III и Cfr 61. Электрофореграммы переваров ДНК фагов 49 и 69 оказались практически идентичными для трех рестриктаз, т. к. характер рестрикции и значение молекулярных масс фрагментов совпадают для обоих фагов. Ряд фрагментов переваров ДНК фага 59 имели одинаковую подвижность с таковой для ДНК фагов 49 (69), а ДНК фага El05 гидролизовалась только рестрикта-зой Cfr 61.

Далее, используя иммуноморфологический анализ, показано, что антитела к фагу 59, связываются с поверхностью головок и хвостового отростка фага 49, то есть образуется комплекс антиген-антитело, как и в случае фаг 59 — гомологичная антисыворотка.. В то же время в случае фаг El05 — антисыворотка к фагу 59 этого комплекса не обнаружено. Эти результаты доказывают идентичность структурных белков фагов 59 и 49, что было подтверждено при электро-форетическом изучении белков фагов. Показано, что структурные белки капсндов обеих фагов совпадают как по относительному содержанию'в внрионах, так и по молекулярной массе, белкам фага El05 свойственен другой набор полипептидов.

Результаты блот-гибриднзации Cfr 61 фрагментов ДНК фагов 49, 59, El05 с 32р ДНК фагов 59 и 49 меченых методом ник-транс-ляцнн позволили установить определенную гемологию,ДНК фага 59 с суммарной мечешюстыо ДНК фага 49. Использовав отношение суммы молекулярных масс гомологичных фрагментов к молекуляр* ной массе ДНК этих фагов, мы установили, что ДНК фагов 49 и 59 имеют около 50 % гомологии, тогда как гомология для ДНК фагов 49 и Е105 составляет 3 %, а для ДНК фагов 59 и Е105 — 8 %.

Если в случае последовательностей ДНК, общих для фагов 49 и Е105 и 59 и El05, трудно представить их функциональную роль, то гомологичная последовательность в геномах фагов 49 и 59 может нести информацию о структурных белках головки и хвостового отростка, которые, как указано ранее, идентичны у обоих фагов.

И если предположить, что фаг 49 явился продуктом рекомбина-цнонного процесса, когда фаг 59 является одним из предков, то можно сделать заключение, что область, кодирущая структурные белки фага 59, является довольно консервативной. Что касается области генома, коднрущей белки базальной пластинки, то она достаточно мобильна и может вовлекаться в рекомбинации.

Исследование свойств умеренных фагов 59 и Е105 Е. carotovora 268

Изучение биологических свойств выделенных фагов показало, что фаг 59, как и фаг Е105, обладали лнтическим действием на

очень ограниченное число штаммов эрвиннй. Так, из 78 штаммов бактерии этого вида к фагу 59 были чувствительны только два — Е. hortícola 450 и Е. horticola 60, а к фагу Е105 из 56 испытанных штаммов чувствительными оказались лишь 5 штаммов — Е. horticola 60, 305, 65, 8560, 43-1.

В качестве индикаторных культур для фага 59 была взята Е. horticola 450, как обеспечивающая максимальное накопление вируса, а для фага Е105 — Е. horticola 60 и 43-1.

Репродукция фага 59 в одноцикловом развитии характеризуется латентным периодом в 70 мин. и выходом сравнительно большего количества фаговых частиц — около 200 на клетку. При репродукции фага Е105 на Е. horticola 43-1 латентный период составил 40—45 мин., а выход фага 100 внрионов на клетку.

Поскольку развитие фагов с икосаэдрической головкой и длинным несокращающимся отростком изучено достаточно подробно, мы сочли возможным не исследовать репродукцию фага 59, а более обстоятельно остановиться на ультраструктурных особенностях репродукции фага El05.

Никаких видимых изменений до 10-й мин. после заражения клетки фагом не отмечено, нуклеоид представлен в виде скоплений фибриллярного материала, Правда, в дальнейшем структурные изменения коснулись именно этого органоида — он оттесняется почти к цитоплазматической мембране. В области нуклеоида появились шарообразные скопления фибриллярно-волокнистых структур, которые приобретали очертания полукруга — овала — напоминая контуры будущих сирнонов. Эти конденсаты в дальнейшем были окружены гранулярным материалом в виде скоплении с четкими очертаниями. Через 27—28 мин. после инфицирования наблюдали образование структурированных частиц фагов. К 30 мни. инфекции в содержимом цитоплазмы обнаруживали полностью сформированные головки частиц фага диаметром 70—80 им, которые были локализованы как по периферии цитоплазмы, так и в области нуклеоида. Можно отметить, что этот этап морфопоэза соответствует во временном интервале ранее установленной длительности вегетативного периода ОЦР фага Е105.

Следует, однако, отметить,-что к этому времени обнаруживали в клетке вирпоны на разных стадиях морфогенеза, что, по-видимому, является следствием асинхронности биосинтеза и сборки вн-русоиндуцнрованных биологических макромолекул — ДНК и белка.

Заключительные стадии инфекции и морфогенеза фага El05 не были своеобразными; правда, отростки фаговых частиц в клетке были оринтнрованы в сторону цитоплазматической мембраны, в которой выявлены разрывы, распространявшиеся и на клеточную стенку. Затем следовал уже период лизиса бактериальных клеток чаще всего по типу «взрыва» — клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана разрывались, содержимое клетки вместе с фаговыми частицами как бы «вываливались» наружу, в культурную жидкость.

Было отмечено, что отдельные искусственные лизогенные клоны — Е. horticola 450 (59), Е. horticola 450 (59, 49), а также Е. hor-

ticola 60 (E105, 59) обладают постоянным иммунитетом к лизоге-ннзнровавшим их фагам.

Анализ причин отсутствия адсорбции фагов 59 и Е105 на «хозяйкой» культуре Е. carotovora 268, а также на искусственно лизо-геннзнрованных или индикаторах позволил прийти к выводу, что здесь имеет место фенотипическое изменение клеточной поверхности или лизогенная конверсия. Это подтверждено данными электронной микроскопии; если на поверхности Е. hortícola 450 адсорбируется множество вирионов, то на стенке клеток Е. hortícola 450 (59) не выявлено ни одной фаговой частицы.

При изучении термоинактивацни фагов было установлено следующее:

кривые инактивации фага 59 при 65 °С в среде АП, ТЕ и ТМ-буферах, отражающие выживаемость вируса в зависимости от времени температурного воздействия, выявили изгиб в области 20 мин.

Выделены два участка, один из которых отражает наличие фракции быстрой инактивации вируса до 20 мин., а другой — после 20 мин.— наличие более устойчивых к температуре частиц в суммарной популяции фага. Поэтому оба участка можно рассматривать как прямые, описываемые как реакции первого порядка (рисунок 1). Важно, что характер этих кривых не изменяется — он одинаков на АП-среде, ТЕ и ТМ-буферах в течение 5 циклов подращивания и инактивации фракции, содержащей бо- с

лее устойчивость частицы фага. Это может свидетельствовать о том, что „ устойчивость фага не связана с делецней в фаговом геноме. Были получены термодинамические параметры процесса инактивации. Цифровые их значения проанализированы в случае проведения аналогичных опытов с фагом Е105.

Здесь отметим, что разница в параметрах быстро- н медленноинактивн-рующейся фракции фага 59 значительна: так, энергия активации (Еа) для в\орон фракции выше в двЬ раза, чем для первой. Аналогичные соотношения характерны для энтальпии активации (ДН=^=), а также энтропии актива- Рис. Кр,)ВЫе термош,акГ11Ващш фага цни 65 °С в среде АП, ТЕ и ТМ-буферах.

о?

-10

• Исходя из этого,- энергию активации (Еа) молено приравнять к энергии деструкции фаговых частиц. Поскольку во второй термо-стабилыюй фракции делеция ДНК исключается, то эта фракция содержит вирионы с фенотипическн модифицированным структурным белком (или белками). Из данных кривой на рисунке 1, отражающей содержание модифицированного фага в ТЕ-буфере, следует, что его количество не превышает 0,01 %.

Кривые инактивации фага Е105 в Н среде и ТМ буфере также выявили наличие в популяции фага двух фракции.

С помощью графиков Аррениуса были затем определены константы инактивации для обеих фракций, а затем рассчитаны основные термодинамические параметры самого процесса термоинакти-вацнн — Еа, АН^, ДБ^ (таблица 2).

Таблица 2

Термодинамические и кинетические характеристики термоинактивации фага Е105 в среде Н и ТМ-буфере

Среда и фракция Т°С Константа 1 скорости инактивации (К), М1ПГ1 Энергия активации (Еа). ккал/моль Энтальпия активации (АНтЬ) ккал/моль Свободная . энергия ккал/моль Энтропия активации (ДБ^) кал/моль °К

Н1 48 ПО 52 55 0,082 0,134 0,165 0,375 45,7 45,1 • 20,2 •86

Н II 48 50 52 55 0,011 0,017 0,023 0,034 35,0 31,0 21,6 35

ТМ I 58 60 61 62 0,124 0,274 0,424 1,004 114,4 113,7 28,2 284

ТМ II 58 60 61 62 0,038 0,058 0,075 0,092 47,3 46,6 21,5 80

Из представленных в таблице данных следует, что Еа, ДН^= и ДБ^ в 2,5 раза выше в ТМ-буфере, чем в среде Н для чувствительной фракции; между тем для термостабнльиой фракции вируса это превышение было менее значительным.

После выделения и получения термостабнльиой фракции фага (инкубация фага при 61° на протяжении 45 мин.) проводили 5-кратные циклы температурного воздействия. Однако двухкомпонентный характер кинетических кривых не изменялся. Таким образом, не удалось получить данных о делецнонной природе при анализе этого пула.

Исходя из_ этого, было сделано заключение, что хотя популяция

фага генетически однородна, в ней всегда имеются фенотипически измененные вирионы с более и менее стабильной четвертичной структурой нуклеопротеина.

Плавучая плотность вирионов фага 59 в хлористом цезии составила 1,500±0,001 г/см. Принимая во внимание расчет Rubio et al (1974), установлено, что М. М. вириона составляет 62 МД. Константа седиментации составила S^ , W=409± 10 S (Ю-13 сек.), а М. М., вычисленная по формуле Pitout et al. (1969), составляет 60,7 МД:

Из приведенных материалов следует, что по размерам фаг 59 близок фагу А. Отсюда, мы вправе считать, что оба фага должны иметь близкие гидродинамические свойства. И, действительно, прн совместной седиментации установлено, что фаги седиментируют с одинаковой скоростью. Для фага X значение Sjo, W составляет 410—416 S, что совпадает с таковым для фага 59. Исходя из этого, можно заключить, что М.м. фага 59 можно оценить в 60 МД.

Итак М.м. бактериофага 59 равна в среднем 61 МД.

Методом седиментационного анализа была установлена константа седиментации фага Е105, которая равнялась 475 S. Исходя, из этого, М.м. вирионов составила 52,8 МД.

Плавучая плотность вирионов фага составила .1,52 г/см3, что дало значение М.м. 54,1 МД. Таким образом, М-м. фага Е105 составила в среднем 53,4 МД. ■

При электронномикроскопическом изучении препаратов фага 59 установлено, что его вирионы состоят из нкосаэдрической головки размером 57± 1,0 нм н отростка — жесткой несокращающейся струк* туры — длиной 168,5±5,0 нм, диаметром 13,1 ±0,5 нм.. .Отросток имеет спиральную упаковку морфологических субединнц и заканчивается базальной пластинкой, имеющей на плоскости вид трезубца. • .

По морфологии фаг отнесен к морфотипу Bj (Ackerman et al¿ 1983).

При электронной микроскопии фага Е105 было показано, что его частицы на плоскости представлены гексагональными структурами диаметром 64 ± 1 нм. и коротким отростком 8± 1 нм. По своей морфологии фаг Е105 мы отнесли, к морфотипу С 1 по классифика: цип вирусов (Ackerman et al. 1983). Было сделано заключение, что головка фага имеет форму икосаэдра, так как. частицы его были ориентированы относительно осей симметрии 5:3:2. Отростки фага не были разрешены в микроскопе, поскольку их размеры слишком малы. Правда, после деградации и. отделения отростков от головок они были представлены в виде торовидной структуры, с которой сочленены двухчленные фибриллы с булавовидными утолщениями. На основании этих данных были построены модели макромолеку-лярной организации вирионов фагов 59 и El05.

Основные свойства и структура фаговых ДНК'

ДНК фага 59 представлена дуплексной молекулой с показателем гиперхронизма в пределах 40 %, выделенные нативные молекулы— линейной формы. Гидролизом фаговой ДНК с помощью

экзонуклеазы S 1 показано, что она не содержит липких концов и не имеет канонических однонитевых разрывов. Геном этого фага переваривается стандартными общепринятыми для рестрикционно-го анализа эндонуклеазами, что может свидетельствовать об отсутствии аномальных оснований в полинуклеотидной цепи.

Константа седиментации ДНК фага 59 равна S20,W=37,7±0,1 S, что соответствует молекулярной массе 29,0±2,4 МД. Плавучую плотность ДНК определяли путем коседиментации с ДНК М. lyso-deic-ticus в градиенте хлористого цезия. Значение плавучей плотности ДНК фага 59 — 1,708 ±0,001 г/см3. Исходя из этого, содержание ГЦ-пар в ДНК фага составило 49 %.

Для дальнейшего изучения структуры генома этого фага проводили денатурацию и фрагментацию ДНК- Денатурированная ДНК в градиенте хлористого цезия имеет плавучую плотность 1,723± ±0,001 г/см3. Анализ фрагментнрованной ДНК в градиенте хлористого цезня показал наличие двух седнментационных пиков, что может свидетельствовать о неслучайном распределении вдоль по-лионуклеотндной цепи богатых АТ-парами участков: один из пиков соответствует именно такой области, так как ее плотность составляет 1,702 г/см3 (или 40 % содержания ГЦ-пар). Между тем другая часть седнментограммы имеет плотность 1,710 г/см3. Это свидетельствует о наличии в фаговой ДНК богатого ГЦ-парами участка (51 % ГЦ-пар). АТ-богатые участки ДНК занимают около 25 % генома фага, что определено соотношением площадей под кривыми седиментации.

При плавлении фаговой ДНК выявлен широкий температурный диапазон — At^7°C. Это также свидетельствует о неслучайном распределении АТ-богатых участков вдоль молекулы.

Исходя из полученных данных (широкий интервал температурного перехода, седиментация фрагментнрованной ДНК), мы проанализировали фаговую ДНК с целью определения внутримолекулярного распределения азотистых оснований по методике Inman (1967) с помощью электронной микроскопии.

В результате была построена карта частичной денатурации ДНК, которая свидетельствует в пользу выраженной полярности распределения ГЦ и АТ-пар. Высокое содержание АТ-блоков установлено в трех областях карты.

Молекулярная масса ДНК фага была установлена также методом электронной микроскопии, где в качестве маркера была взята молекула ДНК плазмиды Col El (мм—4,2 МД). Для ДНК фага М.м. составила 30,98 ±0,73 МД.

Методом гомодуплексного анализа изучены структурные особенности фагового генома. В препаратах обнаруживали незначительное содержание кольцевых гомодуплексов и очень большое — линейных. Отмечены две характерные особенности кольцевых гомодуплексов. В кольцевых гомодуплексах выявлена транспозои-подобная структура.

Вторая особенность кольцевых гомодуплексов состоит в том, что они содержат два односпиральных выступа (или пертрузии), рас-

стояние между которыми в разных молекулах составляет от 1,9 до 2,9 МД.

Наличие в гомодуплексах кольцевых молекул или фрагментов можно объяснить только пермутированноство вирионной ДНК, вследствие чего односпиральные выступы можно рассматривать как концевую избыточность в фаговой ДНК- Размеры концевой избыточности составляют 2,2 % или 1000 пар оснований, а размер Тп-элемента составляет 7 % от полной длины генома.

Константа седиментации ДНК фага Е105 была равна 34 S. При электронной микроскопии препаратов фаговой ДНК показано, что ее молекулы — линейные двухцепочечные структуры с открытыми концами модальной длиной 15 мкм, что соответствует молекулярной массе 29-10бД. В электронном микроскопе фаговая ДНК не формировала замкнутых циклов, что свидетельствует об отсутствии липких концов. Весьма характерно, что щелочная денатурация ДНК с последующей ренатурацией приводила к фрагментации ДНК с дискретным набором фрагментов, что могло свидетельствовать о наличии в молекулах однонитевых разрывов или пиков, и нашло подтверждение при электрофорезе в агарозном геле: был выявлен набор молекул ДНК дискретной длины.

Аналогичную картину наблюдали и после обработки фаговой ДНК экзонуклеазой S 1.

Таким образом, для ДНК фага Е105 характерны однонитевые разрывы или ники.

Столь необычные данные заставили нас более обстоятельно заняться изучением первичной и вторичной структуры этой ДНК. Из данных плавления этой ДНК следует, что ее денатурация происходит с выраженным типичным переходом по типу спираль-клубок в относительно узком температурном интервале Ai=5 °С и гипер-хромным эффектом (37 %), что может однозначно свидетельствовать о двунитевой структуре этой ДНК.

По данным температуры плавления (77,2 °С в 0,1 XSSC) рассчитывали содержание ГЦ-пар в ДНК, которое составило 54 %. Между тем, по результатам седиментации в градиенте С SC1, показано, что плотность ее (в зоне отдельного симметричного пика) составляет 1,707 г/см3, что соответствует 53,5 % содержанию ГЦ-пар.

Как известно, критерием отсутствия аномальных нуклеотндов в составе ДНК является количественное совпадение содержания ГЦ-пар по данным тепловой денатурации и равновесного центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия (или CS2SO4). Поскольку эти данные для ДНК фага Е105 совпадают, можно считать установленным, что аномальных нуклеотидов в составе ДНК фага нет.

Дальнейшее изучение структуры геномов фагов было проведено методом рестрикционного анализа.

Выше отмечалось наличие циклической пермутации в ДНК фага 59. Этот факт подтвержден также переваром этой ДНК с помощью эндонуклеазы Sma I. Эта рестриктаза, наряду с обычными фрагментами, образует два «аномальных»: набор гетерогенных фрагментов (полоса «а») и субмолярный фрагмент «в».

По аналогии с другими пермутированными геномами был сделан вывод, что происхождение этих фрагментов связано с наличием «раск»-сайта, места начала упаковки и разрезания конкатемерного предшественника при созревании ДНК (Spanier et al., 1983). При картировании с помощью рестриктаз Ваш HT, BglTI, Sal 1, Eco 31, Eco R 1, Sma 1 было учтено, что пермутированная ДНК фага состоит из уникальной области и области гетерогенных концов.

После идентификации дополнительных сайтов для рестриктаз Bgl II и Sal 1, находящихся в вариабальной части концов молекулы, а также идентификации концевых фрагментов после гидролиза Sal 1 и Eco R 1 ограниченным Eco 31 гидролизом, была построена рестрикцнонная карта ДНК фага 59 (рисунок 2).

Построение рестрикционной карты ДНК фага El05 заключалось в том, что осуществляли полный н частичный гидролиз иативпых молекул ДНК с помощью рестрпктазы Mva— 1, а затем полпый и частичный гидролиз Mva — 1 фрагментов с помощью эпдонуклеаз Нра 1 и Eco 31, двойной Нра 1/Есо 31 —перевар этих фрагментов.

Обратимся, однако, к исходным данным. При рестрикционном картировании ДНК фага Е105 были применены эндонуклеазы, узнающие гексагональные последовательности, однако большинство наиболее применяемых — Eco R 1, Hind III, Sal 1, Bam H 1, Bgl II, Xma 1, Xho 1 — не гидролизовали ее, и только рестрпктазы Eco 31, Cfr 6/1 Eco 32 Нра 1 расщепляли ее в достаточной для анализа мере.

Чтобы исключить возможность ингнбпрования фрагментов экзогенными примесями, применяли прерывание тронных проб: ДНК Я, ДНК Е105+ДНК К ДНК El05. Оказалось, что Я ДНК расщеплялась этими эндонук-леазами как в отдельности, так и в смеси, а ДНК Е105 ими .не гидролизова-лась; это исключало возможность эзоген-ной контаминации и свидетельствовало об исключительной резистентности ДНК Е105 к рестрнкта-зам..

Поэтому были применены эндонуклеазы, расщепляющие ДНК по тетра-II ментануклеотид-иым последовательностям. Из набора 9 ферментов только Sau ЗА вообще не

Рис. 2. Рестрнкционная карта ДНК фага 59. .расщепляла ДНК, а

Г

Муа 1 —давала всего 3 фрагмента (А, В, С) вместо ожидаемых 30. Это установленный факт послужил основанием для выбора рестрик-тазы Муа 1 для картирования ДНК Е 105. Были установлены молекулярные массы фрагментов (таблица 3).

Таблица 3

Молекулярная масса Mva 1 —фрагментов ДНК фага Е105

, . Фрагмент Л В С в с

МмХ10«МД 12,5 9,7 6,9 22,1 16,1

Если сопоставить Мм обоих рефлексов неполного перевара (в и с) с тремя теоретически возможными, можно заключить, что фрагмент В находится между фрагментами А и С; при этом фрагмент А избран за отсчет конца молекулы.

Далее, как следует из стратегии картирования генома этого фага, с помощью рестриктазы Eco 31 было определено местоположение б из 10 фрагментов молекулы ДНК (65 % генетической емкости генома) — правая часть молекулы, а затем с помощью рестриктазы Нра 1 было установлено положение сайтов левого конца молекулы,— фрагмент С. В итоге была построена рестрикционная карта ДНК фага Е 105 (рисунок 3).

Из приведенных данных видно, что всего на карте ДНК фага El05 картировано 19 сайтов, причем с помощью эндонуклеаз Mva 1 и Нра 1 локализованы все фрагменты, с помощью Eco 31 —частично — 6 из 10.

Результаты этих исследований дают возможность заключить, что ДНК фага El05 представлена линейными, непермутированными молекулами без липких концов, которые не содержат концевой избыточности, превышающей 1,74X10® Д (около 6% генома):

у\ нРп

« J S. XlJf ® 1 I 1 •

___, ______,_

» *с L м ' ' V» О.ЯА ? <М О.A? Ï.31 У \ N.1.V

з.п »,» 1 .11. С.В» 2.94 Есо 31 - i --1-ад . 1 t О ,В2 94 5,35 o/i) е.гс 1,09

- г»««: У"] г ... t » К А ... Г

У,il 1.15 0,45 7,04 2,41

И val"

А - » С

И.Л *.М Т. 14

Рис. 3. Рестрикционная' карта ДНК фага Е 105. '

Экспрессия генетической информации фаги Mu в системе эрвиний

Установление полнлнзогенин у Е. carotovora 268, рекомендованной как высокоэффективный продуцент фермента L-аспарапшазы, объяснило причину спонтанного фаголнзиса культуры.

Поскольку одним из основных качеств бактериальных продуцентов является их фагорезистентность, то поиски путей получения устойчивых к фагу культур является актуальной задачей.

В связи с этим представлялось перспективным использование фагов-транспозонов, вызывающих разнообразные перестройки генетического аппарата клетки — слияние реплнконов, индукции мутаций, делений, дпуликаций и т. п. для предупреждения этого явления.

Известно, что бактериофаг Mu широко и эффективно используется в микробиологии не только для выяснения теоретических вопросов транспозиции хенрв, но и в практических целях усовершенствования бактериальных продуцентов (Rood et' al., 1980; Van Gijsegem, 1983). Как инструмент генетической инженерии in vivo, особенно в составе природной гибридной плазмиды RP4::Mu, фаг Mu обеспечивает возможность конструирования у широкого круга бактерий новых штаммов с заданными признаками.

Штамм Е. carotovora 268 природно устойчив к фагу Mu и его термоиндуцибельному мутанту Muets 62, а 4 собственных умеренных фага этой культуры не активны для использованных в работе штаммов Е. coli. В смешанных культурах суспензий с мембранных фильтров при содержании 2—ЗХЮ8 донорских клеток Е. coli и 1—2x10® клеток реципиента Е. .carotovora на агаре с селективной средой вырастает около ста колоний. Наряду с хромосомным маркером реципиента Nalu и прототрофностыо они характеризуются признаками KmI! и TcR устойчивости плазмиды RP4 п придаваемой фагом Muets 62 термочувствителыюстью — к росту только при 30—32 °С, тогда как. исходный штамм к этим антибиотикам чувствителен и растет при 42 °С.

Наличие полноценной гибридной плазмиды RP4::Mucts 62 в трансконьюгантах Е. carotovora подтверждается суммарным размером ее рестриктов при гидролизе эндонуклеазами Sma 1, Sal 1 и сравнительной электрофоретическон подвижности фракций донора и трансконьюгантов (рисунок 4). Частота переноса для Е. carotovora 268 составляет 1,5—5х10~7 трансконьюгантов в расчете на клетку донора, его максимум приходится па 3—5 ч совместного культивирования.

Функциональная полноценность Muets 62 в составе гибридной плазмиды у полученных трансконьюнгантов Е. caratovora выражается в их способности к термоиндукции фага, лизису клеток и продукции инфекционных частиц.

Локализация и ориентация профага Muets 62 на плазмиде RP14 у Е. carotovora 268 определены по результатам рестрикции (рисунок 5).

Рестриктаза Sma 1 расщепляет ДНК RP4 на 5 фрагментов с размерами 21,9, 15,0, 13,1, 6,35 и 0,65 тпн и не имеет сайтов узнавания в ДНК фага Muets. Рестрикция этой эндонуклеазой гибридной плаз-

í>=S!t&»

Рис. 4. Электрофореграмма рсстрнктов плазмндной ДНК трапскопьюганганта

Е. carotovora 268 (RP4::Mucts 62) 1—^4-Eco R 1; 2 —частичный гидролиз X + Sal 1; 3 — RP4+Sma 1; 4 — RP4::Mucts 62 + Sma 1; 5— RP4 + Sal 1; 6—.RP4::Mucts 62 + Sal 1; 7 — Muets 62+Sal 1;8—RP4 +Sal 1/Hind III; 9 —RP4::Hucts 62 + Sal 1/Hind III;

10 —Muets 62 -f Sal 1/Hind III.

миды RP4::Mucts 62, выделенной из E. carotovora, характеризуется замещением 4-го фрагмента на высокомолекулярный, размером 41,8 тпн, что указывает на локализацию профага в области между 29,5 и 35,85 тпнна физической карте RP4. Для детализации положения профага плазмнду RP4::Mucts 62 обрабатывали рестрнктазои Sal 1, имеющей 2 сайта узнавания в ДНК RP4 и один в Muets. Из трех образующихся при этом рестриктов фрагмент размером 38,65 тпн, располагающийся между сайтами 32,2 и 13, 85 тпн на карте RP4 в направлении часовой стрелки, не претерпевает изменений. Следовательно, интеграция профага возможна только в направлении против часовой стрелки от Sal 1 сайта 32,2 тпн на участке протяженностью до Sma 1 сайта 29,5 тпн карты RP4. Действительно, 2-й Sal 1 фрагмент RP4 размером 18,35 тпн у RP4::Mucts 62 замещается на два других величиной 7,3 и 46,5 тпн. Меньший из них может включать правый конец генома, поскольку левый значительно больший по размерам. В интегрированном состоянии в геноме Muets 62 сайт

что сайт интеграции профага отстоит от Sal 1 сайта RP4, 32,2 тин на 1,7 тпн, то есть приходится на точку 30,5 тпн карты RP4, будучи ориентирован к ней правым концом генома в направлении против, часовой стрелки.

Подтверждение правильности заключения об ориентации генома. Muets 62 получено в опытах дополнительной рестрикции Sal 1 фрагментов эндонуклеазой Hind III. В дальнейших опытах изучалась транспозиция генома Muets 62 в хромосому трансконыогантов Е. carotovora. Поиск такой локализации транспозиции генома фага представлял особый интерес в связи с возможностью последующего делециоиного вырезания в хромосоме трансконыогантов резидентных профагов штамма Е. carotovora 268. После частичной термоиндукции трансконьюгантов были обнаружены клоны, утратившие признаки, обусловленные плазмидой RP4, но сохранившими термо-чувствительиость к росту при 42 °С и способность к спонтанной it термоиндуцированной. продукции фага Muets 62., Сочетание этих свойств с отсутствием плазмидной фракции на электрофореграм-мах тотальной ДНК клонов позволило предположить возможность транспозиции генома фага с плазмиды на хромосому трансконыогантов.

Была проведена блот-гибрндизация рестрнцированнои эндонук-

леазой Bal 1 тотальной ДНК, одного из выделенных трансконыог гантов Е. carotovora с 32р-меченой ДНК фага Muets 62.

Полученные результаты позволили заключить, что транспозиция в хромосому осуществлялась в границах одного генома фага с формированием нового фенотипа Е. carotovora 268 (Muets 62).

Затем была исследована возможность индукции профагом Muets 62 мутаций и делений в хромосоме Е. carotovora 268, включающих геном профагов Е105, что важно для усовершенствования этого бактериального продуцента.

По имеющимся в литературе материалам невозможно составить определенное заключение о стабильности структурной целостности и наследования плазмиды RP4::Mucts 62. Это представляется немаловажным для изучения генетической организации эрвиний, принимая во внимание их, как правило, ограниченную донорскую способность. Этому эксперименту работы было предпослано выяснение степени и характера сегрегации плазмиды RP4::Mucts 62 в двух клонах Е. carotovora 268. Сегрегацию оценивали по устойчивости к КСЮз, как простому тесту на мутабилыюсть Chl-генов (таблица 4).

Таблица 4

Сегрегация плазмиды RP4::Mucts 62 у Chln Mu-термонндуцированных мутантов Е. carotovora 268 и Е. coli I С5466

Количество колоний с маркерами

Штамм и Chi" RP4 и Muets RP4 Mucts . Отсутствует

Е. sarotovora 268-11

RP4::Mucts 62 72 47 2 6 17

Е. sarotovora 268-97

RP4::Mucts 62 119 73 5 16 25

Е. cali I С5466

RP4::Mucts 62 60 58 1 1 0

Сегрегация плазмиды RP4::Mucts 62 в Е. carotovora 268 в условиях термоиндукции происходит более интенсивно, чем в Е. coli, и у 21—24 % исследованных клонов выражается ее полной элиминацией. Строго говоря, наличие у превалирующего числа клонов эрвиний обоих маркеров — RP4 и Mucts 62 еще не свидетельствует ■о сохранении в их клетках структурной целостности гибридной плазмиды. Однако это не исключает принципиальной возможности сегрегации гибридной плазмиды в отдельных клонах эрвиний с сохранением обоих маркеров. Ограниченная донорская способность штамма Е. carotovora 268 не позволила экспериментально количественно охарактеризовать вероятность такой возможности. В отсутствие термоиндукции клоны трансконыогантов Е. carotovora 268, очевидно, стабильно наследует RP4::Mucts 62, судя по отсутствию выщепления маркеров плазмиды.

Хлоратустойчнвые мутанты выделяли в отсутствии селекции фагов Т1, 080. vir и колицинами V, В, специфическими для отбора

мутаций по этому прназкну в гене ton В, локализующимся на 28-й минуте карты Е. coli. Мутации этого фенотипа детерминируются 6:тью генами, локализованными в разных участках генетической карты Е. coli — 0,17, 18, 27, 86 мич. (Bachman, 1987). Из них только ton В мутанты приобретают устойчивость к фагу Т1. Если принять, что генетические карты E.coli и Е. carotovora в общих чертах сходны (Прокулевич, 1984), то выделение ChlR мутантов эрвиний в отсутствии селекции Т1, 080 и колицинами V и В должно отражать достаточно широкий спектр локализации Ми-термоиндуциро-ванных мутаций на хромосоме Е. carotovora 268. Действительно, нз 191 Chi11 клонов эрвиний, полученных термоиндукцией, при испытании на чувствительность к фагу Т1 резистентными оказались лишь 11. Полученные результаты дают основание полагать, что другие Chi — мутации локализовались в иных, неэквнвалетных по функции ton В гену Е. coli участках хромосомы Е. carotovora и не связанных с признаком устойчивости к фагу Т1. Частота спонтанных мутаций по Т1 фагоустойчивости родительского штамма эрвиний не ниже Ю-8.

Для резидентного фага 59 Е. carotovora 268 показана способность к общей трансдукции (Романюк, 1985) и, следовательно, у него не предполагается строго фиксированного сайта интеграции на хромосоме этого штамма. В отношении трех других умеренных фагов этого штамма ни о трансдуцирующей активности, ни о локализации профагов сведении не имеется. Было поставлено несколько серий опытов Mu-термонндуцированного мутагенеза полилизоген-ных клонов эрвиний с целью установления возможности выделения мутантов бактерий с делецнями или глубокими повреждениями их резидентных профагов. Выбрана тактика их косвенного поиска в числе М-индуцированных различных ауксотрофных мутантов эрвиний. Тестирование ла ауксотрофность методом реплик были подвергнуты все выжившие после частичной термоиндукцин клоны Е. carotovora RP4::Mucts 62, как вновь выделенные, так и ранее полученные, включая ChIR, и с транспозицией Muets 62 в хромосому клеток, общим числом более 30000 клонов. С целью широкого охвата поиска возможного близкого совмещения сайтов интеграции резидентных профагов эрвиний и Mu-термоиндуцированных ауксотрофных мутаций идентифицировали признаки потребности в лейцине, треонине, пролнне, цнетеине, гистидине, лизине, метнонине, пуринах. Согласно уточненной генетической карте E.coli К12, выбранные маркеры имеют множественный характер локализации на протяжении всей хромосомы (Bachman, 1987). Мы полагали возможным экстраполировать эти данные в общем виде к эрвиниям. Отобранные ауксотрофные мутанты испытывали на спонтанную продукцию и иммунитет в отношении всех 4-х резидентных фагов Е. carotovora 268 и Muets 62 (таблица 5).

Знаками + или — в числителе таблицы 5 обозначена способность к продукции фагов или ее отсутствие, в знаменателе — соответственно наличие или отсутствие иммунитета к гомологичному фагу.

Все мутанты с нарушенной фагопродукцией 59 и Е105 сохраняли аспарагиназную активность в диапазоне 4,3—8,2 МЕ/мг с.в. Это

Т а б л и к а 5

Совместимость Mu-термоиндуцнрованных ауксотрофных мутаций Е. carotovora 268 _с продукцией рзидентных фагов и. иммунитетом к ним__

Частота мутаций Фаги leu 1.2Х10"4 thr 0,7 XI О"4 pro 0,5 X Ю-4 cys 0,2X1.0-« met 3,1 х ю-4 риг IX ю-4

49 +/ + +/+ +/+ +7+ +/+

69 +/Н- + /■+ + /+ +/+ +/+ +/+

59 +/ + + /+ -/+ +/+ +/+

Е 105 +/+ -/+ +/+ +/+ -/+ -/-

укладывается в рамки разброса показателен аспаригиназнои активности у отдельных клонов в популяции исходной родительской культуры Е. carotovora 268.

Полученные данные подтверждают общепринятое представление о случайном и распространенном по всей хромосоме клетки-хозяина индукции мутаций Mucts, в частности ауксотофных у Е. carotovora 268. Нас интересовала связь этих мутаций с возможностью элиминации или делегирования резидентных профагов у этого штамма эрвиннй путем Mu-опосредованных транспозиций. Этому, казалось бы, и отвечали результаты вышеприведенных опытов с утратой фагопродукции Е105 и 59. Для более углубленного выяснения этого вопроса в последующей работе были использованы два фагонепродуцирующих Е105 клона Е. carotovora 268 Е-91, сохранившим иммунитет к суперинфекцин, н 268 Е-93, утратившим иммунитет.

В дополнительных опытах с индукцией обоих клонов мнтомици-ном С была подтверждена утрата у них способности к продукции фага Е105, тогда как у родительского штамма в этих условиях титр фаголизата возрастает на 2 порядка по сравнению со спонтанным фоном. Известно также, что профаг El05 обуславливает конверсию лнзогенной клетки, выражающуюся в потере ею способности адсорбировать гомологичный фаг. Как показали результаты эксперимента, клон 268 Е-93 адсорбирует до 98 % фага Е105 и сопоставим с уровнем адсорбционной способности индикаторной культуры Е. hortícola 43-1, тогда как клон 268 Е-91, подобно родительскому штамму, гомологичный фаг практически не адсорбирует. В данном конкретном случае просматривается корреляция между состоянием иммунитета к суперннфекции и адсорбционной способности у этих двух клонов, хотя прямой связи между этими двумя свойствами теоретически может и не быть.

По биологическим тестам фагопродукции, иммунитету и конверсии фагорецепторов напрашивается вывод о более полной функциональной блокаде профага El05 у клона 268 Е-93 по срванению с 268 Е-91.

Отсутствие генетически маркированной коллекции EI05 лишает возможности применить комплементационный тест для идентификации сохраненных функций и участков генома фага. Поэтому в дальнейшем для этой цели использован прием гибридизации хромосомной ДНК клонов с фаговой ДНК (рисунок 6). Для более точ-

Рис. 6. Электрофореграмма (А) рес-трпктов ДНК Е. carotovora 268 Е-93 il 208 F.-91 и рлдиоавтограф (Б) н.\ блот-гибрпдпзашш с 32п ДНК фгга Е105.

!.—.}. + Hind Ш, 2 —ДНК Е105 ■+■ + Mva 1, 3, 5-ДНК Е. carotovora .268 F.-9!, 6-ДНК Е. carotovora 268 Е-93.

пого установления протяженности возможных делецпн в. профаге Е105 обе гибридизи-руемые ДНК предварительно гидролнзировали рестриктазон ^а 1> которая расщепляет

ДНК Е105 на 3 фрагмента_

А, В и С размерами соответственно 18,9; 14,7 и 10,5 тип. У хромосомной ДНК клона 268 Е-93 с примененными зондами сигнал вообще отсутствует, а у клона 268 Е-91 обнаруживается только с фрагментом А. Эти результаты однозначно свидетельствуют о Ми-индуцироваи-ной делецшг всего профага Е105 в первом случае и о его частичной делецпн у второго клона. Для этого фага генетическая карта отсутствует, но если принять что фрагмент А занимает крайне левое положите в геноме, то, по-видимому, он включает всю область ранних генов, в том числе иммунности. Возможно здесь же локализуются гены, ответственные за конверсию фагорецеп-торов клетки. В таком случае результаты ДНК-ДНК гибридизации хорошо согласуются с данными приведенных выше биологических тестов, на продукцию фага, иммунность и адсорбционную способность изученных производных Е. саго-1оуога 268.

Перенос и фенотипическая экспрессия фага Muets 62 у бацилл

Продемонстрированные в предыдущем разделе эксперимента проявления транспозиции фага Muets 62 в Е. carotovora, в том чТ.сле для моделирования возможности мутационного выключения им функциональной активности и делеционного повреждения резидентных профагов эршпшй, побудили более обстоятельно обратиться к проблеме взаимодействия фаг-клетка у гетерологичных систем Ь такой постановке вопроса эта проблема предстает как логическое

SivnnTIC содеРжа,шя предыдущего раздела, где эрвинин уже выступали в качестве гетерологичиого вида для фага Mii, хотя и генетически близкого к его естественному хозяину. Решение изучить и

этом плане грамположительные бациллы видов cereus, thüringiensis, jiiesentericus, polymyxa базировалось на их истинно обособленном от грамотрпцательного семейства энтеробактерни положении и систематике микроорганизмов.

Установлена, способность фага Mucis 62 к инфицированию В. thüringiensis в условиях его коньюгативного переноса из В. се-reus GA 682 в составе гибридного комплекса с плазмндон RP4. Биологическим критерием переноса генома фага Muets 62 служили полная утрата способности к росту отдельных клонов штамма В. thüringiensis 612 на чашках при температуре 42 °С и их активный рост при температуре 30 °С с сочетанным приобретением маркеров Km Тс-антибиотикоустойчивости RP4. Фенотип TS фага Muets 62 в сочетании с KmR TcR — признаками RP4 в клетках штамма В. thüringiensis обнаруживался с частотой около 5- Ю-8 на клетку реципиента при абсолютном отсутствии роста в контроле. Свежевыделенные клоны с фенотипом фага Muets 62 и плазмиды RP4 не отличались выраженной стабильностью и отщепляли 2— 10 % клонов с комбинацией признаков фага с одним из двух маркеров резистентности плазмиды — TsKma (3—7%) или TsKcR (2— 10 %). Достоверно, но с низкой частотой, выявляли клоны В. thüringiensis только с одним Ts ■— маркером фага. Полученные результаты свидетельствуют о принципиальной возможности передачи от В. cereus GA 682 фага Muets 62 в составе гибридного комплекса с плазмидой RP4 в штамм В. thüringiensis 612. Кроме того, они указывают на вероятность диссоциации комплекса генома Muets 62 и плазмиды RP4 в гетерологнчном бактериальном хозяине на частично делетированные молекулярные структуры и свидетельствуют об автономном от хромосомы реципиента состоянии плазмиды.

Относительно стабильный клон В. thüringiensis 612-5 с маркерами TsKmnTcu использовали в дальнейшем исследовании. На электрофореграмме его плазмидной фракции ДНК наряду с резидентными плазмидами pvD 3, pvD 2, pvD 1, свойственными исходному штамму В. thüringiensis, обнаруживается новая дискретная полоса, по подвижности превышающая нативную RP4::Mucts 62 Е. coli, но уступающая подвижности плазмиды RP4. Ее молекулярная масса соответствует 48—50 Мдальтон, то есть близка таковой коныогатнвной RP4::Mucis 62 донорского штамма В. cereus GA 682 или полностью сходна с ней. Природа этой полосы четко' -определяется данными блот-гибридизацип с меченными 32Р зондами ДНК фага Muets 62 и плазмиды RP4. Образование стабильных клонов свидетельствует о смене автономного состояния плазмиды интегрированным.

С точки зрения сохранения функциональных проявлений генома фага Muets 62 в системе гетерологичных хозяев представляло интерес выяснить возможность его обратного переноса в составе гибридного с RP4 комплекса из В. thüringiensis 612-5 в В. cereus. Реципиентом фага при этом служил мутант В. cereus DSM 318 StrR. Искомые клоны В. cereus с фенотипом TsKmRTcR выявлялись примерно с той же частотой, как и в прямом переносе из В. cereus GA 682 в В. thüringiensis 612, и характеризовались в

такой же степени нестабильностью с выщеплением разных комбинаций фенотипов. Один из относительно стабильных клонов с фенотипом TsKmuTcK, обозначенный как В. cereus DSM 318-1, изучен более детально но содержанию плазмид и в блот-гибридизациц ДНК. К резидентной плазмиде реципиентного штамма у В. cereus 318, обозначаемой рВСб, с мол. м. 8 Мдальтон в условиях обратного переноса из В. thüringiensis 612-5 добавляемся большая плазми-да с подвижностью, промежуточной между таковыми RP4 н RP4::Mucts 62 Е. coli. Криптическая плазмида рВСб в данном случае выступает как надежный плазмидный маркер штамма-реципиента, дополняя генетические маркеры его идентификации при обратном переносе в него RP4::Mucts 62 из В. thüringiensis 612-5. То,, что имеет место обратная передача именно этой плазмиды, подтверждается и ее подвижностью в гель-электрофорезе, и результатами блот-гибридизацин с мечеными зондами ДНК фага Muets 62 и RP4.

Для углубления информации о способности других видов бацилл обеспечивать какие-либо формы выражения кишечного фага Ми были поставлены аналогичные опыты с В. mesentericus и В. poly-myxa с переносом гибридной плазмиды RP4::Mucts 62 их исходного донорского штамма В. cereus GA 682. Полученные результаты в целом совпадают с приведенными выше данными. У обоих видов бацилл выделены с частотой, варьирующей в опытах от Ю-6 до Ю-8,, клоны с фенотипом TsKmETcR, характеризующиеся наличием полосы плазмидной ДНК на электрофореграммах с мол. м. 50 Мдальтон и четкой положительной блот-гнбридизацией с зондами фага и плазмиды. Достоверность результатов переноса RP4::Mucts 62 подкрепляется спецификой плазмидных профилей штаммов-реципиентов: В. mesentericus ВКМВ 61 обладает обнаруженной резидентной плазмидой с мол. м. около 43 Мдальтон, а штамм В. polymyxa S 14 является бесплазмидным.

Представленные материалы дают положительный ответ на вопрос о возможности переноса в штаммы рода Bacillus гибридного комплекса фага Muets 62 с плазмидой RP4, а также сохранения и воспроизведения его в этих штаммах, хотя и в делегированном состоянии. Но при этом остается неизвестным, какой из этих двух компонентов, составляющих комплекс, преимущественно подвергается делецни. Обнаружение выщепления клонов у всех изученных штаммов бацилл с фенотипами утраты одного из двух, а в редких случаях — и обоих маркеров резистентности к антибиотикам при сохранении фагового Ts-признака указывает на возможность дополнительных делений в процессе наследования RP4::Mucts 62 в границах собственно РР4-плазмиды. Очевидно также, что в гибридном комплексе может иметь место и частичная и даже полная деления генома фага Ми, судя по сегрегации, хотя и редкой, терморезистентных клонов с экспрессией обоих маркеров антибиотико-устойчнвости RP4. Решение вопроса о сохранении интакностн генома фага Muets 62 в составе частично делетированного гибридного комплекса с RP4 в таком природно резистентном к фагу хозяине, каким являются бациллы, представляет немалые трудности.

Одним из прямых подходов могло бы служить выяснение возможности термоиндукцни фага Muets 62 в инфицированных гибридным комплексом бациллах и продукции ими полноценных инфекционных фаговых частиц.

Независимо от видовой принадлежности все четыре испытанных штамма — В. tthüringiensis 612-5, В. cereus DSM 318-1, В. mesen-tericus ВКМВ 61-41, В. Polymyxa S 14-19 — в режиме теплового шока и последующей их инкубации при 37 °С, ведут себя, судя по изменениям оптической плотности и количества жизнеспособных колониеобразующих единиц, очень сходно, различаясь только абсолютными показателями. Полученные результаты согласуются с представлением о массовой гибели клеток при тепловом шоке, не сопровождающемся их дальнейшим лизисом. Прн титровании над-•осадочных жидкостей культур бацилл на газоне индикаторного для Muets 62 штамма Е. coli НВ101 негативные колонии фага не обнаруживаются. Поскольку внутриклеточное созревание фаговых частиц возможно без их выхода из клеток бацилл в связи с отсутствием лизиса, термонндуцированные культуры в ряде случаев подвергали дополнительному лизису лизоцимом или хлороформом. Положительного результата не получено и в этих условиях. Очевидно, формирования инфекционных частиц фага Muets 62 в клетках бацилл не происходит либо пз-за специфики аппарата экспрессии гетерологнчного хозяина, либо по причине делении жизненно важных сайтов генома фага.

Коньюгативный перенос гибридной плазмиды RP4::Mucts 62 помимо возможности выражения у трансконыогатов и транецнпиентов детерминантов фага и антнбиотикоустойчивости в некоторых случаях сопровождается существенными изменения ряда других их свойств.

При сопоставлении биологических свойств исходных штаммов и штаммов-трансципиентов, содержащих плазмпду RP4::Mucts 62, у последних отмечено значительное уменьшение подвижности клеток. Ни одни из исходных реципиентов бацилл не обладает лецити-пазной активностью, тогда как все их производные с плазмидой RP4::Mucts 62 приобретают способность продуцировать лецитина-зу. Содержание аС1 в плотной питательной среде выше 5 % избирательно ингпбирует рост транецнпиентов В. thüringiensis, В. гпе-sentericus и В. polymyxa. Два последних штамма, в отличие от исходных, утрачивают также способность сбраживать маннит.

Образование стабильных транецнпиентов свидетельствующее •о встраивании фага Ми в хромосому, явилось основанием для поиска Mu-индуцированных хромосомных мутаций.

Тестирование на ауксотрофность методом реплик подвергнуты псе штаммы полученных транецнпиентов. Идентифицировались признаки потребности в гистидине, лизине, метионине, тирозине, цистеине, триптофане, глицине, аспарагиновой и глутаминовой кислотах. Наибольшее число ауксотрофных мутантов отмечено у штамма В. thüringiensis 612-5. Все выделенные мутанты характеризовались множественной зависимостью — по глутаминовой н аспарагиновой кислотам, триптофану, гнетиднну и метионину. Частота

мутаций составила 1—Зх10~4. Полученные результаты свидетельствуют о появлении клонов трансципиентов, стабильно утративших способность к росту на минимальной среде, при сохранении стенотипических признаков, обусловленных плазмидой и фагом.

Было проведено сравнение скорости роста по числу жизнеспособных клеток у исходных бацилл и их производных, содержащих плазмиду RP4::Muets 62. Штаммы бацилл, являющиеся донорами и содержащие плазмиду RP4::Mncts 62, имеют наименьшую скорость роста; и соответственно не имеющие плазмиды бациллы, используемые в опытах как реципиенты, обладают наивысшей скоростью роста. Бациллы, которые приобрели плазмиду RP4::Mucts 62, отстают от исходных не только fto скорости роста, но и по количеству жизнеспособных клеток в стационарной фазе.

Причина различий в скорости роста исходных и траисципиент-ных штаммов бацилл частично разъясняется при сопоставлении морфологии их клеток. Суспензии 18-часовых агаровых культур, не содержащих RP4::Mucts 62, в электронном микроскопе на срезах выглядят как нормальные клетки с гомогенной цитоплазмой и неизмененной клеточной оболочкой. В отличие от них, клетки всех трансципнентных штаммов с плазмидой имеют разреженную цитоплазму с гранулированными структурами. Наружный клеточный слой утрачивает целостность на определенных участках и разрыхляется. Клетки приобретают вид хрупких, нежизнеспособных, и в. количественном выражении они составляют до 50 %.

Была измерена толщина клеточной оболочки (клеточной стенки с плазматической мембраной) на срезах, прошедших под прямым углом.

Удалось зафиксировать слонстось клеточной оболочки бацилл.. У всех исследуемых штаммов в ее составе кроме основного слоя присутствуют дополнительные компоненты, которые оформлены в определенную структуру, получившую название S-слоя. Измерение этого слоя на клетках исходных и трансципнентных штаммов дали различные результаты. Величина S-слоя у трансципиентов была заметно снижена по сравнению с исходными реципиентами. На перпендикулярных срезах он выглядит трехслойным с внутренним электронно-прозрачным и двумя электронно-плотными слоями, которые неодинаковы по толщине на всем своем протяжении. Наружный слой, кроме того, у некоторых штаммов выявляется с незначительными разрывами. У некоторых штаммов бацилл наружный слой клеточных, оболочек покрыт образованиями в виде электронно-плотных фибрилл или округлых глыбок. Особенно четко обнаруживается у штамма В. mesentericus ВКМВ-61. Необходимо отметить, что S-слой является трехконтурным у всех реципиентных штаммов, в то время как у штаммов, получивших плазмиду RP4::Mucts 62, такое строение сохраняется только в двух случаях — В. cereus DSM 318-1 и В. mesentericus ВКМВ 61-41 —при уменьшении толщины этого слоя, как было показано выше. У трансципиентов В. polymyxa S 14—19 и В. thüringiensis 612-5 поверхностный слой гомогенен с практически не нарушенной целостностью по всей его длине.

Структурные нарушения клеточной оболочки штаммов с плазми-дой RP4::Mucts определяет, надо полагать, и ряд других наблюдаемых изменений их биологических свойств.

Полученные в работе данные вносят корректировку в представление о полной утрате трехконтурного строения поверхностного S-слоя оболочки у бацилл с плазмидой RP4::Mucts 62.

Бактерии и фаги эрвиний явились объектом для изучения антимикробных свойств препаратов группы имидазола.

При изучении антивирусных свойств вначале была установлена оптимальная доза (100 мкг/мл) и время действия (30—60 мин.) препарата Б-58 (камизола) на внеклеточные фаги 59 и Е 105. Отмечено снижение титров фагов на 51g. Затем исследовали действие препарата на репродукцию фагов в клетке. Установлено, что камн-зол угнетает развитие обоих фагов в 3—4 раза. В дальнейшем противовирусные действия препарата изучены в отношении вирусов клещевого энцефалита (штамм Абсеттаров) и герпеса (штамм HJ1-2). Показано, что камизол ннгибирует репродукцию вируса клещевого энцефалита в культуре клеток (СПЭВ, снижая его инфекционный титр на 3,6 ед.) и обеспечивает 20 % защитную эффективность при одноразовом введении белым мышам.

В случае вируса герпеса (штамм НЛ-2) препарата в концентрации 100 мкг/мл предотвращал развитие ЦПЭ на 75—82 % в культуре клеток ФКЭ.

Другой препарат этой группы — Б40 — был апробирован как антибактериальное средство.

Полученные данные свидетельствуют, что препарат проявляет низкую активность в отношении грамотрнцательных бактерий (Е. carolovora, Е. horlicola, Е. coli, Kl. pneumoniae и др.) даже в высоких концентрациях, в то же время оказывая выраженное антп-•бактериалыюе действие на грамположительпые виды бактерий (St. aureus, В. subtil is). Результаты действия препара на бактериальные клетки изучены с использованием электронной микроскопии.

Учитывая антибактериальные свойства препарата Б-40, предложены питательные среды для выделения грамотрнцательных бактерий и для изучения гемолитических свойств микроорганизмов.

выводы

1. Специфика структурно-функциональной организации полнлн-зогенной системы Ervinia carotovora 268 — продуцентна L-acnapa-гиназы, позволяет рекомендовать ее в качестве экспериментальной модели для изучения межвирусных и вирус-клеточных взаимодействий.

2. Особенности лпзогении Е. carotovora 268 заключаются в стабильной лизогенизации 4-мя индуцируемыми профагами — 59,49, 69, Е105, сильно выраженным постоянным преобладанием в смешанной популяции потомства фага 59, в способности всех профагов к конверсии клетки-хозяина, исключающей адсорбцию гомологичных фагов.

3. Определены индивидуальные для умеренных фагов Е. carotovora 268 основные биологические параметры их взаимодействия с клетками индикаторных культур, выяснены процессы их репродукции и внутриклеточного морфогенеза, установлена кинетика их термоинактивацни. Построены схемы молекулярно-структурной организации их белковых капсидов: вирионы фага 59 характеризуются морфотипом Вь вирионы Е105 — Cj.

4. ДНК фага 59 имеет м.м. 31 МД, представлена линейными цикл1?чески пермутированными молекулами с концевой избыточностью около 0,68 МД. ДНК фага Е105 — линейная непермутнрован-ная молекула с м.м. 29 МД без когезивных концов, содержит канонические односпиральные нити. ДНК-ДНК гомология фага 59 и 49 достигают 50 % но участкам геномов, кодирующих структурные функции, а с фагом Е105 не превышает 15 % и носит рассеянный характер.

5. Построены физические линейная и кольцевая жарты генома фага 59, на которых определено положение раск-сайта и идентифицированы транспозоноподобные структуры, а также линейная карта генома фага Е105.

6. Полилизогенный штамм Е. carotovora 268 служит реципиентом в коныогативном переносе плазмиды RP4::Mucts 62 с частотой 1,5—5хЮ~7 на клетку донора Е. coli. Трансконыоганты эрвинии, лизогенизированные локализованным на плазмиде Muets 62, в качестве его гетероспецифического хозяина способны к термоиндукции этого фага, лизируются и продуцируют полноценные фаговые частицы с незначительными отличиями по этим параметрам от естественного хозяина Е. coli.

7. Индукция фага Muets 62 в трансконьгантных Е. carotovora 268 сопровождается сегрегацией плазмиды RP4::Mucts на оба составляющие ее компонента, их совместной или раздельной элиминацией, более выраженной, чем у Е. coli, а также транспозицией генома фага на хромосому клеток. Обусловленные транспозицией генетические перестройки хромосомы эрвиний проявляются мутациями с частотой 1—ЗхЮ-4. Среди ауксотрофных мутантов обнаружены клоны с необратимой функциональной инактивацией про-фага 59 и с частичной и полной делецией профага Е105 эрвшши, без снижения продукции L-аспарагиназы. Mu-индуцированный му-

гагенез перспективный путь совершенствования продуцента за счет элиминации его резидентных профагов.

8. Осуществлен коныогативноподобный перенос плазм иды RP4:: Muets 62 из Е. coli в Вас. polymyxa и Вас. cereus частотой около 5хЮ-8 с последующей ее передачей в Вас. thüringiensis н Вас. ше-sentericus, Трансципиенты бацилл как гетерологичные хозяева Muets 62 не продуцируют полноценные фаговые частицы, но экс-прессируют детерминируемые геномом фага функции термочувствительности и трансмиссивности, определяемыми компонентом RP4. Трансципиенты бацилл отличаются рядом особенностей: снижением жизнеспособности и ускоренным аутолитнческим распадом клеток, замедлением скорости их роста и размножения, нарушением ультраструктуры клеточной стенки.

9. Трансципиенты бацилл нестабильны и утрачивают признаки, детерминируемые плазмидой RP4::Mucts 62 полностью пли в различных сочетаниях ее компонентов. В условиях селективного давления возможен отбор стабильных трансципиентов, в клонах которых показано наличие делеций различной протяженности плазмиды в автономном состоянии, а также установлена ее интеграция в хромосому бацилл. Термоиндукция трансципиентов сопровождается выходом ауксотрофных мутантов, что можно рекомендовать для выделения4 стабильных ауксотрофов по аминокислотам у видов бацилл с невыраженной способностью к мутагенезу по потребности в аминокислотах.

10. Полилизогенная культура Е. carotovora 268 предлагается в качестве модельной системы для изучения и отбора антивирусных соединений. Препарат Б-58 (камнзол), производное феннлпмндазо-тиазолия, снижает титр фагов эрвшшй 59 и Е105 в 104 раз и в 3—4 раза подавляет их внутриклеточную репродукцию, не влияя па жизнеспособность бактерий. Выявлена ингпбирующая активность препарата на репродукцию вирусов клещевого энцефалита п герпеса в культуре ткани и его профилактический эффект на инфицирование лабораторных животных вирусом КЭ. Совместно с вирусным антигеном препарат стимулирует иммуногенез, повышая в 5—6 раз титр антител у кроликов.

11. Культура Е. carotovora 268 использована для изучения и отбора антибактериальных соединений. Производное фенплимпдазо-тиазолия — препарат Б-40 избирательно подавляет рост Stapylococ-cus aureus, других грамположптельных бактерий, Candida albcans. С препаратом Б-40 сконструированы селективные питательные среды для выделения грамотрицательных бактерий, определения гемолитических свойств.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Электрошю-микроскопнческое изучение умеренных вирусов полнлнзогенной культуры Erwinia carotovora 268 и 268 М // Вирусы микроорганизмов,— Пущи-но, 1981,—С. 73 (соавт.: Рубан В. И., Григорян Ю. А., Р. М. Гжегоцкнй).

2. Исследование структуры ДНК фага 59 Erwinia carotovora фнзнко-хнмически-мн методами//Вирусы микроорганизмов.— Пущиио, 1981.— С. 74 (соавт.: Тов-кач Ф. И., Рубан В. И., Гжегоцкий Р. М.).

3. Structural peculiarities of the temperate phage о! E. carotovora and its DNA // 10. Tagung, Elcstronenmicroscopie — Leipzig, 1981.— P. 65 (соавт.: Kishko J. G., Ruban V. I., Tovkach F. I.).

4. Изучение умеренных фагов Erwina carotovora // Вопросы иммунологии и молекулярной микробиологии.— Нальчик, 1981.— Т. III.— С. 55—56 (Соавт.: Кишко Я. Г., Рубан В. И., Товкач Ф. И., Муращик И. Г.).

5. Characterization of Е. carotovora temperate phages // V International Congress of Virology, Strasburg, 1981,—P. 273 (соавт.: Kishko J. G., Ruban V. I., Tovkach F. I., Grigorian Ju. A.).

6. Physical properties of Erwina carotovora temperate phage 59 DNA // Studia biophysica — 1982,— V. 87.— No. 2/3, p. 91—93 (соавт.: Ruban V. I., Kishko Ja. G.r Tovkach F. I.).

7. Термоннактпвацня нуклеопротеидов трех умеренных фагов. Е. carotovora If I Всесоюзный биофизический съезд (Москва, 1982); Тезисы докладов.— С. 106 соавт.: Григорян Ю. А., Муращик И. Г., Товкач Ф. И).

8. Использование электронной микроскопии для изучения частичной денатурации ДНК фага 59. Е. carotovora//XII Всесоюзная конференция по электронной микроскопии. М.: Наука, 1982,—С. 282—283 (соавт.: Кишко Я. Г., Рубан В. И., Товкач Ф. И.).

9. Structure of Е. carotovora temperate bacteriophage 59 and its DNA // J. Virol. 1983,—V. 46,—No. 3.—P. 1018(1021 (соавт.: Kishko J. G„ Ruban V. I., Tovkach F. I.).

10. Особенности лнзогенной индукции дефектно-полнлнзогеннон культуры Erwinia carotovora 268//VI съезд Украинского микроб, об-ва: Тезисы докладов.— Киев: Наукова думка, 1984.— С. 165 (соавт.: Кишко Я. Г., Рубан В. И., Григорян Ю. А., Товкач Ф. И.).

11. Полилнзогения и умеренные фаги Е. carotovora 268//VI съезд Укр. микроб, об-ва: Тезисы докладов.— Киев: Наукова думка, 1984.— С. 170 (соавт.: Товкач Ф. И., Гнгорян Ю. А.).

12. Polylysogeny and Erwinia carotovora 268 temperate phages // Sixth International Congress of Virology (Sendai, 1984), P. 66 (соавт.: Kishko J. G., Tovkach Т. I., Grigorian Ja., Ruban V. I.).

13. Морфолого-структурная характеристика бактерий E. carotovora 268//Фитонциды. Бактериальные болезни растений: Труды Всесоюзн. конференции. Ужгород, 1985 —Киев: Наукова думка, 1985,— Ч. 2,—С. 27—28 (соавт.: Рубан В. И.).

14. Репродукция, и морфогенез фага Е105 Erwinia carotovora 268//Микроб журнал,— 1987 —49,—С. 35—37 (соавт.: Рубан В. И., Павлнй С. И.).

15. Рестрикцнонная карта пермутировашши ДНК умеренного бактериофага 59' Erwinia carotovora // Мол. генетика. 1988.— 1.— С. 20—25 (соавт.: Товкач Ф. И., Григорян Ю. А., Кишко Я. Г.).

16. Рестрикцнонная карта ДНК умеренного фага Е105 полнлнзогенной культуры Erwinia carotovora 268 // Мол. генетика,— 1988,—3. С. 24—27 (соавт.: Григорян Ю. А., Товкач Ф. А., Кишко Я. Г.).

17. Electron microscopic study of the fine DNA-structure of Erwina phages 59 and transposon-like element // Veröffentlichungen zur 12. Tagungelectronenmicrosco-pie (Dresden, 1988). P. 201—202 (соавт.: Kishko J. G„ Tovkach S. I., Grigorian Ju. A., Ruban V. I.).

18. Способ приготовления питательной среды для выделения грамотрнцательных микроорганизмов // А. С. СССР № 1426098 ДСП (соавт.: Кишко Я. Г., Павлнй С. И., Рубан В. И., Романов Н. Н., Ковтун 10. П.).

19. Способ получения ангпсывороткн к вирусу гриппа В // А. С. СССР № 1505196 ДСП (соавт.: Кишко Я. Г., Рубан В. И., Павлий С. И., Романов Н. Н., Ковтун Ю. П.).

20. Влияние препарата Б-58 на экспериментальную инфекцию, вызванную вирусами клещевого энцефалита и герпеса // Матер. Всесоюзн. конференции «Эпизоотология, эпидемиология, средства диагностики и специфической профилактики инфекционных болезней общих для человека и животных». Львов, 1988.— С. 463 (соавт. Павлий С. И., Виноград И. А.).

.21. Особенности ультраструктурных изменений в клетках Е. carotovora 268 и Staph, aureus 209-Р под действием препарата Б-40//Микроб, журнал, 1988.— С. 6. Деп. в ВИНИТИ 1989, № 3017-1389 (соавт.: Павлий С. И., Рубан В. И., Кншко Я. Г.).

22. Электронномикроскопическая структура бактерий Е. carotovora 268 // Микроб, журнал,— 1989— 6,—С. 15—19 (соавт.: Павлий С. И., Рубан В. И.).

23. Structural study of Ervina carotovora temperate phages // Intern, symposium: Molecular orgaization of biological structures. Abstract book I, Moscow, 1989.— P. 95 (соавт.: Kishko Ja. G., Tovkach F., Ruban V.).

.21. Structure of temperate bacteriophage E105 of E. carotovora // Там же.— P. 96 (соавт.: Kishko Ja. G., Grigorian Ju. A., Tovkach F. I.).

25. Ультраструктурные изменения в клетках под действием препарата Б-40 // VII съезд Украинск. микроб, об-ва: Тезисы докладов, Киев—Черновцы, 1989, ч. I.— С. 64 (соавт.: Павлнй С. И., Рубан В. И.).

26. Инфицирование бацилл фагом Muets интегрированным в плазмпду // Микроб, жури,— 1990,—3,—С. 57—63 (соавт. Брицкая В. С.).

.27. Множественный эффект плазмиды RP4::Mucts 62 в трансципиентах бацилл// Микроб, журнал.— 1990.— 4.— С. 17—22 (соавт.: Брицкая В. С., Ковали-шнн В. И., Гордий П. Д., Переверзев Н. А. и др.).

28. Репродукция умеренных фагов E. carotovora // Фитонциды. Бактериальные болезни растений. Киев—Львов, 1990.— Ч. II.— С. 41 (соавт.: Рубан В. И., Павлий С. И.).

-29. Способ приготовления питательной среды // Полож. решение № 4184502/31-63 ДСП от 27.04.90 (соавт.: Кншко Я. Г., Рубан В. И., Павлий С. И., Романов Н. Н„ Ковтун Ю. П.).

30. Способ ингибирования вирусов // Полож. решение № 4707449/30-13 ДСП от 27.04.90 (соавт.: Кишко Я- Г., Рубан В. И., Павлнй С. И., Виноград И. А., Романов H. Н., Ковтун Ю. П.).

■31. Антибактериальное, антнкандидозное средство // Полож. решение Лг 4741942/ 14/122396 ДСП от 2.10.89 г. (соавт.: Кншко Я. Г., Рубан В. И., Павлий С. И., Романов H. Н., Ковтун Ю. П.).

■32. Кон'югатнвне перенесения пбридно! плазмщн у бацнл // Медицина i фарма-щя—досягнсння i перспектив». Льв!в, 1990.— С. 120 (соавт.: Брицька В. С.).

■33. Erwinia carotovora как реципнентная система природной гибридной плазмиды RP4::Mucts 62 // Мол. генетика, 1990,—9 —С. 23—26 (соавт.: Брицкая В. С., Ильяшенко Б. П.).

34. Вплив плазмщи RP4::Mucts 62 на клггннп бацнл // Актуалып проблемн роз-внтку медично!' науки в сучасних умовах. Льв1в, 1990.— С. 104 (соавт.: Брицкая В. С.).

33. Визначення оптималышх умов передач! плазмой RP4::Mucts 62 // Актуалып' проблем» розвитку медично!" науки в сучасних умовах, Львш, 1990.— С. 105 (соавт.: Брицька В. С.).

•36. Бактериофаги эрвшшй // Бактериофаги условно-патогенных микроорганизмов. Нальчик, 1990,—С. 59—72.

•37. Mu-нидуцированные делеции п мутации хромосомы E. carotorova включающие резидентный профаг Е 105 // Мол. генетика, 1992.— Хя 1.— С.