Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-фцнкциональная характеристика энтомопатогенных бактерий BACILLUS THURINGIENSJS и их фагов

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Структурно-фцнкциональная характеристика энтомопатогенных бактерий BACILLUS THURINGIENSJS и их фагов"

ДО Й { Я % ;

' АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 579.852:578.81

СМИРНОВА Татьяна Александровна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭНТОМОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ BACILLUS THURINGIENSIS И ИХ ФАГОВ

03.00.07 — микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва — 1991

.-^»■'Тг*) ^ ь»,г -у^л

Работа ныполнена во Всесоюзном научно-исследовательском институте генетики и сслскции промышленных микроорганизмов.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ:

доктор биологических наук Р. Р. Азизбекян

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук В. И. Дуда

профессор, доктор медицинских наук Б. Н. Ильяшенко

доктор биологических наук Г. Г. Честухина

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ — Московский Государственный Университет им. М, В. Ломоносова, кафедра вирусологии

Защита состоится « 1992 г. в « ' ' > часов на заседании Специализированного совета И 002.64.01 при Институте микробиологии АН СССР (Москва, 1Л7811, проспект 60-летня Октября, 7, кор. 2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан « * ^ 4.1991

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. Е. Никитин

urcreaiMD «зЮТШ

J, i. 4IIH

Отдел сортгциД

Актуальность проблемы.В последние годы широкое распостране-ние получил микробиологический метол защиты растений от вредных насекомых. В качестве производственного продуцента бактериальных инсектицидов используются, в основном,энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis. Отличительная особенность Вас. thuringiensis - способность продуцировать при споруляшш параспо-ральные кристаллы,токсичные для личинок чешуекрылых,жесткокрылых, двукрылых.Инсектициды на основе Вас. thuringiensis характеризуются узкой направленностью энтомоцидного действия и экологически безвредны.Основными инсектицидными факторами являются, эндотоксин и экзотоксин.определенную роль в развитии патологического процесса играют споры.которые вахни для сохранения вида во внешней среде и его циркуляции в естественных биоценозах. Коммерческие препараты бактериальных инсектицидов представляют собой смесь кристаллов и спор.Бактерии Вас.thuringiensis,кристаллический эндотоксин и споры - основные инсектицидные факторы - заслуживают всестороннего и детального исследования.Актуальность данной проблемы возрастает,если учесть,что в процессе применения биоинсектицидов на основе споро-кристаллических комплексов,в окружающую среду вносится большое количество спор и кристаллов.

В настоящее время проводится многоплановое изучение Вас.thuringiensis. Однако цитологические исследования,как база для нзуче-чения биологических свойств Вас.thuringiensis,не получили должного развития.к моменту начала наших исследований ультраструктурная организация Вас.thuringiensis была недостаточно изучена.Особенности споро- и кристаллообразования у ряда подвидов не были исследованы.Немногочисленные цитологические данные не позволяли установить связь таких важных для Вас.thuringiensis характеристик, как колониально-морфологическая изменчивость.способность к обмену генетической информацией и к адгезии со свойствами определенных

клеточных структур.В настоящее время насчитывается около 3 0 разновидностей Вас.итгз.1^ег^8,различаюдихся по Н-антигену,культу-рально-биохкинческнн свойствам и спектру энтомоцидной активности, эти признаки используются для дифференцировки подвидов.Однако в существующей классификации практически не используются цитологические критерии,а также данные по фагочувствительности и лизоген-ному статусу.Выявление таксономически значимых признаков имеет важное значение в связи с поиском природных штаммов для производства энтомоцидных препаратов.С учетом промышленного значения Вас. Шдгаг^ег^Б особую важность приобретает вопрос о фагах,как основной причине дефектных заводских операций.Сложность проблемы фаголизиса усугубляется постоянной сменой подвидов и штаммов , практикуемой при производстве средств завиты растений.Поэтому существовала необходимость изучения производственных фагов и анализа фаговой обстановки на заводах,без чего невозможно вести целенаправленное получение фагоустойчивых штаммов.

Фаги Вас. 1Ьиг:и^1еп51Б до настоящего времени не классифицированы, для их систематизации необходимо получение молекулярно-би-ологических характеристик,в том числе физико-химических параметров нуклеиновых кислот,не определенных для этой группы фагов.Все вышеизложенное послужило■основанием для проведения работы по характеристике бактерий Вас. И1иг1пд1еп818,их фагов и взаимоотношений в системе фаг - клетка.

Цели и задачи исследования.Целью наших исследований явилось выявление структурно-функшоннальных особенностей вас. 1:Ьигз.одаеп51з,разработка критериев для дифференцировки штаммов, а также молекулярно-биологическая характеристика фагов,их систематизация и анализ взаимоотношений с бактериями-хозяевами в связи с проблемой фаголизиса при производстве энтомоцидных препаратов.

В соответствии с поставленной целью были определены следующие основные задачи исследования,включавшие электронноиикроскопи-ческое изучение динамики споро- и кристаллообразования у продуцентов энтомоцидных препаратов; электронномикроскопический анализ вегетативных клеток,спор,кристаллов ряда итаммов Вас.Ишгаг^еп-з15,а также их фагов и фаговой ДНК; выявление функциональной роли структурных элементов клеток и спор в связи с колониально-морфологической изменчивостью,процессами,связанными с переносом генетической информации и адгезией; создание коллекции фагов,выделенных из различных источников,изучение биологических и физико-химических свойств фагов и их взаимодействия с бактериями; установление родства фагов различного происхождения и природы производственного фаголизиса.

Научная новизна и практическая ценность. На клеточном и молекулярном уровне изучены свойства Вас. И1игз^1еп818,связанные с биологией энтомопатогенных бактерий.Основные данные,полученные впервые.касаются строения и функции поверхностных структур вегетативных клеток и спор. У вегетативных клеток выявлены микрокапсула ,структурирований слой (С-слой) клеточной стенки и единичные фимбрии.Обнаружены компоненты структуры клеточной стенки,способствующие обмену генетической информацией.Показано образование межклеточных мостиков при совместном культивировании Вас. Итг^д!-епз18 и Вас.сегеив,сопровождавшемся переносом плазмид кристаллообразования. Найдены различия в тонком строении зкзоспориума и покровов у подвидов Бас. 1Ьиг;^1еп515.Впервые у Вас. 1Ьиг1п§1еп515 обнаружены споровые выросты трех типов и изучено их тонкое строение . Показано , что у спор в зависимости от подвида доминирует определенный тип выростов.Показано,что споры обладают адгезивной способностью за счет трубчатых выростов,морфологически сходных с

лилями грамотрицательных бактерий.Найлены клетки-иишени (эритроциты морской свинки,цыпленка,крысы),позволившие выявлять адгезивно-активные итаммы Bac.thuringiensis с помощью реакции гемагглю-тннации (РГА).Методом солевой агрегации (МСА) и с помощью гексадекана показано,что выросты модифицируют поверхность споры, повышая пглрофобность и усиливая адгезивные свойства.

Выявлена корреляция между способностью вызывать РГА и адгезией к гидрофобным поверхностям и листьям.Предложена классификация подвидов Бас.thuringiensis,основанная на геыагглютинируюией активности.обнаружение адгезивной способности у спор Bac.thuringiensis дало возможность представить взаимоотношения в системе растение - насекомое - зкгомопатогснные бактерии с учетом взаимодействия всех компонентов.Полученные данные позволили сделать вывод о том.что для выживания и проявления токсического действия Bac.thuringiensis эволюционно приспособлены структуры,которые могут обеспечить спорам первичный контакт с листьями или другими поверхностями для дальнейшего попадания в кишечник насекомого и прорастания.

В результате изучения большой коллекции фагов Bac.thuringiensis обнаружена их неоднородность по ультраструктурным и молеку-лярно-биологическим характеристикам.С учетом морфологических и физико-химических особенностей фаги разбиты на группы,куда вошли представители морфотипов А1,В1,В2,С1 и С2. Электронномикроскопи-ческое исследование днк,впервые,позволило обнаружить фаги Bac.thuringiensis, ДНК которых цкркулярно пермутирована и имеет концевую избыточность.С помощью сайт-специфических рестриктаз изучена структура геномов вновь выделенных фагов.Многолетние исследования фагового фона на заводах-производителях средств защиты растений позволили выявить наиболее опасные для производства каждого энто-

мошшюго препарата фаги.Доказано экзогенное происхождение фагов, вызывающих фаголизис при производстве средств зациты растении.

Результаты изучения фагочувствительности "природных" изоля-тов показывают,что они не. отвечают всем технологическим Требованиям, в том числе и фагоусгойчивости."Природные" штаммы могут служить лишь основой для дальнейших генетических экспериментов.Результаты исследований были использованы при создании штаммов-продуцентов средств защиты растений (Автор.свид.СССР N 1190566, 1985; Автор.свид.СССР Н 1412290,1988; Автор.свид.СССР,полох.решение от 25,09.1990).Работа выполнена в рамках темы 1891-6464,-12 (номер гос.регистрации 0188007402) в лаборатории генетики энтомопатоген-ных бактерий ВНИИ Генетика.

Основные положения,выносимые на зациту.

1. Виду Вас. Ь}|1]г11^1еп515 свойственна гетерогенность ультраструктурной организации эндоспор и кристаллов эндотоксина,связанная с принадлежностью к подвиду.

2. Вегетативные клетки Вас.Ш1гл.п£1еп518 обладают фимбриями, структурированным слоем клеточной стенки я микрокапсулой, выявляемой у Э-форм. ___

3. споры подвидов Вас. Ишгз^хепзхв различаются по тонкой структуре экзоспориума,покровов,толщине кортекса.

4. споры различных подвидов вас. 1Ьиг:^1епз18,за исключением подвида с1епс1го1т18,обладают уникальными поверхностными структурами белковой природы - выростами.Имеются выросты трех морфологических типов: тубулярные.филаментоэные.цилиндрические.В зависимости от подвида у спор доминирует определенный тип выростов. Функцией выростов является обеспечение спорам способности прикрепляться к различным поверхностям,в том числе и к листьям,что необходимо для попадания в кишечник насекомого.

5. Подвиды Вас.^ига^аеп®!® (адгезивно-активные штаммы) обладают гемагглютинирующей активностью.Способность вызывать реакцию гемагглютинации может служить дополнительным признаком для внутривидовой дифферениировки.

I-. Форма и тонкая структура кристаллов эндотоксина коррелируют с патотипом,что может быть нспользовано для скрининга штаммов с определенным спектром энтомоиидного действия.

~>. саги Вас. Иш^г^хепв^Б относятся к 5 морфологическим ти-Ш1М ( А1 , Б1,в;,С1,С2).различаются по спектру литического действия и физико-химическим параметрам ДНК.

к. Подвиды Вас.1Ьиг1пц1епз15 различаются по фагочувствитель-ности и особенностям лизогенного состояния.Природные изоляты эн-томопатогенных бактерий не могут быть внедрены в производство без предварительной селекции по признаку фагоустойчивостк.

Апробация работы.Материалы диссертации доложены или представлены: на Международном симпозиуме "Сборка пред&иологических и биологических структур".Москва,197 9; XII Международном микробиологическом конгрессе.Мюнхен,1978: XI Всесоюзной конференции по электронной микроскопии,Таллинн,197 9; ХП Всесоюзной конференции по электронной микроскопии.Москва,1982; Всесоюзном совещании "Цитология микроорганизмов".Пущнно,1984; Всесоюзном симпозиуме "Криогенные методы в электронной микроскопии".Пуиико,1985: XIII Всесоюзной конференции по электронной микроскопии.Звенигород,1988; Всесоюзной конференции "Проблемы создания и применения микробиологических средств зашиты растений".Велегож,1989; Международном симпозиуме "молекулярная биология Вас. Ишги^епв^я".Сан-Франциско, 1991 .

Структура и объем работы.Настоящая диссертация состоит из 2-х томов (основная часть и приложение).она содержит 238 страниц

машинописного текста.В ней имеется обзор литературы,описание объектов и методов исследования.экспериментальная часть.общее заключение и выводы.Результаты проиллюстрированы 236 микрофотографиями, 2 схемами,3 графиками,-27 таблицами.Список цитируемой литературы включает 282 публикации.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ H МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Бактерии.Штаммы Вас.thuringiensis получены из коллекции музейных культур ВНИИ генетика и Пастеровского института (Париж). Штамм Bac.cereus GP-7 получен от д-ра Гебеля (ФРГ).Штамм Вас. sphaericus получен от д-ра юстена (США).

Фаги.Использованные в исследованиях фаги получены из коллекции ВНИИ Генетика и ЦЗЛ заводов-производителей средств завиты растений.Ряд фагов выделен в процессе настоящей работы.

Среды.В качестве питательных сред использовали бульон и агар Хоттингера,дрожже-полисахаридную_ среду и минимальную среду (Nickerson a. Bulla,1974) с необходимыми добавками.

Выделение культур энтомопатогенных бактерий,определение их видовой принадлежности и биологической активности проводили по стандартным методам.

Передачу плазмид при смешанном культивировании проводили по методу Gonzalez et al.(1982).

Выделение фагов из почвы,лизогенных культур и фаголнзатов проводили по методам,описанным ранее (Азизбекян,1980).

Титрование фагов проводили по методу Маиса (1961).

Выращивание,концентрирование и очистка фагов. Препараты фа-

гов получали методом сливного лизиса на плотной питательной среде .Аля концентрации фагов использовали метод дифференциального центрифугирования.Окончательную очистку фагов проводили в ступенчатом или линейном градиенте хлористого цезия.

Выделение фаговых днк проводили методом фенольной депротеи-ннзации или с помощью термического шока.

Определение нуклеоткдного состава фаговых ДНК проводили методом термоденатурации совместно с Тягловым Б.В., расчет мол.% ГЦ осуществляли по уравнению ы.Франк-Каменецкого (1971).

Рестрикционный анализ фаговых ДНК.Обработку днк рестрикцион-иыми эндонуклеазаии проводили согласно методам,описанным в руководстве по генетической инженерии (Маниатис с соавт.,1984).

Выделение плазмидной днк проводили по методу Birnboiœ а. Doly (1979) и Gonzalez a. Carlton (1980).

Для получения очищенных кристаллов использовали двухфазный метод в модификации Честухкной (1990).

Получение меченной ферритинои сыворотки проводили по методу Singer a. Schick (1961).

Иммунофернентиый анализ.Споро-кристаллическую смесь суспендировали в физиологическом растворе и обрабатывали КаОН.После инкубации в щелочи из суспензии центрифугированием удаляли споры. Полученный супернатант разводили забуференным физиологическим раствором и наносили на нитроцеллюлозные фильтры.Фильтры инкубировали с антисывороткой,полученной при иммунизации кроликов электрофоретически гомогенным,очищенным от спор,препаратом кристаллов. После обработки антисывороткой фильтры инкубировали с антикроличьими антителами,конъюгированными с пероксидазой.и затем окрашивали диаминобензидинои.

Электронная микроскопия.Электронномикроскопически исследо-

вали бактериальные клетки,споры,кристаллы,фаги.фаговую и плазмид-ную днк.Исследования проводили в трансмиссионном (ЛЕМ-ЮОВ) и сканирующем (Hitachi s-45 ) электронных микроскопах.препараты готовили по стандартным методам (Тихоненко А.С.,1968; Ryter'et al., 1958 и др.). Оптическая дифракция и фильтрация выполнена Михайловым a.m. (ин-т кристаллографии ан ссср).

Замораживание-травление препаратов кристаллов и спор проводили на установке BAF-301 совместно с Григорьевым В.Б. (Ин-т вирусологии им.Л.И.Ивановского АМН СССР).

Препараты для электронной микроскопии ДНК готовили, по методу Kleinschmidt et al.(1962) и Davis et al.(i97i).

Адгезивные свойства втаммов Bac.thuringiensis изучали в реакции гемагглитинашга (РГА) эритроцитов человека,разных видов животных и птиц (Далии,Фиш,1985).Этот раздел работы выполнен совместно с Кулииич л.И. (Отраслевая научно-исследовательская лаборатория экологической иммунологии и аллергологии мма им.И.М. Сеченова).

Для измерения адгезии к стеклу использовали покровные стекла. Часть стекол покрывали гидрофобной пленкой из поливинилформальде-гида (формвара). Клетки для этих опытов растили на среде,содержа-ией^С-урацил. Мерой адгезии бактерий к гидрофобной поверхности служило соотношение радиоактивности на обычных стеклах и на стеклах, покрытых формваром.

Для количественной оценки адгезии спор и кристаллов был применен эпифлуоресцентный метод (Поглазова М.Н..Мицкевич И.Н.,1984). Этот раздел работы выполнен совместно с поглазовой М.Н. и Мошков-цевой a.b.

Поверхностную гидрофобность определяли методом солевой агрегации (Lindal et al.,1981) н с помощью гексадекана (Koshikawa

а1.,1989).

Молекулярную массу структурного компонента споровых выростов определяли с помощью электрофореза в полнакрилашшкш геле в присутствии ЭОБ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ХАРАКТЕРИСТИКА ВЕГЕТАТИВНЫХ КЛЕТОК

Структура поверхности вегетативных клеток.Поверхность вегетативных клеток Вас. йигхп^хепэхБ характеризуется наличием жгутиков ,фнмбрий,иикрокапсулы (у Б-фори).У Вас.^игзлщхепзхБ наблюдается перитрихиальное расположение жгутиков,имеющих типичную для грамположительных бактерий структурную организацию.У изученных подвидов при электронномикроскопическом исследовании не были обнаружены различия в структуре жгутиков.Помимо многочисленных жгутиков были найдены единичные тонкие выросты с каналом,аналогичные по внешнему виду Р-фимбриям граиотрицательных бактерий.до настоящего времени фямбрии у бацилл описаны не были.Наличие фимбрий -отличительный признак Вас.Ишгн^ет^в.

В связи с проблемой колониально-морфологической изменчивости проводились электронномикроскопические исследования,направленные на выявление капсулы (иикрокапсулы).С целью обнаружения этой структуры клетки из Б и К-колоний обрабатывали рутениевым красным. У бактерий,образующих колонии Б-формы,обнаружена аморфная элект-ронноплотная микрокапсула,способствующая их агрегации и плотной упаковке.У (г-форм микрокапсула отсутствовала,что способствовало свободному перемещению бактерий.

Изучение поверхности вегетативных клеток методом негативного контрастирования показало,что в состав клеточной стенки Вас. 1Ьи-ringiensis входит структурированный слой (С-слой).образованный

тетрагонально уложенными субьединицами кольцевой формы диаметром , 7,0-7,5 нм.Расстояние между центрами частиц - 13 км. Регулярное расположение субъединиц отчетливо выявляется после обработки клеток фагом Т|> 13.Наличие ассоциатов Tg 13 - С-слой после очистки фаголизатов в градиенте плотности хлористого цезия свидетельствует о высокой степени сродства фага и С-слоя,что указывает на его возможную фагорецепторную функцию. Как показал сравнительный электронномикроскопический анализ,параметры С-слоя Вас.Ш)г:п^1еп-и Вас.ЕрЬаег1сиз совпадают,что подтверждает универсальность организации структурированной оболочки бацилл.

На ультратонких срезах клеточная стенка имеет трехслойное строение.Толщина клеточной стенки достигает 30 нм.Контраст наружной и внутренней поверхности клеточной стенки повышается после обработки рутениевым красным,что свидетельствует о наличии кислых полисахаридов.

Рост и деление.Растущие и делящиеся клетки Вас.1Ьиг1пдхеп518 проходят несколько хорошо различимых морфологических стадий.За увеличением клеточной поверхности следует образование перегородки , разделение дочерних клеток и утолщение клеточной стенки.Нарушение деления,сопровождающееся образованием "иини" клеток, было обнаружено нами у отобранных по устойчивости к рифампицину мутантов.

В процессе работы определяли некоторые характеристики роста при выращивании на полноценной питательной среде (бульон Хоттин-гера) у Вас.Ш1г:н^1еп518 БиЬзр.Ит^г^епэхв.депсЗгоНтиБ,да11е-г1ае.Исследования показали,что взятые в опыт штаммы различались по характеру роста.Вас.{.Ьиг^аепяхв subsp.dendroli.nus характеризуется более затянутым лаг-периодом роста,тогда как Вас.Ишг1п£1-ensis зиЬир^аПе^ае быстрее вступает в логарифмическую фазу.

Замедление темпа роста наблюдали у природного и производственного штаммов Н4 серотипа.штаммы Н1 серотипа относятся к быстрорастущим и незначительно различаются по скорости роста. Время генерации для итамма Н5 серотипа и трех штаммов Н1 серотипа составило .4 0 мин., а для штамма Н4 серотипа - 51 мин.

Цитологические аспекты протопластирования.слияния протопластов и трансцепши. При хранении и пересевах в популяциях знтомо-патогенных бактерий накапливаются аспорогенные варианты,утерявшие способность к кристаллообразованию. Утрата способности к споро- к кристаллообразования» сопровождается появлением дефектных по клеточной стенке бактерий и длинных неделяиихся нитей.дефектные по клеточной стенке бактерии и протопласты были обнаружены нами при изучении аспорогенкого мутанта.полученного спонтанно после отбора и клонирования по Б-морфологии колоний Вас. Иаигхг^хепБав яиЬвр. gaПeгiae и обозначенного как 135 5ро".У данного мутанта из-за нарушения целостности клеточной стенки без воздействия внешних Факторов происходило слияние протопластов и клеток с дефектной оболочкой.

Способность к спонтанному образованию протопластов у Вас. 1Ьиг1пр1епк18 сочетается с устойчивостью к лизоциму и трудностью получения лизоцимных протопластов, используемых для получения ре-комбинантных штаммов методом слияния протопластов. К моменту начала исследования этот процесс у энтомопатогенных бактерий цитологически не был изучен. Принимая во внимание устойчивость клеточной стенкк Вас 1Ьиг1^1еп51.<; к лизоциму, представляло интерес провести электронномикроскопический анализ лизоцимных протопластов и продухтов слияния. При просмотре срезов лизоцимных протопластов оказалось, что они не полностью свободны от клеточной стенки. При электронномикроскопическом анализе продуктов слияния.

полученных с помощью полиэтиленгликоля (ПЭГ), выяснилось, что нэ-за сохранения протяженных участков клеточной стенки взаимолеисг-вие между протопластами осуществляется на ограниченном участке поверхности. При этом образуется "мостик", в котором прослеживаются остатки индивидуальных мембран каждого протопласта, перестающих нести свою разграничительную функцию и не препятствующих слиянию. Слияние.индуцированное ПЭГ, аналогично процессу, происходящему спонтанно. В обоих случаях контактируют ограниченные участки поверхности с образованием мостиков .

Слияние протопластов или клеток с дефектными . клеточнымг стенками создает условие для переноса генетической информации. Однако более эффективный способ введения чужеродной ДНК - конъюг-ационно-подобная передача генетической информации (трансцепиия). Механизм конъюгации у грамположительных бактерий во многом не ясен и слабо изучен. Представляло интерес провести электронномик-роскопнческое изучение трансцепшш и трансципнентов.Нами была выявлена способность к гомологичной и гетерологичной трансцепшш у не изученных в этом отношении штаммов. Электронномнкроско-пнческое изучение проводилось после смешанного культивирования Вас. 1Ьиг1пд1еп515 Н5Г11 ТМ'Шс виа 51г!''1?1Г!^45Сгу + и Вас.сегеи;; Тс^р-Т (рВС1б) Tg4f,.Смесь штаммов Н5Г11 и СР-7 высевали на среду с тетрациклином.При светооптическом контроле среди Тс"-клонов были выявлены клоны.образующие кристаллоподобные включения.тснОгу+-клоны имели все признаки реципиентного штамма бР-7 - прототрод-ность.устойчивость к фагу Tg4,чувствительность к стрептомицину и рнфампншгну,отсутствие реакции с иммунной сывороткой к Н5 сероти-пу.что позволило считать ТсчСгу*-клоны производными штамма Вас.сг-геия СР-7.приобретшими способность к синтезу кристаллов,Трансин-ппенти обедали разным уровнем инсектицидно» активности. л\я лек.!-

- IS -

зательства того,что Сгу+-призкак Тсн-итаммов Bac.cereus действительно связан с передачей Сгу^-плазмяды втамма Н5Г11.анализировали плазмидные профили родительских штаммов и Тс * Cry * —клонов.В клетках донорного штамма Н5Г11 обнаружено 7 плазмид,из них две расположены выше хромосомы.В клетках реципиента - штамма GP-7 выявлялись две плазмиды (2,« ида и 23 мда).В клетках Сгу+-клонов обнаруживалась плазмида с электрофоретической подвижностью плазмиды рвС16 (2,8 мла) и высокомолекулярная плазмида,расположенная на уровне одной из высокомолекулярных плазиид донорного штамма.

Полученные данные позволяют считать,что плазмида рВТИ,видимо, кодирует синтез эндотоксина и при переносе в Bac.cereus dp-7 сообшает этим клеткам способность к токсинообразованию.дополнительные данные о способности трансципиентов к продукции белка эндотоксина были получены с помощью имиуноферментного анализа.

Электронномикроскопическое исследование трансципиентов показало, что они имеют ультраструктуру спор,типичную для Bac.cereus GP-7.Выло обнаружено,что при смешанном культивировании в жидкой среде имеет место агрегация бактерий и образование межклеточных контактов,необходимых для передачи плазмид.Анализ зоны контакта показывает,чго создаются условия для нечувствительного к ДНК-азе переноса генетической информации с помощью мембранных структур.

ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАСТРУКТУРЫ СПОР И КРИСТАЛЛОВ

Светооптические и электрокномикроскопические исследования показали,что подвиды Вас.thuringiensis на стадии вегетативного роста не имеют выраженных морфологических различий.Представляло интерес выяснить,насколько однородна ультраструктурная организация спор у разновидностей Вас.thuringiensis.На первом этапе исследования анализировали ультраструктурные изменения при споро- и

кристаллообразовании у неизученных в этом отношении подвидов.

Объектами исследования служили Вас.thuringiensis subsp.galle-riae и insectus,используемые для производства отечественных энто-моцидных препаратов,знтобактерин и инсектин.Результаты исследования показали,что споруляция у этих подвидов происходит по плану .характерному для бацилл.

Кристаллообразование приурочено к III стадии споруляции,как и у ранее изученных птаммоа.отличительная особенность подвида galleriae - образование наряду с кристаллами параспоральных включений споровых покровов, освобождающихся вместе с, кристаллами при лизисе спорангия.С использованием иммуноцитохимическнх методов обнаружено серологическое родство включений споровых покровов и кристаллов. У подвида insectus выявлено характерное отличие - образование дополнительного электронноплотного ворсинчатого слоя снаружи от пластинчатого слоя покровов.На заключительном этапе спорообразования формируются зрелые споры,окруженные многослойной оболочкой.На ультратонких срезах спор видны сердцевина, наружная и внутренняя проспоровые мембраны,зародышевый слой клеточной стенки,кортекс,покровы,экзоспориум.При негативном контрастировании спор выявляется регулярная структура базальной мембраны экзоспорнума.с помощью оптической дифракции установлено,что субъединицы базальной мембраны имеют правильную гексагональную упаковку.На фильтрованном изображении экзоспорнума видны "усредненные" морфологические субьедишшы с отверстиями в центре. Это согласуется с представлением об экзоспориуме как о порозной структуре.

В случае вас.thuringiesis subsp.galleriae применение метода негативного контрастирования позволило впервые обнаружить споровые выросты двук типов - тонкие,филаыентозные и более толстые

трубчатые, напоминающие пили грамотрицательных бактерий. Толщина трубчатых и филаментозных выростов 10 нм и 3 ни, соответственно, длина значительно превышает поперечник споры и достигает в отдельных случаях 13 мкм. изучение спор методом замораживания-травления позволило выявить палочковидный (СР) и дырчатый (Р) слои споровых покровов. На криофрактограммах спор штамма 11-67 подвида £а11ег1ае обнаружен сплошной СР-слой, раннее описанный только у подвида авгаеХепБХБ . В дополнение к подвидам £а11ег1ае и хпэес^Б электроиномикроскопически были изучены споры Вас. Ышгы^епз^Б виЬБр.ГХп^гтиз.йепйгоНшиБ ,киг51акз.,тогг1501п., 15гае1епз18.

Исследовались споры производственного и двух природных штаммов подвида дехиЗгоИтиэ. Споры всех трех штаммов окружены экзос-пориумом, но лишены споровых выростов, типичных для подвида £а11ег1ае. обнаружены штаммовые различия в строении покровов. У одного из природных штаммов наблюдается гиперпродукция ламелляр-ного слоя покровов . В отличие от спор подвида £а11ег1ае избыточный компонент покровов остается структурно связанным со спорой. Штаммы различались по толшкне кортекса, более развитого у производственного итаима по сравнению с природными.

Споры Вас. 1.Ьиг1^1епз15 зиЪЕр.кш^ак! окружены экэоспориу-мом с выростами, аналогичными виЬзр^аПегаае. При негативном контрастировании обнаруживается продольная исчерченность экзоспо-риуиа, указывающая на присутствие подлежащих слоев.просмотр ультратонких срезов спор подтвердил наличие пластинок, примыкающих к внутренней стороне базальной мембраны. Экзоспориальное пространство спор заполнено элементами базальной мембраны экэоспориума и необычными структурами типа "клубков" из тонких волокон. 'Клубки* формируются в спорангии вместе с кристаллом и овальными тельцами - характерной особенностью этого штамма, они не подвергаются

разрушению одновременно с цитоплазмой материнской клетки и пространственно разобщены с овоидными тельцами, которые при дальнейших структурных перестройках оказываются тесно спаянными с кристаллами. 'Клубки' остаются внутри экзоспоркума или же освобождаются при лизисе спорангия.

Споры Бас. Ишг:ищ1епз18 эиЬзр. погг1зоп1 окружены экзоспо-риумом с выростами. Споры имеют характерное отличие - покровы содержат необычный аморфный слой снаружи от ламеллярного, утолщающийся на полюсе споры.локальная гипертрофия аморфного материала и отпочковывание от покровов приводит к образованию включений в эк-зоспорпуис.В результате этого процесса в экзоспориальном пространстве появляется второй кристалл подобно Вас.thuгingiensis зиЬзр.Ггпз-Нгшз.споры подвида шоггтяопт покрыты сплошным СР-слоем как и споры БиЪБр.galleгiae,1згае1епз18.

Споры Вас.йиглт^аег^Б виЬяр. 18гае1еп51з имели характерные многочисленные выросты,отличающиеся от трубчатых и филаментозных и представляющие собой сплошные цилиндрические структуры толщиной 4 нм и длиной около 4-5 мкм.для них характерна агрегация бох о бок,приводящая к образованию своеобразных пучков,на поверхности которых удается выявить периодическую исчерченность.Покровы на ультратонких срезах представлены ламеллярным и аморфным слоями.На криофрактограммах выявляется сплошной СР-слой.

Таким образом.изучение спор различных подвидов

Вас.И1иг:й^1ел5±5 показало,что они различаются по тонкому строению. Можно выделить следующие основные морфотипы спор: 1 - споры, при образовании которых синтезируется избыток ламеллярного компонента покровов; 2 - споры,характеризующиеся гипертрофией аморфного слоя покровов; 3 - споры с дополнительным необычным слоем снаружи от покровов-, 4 - споры с многослойным экзоспориу-

мом; 5 - споры с относительно тонкой наружной оболочкой без дополнительных слоев экзоспориуиа и покровов.Кроме того,показаны различия по споровый выростам,их количеству н морфологическим характеристикам (Рис.1).У различных подвидов ВасЛЬигы^епБ^Б обнаружены покровы типа Вас. сегеиэ (наличие сплошного СР-слоя).показано, что споры штаммов Вас. Ншги^1еп818, используемых в качестве основных производственных продуцентов,характеризуются многокомпонентной споровой оболочкой, включающей экзоспориум,развитые покровы и кортекс.

С целью получения более полной информации о структуре кристаллов эндотоксина было проведено электронномнкроскопическое исследование кристаллов подвидов ап8ес1и5,Г1пН1ти8,кигБ1ак1.,с1епс1го-11ти5^а11егаае,вюгга8ош.,18гае1еп815,различающихся по спектру энтомоцидного действия.Изучение кристаллов проводилось методами негативного контрастирования, ультратонких срезов, замораживання--травления.Наибольшим полиморфизмом в группе активной против чешуекрылых отличались включения подвида £а11ег1ае.Наряду с бипира-мидальными обнаружены кубоидные и аморфные включения.Кристаллы большинства подвидов характеризовались правильной бипнраиидальной формой и располагались,за исключением НлиИвшв и вогг1Боп1,снаружи от экзоспориума.На их поверхности при негативном контрастировании выявлялась поперечная исчерчениость.Ка криофрактограммах были обнаружены ряды плотноупакованных субъединиц гантелеобразной формы.У подвида тотг^эопх обнаружено несколько кристаллов в одном спорангии,один из которых располагался внутри экзоспориума.

Кристаллы подвида ¿8гае1епз1з,токсичные для двукрылых,отличались по внешнему виду от кристаллов,активных против чешуекрылых. Они не имели правильной геометрической формы и были окружены оболочкой. На их поверхности при негативном контрастировании наблюла-

ли сетку с косоугольными ячейками.Параметры ячейки: а -9 им,о -13 нм,а-70°.у кристаллов подвида 15гае1епз18 независимо от разь'-р:. и формы не удавалось выявить поперечную исчерченность,хара>лерну для кристаллов,действующие на чешуекрылых.Таким образом,кристалла эндотоксина с различным спектром эитомоииляого действия различаются по характеру укладки субъедиииц.

Особенности СТрОвНИЯ СПОр у ПОДВИДОВ Вас . 1Лигап»'Деп£1г и Bac.ce.reus. 1-зиЬзр.1.пзес'ЬиБ; 2-зиЪзр.:Г1тгд.гпие; 3-виЬвр.!си1Б1ака; Да-виЬзр.йепдгоИтиз 79/31 '.ДЪ-зиЪяр. (ЗепйгоИтиа 1013; 5-еиЪар.2а11ег1ве; 6-зиЬэр.тогг1Ео!:1 7-БиЪзр.1/эгае1епз1з; 8-Вас.сегеиз 0Р-7.

В - выросты, Э~ экзоспориум, П- покровы, К- кортекс Ш - наружная; мембрана, В1Л - внутренняя мембрана.

АДГЕЗИВНЫЕ СВОЙСТВА ВАС. ТШК1Ш1Е№18

Одним из условий эффективности применения энтомоцидных препаратов является их способность удерживаться на обрабатываемых поверхностях.У многих бактерия для прикрепления к различным субстратам служат клеточные сгруктуры.обоэначаемые как пили (фимбрнн). Характерным свойством пилен грамотрицателъных бактерий является их способность вызывать реакцию гсмагглютинации (РГА).для выявления пилированных клеток применяются также методы,оценивающие поверхностную гидрофобность,возрастающую при экспрессии пилей.Сходство морфологии обнаруженных нами споровых выростов с пилями грамотрицателышх бактерий побудило нас исследовать адгезивные свойства этих структур на модели РГА и изучить влияние выростов на поверхностную гидрофобность спор.

По данным электронной микроскопии споры подвидов galleгxae, ки^ака снабжены трубчатыми выростами,тогда как споры подвида йепйгоНшия их не имеют,а у спор подвида 18гае1еп8аБ преобладают цилиндрические выросты.Изучение взаимодействия с эритроцитами спор,различающихся по выростам,показало,что споры подвидов £а11е-гхае и кигз1ак1 ,в отличие от спор подвида йепсЗгоНпшБ.вызывают агглютинацию эритроцитов морской свинки,цыпленка,крысы,но не агглютинируют эритроциты человека,барана,быка.Слабая гемагглютиннру-юшая активность спор подвида 18гае1ехш1в по сравнению со спорами штаммов 5а11ег1ае и кигв1ак1 указывает на то,что за РГА отвечают трубчатые выросты,имеющиеся у этого штамма в меньшем количестве. Изучение гемагглютюшруюшкх свойств различных подвидов показало, что способность спор вызывать агглютинацию эритроцитов может быть использована для их дифференцировки.По данному признаку

штаммы 11 подвидов были отнесены к 6 различным типам (табл.1).

Таблица 1.

Классификация штаммов по способности к РГА

Подвид ( "еротип Число -РГА, 1/ТИТр- Группа

штаммов морская крыса курица

<1еш1го11ои8 4аЬ 2 1-2 1 1 А

^игдт^епя^Б 1 2 1 32 16 В

д-пзес^з 1 1 1 16 16

15гае1епз1з 14 2 4 64 16 с

fi.nit.inus 2 1 1 16 1

Ш0гг150п1 8аЬ I 1 64 1 О

darmstadiensislо 1 1 32 1

кигз1ак1 ЗаЬ 2 64-128 128 128

да11ег10е 5аЬ 3 64-128 128 64 Е

tenebгionis 8аЬ 1 64 128 64

wцhanensis 1 4 4 1 Г

При использовании ряда Сахаров ^-маннозы .лактозы .галактоза-мннаД-ацетилглюкозамина) не удалось выявить торможения РГА этими сахарами.которое могло бы свидетельствовать о специфичности взаимодействия спор с рецепторами эритроцитов,содержащими остатки со-

ответствующнх Сахаров.

Была выявлена корреляция между гидрофобностью спор.определя-eMoíi по сродству к гексадекану,наличием трубчатых выростов и способностью вызывать агглютинацию эритроцитов.Изучение гидрофоб-ностн с помощью метода солевой агрегации дало сходные результаты. Споры подвида galleriae,облагающие хорошо развитыми выростахи трубчатой формы.слипаются и выпадают в осадок при значительно меньшей ионной силе раствора,чем споры штаммов подвила dendrolira-us, лишенные таких выростов.Концентрация (NH^SO^j.требуемая для осаждения клеток.служила косвенным показателем гидрофобности их поверхности.

Окончательную оценку адгезивности спор проводили с помощью прилипаемости спор к стеклу.Сравнение адгезии спор к чистому стеклу и к стеклу.покрытому гидрофобной пленкой .показа/го, что обработка формваром способствует прикреплению спор штаммов подвида galleriae.Выраженность РГА.уровень адгезии к покрытому формваром стеклу и чувствительность к ионной силе раствора коррелирует с наличием на поверхности спор трубчатых выростов,которые,видимо, способствуют неспецифической адгезии спор к различным поверхностям iтаЬл.2).Изучение свойств трубчатых выростов выявило их исключительную стабильность.При электронной микроскопии не обнаружено каких-либо изменений этих структур после центрифугирования, обработки мочевиной и пронаэой.В связи с прочностью прикрепления выростов к спорам для их удаления суспензию спор в 6М гуанидинхл-ориде подвергали ультразвуковой обработке.В полученных экстрактах ппдвида çalleriae была обнаружена белковая полоса с мол.массой 24 ю.а,полностью отсутствовавшая в экстрактах спор подвила dendroli-rîus. Таким образом.есть основания предполагать,что споровые выросты содержат белок с мол.массой 24 кда.

Таблица :.

Характеристика выростов на спорах

Наличие выростов РГА Адгезия Высгг-

Штамм Подвид труб- фила- цилин- 1/титр к стеклу лива-

чатые мент- дриче- срм/срм нме

озные ские 1 /М

69-6 galleгiae ++4 + - 128 2 2 5,0

11-67 galleriae 4+4 + - 64 1 ,6 1 .6

79/31 бепйгоИтиБ - - - 1 0,» 0,6

1 13 депбгоНпиз - - - 1 0,6 0,55

НД-1 кигв1ак1 +44 + - 64 Н.д. 5 , С

1Р5-82 1згае1еп818 4 - 44-4+ 4 Н.д. 0,5

Примечание:жОтноиение радиоактивности на стеклах .покрытых формва--ром.к радиоактивности на обычных стеклах; АЛ Нет данных.

для выяснения вопроса о роли споровых выростов в прикреплении спор к их природным субстратам - листьям растений в качестве количественного метода измерения адгезии спор к различным поверхностям был применен эпифлуоресцентный метод прямого счета частиц, смытых с исследуемой поверхности на мембранный фильтр.В качестве модельной поверхности для подбора оптимальных условий прикрепления спор к листьям были использованы покрытые формваром стекла.Было показано,что споры с выростами (подвил раНепае; обладают лучшей адгезией к листьям,чем споры без выростов (подвил <5еп(Зго1:пгш8).Прикрепление спор к листьям оказалось более прочным,

чей к формваровои плевке,что могло быть связано как со сложной формой поверхности листа,так и с наличие» специфических рецепторов узнаваемых споровыми выростами.

В результате подсчета кристаллов,осажденных на фильтрах,не выявлено каких-либо различии в прикреплении кристаллических эндотоксинов подвидов £а11ег1ае и йешЗгоИвшв ни к формваровой пленке ни к поверхности листа.

ФАГИ ВАС.ТН1Ж1Ы(31ЕЫ518 Фаги различного происхождения,выделенные из почвы,лизогенных культур,промышленных фаголизатов характеризовались структурным разнообразием,значительной вариабельностью биологических свойств и физико-химических параметров.

Ультраструктура и спектр литнческого действия.Среди фагов Вас. ^игы^епБхв были обнаружены представители 5 морфологических групп: фаги с . сокращающимся отростком и изометрическим капсидом (А1); фаги с несократаювимся отростком и изометрическим капсидом (В1); фаги с несокраиаюиимся отростком и вытянутым капсидом (В2); фаги с коротким отростком и изометрическим капсидом (С1); фаги с коротким отростком,вытянутым капсидом и характерной структурой типа "воротничка" (С2).Фаги группы В1 и В2 вариабельны по строению дистальной части отростка (рис.2).

Одной из основных характеристик фагов является спектр лити-ческого действия.для неизученных в этом отношении фагов был определен круг хозяев.обнаружена определенная корреляция между спектром литического действия и ультраструктурой вирионов.Фаги А1 -морфологии ииеют более широкий круг хозяев по сравнению с представителями других морфологических типов.Установлено,что фаги.нме-юиие сходную морфологию,различаются по спектру литического дейс-

твия.Так,"почвенные" фаги группы А1 обладают более аироким кругом, хозяев по сравнению с ■производственными".Фаг Д5 из группы В1 лн-зирует подвиды ки^ака.йепсЗгоНииэ,galleгiae>нo не подвид ^игд,-пдхепягз,чувствительному к идентичному по морфологии фагу'БТЕ.

Культуры 81,101 и 351 подвида galleriae лизогенны по "ворот-ничковым" фагам т$>81,тд101 и Тё20.соответственно.'Воротничковые' фаги С2-морфологии (тg20,тg48,тg8ltтgl0l) имели узкий спектр ли-тического действия,лизировали подвид кигз1ака,а в отношении подвида gaHeгiae их действие штаммоспецифично.Было показано,что фаги Т£81 и Т£101 в отличие от фага Tg20 неспособны лизировать собственные штаммы,из которых они были выделены,т.е. культуры 81 и 101 были иммунны к суперннфекиии фагами Tg8l и TglOl.вce "воротничковые" фаги оказались гомоиммунными.так как не были способны развиваться на штаммах 81 и 101.Вместе с тем способность этих фагов лизировать штамм 351 могла свидетельствовать о том,что профаг Tg20 дефектен по синтезу репрессора.

Физико-химическая характеристика фаговых нуклеиновых кислот.Исследовались физико-химические свойства ДНК представительных фагов каждой морфологической группы.

Электронная микроскопия днк.При электронномикроскопическом анализе ДНК "воротничковых" фагов Tg20.Tg48.Tg8i ^101 и фагов Д5, БТБ.Т1п1,Т14 наряду с линейными молекулами были обнаружены кольцевые ,указывающие на наличие "липких" комплементарных кондов,способных к спонтанному взаимодействию.Молекулярные массы ДНК фагов рассчитаны исходя из контурной длины.В качестве внутреннего стандарта длины использовали плазмиды рВР.322 и Со1Е1 .В препаратах ДНК фагов Тш2 и Т§27 после денатурации с последующей ренатурацией в присутствии формамнда были найдены двунитевые кольцевые молекулы с однонитевыми ответвлениями,что свидетельствовало о циркулярной

л 1)

ТчИ

Рис. 2 Фаги Вас.thuringiensis пермутацни молекул и наличии концевых повторов.Средний размер кольцевых молекул,т.е.геномов фагов Ти2 и 7^27,составлял 45,2+1,9 и 42,5+0,8 т.п.н., соответственно, одконитевые отростки, длина которых соответствует величине концевого повтора,были измерены относительно однонитчатой ДНК фага Г с!. Размер концевых повторов у фага Тш2 - 2,7+0,4 г.п.к.,а у фага Т027 - 5,0+0,5 т.п.н. Сумма величин геномов фагов Тп2 и Tg27 и концевых повторов в пределах точности измерения совпадала с размером молекул нативной ДНК.выделенной из зрелых частиц.Фаги Тт2 и Tg27 различаются по размерам генома и концевого повтора,ко близки по размерам инкапсулированной ДНК. для Вас. Ишгаг^аепзгБ это первые описанные фаги с подобными физическими параметрами дне.Интерес к, ним связан с их способностью осуществлять общую трансдукцию.длина инкапсулированной ЛКК у таких фагов определяется только емкостью капсида.и упаковка происходит без узнавания ДНК специальными белками головки.В случае делеткрования части генома деления компенсируется увеличением концевого повтора,как это было показано для ряда фагов.Представляло интерес выяснить,является ли фаг Tg2 7 делеционным мутантом

фага Тп2,Степень родства фагов Тп2 и Tg27 была определена с по- • мощью гетеродуплексного анализа.

При отжиге предварительно денатурированных ДНК фагов Тш2 и Tg27 были обнаружены гетеродуплексные молекулы с двумя областями негомологии в виде однонитевой петли и неспаренного участка.образующего "равноплечий' пузырек.Область петли вставочно-делеционно-го типа имеет размер 2,9 т.п.н. "Равноплечий" пузырек (5,0 т.п.к.) может бить обусловлен инверсией данной области,либо замещением генетического материала.Таким образом,гетеродуплексньш анализ подтвердил наличие делении в геноме Tg27.

методом гетеродуплексного анализа определяли родство "ворот-ничковых" фагов,выделенных из почвы (Т048).лизогенных культур (ТвЮ1) и производственных фаголизатов (к).Анализ гетеродуплекс-ных молекул выявил гомологию практически по всей длине гибридных молекул,за исключением области негомологии вставочно-делеционного типа в виде небольшой однонитевой петли.Размер петли в гетеродуп-лексе Tg48/Tgl0l составил 0,75 т.п.н.,а в гетеродуплексе К^48-0,45т.п.н.Таким образом,"вортничковые"фаги обладают высоким уровнем ДНК~ДНК-гомологии,хотя и не полностью идентичны.Обнаружение близкого родства между "почвенными*,"производственными" фагами и аналогичными фагами из лизогенных культур свидетельствует о том, что фаголизис при использовании штаммов подвида gaXleгiae (производство "энтобактерина') может вызываться как эндогенными,так и экзогенными фагами.

Рестрикционный анализ.Геном фагов из различных морфологических групп исследовали с помощью сайт-специфических рестриктаз.Фаги группы а1.выделенные при производстве дендробациллина и обладающие широким спектром лктического действия,оказались наиболее устойчивы к большинству использованных рестриктаз.в том числе и к

выделенным из Вас. ишги^ехвдя - Bt.il ,В1и1 ,В1с1.Только две рест-триктазы НхпдШ и РуцЦ имели сайты узнавания на ДНК этих фагов. С помощью комбинации рестриктаз,специфичных в отношении метилированных ЛНК,исследовали механизм антирестрикщш этих фагов.Использовали чувствительную к бас-метилированию рестриктазу ЫЬоХ и узнающую ту же последовательность (бАТС).нечувствительную к <1ап-ме-тилированию,рестриктазу БаазА.Отсутствие гидролиза фаговой ДНК как в случае МЬо1,так н ЭаиЗА не подтвердило предположение о метилировании оснований ДНК в данном сайге.

ДНК фагов морфологических групп В1.В2.С2 гидролизовались ре-стриктазами ЕсоК1 .ВврШ ,Нхп<Ш1 .но различались по наличию сайтов чувствительных к рестриктаэе Pvull.no данным рестрикционного анализа фаги из разных морфологических групп различаются по количеству и размеру фрагментов.образующихся при гидролизе их ДНК эн-лонуклеазами рестрикции,но в пределах одной группы электрофорети-ческая подвижность большинства рестрикциокных фрагментов совпадает. Молекулярные массы фаговых ДНК.определенные по сумме рестрикциокных фрагментов,представлены в табл.3.

Молярный состав оснований.Молярный состав оснований определяли на основании температуры плавления (Тп).

ГЦ-состав изученных фагов представлен в табл.3.можно видеть, что все фаги относятся к АТ-типу,их ГЦ-состав близок к ГЦ-составу баътерин-хозяев и колеблется в пределах от 47 до 34%.

Таблица 3'.

Характеристика фагов Вас.Шигм^епэаз

Морфологическая Размеры в нм Шлек.

группа Фаг капсил отросток масса ДНК., иДа гц-состав, %

Тр1 5 80 200X20 72, 47

А1 Д2 ^13 120 90 800X30 300X20

ТС1 90 300X20 6 5^

Ti.nl 64 200X10 33,3^ 42,9

БТБ 60 180X10 29,7^

Т(315 85 480X14 68^

В1 &5 т§4 60 55 180X10 240X14 к 34,67 43,7

Т021 55 200X14 17^

ТшЗ 55 250X14 24,3^

П4 55 200X14 24 ,0 44 , 8

116 35 200X14 8,0^ 45,4

Тш2 55X62 160X15 к. 27,85 37

В2 Т£27 55X62 160X15 к 28,28 37

С1 Т1П5 0 52

С2 Tg20 68X42 42 17,82^ 34

^"мол.массу днк определяли по сумме масс "рестрикционных фрагментов.

;ол.масса днк рассчитана по контурной длине.

ВЗАИМООТНОШЕНИЯ Б СИСТЕМЕ ФАГ-КЛЕТКА лизогения.Фаговые частицы одного или более морфологических типов были выявлены в культурах всех исследованных подвидов,за исключением подвидов thuringiensis и israelensis.y подвидов ales-ti,kurstaki,dendrolinus.tolworthi обнаружены фаги,относящиеся к группе В1,у подвида oorrisoni - фаги В1 и В2-морфологиии.При массовом анализе штаммов Вас.thuringiensis subsp.galleriae выявлены две культуры,спонтанно выделяющие фаги С2-морфологии ("воротнич-ковые•),обозначенные соответственно как Tg8i и TgiOi.B отличие от лнзогенных систем,в которых фаги С2-морфологин сопутствовали фагам Bi-морфологии,культуры 81 и 101 лизогенны только по "воротнич-ковым" фагамВоротничковый" фаг Tg20 систематически выявлялся при размножении методом сливного лизиса на итамме 351 Вас.thuringiensis subsp.galleriae гетерологичиых фагов.При концентрировании в градиенте плотности хлористого цезия наряду с основной полосой размножаемого фага обнаруживалась дополнительная полоса фага Tg2C. "Ворютничковый* фаг Tg20 лизировал свою собственную культуру.Попытки выделить фаг Tg20 без предварительной инфекции культуры 351 гетерологичным фагом оказались безуспешными.Можно предположить, что культура 351 лизогенна по профагу Tg20,который может трансак-тивироваться лишь при суперинфекцкк другими фагами.Аналогичное явление наблюдалось и в случае фага Tin5о,выделенного из Вас.thuringiensis subsp. insectus. Фаг TinsО Cl-морфологии также обнаруживался только при суперифекции гетерологичными фагами.

Культуры трех подвидов (tolworthi.dendrolimus.oorrisoni) бы-

ли полилизогенны и выделяли фаги различной морфологии.Штаммы под- • видов беЫгоИвиз и 1о1»ог1Ы выделяли фаги с крупным и мелким капсидом, обозначенные как Тс! 8 н Тс15 и как Т14 и Л б ,а подвил пог-г15огй - фаги Тш2 и ТпЗ.различающиеся по форме капсидов.

Поскольку титр спонтанно выделенных жизнеспособных фагов относительно низок,была проведена УФ-индукция.уФ-облучение различными дозами не повышало титра фагов Тй8,ТЫ,что контролировалось титрованием и злектронноыикроскопически.При облучении культуры подвида тогг18оп1 титр фагов Тп2 и ТиЗ повышался на три порядка. Титр "воротнкчковых* фагов Tg8l и Т§101 при УФ-икдукции также повышался на 2-3 порядка и достигал 1О3-10*частиц/мл.Было показано, что все умеренные фаги,выделенные из лизогенных культур,титровались на Бас.Ш]г:п^аепз18 БиЬвр.8а11ег1ае.

Наряду с коллекционными к заводскими штаммами нами исследовалась лизогения природных изолятов.В природных штаммах подвидов gaПeriae и «ЗепйгоНтия были обнаружены фаги В1 и С2-морфологии. Таким образом,и природный материал может быть причиной заноса на производство новых фагов.Приведенные данные свидетельствуют о распространенности лизогении у вас. Ишгм^епзхз.что должно учитываться при промышленном культивировании.

Фагочувствительность подвидов Вас ЛЬигхт^епБаз. Подвиды Вас. Ишг1г^1епз15 различаются по естественному уровню фагоустойчиво-сти. Штаммы Вас. Ш1г1вд1еп818 зиЪяр. 1Ьиг;н^1еп518,ДепсЗгоНииз, гя-гаеХепзгэ устойчивы к фагам,активным против подвидов galleriae и кигБ1акз..

Низкая эффективность посева фагов может определяться лизо-генным состоянием,снижением адсорбционной способности и наличием систем рестрикции-модификации.Анализ лизогенного состояния культур показал,что производственные штаммы лизогеины по фагам В1,С]

н С2-морфологии,отличавшихся.за исключением "воротничковых• фагов от производственных фагов по ультраструктуре и физико-химическим параметрам.Не были найдены штаммы.лизогенные по фагам Al группы, выделяемый из промышленных лизатов.Таким образом.фагорезнстент-ность не могла быть обусловлена иммунностью лиэогенных бактерий к этим Сагам.

неспособность ряда фагов развиваться на Вас.thuringiensis .subsp.israelensis.возможно,связана с наличием системы рестрикиии--моднфикации Bti .обнаруженной ранее у этого подвида. Однако из клеток Вас.thuringiensis subsp.thuringiensis и subsp.dendrolinus не удалось выделить ферменты,обладавшие сайт-специфической рест-ркцируюией способностью.В этом случае ограничение развития фагов, не связанное со снижением адсорбционной способности.могло быть обусловлено высоким уровнем спорообразования.

Проведенные исследования показали, что для каждого ютамма--продуцента опасность представляет определенная группа фагов,способных вызывать фаголиэис.В случае производства битоксибациллина и дендробациллина эти фаги имели экзогенное происхождение.

Особый интерес представляет вопрос о фагочувствительности природных изолятов.Полученные данные свидетельствуют о том,что природные штаммы подвидов thuringiensis и dendrolinms чувствительны к большинству "производственных" фагов.

ОБСУЖДЕНИЕ

Нами проведено исследование ультраструктуры вегетативных клеток, спор, кристаллов эндотоксина и фагов Вас.thuringiensis.Показано, что тонкая структура вегетативных клеток не будучи специфичном для подвидов имеет ряд особенностей.К ним относятся лиэоиим-устпйчпвость клеточной стенки.наличие с-слоя.микрокапсулы у к\ет-

ок из Б-колоний и единичных фимбрий аналогичных И-пилям.Обнаруже- . на нестабильность структуры клеточной стенки,способствующая образованию аутопластсв и их спонтанному слиянию.

Электронномикроскопический анализ процесса трансцепции (конъюгации) показал,что перенос плазмид у Вас. Мшгзл^епзхБ происходит благодаря образованию межклеточных хонтактов,возможно,при участии фимбрий,способствующих агрегации клеток.Таким образом,получены данные.важные для понимания структурной основы обмена генетической информацией у Вас. И!иг11^еп515.Устойчивость к лизоци-му,который обнаружен в гемолимфе насекомых и играет защитную роль с одной стороны,и способность к спонтанному слиянию аутояластов и к конъюгации с другой.создают условия не только для выживания Вас. Ип1г1п01еп81$,но и постоянного расиирения спектра занимаемых этим видом экологических ниш за счет обмена плазмидами токсинообраэое-ания.

Важная роль в выживании и распространении вида вас. Итгл.!^-епБхэ принадлежит спорам.Электронномикроскопический анализ показал,что споры разновидностей Вас.Ишгзл>81еп818 при сохранении общего плана структурной организации различаются по структуре внешних слоев оболочки.По строению споровых покровов подвиды Вас.Ит-г1^1еп51Б делятся на две группы,в зависимости от сходства со спорами Вас.сегеиБ.Согласно данным литературы к спорам типа Вас. сегеив относятся только споры подвида 18гае1епэ15.в результате проведенного исследования нам удалось доказать большую распространенность этого типа спор среди разновидностей Вас. Итг^вхепв!«.

данные по тонкому строению спор важны не только в теоретическом,но и в практическом аспекте.У ряда природных изолятов обнаружено слабое развитие кортекса.что может препятствовать их использованию в качестве промышленных продуцентов.К вариабельным

морфологическим признакам относятся споровые выросты.Нами впервые у спор Бас ЛЬигзл^епБгБ обнаружены выросты трех типов: трубчатые, филамектоэные,цилиндрические.У большинства подвидов обнаружено 2 типа выростов.Споры подвида йепйгоНвиз характеризуются отсутствием выростов.Выросты на спорах подвида 1кгае1епБ15 представлены тонкими цилиндрическими структурами.

Обнаружение споровых выростов поставило вопрос об их функциональной значимости.Взаимоотношения между структурой и функцией удается проследить при изучении поверхности клетки,граничащей с внесшей средой.Оболочка клеток и спор ответственна за выполнение ряда важнейших функций,в том числе и за адгезивную.

Патогенные микроорганизмы.включая энтомопатогенные грибы,обладают адгезивной активностью,определяемой в реакции гемагглюти-нации.Гемагглютинины,ассоциированные с клеточными структурами.были найдены нами у спор Вас ЛЬшапегег^в. Анализ гемагглютинирующ-ей способности спор Вас. ЦшгаодхепБаБ,различающихся по поверхностным структурам, обнаружил корреляцию между наличием тубулярных отростков и способностью вызывать прямую реакцию гемагглютииации. Таким образом,у спор Вас. 1Ьиг:од1еп818 впервые обнаружены гемагглютинины ,связанные со споровыми выростами.

При массовом анализе спор различных подвидов оказалось,что они различаются и по гемагглютинируюией активности.Поэтому мы предлагаем дополнить основополагающие признаки существующей классификации Вас.^игиг^хеп^Б способностью спор к гемагглютииации.При проверке специфичности взаимодействия спор с эритроцитами оказалось, что гемагглютинаиия,вызываемая спорами,не ингибируется соединениями ,входящими в состав рецепторов клеток-мишеней. Вместе с тем избирательность адгезии к эритроцитам различного происхождения не исключает возможности специфического связывания спор с ме-

мбраной эукариотических клеток.

Известно,что наряду со специфическим связыванием с рецепторами клеток-мишеней адгезия может быть обусловлена гидрофобными взаимодействиями.При изучении свойств спор было обнаружено,что выросты модифицируют поверхность споры,повышая ее гидрофобность.

Споровые выросты Вас.Ишг1^1еп51з являются уникальной структурой.При морфологическом и функциональном сходстве с пилями грамотрицательных бактерий выросты имеют ряд четких отличий.они исключительно стабильны при воздействии внешних факторов; прочно связаны с экзоспориуиом.а не с клеточной стенкой; образуются при споруляции,но не на стадии вегетативного роста.

практический интерес в проблеме адгезии представлял вопрос о роли споровых выростов во взаимодействии с естественными субстратами.Было показано,что наличие споровых выростов сопряжено с усилением адгезии к поверхности листьев.

Применительно к Вас.Итги^егтв споровые выросты могут иметь особое значение в связи с патогеиностыо этого вида для насекомых. Предположительно, роль споровых выростов Вас. 1Ьиг:]^хепв1.ч сводится к следующему: ____

1.для выживания и распространения различных подвидов Вас. 11шг1^1еп518 эволюционно приспособлены структуры,которые могли бы обеспечить спорам первичный контакт с листьями или другими поверхностями для дальнейшего проникновения в кишечник насекомого.

2.В зависимости от конкретных взаимоотношений в системе Вас. ^иги^едозя - насекомое - растение .бактерии должны были выработать специфические структуры,способные обеспечить им контакт с тем видом растений,который является пищей для насекомого.Поэтому, возможно,штаммы,которые в процессе эволюции выработали токсины для борьбы с различными видами насекомых,также могли создать ме-

ханизмы адгезии к тем поверхностям,которые предпочтительны для данного отряда насекомых.

3.Поскольку различные поверхности обладают различными гидрофобными свойствами,бактерии выработали различные типы споровой поверхности.

При изучении энтомопатогенных бактерий представляется целесообразным системный подход.Можно представить цепь событий,приводящих к гибели насекомых при контакте с энтоыопатогенными бактериями и продуктами их жизнедеятельности: споры и кристаллы должны прикрепится к листовой поверхности,далее насекомые,поедая растения,захватывают споры к кристаллы.При развитии патологического процесса может проявиться роль фагов.В препаратах биоинсектицидов выявляется большое число фагов и при попадании в кишечник насекомого они способны уменьшить число жизнеспособных бактерий и тем самым предотвратить гибель насекомых.Использование в качестве продуцентов лизогенных штаммов также может привести к снижению численности жизнеспособных бактерий.Нельзя также исключить возможность 'захвата' фага в спору и последующий лизис культуры при прорастании спор.Исходя из вышеизложенного.можно считать,что фаги играют важную роль в патологическом процессе,вызванном Вас.1Ьиг1-Поэтому при исследовании энтомопатогенных бактерий, как Составную часть системы, следует изучать^ фаги и особенность их взаимодействия с клетками.Решение поставленных вопросов невозможно без создания коллекции фагов,охарактеризованных по биологическим и физико-химическим параметрам. Нами изучены свойства ряда фагов,из которых большая часть выделена впервые.Электронномикрос-копическнй анализ выявил их исключительное морфологическое разнообразие,были обнаружены представители 5 морфологических групп (А1, В1, В2,С1,С2).

Электроннсмикроскопическое исследование фаговой ДНК позволило выявить наличие у ряда фагов "липких" концов,а у фагов Tm¿ и Tg27 наличие циркуляркой пермутации к концевой избытсченности. Структура геномов фагов изучалась с использованием сайт-специфических рестриктаз.Показано,что фаги различаются по чувствительности к рестриктазам.но ДНК всех взятых для исследования фагов гид-ролизовалась рестриктазой Hindin. С учетом признаков,определяющих родство,были выявлены гомологичные по основным параметрам фаги, мол. массы фаговой ДНК,определенные по контурной длине и по сумме рестриктов,колеблются в широких пределах от 8 др 75 мда. Благодаря проведенный исследованиям систематизированы данные по фагам Вас.thuringiensis,как это сделано для других бациллярных фагов.Многолетние исследования фагов,выделенных при производстве дендробациллина и битоксибациллина,показали,что причиной дефектных заводских операций являются экзогенные фаги.

В настоящее время производство промышленных энтомоцидных препаратов ведется с использованием штаммов,выделенных из природы. Поэтому актуальной научно-производственной задачей является создание коллекции природных штаммов,отвечающих технологическим требованиям, необходимое условие "технологичности* штамма - фагоусто-йчивость.Анализ фагочувствительности природных штаммов показал невозможность их использования без предварительной селекции по признаку фагоустойчивости.Одной из характерных особенностей культур Вас. thuringiensis является лизогения. При этом можно отметить две обнаруженные нами закономерности: первая,ряд штаммов различных подвидов лнзогенен по фагам с одинаковой морфологией частиц и,вторая,как правило,для штаммов большинства подвидов характерна лизогения по одному уникальному и специфичному для данного подвида фагу.данный факт,т.е. наличие уникальных умеренных

фагов,выделяемых штаммами определенных подвидов,может быть использован для классификации штаммов или отнесения вновь выделяемых иэолягоБ к тем или иным подвидам,таким образом,помимо различий в тонкой структуре спор подвиды различаются по способности продуцировать частицы определенного морфотипа.

Исходя из вышеизложенного,существующая классификация подвидов ВасЛЬиг:и^аеп818 на основам;;! Н-аитигена может быть дополнена или расширена за счет других характеристик - их способностью выделять уникальные по ультраструктуре фаги,морфологией спор н гемагглюткнирующей активностью.

ВЫВОДЫ

1.С помощью современных электронномихроскопических и молеку-лярно-биологических методов проведено изучение структурно-функциональной организации вегетативных клеток,эндоспор и фагов Бас. ЫшгЛг^м^б. Выявлен комплекс ультраструктурных особенностей, специфичных для вида и его подвидов,свидетельствующих о многообразии структуры и функции и множественных путях эволюции изученной группы организмов.

2.Выявлены следущие особенности вегетативных клеток Вас. ги^аепвхз: наличие фимбрий, структурированного С-слоя клеточной стенки,микрокапсулы (у Б-форм).Обнаружена способность к спонтанному протопластированшо,слиянию,аналогичному сплавлению лнзошш-ных протопластов,и образованию межклеточных контактов.

3.Показан полиморфизм спор и кристаллов эндотоксина,зависящий от принадлежности к подвиду. Споры различаются по тонкой структуре споровых выростов,экзоспориума,покровов,толщине кортек-са,а кристаллы - по форме и укладке субъединиц.

4.На спорах большинства подвидов Bac.thuringiensis.3a исклю-

ас.thuringiensis.-там же,с.97

25.Кузин А.И..Смирнова Т.А.,Нетыкса Е.М..Мазанов А.л., Волокна л.И..Азизбекян . P.P.,1988.Вариабельность фагов Bacillus thu-ingiensis С2-морфологии. -Мол. генет. микроб. вирусол., N12, с". 2 9

26.Нетыкса Е.М.,Смирнова т.А.,Константинова Г.Е.,Азизбекян .Р.,1989.лизогения Bacillus thuringiensis var.kurstaki.-Тез.докл сесоюзн.конф."пробл.созд.примен.микр.средств защ.раст.",М.,с.27

27.Смирнова Т.А..Ииненкова и.Б.,Богданова Т.д.,Азизбекян Р.Р 989.Характеристика фагов Bacillus thuringiensis var.dendrolimus. Там же,с.31

28.Азизбекян P.P..Смирнова Т.А.,1988.Спорообразование и кри-таллообразование у Bacillus thuringiensis.(Обзор) -успехи микро-иол. ,м..наука,с.82

29.Смирнова Т.А.,Кулинич А.И..Гальперин М.Ю..Азизбекян P.P.,

989.морфологические особенности и адгезивные свойства выростов ia спорах Вас.thuringiensis.-Микробиология,т.58,N5,с.835

3 0.Королева Ю.В..Григорьева Т.М..Смирнова Т.А..Азизбекян Р.Р

990.Бактериальная модификация фагов Вас.thuringiensis.-Биотехно-.огия.Иб.с. 12 ______

31.Smirnova Т..Kulinich L..Galperin М..Azizbekyan R.,1991. 'he haemagglutional ability of the spore of Bacillus thuringien-;is.-i international conference of the molecular biology of Baci-lus thuringiensis,san Francisco,p.ю

32.Богданова Т.л..Смирнова Т.А..Миненкова И.Б..Азизбекян Р. '.,1991.Генетические свойства безжгутикового мутанта Bacillus thu-■ingiensis.-Мол.генет.микроб.вирусол.,N5,с.29

33.Смирнова Т.А..Поглазова М.Н..Машковцева А.В.,Кулинич л.И. "альперин М.Ю.,Азизбекян Р.Р.,1991. Исследование адгезивных свой-:тв спор Bacillus thuringiensis подвидов galleriae и dendrolimus.

-Микробиология,Т.60,N4,С.697

34.Snirnova Т.А..Kulinich L.I..Galperin M.Yu..Azizbekyan R.R 1991.Subspecies-specific haemagglutination patterns of fimbriated Bacillus thuringiensis spores.-FEMS Microbiol.Lett.,in press.

Зак. 7v? lC0 Тип. Мин-ва культуры СССР