Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика взаимоотношений в системе фаг-клетка BACILLUS THURINGIENSIS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Характеристика взаимоотношений в системе фаг-клетка BACILLUS THURINGIENSIS"

п о им

- 5 АПР 1093

акадймя наук россии инсгоуг микробиологии

На правах рукописи УДК 6ВЗ.18157?.579.II]

КОРОЛЕВА Юлия Валентиновна

характеристика. взаимоотношений в системе фаг-клетка васшйз тжшашзгс

03.00.07 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выложена в лаборатории генетики и селекции энтомо-патогенных бактерий Государственного научно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов.

НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ:

доктор биологических наук, профессор , P.P. Азнзбекян

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

профессор, доктор медицинских наук Б.Н. Ильяшенко

кандидат биологических наук Е.О. Добряанская

ВВДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ - Икстигут вирусологии именй Д.И. Ивановского Академии Медицински Наук России.

Защита диссертации состоится »¿Я« CLnfUMi^z года в

" часов на заседании Специализированного совета Д 002.64.01 при Институте микробиологии АН России (Москва, II78II, проспект 60-летия Октября, 7, кор.2)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии АН России.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.Е. Никитин

Актуальность проблемы. Борьба с вредителями сельского и лесного хозяйства,уничтожающими до 20-30% урожая,' является одной из важнейших задач настоящего времени. По ряду биологических и технологических признаков наиболее эффективными продуцентами микробиологических средств защиты растений служат бактерии Bacillus thuringlensls (ВТ), успешно используемые в промышленности ряда стран., Основным положительным свойством бактериальных средств защиты растений является высокая специфичность энтомоцидного действия. Препараты на основе спор и белковых кристаллических включений различных серотипов Bacillus thuringlensls токсичны для представителей отрядов Lepidoptera, Díptera и Coleóptera. На основе некоторых штаммов В. thuringlensls, продуцирующих р -экзотоксин, созданы препараты, 'значительно расширяющие спектр инсектицидного действия В.thuringlensls.

Совершенствование качества энтомопатогенных препаратов и технологии их производства и применения является исключительно важной задачей. Используемые в производстве штаммы выделены из природных источников и не всегда отвечают технологическим требованиям при промышленном культивировании. В связи с этим, производство осложняется рядом факторов, среди которнх необходимо отметить нестабильность" признака токсинообразования и фа-голизис. Причиной фаголизиса может быть как инфицирование фагом извне, так и использование в качестве штаммев-продуцентов лизогенных культур. В этой связи большую актуальность приобретает проблема создания фагорезистентных высокоактивных продуцентов, включающая необходимость всестороннего изучения физиологии, биохимии и генетики В.thuringlensls и конкретных взаимоотношений в системе фаг-клетка.

На основе спор, кристаллов иjj-экзотоксина штаммов В.thuringlensls subsp.thuringlensls создан препарат битоксибацил-лин, один из ведущих отечественных препаратов, широко применяемый против насекомых отрядов Coleóptera и lepidoptera.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение взаимоотношений в системе фаг-клетка Bacillus thuringlensls для выявления фаговой инфекции в производстве битоксибациллина и разработки мер борьбы с ней на основе создания фагорезистентных штаммов-продуцентов.

В связи с этим были поставлены следующие задачи: I.- Изучить структурные и молекуляряо-биологические свойства фагов, выделенных из фаголизиснкх операций при производстве битоксибациллина ;; 2. Выделить фагорезистентные, технологически значимые продуценты битоксибациллина; 3. Изучить молекулярно-биоло-гическими методами свойства. селектированных фагорезистентных штаммов; 4. "С использованием полученного фагорезистеятного штамма выделить из почвы новый фаг, обладающий широким спектром литического действия; 5. Получить на основе селектированного фагорезистеятного штамма акристаллические фагорезнстент-ные мутанты, для использования их в качестве потенциальных реципиентов крксталлкодирувдих плазмид.

Научная новизна. Проведен структурный и молекулярно-биоло-гический анализ фагов, выделенных из фаголизисных операций при производстве битоксибациллина. Показано, что наибольшую опасность, для производства представляют фаги ТЪ-2 группы, обладающие высоким относительным урожаем. Установлено, что попеременное использевание в производстве чувствительных и устойчивых к инфекции фагов продуцентов приводит'к появлению "модифицированных" фагов, характеризующихся расширенным спектром литичес-кого действия. С использованием группы ТЬ~2 фагов выделены 34 фагоустойчивых мутанта штамма Bacillus thuringiensls HI-I77, продуцента битоксибациллина. Показано, что фагоустойчивые мутанты в различной степени ограничивают развитие фагов и сохраняют при этом основные технологические параметры-уровень синтеза эндотоксина, экзотоксина, титр спор. Фагорезистентность отобранных штаммов обусловлена» по-видимому, хромоеомальными ■ мутациями, влияющими на внутриклеточное развитие фагов, что гарантирует стабильность признака фагорезистентности отобранных продуцентов. Изучены плазмидные профили фагорезистентных штаммов'. Осуществлена-межвариантная транедукция плазмида рВИб (Тс* ) в фагорезистентЕШ штаммы. С использованием селектированного фагоустойчивого штамма HI-C6, полностью ограничиваще-' го. развитие фагов ТЬ-2 группы, выделен из почвы и изучен новый транедуцирующий фаг Tt9I, обладающий широким спектром литичес-кого действия. На основании данных об устойчивости ДНК фага Tt9I к рестриктазам к плавлении ДНК данного фага в широком интервале температур' высказано предположение о возможных аномалиях в составе ДНК фага Tt9I. На основе штамма HI-C6 получены

акристаллические фагоустойчивые реципиенты. Изучены плазмидные профили акристаллических мутантов. Показана роль низкомолекулярной 5,6-МДа плазмиды в регуляции количественной продукции эндотоксина. Установлено, что продукцияр-экзотоксина в штамме HI-C6- определяется плазмидой, детерминирущ'ей продукцию кристаллических включений.

Практическая значимость работы. .Выполненный структурный и молекулярно-биологический анализ фагов ТЬ-2 группы являлся необходимым условием создания фагорезистентных высокотехнологичных штаммов - продуцентов битоксибащшина. Использование в качестве продуцентов биоинсектицида созданных' высокоактивных фагорезистентных штаммов позволит получать препарат высокого качества при более экономичном ведении процесса производства. Селектированные фагорезистентные штаммы могут быть использованы как универсальные доноры фагоустойчивости. Выделенный из почвы новый трансдуцирухщий фаг Tt9I благодаря широкому спектру литического действия и большим размерам может быть использован для генетического картирования. Полученные акристаллические фагоустойчивые мутанты могут быть использованы, в качестве реципиентов плазмвд. кодирующих синтез белков с различным спектром инсектицидного действия.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на семинарах лаборатории генетики и селекции энтомопатогенных бактерий ВНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов, на заседаниях кафедры "Биотехнология микробного синтеза" МТИПП, на XIV Конференции по электронной микроскопии (биология и медицина, Москва, 1992).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано четыре работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 12 рисунков и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения, выводов и списка-литературы, включающего 220 наименований, в том числе 183 зарубежных авторов.

материалы и методы исследования.

В работе использованы птаммы Bacillus thurlngleasls subsp. thurlngiensis, subsp.gallerlae, subsp.dendrollaus, полученные

из коллекции ВБШгенетики и селекции промышленных микроорганизмов, штамм subsp.kurstaicl, выделенный из препарата Dipel (фирма "Abbott Lab.",США), штамм subsp.israelensls, полученный от Иостена (Yousten, США), штаммы других серотипов Bacillus thurlnglensis получены из коллекции института Пастера (Париж). Фагоустойчивые бактериальные мутанты выделены в процессе настоящей работы.

В работе использовали'фаги,'выделенные из промышленных дефектных операции при культивировании штамма subsp.thuringieri-sis HI-98 : БТБ, 5БТБ, 2/77, 2/99, 3/97, 26, 5-3, 5-1, 7/55, а также трансдуцирувдие фаги Bac.cereus CP-5I, СР-54 (Yelton а.Ююгие,1971; Lecadet et al. ,1980). Фаг Tt9I выделен из почвы в процессе настоящей работы.

Для роста бактериальных культур и титрования фагов в качестве полноценной среды использовали бульон и агар {2%) Хот-тингера. Для определения инсектицидной активности культуры выращивали в дрожке-полисахаридной среде ( ДПС ).Для выделения препаративных количеств плазмидной ДНК культуры выращивали в среде IB (Маниашс и соавт. ,1984).

Фаг Tt9I выделяли из почвы с помощью метода обогащения (Азизбекян и Кривиский, 1966).

Спектр литического действия фагов оценивали титрованием фагов на бактериальных культурах различных серотипов двухслойным методом.

Препараты фагов.с высокой концентрацией получали методом сливного лизиса на плотных питательных средах с последующим даСЕференциальйым центрифугированием. Окончательная очистка достигалась центрифугированием в преформированном градиенте хлористого цезия.

Адсорбционную способность фагов исследовали методом определения количества неадсорбированного фага.

;. Электронную микроскопию фагов проводили с использованием стандартных методик (Тихоненко,1968).

Выделение фаговых- ДНК проводили фенольным методом (Маниа-тис.и соавт.,1984) и методом термического шока.

Исследование гетеродуплексных молекул ДНК фагов осуществляли по методу Дэвиса с соавт.(Davis et al.,I97I).

Гидролиз фаговых ДНК рестрикционными эндонуклеазами осуществляли в'соответствии с"методиками, данными в руководстве по

генетической инженерии (Маниатис и соавт.,1984). В качестве маркеров для расчета молекулярных масс фрагментов исследуемых ДНК использовали EcoRI- , HindiII- и Pstl-фрагменты ДНК фага А.

Температуру плавления ДНК (Та) фага Tt9I определяли на регистрирующем спектрофотометре "Unlearn SP-I800". Регистрацию кривых плавления проводили ъ 0,2% SSC-буфере при длине волны 260 нм. Нагревание образца осуществляли непрерывно ео скоростью 0,5?мин. Интервалы температурного перехода определяли графически.

Молекулярные массы фаговых и бактериальных белков определяли методом электрофореза в полиакриламидном геле ; ДМГ ). Электрофорез осуществляли как предложено Ведером и Осборном (Weder a. Ostorn, 1969) в 0,05 M трясглициновом буфере, pH .8,5. В качестве ' маркеров использовали стандартный набор белков MW-SDS-200 Kit.

Трансдукцию плазмиды рВС16 осуществляли с помощью транеду-цирующего фага CP-5I и выделенного з процессе настоящей работы фага Tt9I по методике, описанной Погосбековой и Азизбекяном (1984).

Инсектицидную активность культур по J-эндотоксину определяли в соответствии с промышленным регламентом на гусеницах непарного шелкопряда первого-второго возраста, вычисляя минимальные концентрации культуральной жидкости штаммов, вызывающие 50%-ую гибель тест-насекомых (Lc50).

Продукцию р -экзотоксина оценивали спектрофотометрическим способом и по отношению к тест-насекомым (мухи, колорадские жуки), определяя 1>с50.

Плазмидные ДНК выделяли, используя модифицированный метод Бирмбойма и Доли (Blrmbolm a. Doly,I979), и метод, описанный в работе К.Хилл с соавт. (Hill et al.,1989).

^Для элиминации плазмид использовали субингибирущую температуру роста +43°С. Отобранные акристаллические мутанты проверяли на продукцию ¿-эндотоксина, р-экзотоксина и вирулентность по отношений к тест-насекошм.

Перенос плазмвдной ДНК при смешанном культивировании осуществляли по методу Гонзалеса и Нарлтона (Gonzalez a. Carlton, 1982). В качестве селективной среды использовали агар Хот-тингера, содержащий 500 мкг/мл стрептомицина и 25 ыкг/мл тетрациклина .

- 6 -

результаты и их обсуждение.

Структурная и биологическая характёристика Фагов. . вытгелагогых при производстве битоксибашшшна.

При производстве битоксибациллинз на основе штамма Bacillus thirringlensls subsp. thuringlensls HI-98 из фаголизис-ных операций были' выдалавд фаги ТЬ-2 группы: БТБ, 5БТБ, 2/77, 2/99," 3/97,*26, 5-3, 5-1, 7/55. Яри титровании на шташе, HI-98 все выделенные фаги образовывали негативные колонии двух типов: прозрачные (2-3 мм) и прозрачные с мутным ореолом.

Проведенный электронно-микроскопический анализ показал, что все исследуемые фаги имеют одинаковое морфологическое строение (морфотил BI): гексагональные капсиды (диаметр 60 нм) и несокращающиеся отростки (180x10 нм), в. дистальной части которых расположены базальные пластинки в виде дисков, от краев которых отходили тонкие нити. Количество поперечных дисков у фаговых частиц было различно. Фаги подобной морфологии описаны для HI-серотща ранее (Бальман и соавт. ,1987).

• Одной из важнейших характеристик фага является его спектр литического действия. На чувствительность к анализируемой груше фагов проверяли штаммы бактерий, принадлежащих к пяти серотипам ВТ, используемым в качестве продуцентов биоинсектицидов (Табл.1). Наряду с производственным шташом HI-98 для анализа- спектра литического действия фагов нами были использованы другие, штаммы HI-серотипа: фагорезистентный штамм HI-T3 и чувствительный штамм HI-I77, отличающийся от производственного штамма HI-98 большей биологической актишостыо .и продуктивностью. Исходя из результатов анализа спектра литического действия, (Табл.1) все исследуемые фаги ТЬ-2 группы можно разделить на две подгруппы. Фата I подгруппы: БТБ, 5БТБ, 2/77, 2/99, 3/97, 26, 5-3 развивались'-с эффективностью посева (ЭЩ-1 на своем пермиссивном хозяине-штамме- HI-98 и со сниженной эффективностью посева -Ю~- 10 на штаммах Щ-ТЗ, Н5-69-6. Фаги II ~ подгруппы: '5-1 и 7/55 размножались с ЭП-I не только на чувствительном штамме HI-98, но и на фагоустойчивом штамме HI-ТЗ и шташе Н5-69-6. Ограничение развития всех исследованных фагов ТЪ-2 группы на шташе HI4-IsI, вероятно, обусловлено наличием в клетках et зима ранее показанной системы рестрик-

Таблица I.

Спектр литического действия фагов ТЬ-2 группы.

Штаммы В.Иш- Эффективность посева (ЭП)* фагов ТЬ-2 группы

Г1пв1епз18 зиЬзр. I подгруппа II подгруппа

БТБ 5БТБ 2/77 2/99 3/97 26 5-3 5-1 7/55

№иг1п£1епз1а

Н1-Э8 . I I I I I I I I I

Н1-ТЗ 8.Ю"5 2,8.10* 5 -5 2.10 2,4.10^ 3,1.10^ 2 то'4 1,10"^ I I

НЫ77 I I I I I I I I I

kuгstaki ■

НЗ-г-52 <6.10"* -9 <8.10 -9 <5.10 <5. Ю"^ <1,3.10^1 -9 -9 3.10 <1.10 о.ю''5 <4.105

<1епс1го11тиз

Н4-79-31 -9 <6.10* -9 <8.10 <5. Ю"5 <5. И?* <1,3.10^<1 -а -д 3.10 <1.10 9 <3.10 -9 <4.10

galleгlae

Н5-69-6 7.10^ 1,5.10~ 4.10* 2.10"* 2 10* 1.10* I I

1згае1епз1з

Н14-Ш 5.10"? 4.10"'' -е 7.10 3,5.10 6 1,4.10 ? 2 10 7 .51.10 2.10 -4 4.10

* За I принята ЭП фагов на штамме Н1-98

цш-модификации (ЛзизСекян и соавт., 1984). Ограничение развития фагов I подгруппы штаммами 69-6 а Т-3 не связано с их адсорбционной способностью (Табл.2).

• Урожай из отдельной негативной колонии или относительный урожай (ОУ) ТЪ2 фагов на чувствительных штаммах Н1-98 и Н1-177 составлял 10 -10 /нк, что свидетельствовало о большой вирулентности ТЬ-2 фагов-.

Таблица 2.

Адсорбция фагов ТЪ-2 группы на пермиссивных и

непермиссивных шт аммах.

Штаммы Адсорбция фагов, %

В.ШдгШ- I подгруппа П подгруппа

51епз1Б БТБ 5БТБ 2/77 2/99 3/97 26 5-3 5-1 7/55

Н1-98 87 90 82 86 91 95 84 89 87

Н1-ТЗ 83 85 78 80 84 88 79 86 81

Н5-69-6 38 50 43 32 47 29 39 36 27

. Характеристика ДИК Фагов ТЬ-2 группы.

Поскольку ТЬ-2 фаги I и II подгрупп различаются по спектру литического действия,для выявления возможной негомологии фаговых геномов и для определения молекулярных масс ДНК нами, был выполнен сравнительный рестрикциовшй анализ фагов I и II подгрупп. Результаты рестрикционного анализа ДНК фагов I и II подгрупп, выполненного с помощью эндонуклеаз Н1псШ1, ЕсоНУ выявили их идентичность как по числу рестрикционных фрагментов, так и по молекулярным массам отдельных рестршстов (Табл.3). Молекулярные массы ДНК, определенные двумя независимыми методами по суше рестрикционных фрагментов и по контурной длине молекулы ( электронная микроскопия ) давали хорошую сходимость результатов и составляли 22,7±0,4 МДа. При анализе гетеродуплексов ДНК фагов 7/55/2/77 и 5-1/2/77 негомологии выявить не удалось. Таким образом, выявленные различия в спектре литического действия, по-видимому, не обусловлены существенными изменениями структуры фаговых ДНК. Возможной причиной, вызвавшей изменения 'спектра литического действия фагов II подгруппы 7/55 'и 5-1 может "быть точечная мутация или мутация,

Таблица 3.

Размеры фрагментов ДНК фагов ТЪ-2 группы после гидролиза эндонуклеазами (в ИДа).

Номер фра- Есоет ншаш

гмента БТБ 26 2/77 3/97 5-3 5-1 7/55 БТБ 26 2/77 3/97 5-3 5-1 7/55

I 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 5,8 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0 9,0

2 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2 3,2 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 . 6,8

3 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,75 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2

4 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,2 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0

5 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 2,0 1,52 1,52 1,52 •1,52 1,52 .1,52 1,52

6 1,65 1,65 1,65 1,65 1,65 1,65 1,65 0,8 0,8 0,8 0,8 0.8 0,8 0,8

7 1.25, 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 1,25 0,6 0,6 0,6 0,6 0,6 • 0,6 0,6

'8 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20 1,20

9 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0 1.0 1,0

10 . 0,98 0,98 0,38 0,98 0,98 0,98 0,98

II 0,65 0,65 0,65 0,65 0,65 0,65 0,65

Молекулярная масса ДНК 22,58 22,58 22,58 22,58 22,58 22,58 22,58 22,92 22,92 22,92 22,92 22,92 22,92 22,92

- 10 -

затрагивающая менее 40 пар нуклеотидов фаговых ДНК.

Бактериальная модификация Фагов ТЬ-2 группы.

В специальных экспериментах наш было показано, что среди фагов I подгруппы (26 и 5-3), размноженных на штаммах HI-T3 и Н5-6Э-6 с большой частотой ( Ю"5- ю"г) можно было отобрать клоны, примерно с одинаковой эффективностью посева, размножающиеся при последующих пассажах на штаммах HI-98, HI-I77, HI-T3 и Н5-69-6. Выделенные клоны в дальнейшем стабильно сохраняли свои характеристики независимо от хозяина, на котором они размножались. При первоначальном размножении фагов 26 и 5-3 на шташе Н5-69-6 наш были отобраны клоны, которые имели одинаковые ЭП на шташах HI-98 и HI-T3 и значительно лучше ( в 100 раз) развивались на штамме 69-6, и эта характеристика далее не зависела от выбора хозяина. Возникновение фагов с расширенным спектром литического действия при размножении на непермиссив-ных штаммах объясняется возможной модификацией, обусловленной клеткой-хозяином. Следует отметить, что штаммы HI-T3 и Н5-69-6 обладают различной модифицирующей способностью. Таким образом, причиной возникновения ТЬ-2 фагов II подгруппы 5-1 и 7/55, обладающих измененным спектром литического действия, может быть чередование в производстве чувствительных и резистентных к фагам культур. Следствием подобного чередования может быть возникновение "модифицированных" фагов. В связи с этим целесообразным представляется- создание биопрепаратов на основе фагоустойчивых штаммов-продуцентов без переменной замены их чувствительными к фагам культурами.

Получение и характеристика Фагоустойчивых мутантов Bacillus thurlmlensls subsp.thurlnglensls.

Выделение из фаголизатов при производстве битоксибациллина II подгруппы ТЬ-2 фагов ( .7/55 и 5-1 ), обладающих расширенным спектром литического действия и лизирующих селектированный ранее фагоустойчивый штамм HI-T3 с ЭП-I, обусловило необходимость получения новйх биологически активных штаммов, устойчивых к инфекции ТЬ-2 фагов I и II подгрупп. Для получения фагоустойчивых штатов в работе использованы ТЬ-2 фаги I подг-рупда - 26 и 5-3 и II подгруппы - 5-1 и 7/55. Селекцию проводили на основе штамма HI-I77, показавшего наилучшие технологические характеристики. Наш биМ получены 34 мутанта штамма

Н1-177, в различной степени ограничивающие развитие использованных для селекции фагов. Для удобства анализа, независимо от способа получения, все 34 мутантных штамма мы разделили с некоторыми допущениями по перекрестной устойчивости к фагам на 5 групп (Табл.4).

Таблица 4.

Спектр литического действия ТЬ-2 фагов.

N группы Штаммы Вас. thurlng. var.thu-rlnglen-sis Кол-во штаммов, полученных к ТЪ-2 фагам Эффективность посева фагов*

1пгр. ТЬ-2 фэгов Ппгр.ТЬ-2 фагов

Irp. Ilrp. 26 5-3 5-1 7/55

I. Б2 12 4 MÖf з-га"'' -а МО -3 2-10

2. T5 3 10 <2 -Го' МО* 4-Ю - 4 МО

3. ПН _ 2 3-10* 2 • 10 S МО* 1.10*

4. C2 _ 2 -г 2-10 МО"5 -А 2-Ю 1-10*

5. Контроль C6 177 — I <2-10 I -ю <4-10 I <6-10 I -3 <5-10 Г X

* За I ЭП.фагов принят титр фагов на штамме HI-98.

Приобретение устойчивости к одному из ТЬ-2 фагов приводит к обязательному приобретению устойчивости (с различной ЭП) и к другим ТЬ-2 фагам. Уровень ограничения развития фагов 5-3 и 5-1 почти точно совпадает, несмотря на принадлежность фагов к различным подгруппам (I и II пгр. ГЪ-2 фагов соответственно). Наиболее сложным представляется получение штаммов, в значительной степени ограничивающих развктйе фага II подгруппы-7/55. По-видимому, спонтанные мутации, приводящие к ограниче- • нию развития фага 7/55 достаточно редки (Табл.5).

Таблица 5.

Частота спонтанных мутаций штамма Н1-177, ограничивающих развитие ТЪ-2 фагов.

ТЪ-2 фаги

I подгруппа . II подгруша

26 5-3 5-1 7/55

КР5- кг* 10'*- ю_<? 10 ГО""- 10"*

Все полученные фагорезистентные штаммы сохраняли способность к экзо- и эндотоксинообразованию (Табл.6).

Таблица 6.

Продуктивность и инсектицидная активность фагоустойчивых шт аммов В. Шиг1щ1епз1з ■ заЬзр. 11шг1щ51епз1з.

Штаммы В.Ш1- Споруляция,$ Титр спор Ьс50, % Количество

г11^1епз1в •V? ' ^-экзоток-

Н1-серотипа сина, мг/мл

98 Контроль 85 1.8 0,065 0,765

177 90 2,2 . 0,058 0,837

Б2 80 1.5 0,066 0,796

Т5 85 1.9 0,090 0,647

П9 75 0,9 0,075 0,587

ПЮ 90 2,3 0,120 0,564

ПИ 85 2,4 0,047 0,896

П12 90 2,0 0,070 0,561

П13 85 1.7 0,130 0,693

С2 80 1.0 0,090 0,427

С6 80 1.6 0,056 0,862

Анализ Факторов, определяющих Фагорезистентный Фенотип полученных штаммов.

Уровни адсорбции ТЪ-2 фагов на мутантных культурах составляют 60-90% и сравнимы с таковой чувствительного родительского

штамма HI-I77, таким образом, устойчивость полученных мутантов не была обусловлена изменением фагорецепторного аппарата. Урожай из отдельной негативной колонии или относительный урожай (ОУ) ТЬ-2 фагов на селектированных птаммах составил 10 - 10 и был значительно снижен относительно значений ОУ ТЬ-2 фагов на чувствительном штамме HI-I77 (10?-Ю*.

Представленные выше данные, свидетельствуют, что мутации, обуславливающие фагоусгойчивость бактерий, затрагивают внутриклеточное развитие фагов. Известно, что в ряде случаев развитие фагов находится под контролем генов, локализованных на плазмидах (Klaeníiamner a. Sanozky,I985; Калинина и со-авт.,1991). С целью проверки последнего предположения мы анализировали плазмидные профили исходного и фагоустойчивых штаммов. Различий обнаружить не удалось, что, однако, не исключает возможность мутаций, влияющих на развитие фагов,в генах, локализованных на плазмидах. Однако, фагорезистентность, обусловленная генами, локализованными на плазмидах, не стабильна. Спонтанное появление фагочувствительных клонов в подобной популяции случается с достаточно высокой частотой (Sanders, 1988). В нашем случае фагорезистентннй фенотип стабильно сохранялся полученными штаммами в течение длительного срока хранения (12 месяцев) и при культивировании штаммов при субинги-бирующей температуре роста (42°С), обуславливающей элиминирование плазмид. В связи с этим, наиболее вероятной нам представляется хромосомальная природа мутаций фагоустойчивости у полученных нами штаммов.

Трансдукция Фа горе зис ген тных штатов В. thurlnglensla subsp.

thurlnglensls.

При отборе фагоустойчивых .мутантов получены штаммы, в значительной степени ограничивающие инфекцию всех фагов ТЬ-2 группы, что могло свидетельствовать о возможном ."универсальном" характере резистентности. Представляло интерес оценить устойчивость этих мутантов к другим фагам, отличающимся по ультраструктуре и молекулярно-Сиологи^ескиы характеристикам. В „частности, мы изучили чувствительности мутантов к фагу CP-5I, широко используемому в опытах по трансдукции. Эффективность посева фага CP-5I на штамме HI-I77 составила I, на фагоустойчивых мутантах -ю", а на шташе С-6 менее 10. За'1 ЗП фага

CP5I принят титр фага на штамме Bacillus cereus. Поскольку предполагался нездсорбциошый характер мутации фагоустойчивос-ти, мы попытались осуществить трансдукцию резистентных мутантов по признаку тетрациклинустойчивости. В качестве донора использовали штамм Bacillus thurlnglensts 69-6, несущий плазмиду рВС16, определяющую устойчивость к тетрациклину, в качестве реципиентов - фагоустойчивые штаммы ПИ и Сб. Частота обнаружения Тс -трансдуктантов ^ обоих иташов была примерно одинакова и составляла 10 -10 , что соответствует обычным частотам трансдукции плазмид у Bacillus thurlnglensls (Ruhiel et al., 1984). В клетках Тс-трансдуктантов ПИ и С6 были выявлены плазмиды с электрофоретической подвижностью, соответствующей подвижности плазмиды pBCIG. Такая плазмида в исходных штаммах ПИ и С6 отсутствовала. Эти данные подтверждают неадсорбционный характер мутации(ий) фагоустойчивости штамма С-6, полностью ограничивающего литическое развитие фагов ТЬ-2 группы и неродственного им трэнсдуцирукщего фага CE-5I, и дают основание предположить "универсальный", характер данной(ых) мута-ции(ий),что делает штаммы подобные С6 потенциальными технологически значимыми продуцентами.

Структурная и биологическая характеристика нового Фага

Bacillus thurlmd.ensls Tt9I.

Полученный нами фагорезистентный биологически эктивйый штамм НГ-С6 полностью ограничивал инфекцию фагов ТЬ-2 -группы, относящихся к морфологической группе BI, и неродственного им трэнсдуцирукщего бактериофага CP-5I (морфотип AI). В связи с этим нам представлялось интересным обнаружить фаг, способный инфицировать штамм HI-C6, гак как, по всей видимости, подобный фаг должен обладать достаточно широким спектром литического действия. С использованием в качестве хозяина штамма HI-C6 нами выделен из почвы фаг Tt9I, образующий при титровании на родительском шташе мелкие яркие негативные колонии. Электронно-микроскопический анализ показал, что фаг Tt9I имеет крупный гексагональный капсид, длинный отросток с 'сокращающимся чехлом, заканчивающийся болыпш количеством фибрилл. Диаметр кап-сида-140 нм, длина отростка-280 нм, Проведенный ультраструктурный анализ позволил отнести фаг T't9I к морфотипу AI. Фаги подобной морфологии выделены на штамме Bacillus cereus и описаны ранее (Yelton a. Thome, 1971). Выделенный нами фаг Tt9I

отличался от фагов СР-51, СР-53, СР-54 большим размером капси-да и устойчивостью к холоду.-

Фаг 1491 ¿Йрактеризуется широким спектром лигического действия, с высокой эффективность» лкзирует штаммы ВТ, используемые при производстве биоинсектицвдов. По чувствительности к фагу П91 все использованные в работе итамлы можно разделить на 4 группы (Табл.7).

Таблица 7.

Спектр жтического действия фага Tt9I.

Эффективность посева Tt9I (ЭП)* N i ~ ■ .............. Штаммы Bacillus thuringiensis и Baclllus cereus

I. thurlnglensis, HI

ЭП=1 2. JmrstafcL, H3ab

3. dendrollmus, Н4аЪ

4. morrisonl, H8ab

5. toumanoíli, HIlab

- 6. kyushuensls, HIlac

7. i3raelensis, HI4

8. Baclllus cereus 569.

9. gallerlae, H5

ЭП=Ю 10. aizawai, 17

И. alestl, H3a

12. tenebrloals, H8ab

ЭП=10~2 13. paklstanl, HI3

14. Indiana, HI6

15. tohokuensls, HI7

16. lcumamotoensis, HI8

17. yannaneiisis, H20ab

18. pondlcherlensls, H20áo

ЭП<10"8 19. tochlgiensis, HI9

20. colmerl, H2I

21. 22. Japonensls, H23 neoleonenkis, H24

23. siloensls,' H26

24. mexicanensis, H27

* За I ЭП фага Tt9I принят титр фага на родительском штамме HI-C6.

Трансдущфушая способность фага 1491.

Фага, относящиеся к морфоишу AI, обладают способностью к генерализованной трансдукции. Поэтому мы попытались осуществить траксдукцшо по признаку тетрациклинустойчивости штаммов подвида thuringlensls.с помощью фага Tt9I. В качестве донора использовали штамм ВТ sufcsp. galleriae 69-6, несущий плазмиду рВС16, определяющую устойчивость к тетрациклину, в качестве реципиентов - штаммы ВТ HI-I77 и HI-C6. В обоих случаях были обнаружены Тс - трансдуктанты штаммов HI-I77, HI-C6. Частота обнаружения Тс"- трансдуктантов у обоих шташов была примерно одинакова и составляла 10 -10. В клетках Тс - трансдуктантов штаммов HI-I77 и HI-C6 были выявлены плазмиды с электрофорети-ческой подвижностью, соответствующей подвижности плазмиды рВС16. Такая плазмида б исходных штаммах 177 и С6 отсутствовала. Результаты опыта подтвердили способность к межвариантнбй трансдукции фага Tt9I.

Физико-химическая характеристика ДНК Фага Tt9I. •

Молекулярная масса ДНК фага Tt9T, ' 'определенная по сумме фрагментов рестрикции, образованных при гидролизе рестриктазой PvuII составляла 94,4 ВДа. Выполненный нами рестрикционный анализ показал устойчивость ДНК фага Tt9I к большинству (17 из 18 использованных) сайт-специфических эндонуклеаз рестрикции: ¿lui, BaraHI, Bell, BglII, Btcl, BspI43I (Sau3AI), Cirl, EcoEI, EcolI36I, Hindi II,. Kpn2I, Mini, Mspl, Ncol, Ndel, Pstl, Xbal.

Из ранее изученных фагов устойчивость ко многим рестрикта-зам показана для ДНК фагов Тр (Смирнова и соавт.,1989) и TgI3 (Смирнов,1983). Возможной причиной подобной резистентности к рестрикгазам может быть метилирование оснований ДНК фага Tt9I. Однако использование рестриктаз Sau3A и BglII, на активность которых не влияет метилирование оснований ДНК, исключает, по-видимому, метилирование как возможный механизм защиты от рестрикции ДНК фага Tt9I. Выполненный нами анализ температуры плавления ДНК фага Tt9I показал, что ДНК фага Tt9I плавится в широком интервале температур от +55 до +77° С, что исключает возможность определения содержания ГЦ-пар на основе Тш и, по-видимому, указывает на возможные аномалии в составе ДНК фага Tt9I, чем, вероятно, может быть объяснена необычная устойчи-

- 17 -

вость ДНК фага к действию эндонуклеаз рестрикции.

За последнее время выделен ряд новых серотипов ВТ, инсектицидные и ише свойства которых еще недостаточно изучены. Для расширения возможностей исследований новых штаммов ВТ может быт:- применен выделенный наш из почвы новый трансдуцирующий фаг Tt9I, который благодаря широкому .спектру литического действия и большим размерам может быть использован для генетического картирования.

" Характеристика акрисгаллических мутантов Фагоустойчивого штамма HI-C6.

.Полученный наш фагоустойчивый штамм III-CS, полностью ограничивающий развитие фагов ТЬ-2 группы, может быть использован в качестве фагоусгойчивого реципиента плазмид, кодирующих синтез кристаллических белков с различным спектром инсектицидного действия. В связи с этим необходимо было получить Сгу-му-танты штамма HI-CS и исследовать их свойства. В результате двух этапов культивирования при субингибирующей температуре (42-43°С) клонов штамма HI-C6 нами были отобраны с помощью оптической микроскопии 10 акристаллических клонов (Spo+ Cry" ). Анализ фагорезистентности показал,- что все полученные акрис-таллические клоны сохраняют фагорезистентнне свойства исходного штамма HI-C6 и проявляют устойчивость к инфекции фагов ТЬ-2 группы. Отобранные акристаллические клоны не обладали биологической активностью по отношению к личинкам непарного шелкопряда (^-эндотоксину и колорадского жука (р-экзотоксин).

■ Исследование белкового состава Cry ~-мутантов с помощью электрофореза в полиакриламидном показало, что в препаратах отсутствуют мажорные кристаллические белки 130 и 60 кДа, характерные для исходного штамма HI-C6.

Анализ грансцепиентов штамма HI-C6 и Сгу~- мутантов. . Выполненный нами анализ плазмидного профиля-показал, что состав высокомолекулярных плазмид отобранных клонов не изменился по сравнению с плазмидным профилем исходного штамма HI-C6, однако, из клеток некоторых СрГ-мутантов была элиминирована'низкомолекулярная 5,6-МДа пла?мида (Табл.8).

Для проверки,предположения о возможном участии в регулировании синтеза протоксина 5,6-МДа плазмиды из штамма HI-C6 мы провели эксперименты по совместному культивированию штамма HI-C6

Таблица 8.

Плазмидный состав штамма Н1-С6 и Сгу--мутантов

N Штаммы Молекулярные веса плазмид, МДа.

I Н1-С6 . 55; 43; 12; 7,3; 5,6; 5,1;. 2,8(рВС16)

2 Сгу"-1-13 55; 43; 12; 7,3; - ; 5,1

3 Сгу"-2 55; 43; 12; 7,3; 5,6; 5,1

(рВС16), являщегося донором 5,6-ВДа плазмидн, и акристалли-ческого мутанта 1-133^, в котором отсутствовала данная низкомолекулярная плазмида. Частота передачи плазмида рВС16 составляла Ю"еог числа рецшшентных клонов. Все трансконьюганты с фенотипом Б^Тс^содержали кристаллические включения бипирами-дальной формы, аналогичные таковым донорного штамла Н1-С6. Анализ плазмидного профиля получении наш трансконьюгантов показал, что 5,6-ВДа плазмида передавалась с частотой порядка 50$ от исследованных трансконьюгантов.' Наличие кристаллических включений в трансцепиентах, не содержащих низкомолекулярную 5,6-МДа плазмиду, исключает, по-видимому, решающую роль данной плазмида в регуляции синтеза протоксина. Однако, биологическая активность по о-эндотоксину трансцепиентных клонов, не содержащих 5,6-МДа плазмиду, была снижена по сравнению с биологической активностью трансцепиентов, получивших 5,6-МДа плазмиду (Табл.9), что позволяет предположить участие данной плэзмвды в регуляции количественной продукции эндотоксина. ,

Таблица 9.

Биологическая активность трансконьюгантов.**

Тест-на- 1^3 Трансконьюганты

секомые С6 *1 |*2 |*5 *7 *8 2 3 4 6 9 10 г

шелкопряд 0 10 3 2 3 4 I 13 6 6 7 8 5 32

колорадский жук 0 10 5 4 7 5 8 29 7 6 6 7 4 30

* Клоны, содержащие 5,6-МДа плазмиду;** Приведены количества

живых насекомых; В каждый опыт взяты по 10 насекомых.

Необходимо отметить, что все грансконыоганты, восстановившие продукцию протоксина, восстанавливали и продукцию ^-экзотоксина (Табл.9). Снижение продукции^-экзотоксина трансцепиентными клонами по сравнению с контрольный штаммом HI-C6 может быть объяснено использованием для анализа отдельных, клонов, обладающих сниженной по сравнению с контрольным штаммом биологической активностью. На основании полученных результатов можно сделать предположение,' что в штамме HI-C6 продукция ^-экзотоксина обусловлена кристаллкодирующей йлазмидой, которая расположена, по-видимому, на уровне 43- или 55-МДа плазмиды и экранируется при анализе плазмидного профиля штамма HI-C6.

ВЫВОДЫ

1. Наибольшую опасность для производства битоксибациллина представляют фаги ТЪ-2 группы, обладающие высоким относительным урожаем.

2. Чередование в производстве чувствительных и устойчивых к инфекции фагов продуцентов приводит к появлению "модифицированных" фагов с расширенным спектром литического действия. В связи с этим смена культур признана нецелесообразной.

3. Ограничение развития ТЬ-2 фагов полученными фагоустой-чивыми. мутантами штамма Bacillus thuringiensls HI-I77 не связано с фагадсорбирующей способностью.

4. На основании анализа относительного урожая фагов и экспериментов по трансдукции установлено, что фэгорезистентность отобранных штаммов обусловлена мутациями, влияющими на внутриклеточное развитие фагов.

5. С использованием селектированного фагоустойчивого штамма HI-C6, полностью ограничивающего развитие! фагов ТЬ-2 группы, выделен фаг Tt9I, способный осуществлять межвариантную трансдукцию.

6. Полученные на основе штамма HI-C6 акристаллические фа-

гоустойчивые реципиенты могут быть использованы для создания высокоактивных энгоыопатогенных продуцентов, обладающих различным спектром инсектицидного действия.

7. В клетках штамма EI-C6 генетические детерминанты экзо-и эндотоксинообразования локализованы на одной плазмиде.

Список работ, опубликованных по материалам.диссертации

1. Королева Ю.В., Григорьева Т.М., Смирнова Т.А., Азизбе-кян P.P. Бактериальная модификация фагов Bacillus thuringlen-sl3.- Биотехнология, 1990, 6:12.-15.

2. Королева Ю.В.-, Григорьева Т.М., Азизбекян P.P. Выделение и характеристика фагоустойчивых мутантов Bacillus thurln-glensls var. thurlnglensls.- Биотехнология, 1992, 2:3-5.

3. Королева Ю.В., Миненкова И.Б., Азизбекян P.P. Ультраструктура нового трансдуцирующего фага Tt9I с широким спектром литического действия.- В сб.: Тезисы докладов конференции по электронной микроскопии. М., 1992, с.26.

4. Королева Ю.В.,Миненкова И.Б..Шамшина Т.Н..Азизбекян P.P. Структурная и молекулярно-биологическая характеристика нового трансдуцирующего фага Bacillus thurlngiensls Tt9I.- Молекулярная генетика,. микробиология и вирусология, 1993 (в печати).