Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Изучение структуры геномов группы бактериофагов Bacillus thuringiensis

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Смирнов, Виктор Борисович

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.II

1.1. Краткая характеристика вида микроорганизмов Bacillus thuringiensis.

1.2. Экстрахромосомные элементы генома Bacillus thuringiensis

1.3. Исследование геномов с помощью рестриктаз

1.3.1. Системы рестрикции-модифжации.

1.3.2. Рестрикционный анализ вирусных и фаговых геномов.

1.3.3. Гетерогенность вирусных и фаговых популяций

1.4. Использование фаговых геномов в молекулярном клонировании.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Изучение структуры геномов группы бактериофагов Bacillus thuringiensis"

Производство бактериальных средств защиты растений от вредных насекомых является одной из наиболее развив авдихся отраслей микробиологической промышленности. Основу бактериальных средств защиты растений составляют спорокристаллические комплексы Bacillus thuringiensis . Широкое применение микробных энтомопатоген-ных препаратов для регуляции численности вредных насекомых в природных и искусственных экосистемах обусловлено высокой избира -тельностью действия данных препаратов по сравнении с химическими инсектицидами, и прежде всего, отсутствием токсического действия на теплокровные организмы. Однако, несмотря на успехи в технологии ферментации Вас•thuringiensis и в применении бактериальных препаратов, вопрос получения продуктивных и технологических штаммов, стабильных по важнейшим показателям, продолжает оставаться актуальным.

Возможность дальнейшего увеличения производства и повышения эффективности действия энтомопатогенных препаратов несомненно связанн о накоплением и использованием в практических целях информации в области молекулярной биологии и генетики Вас.thuringiensis*

В результате усилий различных коллективов исследователей установлена биохимическая структура энтомопатогенного кристалла / 72, 74, 75, НО, 149 /, показано наличие в клетках Вас. thuringiensis внехромосомных элементов наследственности / 19 , 23, 31, 120, 123, 126, 136, 214/, продемонстрирована поли-лизогения штаммов ряда серотипов /3, 36, 39, 56, 58, 83 /, установлено, что характер взаимоотношений в системе фаг-клетка Вас. thuringiensis определяется уровнем спорообразувдей активности бактерий, наличием системы рестрикции - модификации, лизогенным состоянием чувствительных штаммов /2, 3, 4, 5 / .

Полученные в разные годы данные обобщены в ряде монографий и диссертаций / I, 10, 18, 19, 73, 78 /.

Особо пристальное внимание исследователей, работающих в области генетики бацилл, привлекают проблемы создания векторных систем, что может способствовать решению как теоретических, так и прикладных задач. При конструировании рекомбинантных молекул могут быть использованы такие генетические структуры, как геномы плазмид и умеренных фагов. Однако, по сравнению с системами Е. eoli и Вас. subtilis , система Вас. thuringiensis практически не изучена.

Во-первых, для плазмид и фагов Вас. thuringiensis , являющихся потенциальными векторами, еще не построено достаточно полных генетических карт, и ни один из изученных фагов до настоящего времени не применялся в качестве вектора. Кроме того, имеются всего лишь единичные сообщения о трансдукции бактериофагами Вас. thuringiensis / 3, 7, 95, 217 /. Во-вторых, функции исследованных до сих пор геномов, фагов и плазмид, содержащихся в клетках Вас .thuringiensis остаются большей частью криптическими / 62 /.

Необходимым условием успешного проведения физико-химических исследований фаговых макромолекул является получение чистых препаратов фагов. В то же время анализ данных литературы, посвященных исследованию фагов Вас. thuringiensisj показывает, что большинство экспериментов выполнено с применением нефракционирован-ных фаголизатов. Однако, учитывая лизогенный статус шташов Вас. thuringiensis » очевидно, что исключение этапа фракционирования фаголизатов может привести к получению некорректных результатов, особенно при тонких физико-химических и иммунологических исследованиях, так как исходные фаголизаты многокомпонентны.

Цели и задачи исследования. Актуальность исследования фагов Bac.thuringieneie , как потенциальных векторов, а также необходимость разработки адекватных методических приемов концентрирования и фракционирования фаголизатов, определили следующие ос -новные задачи настоящего исследования:

1) выделить умеренные и вирулентные фаги Вас. thuringiensis из различных источников, в том числе из лизогенных штаммов Ш, 1У, У серотипов, учитывая, что штаммы перечисленных серотипов используются в СССР в качестве продуцентов микробиологических средств защиты растений;

2) провести первичную таксономическую дифференциацию фагов;

3) разработать методические приемы получения препаративных количеств фагового материала; дать основные параметры режимов концентрирования и фракционирования фаголизатов;

4) изучить физико-химические свойства ДНК выделенных фагов; исследовать с помощью рестриктаз структуру геномов фагов; опре -делить количество и молекулярные массы образующихся рестрикцион-ных фрагментов;

5) на основании полученных данных по изучению биологических свойств, физико-химических параметров ДНК и особенностей структуры геномов выделенных фагов, оценить степень их родства и воз -можность применения для конструирования векторных систем Вас .thuringiensis*

Научная новизна работы. В процессе настоящей работы выделены

• из различных источников 24 фага Вас.thuringiensis . Изучены биологические и структурные характеристики фагов. Установлен факт • полилизогении штамма" Ш серотипа.

Разработаны методические приемы препаративного получения и фракционирования фагов Вас,thuringieneie ; методом ^-изопикни-ческого центрифугирования в градиенте плотности хлористого цезия показана гетерогенность популяции фагов по плавучей плотности , коррелирувдая с гетерогенностью по биологическим признакам.

Изучены физико-химические параметры ДНК представителей групп фагов. Проведен рестрикционный анализ геномов фагов. Показано , что фаги Td6 и Tg2I, выделенные из штаммов 1У и У серотипов, обладают сходством структурной организации геномов. Установлено , что ДНК фага Tg20 гидролизуется рядом рестриктаз с образованием фрагментов различной молекулярной массы, вследствие чего фаг Ug20 может быть рекомендован к использованию в экспериментах по генной инженерии.

Научно-практическая значимость работы. Выделенные бактериофаги могут быть использованы в изучении взаимоотношений в системе фаг - клетка Bac.thuringieneis

Исследовано действие спектра рестриктаз на фаговые ДНК , что является необходимым этапом для использования фаговых геномов в экспериментах по молекулярному клонированию»

Установление факта лизогении штамма Ш серотипа Bac.thuringien-sie может быть использовано при разработке мер борьбы с фаголизисом на производстве.

Предложенные методические приемы выделения фагов, концентрирования и фракционирования фаголизатов могут быть использованы в лабораториях, занимающихся вопросами бактериофагии Bac.thuringi-ensis

Апробация. Результаты диссертационной работы докладывались на Ш Всесоюзной конференции по генетическим основам селекции промышленных микроорганизмов (Минск, 1975); П научной конференции молодых ученых ВНИИ генетика (Москва, 1976); советско-американ ской конференции "Генетика актиномицетов и бацилл " ( Ереван, 1977); I Всесоюзной конференции "Статистические свойства микроструктур" (Москва, 1978); Х1У Международном генетическом конгрессе (Москва, 1978); Региональной конференции молодых ученых и специалистов Нечерноземной зоны РСФСР (Ленинград, 198I); совместном заседании Ленинградского отделения Всесоюзного микро -биологического общества и кафедры микробиологии биолого-почвенного факультета ЛГУ (Ленинград, 198I); Городской конференции молодых ученых и специалистов ЛО ВМО "Микробиология - народному хозяйству" (Ленинград, 1981); межлабораторном семинаре по генетике бактериофагов ВНИИГенетика (Москва, 1983).

Материалы диссертационной работы были представлены и премированы на конкурсе работ молодых ученых Ленинградского отделения Всесоюзного микробиологического общества (Ленинград, 1981), на конкурсе работ молодых ученых Ленинградской области, посвя -щенном XIX съезду ВЛКСМ (Ленинград, 1982), на Всесоюзном конкурсе работ молодых ученых (Москва, 1982).

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Смирнов, Виктор Борисович

ВЫВОДЫ

1. Из природных источников - образцов почв и лизогенных культур выделены бактериофаги, продуктивно инфецирующие штаммы Bac.thuringiensis . На основании полученных данных по изучению биологических и структурных характеристик бактериофаги разделены на три группы.

2. Методом JJ-изопикнического центрифугирования в градиенте плотности CsCi показана гетерогенность популяций фагов , TgE3, TgI8, Tg20, TkI.

3. Обнаружена фракция структурированных элементов, идентифицированная как тетрагональный слой клеточных стенок Bac.thuringiensis •

4. Изучены физико-химические свойства ДНК фагов Т£4, TgI2, TgE3, TgE8, Т&20. Методом термической денатурации установлено процентное содержание ГЦ-пар в фаговых ДНК. Методом измерения контурных длин молекул и по сумме рестрикционных фрагментов определены молекулярные массы ДНК фагов.

5. Проведен рестрикционный анализ ДНК фагов Tg£, Gg9, Tgll, TgI2, IfclB, Tg20, Tg2I, Td6, TkI. Определены количество и молекулярные массы рестрикционных фрагментов ДНК. На основании сравнения электрофореграмм, полученных при разделении продуктов гидролиза ДНК фагов Tg4, %9, Tgll, Tg2I, Td6 рестриктазой Hind III, сделано заключение о сходстве структурной организации их гено -мов.

6. Данные о наличии минорных зон ДНК на электрофореграмме продуктов гидролиза ДНК фага TgI2 рестриктазой Hind ill } наряду с гетерогенностью популяции по физическим и биологическим признакам, могут свидетельствовать о структурной вариабельности генома фага 3gI2.

7. Чувствительность ДНК фага Tg20 к большому числу рестрик-таз, а также широкое разнообразие молекулярных масс и количества рестрикционных фрагментов позволяет рекомендовать ДНК данного фага к использованию в качестве векторной молекулы.

Заключение

Вид микроорганизмов Bacillus thuringiensis является основным продуцентом энтомопатогенных препаратов в СССР,

В настоящее время дальнейшее увеличение производства микробных инсектицидов сдерживается как несовершенством технологии ферментации, так и отсутствием штаммов Bacillus thuringiensis, стабильных по важнейшим генетическим и биохимическим показателям. Дальнейший прогресс в получении новых штаммов-продуцентов энтомопатогенных препаратов, как указано в Продовольственной программе, связан с использованием методов генетической инженерии.

Согласно литературным данным генетический аппарат Вас.thuringiensis содержит геномы умеренных фагов, что дает возможность использовать эти генетические структуры для конструирования рекомбинантных молекул в системе вектор-хозяин Вас. thuringiensis с целью изменения питательных потребностей штаммов, введения новых систем рестрикции модификации и получения других полезных признаков.

Практика молекулярного клонирования показывает, что необходимыми этапами технологии получения рекомбинантных молекул является поиск адекватных решшконов и изучение их структурных особенностей и характера взаимодействия с рестриктазами - одним из основных инструментов генной инженерии.

Таковы основные положения, вытекающие из обзора литературы и определившие ход наших исследований.

Экспериментальная часть

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Объекты исследования

В работе использованы штаммы Вас#thuringiensis, полученные из коллекций микроорганизмов ВНИИ генетика; штамм Вас,thuringiensis v#kurstaki-zi2 получен от Э.Р.ЗУрабовой.

Фаги выделены в процессе выполнения настоящей работы из образцов почв методом обогащения с применением штаммов различных серотипов, либо из лизогенных культур при спонтанной индукции.

2.2. Материалы

I. Жидкая среда для выращивания бактериальных культур: сухой препарат Nutrient Broth фирмы Difc!o 8 г дистиллированная вода I л

2. Плотная агаризованная среда перевар Хоттингера 150 г агар-агар 15 г дистиллированная вода до I л рН 7,2

3. Полужидкий агар агар-агар 7 г сухой препарат Nutrient Broth 2 г хлористый кальций 0,11 г сернокислый магний 0,15 г сернокислый марганец 1,2 г дистиллированная вода до I л рН 7,2

Г1

4. Трис-магниевый буфер для работы с препаратами фагов хлористый натрий 0,15 М хлористый магний 0,02 М сернокислый магний трис - HCI рН

5. Стандартный солевой буфер хлористый натрий лимоннокислый натрий

6. Буферный раствор для хранения препаратов ДНК, предназначенных к обработке рестриктазами хлористый натрий 50 мМ трис-НС1 10 мМ рН 8,2

7. Инкубационные смеси для проведения реакции гидролиза ДНК рестриктазами

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Смирнов, Виктор Борисович, Москва

1. Азизбекян P.P. Бактериофаги Bacillus subtilis . В кн.: Успехи современной генетики, 1972, № 2, с. 3-46.

2. Азизбекян P.P., Белых Р.А., Нетыкса Е.М., Погосбекова М.Р. Сравнительная характеристика спорообразующих и аспорогениых штаммов Bacillus thuringiensis . Генетика, 1978, т. 14, Л 3, с. 510-518.

3. Азизбекян P.P. Энтомопатогенные бактерии Bacillus thuringiensis и их фаги: генетическая и физиологическая характеристика. Автореф. дис. на соиск. учен, степени докт. биол. наук.- М., 1980. 36 с.

4. Азизбекян P.P., Нетыкса Е.М. Особенности развития фагов в спо-рообразуадих и аспорогенннх штаммах Bacillus thuringiensis- Генетика, 1978, т. 14, Л 4, с. 666-672.

5. Азизбекян P.P., Нетыкса Е.М. Сравнительная фагочувствитель-ность s и R - штаммов Bacillus thuringiensis . - Микробиология, 1978, т.47, в.З, с. 527-533.

6. Азизян А.Г. Генетическое изучение бактериофагов G1 , G3 и G 8 Вас.thuringiensis var.galleriae. Автореф. дис. на соиск .учен. степени канд. биол. наук. - М., 1977. - 21 с.

7. Алешин Г.И., Бурцева Л.И., Скавронская А.Г. Генерализованная трансакция Bacillus thuringiensis Генетика, 1979, т. 15, Я 7, с. II86-II90.

8. Алиханян С.И. Эксперименты по генной инженерии Bacillus thuringiensis . В кн.: 1У двусторонний симпозиум СССР ФРГ. Структура и транскрипция генома. Тезисы докладов. - М., 1980, с. 9.

9. Альбертсон П.О. Разделение клеточных частиц и макромолекул.- 102 - М.: Мир, 1974. 381 с.

10. Африкян Э.К. Энтомопатогенные бактерии и их значение. Ереван, 1973, АН Арм.ССР. - 420 с.

11. Беляева Р.Х., Добрица А.П., Ли Л.И., Баев А.А. Физическое картирование продуктов гидролиза ДНК фага л!ямбда рестрициру-вдей эндонуклеазой Serratia marcenses.- Докл. АН СССР, 1976, т. 230, в.2, с. I2I8-I222.

12. Бобык М.А., Афиногенова А.В., Чуркина А.Г., Зажин Э.И., Ламбина В.А., Кулаев И.С. Очистка Bdellovibrio bacteriovorus от клеток и мембран бактерий-хозяев. Изв. АН СССР. Сер.биологическая, 1978, * I, с. 155-157.

13. Богуш В.Г., Звенигородский В.И., Ребентиш Б.А., Смирнова Т.А., Пермогоров В.И., Алиханян С.И. Сравнительная оценка фагов Bacillus thuringiens-Генетика, т. 14, й 5, 1978, с. 867-875.

14. Богуш В.Г. Сравнительная оценка фагов Bacillus thuringiensis -Дис.на соиск. учен.степ. канд. био л .наук. М., 1978. - 124 с.

15. Бойер Г., Бетлах М., Боливар Ф., Родригес Р., Хейнекер Г., Шайн Дк., 1*удман Г. Создание векторов для молекулярного клонирования. В кн.: Рекомбинантные молекулы: значение для науки и практики. - М.: Мир, 1980, с. 20-34.

16. Воронин A.M. Онтогенез микроорганизмов. М.: Наука, 1979, с. 24-33.

17. ЗВ. Бурцева Л.И. Биологические особенности бактерий Bacilli thuringiensis . Автореф. дис. на соиск. учен, степени канд.биол. наук. Л., 1970. 27 с.

18. Галушка Ф.П., Азизбекян P.P. Плазмиды Bacillus thuringiensis Докл. АН СССР, 1977, т. 236, в. 5, с. 1233-1235.

19. Галушка Ф.П. Автореф. дис. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. М., 1979. 32 с.21. 1*улько Л.Б. Физическое картирование фагов и плазмид антино-мицетов. Автореф. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. М., 1983. 20 с.

20. Гришин А.С., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М., Колос, 1971, с. 55-76.

21. Дебабов В.Г., Азизбекян P.P., Хлебалина О.И., Дьяченко В.В., Галушка Ф.П., Белых Р.А. Выделение и предварительная характеристика экстрахромосомальных элементов ДНК Bacillus thuringiensis, Генетика, 1977, т. 13, ^ 3, с. 496-501.

22. Дебабов В.Г., Лицеман Л.Ф., Хлебалина О.И., Котова Т.С. Использование совмещенной системы транскрипции-трансляции для выяснения роли криптических плазмид Bacillus thuringiensis Мол. биология, 1979, т. 13, в. 6, с. 1230-1239.

23. Денисова Т.С., Ситникова Б.С., Гибадулин Р.А. Изучение фрагментации ДНК птичьего аденовируса CELO с помощью специфических ЭНДОНуклеаЗ R.Hpal, R.EcoRI, R.Hindlll.

24. Мол. биология, 1979, т. 13, в. 5, с. 1021-1034.

25. Дэвидсон Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М., Мир, 1976. -412 с.

26. Евдосеева И.А., Саминина А.А. Гетерогенность популяций современных штаммов вирусов гриппа В.Микробиологический журнал, Киев, 1980, т. 42, 4, с. 513-515.- 104

27. Егоров Н.С., Милько Е.С. Колониально-морфологическая изменчивость трех форм lycobacterium lactocolum 104 , полученных из одной клетки. Вестник Моск. ун-та, сер. биология и почвоведение, 1974, J£ 6, с. 59-62.

28. Егоров Н.С., Милько Е.С., Янева М.Б., Степанова Р.А., Мартын-кина Л.П. Установление лизогенности S формы Mycobacterium lacticolum и определение некоторых свойств выделенного бактериофага. Биологические науки, 1980, Jf 2, с. 88-92.

29. Завизион Б.А., Гольдберг Е.В., Народицкий Б.С., Золотарская Д.Е., Тихоненко Т.И. Фрагментация аденовируса обезьян типа 7 ( SA7 ) специфическими эндонуклеазами R.Bgl II,R. Hind. Ill Вопросы вирусологии, 1979, К 6, с. 565-599.

30. Захарян Р.А., Исраэлян Ю.А., Агабалян А.С., Татевосян П.Е., Акопян С.М., Африкян Э.Г. Плазмидные ДНК Bacillus thuringien-eie . Микробиология, 1979, т. 68, в.2, с. 226-229.

31. Звенигородский В.И., Смирнова Е.И. Выделение и свойства вирулентных и умеренных фагов Bacillus thuringiensis Биологические науки, 1976, J5 II, с. 17-23.

32. Звенигородский В.И., Серегина Т.Г., Смирнова Е.И. Особенности взаимодействия некоторых умеренных фагов с культурой Bacillus thuringiensis . Биологические науки, 1974, К 5, с. 19-25.

33. Казакова Т.Б. Рестрикционные эндонуклеазы как инструмент анализа структуры митохондриального генома. Успехи современной биологии, 1979, ь. 88, в. 1(4), с. 18-35.

34. Кишко Я.Г., Полховский Л.А., Самойленко В.И. Морфология фагов спорообразукхцих бактерий. Киев, Микробиологический журнал, 1980, т. 42, I I, с. 22-26.- 105

35. Кишко Я.Г., Полховский В.А. Лизогения культур Bacillus thuringiensis выделенных из различных природных источников. Микробиологический журнал, 198I, т. 43, Л 3, с. 288-292.

36. Козлов Ю.И., Машко С.В., Дебабов В.Г. Методы генетической инженерии. Успехи соврем, биол. химии, 1982, т. 22, с. 7-25.

37. Коротяев А.И. Плазмиды, вирусы и некоторые вопросы эволюции генетической схемы. В кн.: Научные труды Кубанского мед. института, 1978, т. 57, с. 123-138.

38. Кочкина З.М., Блохина Т.П., Раутенштейн Я.И. О полилизоге-нии культур Bacillus thuringiensis v.galleriae. Микробиология, 1977, т. 46, Я 4, с. 730-736.

39. Кочкина З.М., Раутенштейн Я.И., Тихонова Л.С. Концентрация и очистка актинофага на deae целлюлозе. Микробиология, 1966, т. 35, в. 3, с. 472-476.

40. Лазуркин Ю.С. Молекулярное плавление ДНК и эффект тонкой структуры кривых плавления. Мол. биология, 1977, т. II, в.6, с. I3II-I324.

41. Ловетт П.С., Брамуцци М.Г., Кеггинс К.М. Фаговая конверсия мутантов с нарушенной споруляцией. В кн.: Генетика акти-номицетов и бацилл. Сборник докладов советско-американской конференции, Ереван, 1977. М., 1978, с. II7-I26.

42. Машко С.В., Козлов Ю.И., Генинг Л.В., Стронгин А.Я., Ребен-тиш Б.А., Буйвид В.А., Захаренко В.И., Дебабов В.Г. Распределение последовательностей ДНК, узнаваемых специфическими эндонуклеазами. Мол. биология, 1977, т. II, в. 5, с. 11241136.

43. Методы практической биохимии. Ред. Б.Уильяме, К.Уилсон. М., Мир, 1978. 268 с.

44. Минина B.C., Андрусенко М.Я., Игнатьева Л.И., Князева И.Ф., Гордон И.О., Сорокина А.С., Рогова Т.Е., Астафьева Э.Н., Середнякова Н.И. Микробиологический синтез за рубежом. М., Главмикробиопром, 1973, с. 31-34.

45. Михайлов Е.Н., Шевякова М.И., Орлова И.А. Концентрация вирулентного фага и инсектицидная активность энтобактерина. Защита растений, 1972, Я 7, с. 25-26.

46. Попов Г.В., Трифонова А.Г., Райчева Е.С. Концентрация поли-этиленгликолем и очистка на сефарозе бактериофагов. Вопросы вирусологии, 1973, № 4, с. 461-465.

47. Полховский В.А. Макромолекул^фная структура бактериофагов Bacillus . Мол. биология, 1974, т. 8, в. I, с. 100-107.

48. Полховский В.А. Изучение адсорбционной способности некоторых фагов Bacillus . Вестник Каракалпакского филиала АН Уз .ССР, 1974, т. 2, Л 5, с. 35-37.

49. Полховский В.А. Физико-химическая характеристика ДНК и аминокислотный состав фагов Bacillus . Вопросы вирусологии, 1976, Н 5, с. 597-601.

50. Поляновский О.Л., Носиков В.В. Рестрикционные эндонуклеазы в генетической инженерии. Итоги науки и техники. Сер. биол. химия. М., 1978. 190 с.

51. Раутенштейн Я.И. Бактериофагия и микробиологический метод борьбы с вредными насекомыми. В кн.: Микробиологические метода борьбы с вредными насекомыми. М., АН СССР, 1965. -144 с.

52. Раутенштейн Я.И., Мисюрева Н.Г., Хачатрян Л.С. Лизогения культур Bacillus cereus v.galleriae и особенности содержащихся в них фагов. Микробиология, 1964, т. 33, в. 6, с. 980986.

53. Раутенштейн Я.И., Москаленко Л.Н., Маранц Л.А., Блохина Т.П. Индукция вирулентных мутантов умеренных фагов индикаторных культур как причина возможных ошибочных заключений. Микро -биология, 1964, т. 43, в.4, с. 732-734.

54. Раутенштейн Я.И., Курковская Г.Е., Блохина Т.П., Соловьева Н.Я. Получение вирулентных культур группы Bacillus thuringiensis под влиянием антибиотика ванкомицина. Микробиология, 1972, т. 41, в. I, с. 177-178.

55. Раутенштейн Я.И., Москаленко Л.Н., Беспалова И.А., Тихонен-ко А.С. Ультраструктура бактериофага, специфичного для Bacillus thuringiensis v. galleriae . Микробиология, 1976, т.45, в. 4, с. 690-700.

56. Ронинсон Б.А., Народнцкий Б.С. Физическое картирование геномов ДНК содержащих онкогенных вирусов. Вопросы вирусологии, 1978, JS 4, с. 384-398.

57. Саканян В.А., Селиванова Г.Н., Буканов Н.О., Крупенко М.А., Алиханян С.И. Распространенность, гомология и клонирование криптических плазмид Bacillus thuringiensis . Генетика, 1982, т. 18, № 2, с. 181-389.

58. Симонян С.З., Антонова Т.Н., Чернов В.И., Носиков В.В. Использование рестриктаз EcoR I , Bam Н I , Kpn I , Hind III для анализа генома вируса осповакцины. Мол.биология, 1979, т. 13, в. 6, с. I255-I26I.

59. Сладкова И.А., Васильченко Л.Г., Ломовская Н.Д., Мкртумян Н.М. Физическое картирование ДНК актинофагов Streptomyces coelicolor А3(2). I. Локализация с-области актинофаги C3I. i-Мол. биология, 1980, т. 14, в. 4, с. 910-915.

60. Сладкова И.А., Ребентиш Б.А. Физическое картирование актинофагов streptomyces coelicolorA3(2). Ш. Рестрикционный анализ. Мол. биология, 1980, т. 14, в. 5, с. II3I-II36.

61. Сладкова И.А. Физическое картирование актинофагов Streptomycfes coelicolor А3(2). Ш. Рестрикционный анализ. Мол. биология, 1980, т. 14, в. 5, с. II37-II40.

62. Талалаева Г.Б., Андросова Л.Н. Фаги бацилл группы thuringiensis и их влияние на инфекционный процесс. Сиб.вестник с/х науки, 1974, В I, с. 59-63.

63. Технология производства и характеристика бактериальных препаратов. М., Главмикробиопром, 1979. 53 с.

64. Тихоненко А.С. Ультраструктура вирусов бактерий. М., Наука, 1968. 168 с.

65. Тихоненко Т.И. Биохимия вирусных частиц (нуклеиновые кислоты) . М., Медицина, 1977. 368 с.

66. Трусков В.М. Функционально-структурная характеристика бацилл группы thuringiensis и их инклюзий, полученная на основании физических методов исследований. Автореф. дис. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. Иркутск, 1969. 26 с.

67. Трофименков В.Н., ТуМаркин Р.И., Файбич М.М. Биологическиеи имцунохимические свойства бежа кристаллов Bacillus thuringieneie . Изв. АН СССР, Сер. биол., 1979, & 2, с. 296-300.

68. Хачатрян Л.С. Бактериофаги культур групп Bacillus cereus-thuringienais . Автореф. дис. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. М., 1965. 24 с.

69. Честухина Г.Г., Костина Л.И., Залунин И.А., Котова Т.С., Катруха С.П., Кузнецов Ю.С., Степанов В.М. Белки кристаллов

70. С- эндотоксина Bacillus thuringiensis . Биохимия, 1977, т. 42, в.9, с. 1660-1667.

71. Шемякин М.Ф., Шумилов В.Ю. Защита РБК полимеразой Escherichia соДДучастков решшкативной формы I ДНК фага 4 х174, узнаваемых рестриктазами Hind ll,Bsp R l,Alu I . Мол. биология. 198I, т. 15, в. 5, о. II44-II57.

72. Эрлих С., Бурштейн-Петегрю X., Стройновски И., Ледерберг Дж. Клонирование гена тимидилат-синтетазы фага / ЗТ. В кн.: Рекомбинатные молекулы, значение для науки и практики. М., Мир, 1980, с. 91-104.

73. Яловицин М.В. Физиология энтомопатогенных бацилл как биологических инсектицидов. Автореф. дис. на соиск. учен, степени канд. биол. наук. Алма-Ата, 1969. 26 с.

74. Aai J.C.,Boret P. OJhe gel electrophoresis of DBA.-Biochim.> Biophys.Acta,1973»v.269,H 16,p.192-»200.80* Adams Ы.Н. Bacteriphages.London,1959»

75. Ackermann H.W. La classification des bacterophages de "Bacillus" et "Clostridium".-Pathol.Biol.f1974f22f N 10fp.909~ 917.

76. Ackermann H.W.tAudurier A.fBerthiaume L.,Jones L.A.,Mayо J.A. Lidaver A.K. Guidelines for bacteriophage charactirization.». Adv.Virus Res., 197$v.23,p.1-24.

77. Ackermann H.W.,Smirnoff W.A. Rechercheв sur la lysogenie chez Bacillus thuringiensis et Bacillus cerens.~Can.J.Miorobi~ ol.,1978,v.24,H 7tP»818~826.

78. Ackerman H.W.,Eisenstcrk A. She present state of phage taxono-my.-Intervlrol.,1974,v.2»P.201-219.

79. Anderson D.L.,Micman D.D.,Reilly B.E. Structure of Bacillus subtilis bacteriphage 0 29 and the length of 0 29 deoxyribonucleic acid.-J.Bacteriol.t1966 ,v.91,N 5,p.2081-2089#

80. Anderson D.L.,Mosharrafa Б.Т. Physical and biolygical properties of phage 0 29 deoxyribonucleic acid.-J.Virol., v.2fH 10,p.1185-1190.

81. Angus T.A. A bacterial toxin paralieing larval.-Nature,1954,

82. Arber W.,Linn S. DM modification and restriction.-Ann.Rev. Biochem.,1969,v.38,p.467-500.

83. Barksdale L,,Arden S. Persisting bacteriophage infections lysogeny and phage conversions.-Ann.Rev.Microbiol.,1974, v.28,p.265-299.

84. Barns K.J.,Kelly T.J. Visualization of the inverted virus DNA.-J.Molec.Biol.,1974,v.82,H 2,p.267-271.

85. Berns K.J.,Kort J,,Pife K.H.,Gragan E.W.,Spear J. Study of the fine structure of adeno-associated virus DHA with bacterial restriction endonucleases.-J.Virol.,1975,v.16,lI 3,p.712-719. i

86. ЮО.Вопату C.,Keryer E.,Szulmajster J. Cloning of Bacillus subti-lis DNA fragments carrying spore genes.-Spores 7*Pap.7-th Int.Spore Conf.,Madison,Misc.1977»D.C.,1978,p.133~143.

87. Bonnefoi A.,Barbae H.,de,Classification dee souohes du grou-pe Bacillus thuringiensis par la determination de llantigene flagelaire.-Entomophagaf1963,v.8,.J 3,p.223-229.

88. Bott K.,Strauss B. The carrier state of Bacillus subtilis infeeted with the transducing bacteriophage SP-10.-Virol#, 1965 tv.25,H 1,p.218-225.103#Boyer W.H. Restriction and modification of DNA: enzymes and substratee.^Fed.Proc.,1974,v.33,p.1125-1127.

89. Bradly G.E. The isolation and morfology of some new bacteriophages specific for Bacillus and Acetobacter species.-J.Gen.Microbiol.,1965,v.41,H 2,p.233-241.

90. Brockman W.W.,Bathane D. The isolation of simian virus 40 variants with specifically altered genomes.-Proc.Hat.Acad. Sci.USA,1974,v.71,p.942-946.

91. Bron S.,Murray K. Restriction and modification in Bacillus subtilis.Hudeotide sequence recognized by restriction en-donucleaee R.BsuR from Btrain R.-Mol.Gen»Genet,v.14, N 1,p.25-33.

92. Campbell A. The bacteriophage lambda.-Cold Spring Harbor Laboratory,1971,p.21-24. ,

93. Danna K.J.,Nathans D. Bidirectional replication of simian virus 40 DHA.-Proc.ITat.Acad.Sci.,USA,1972,v.69,p.309-310»

94. Debabov V.G.,Azizbekyan R.R.,Khlebalina 0,J.,Sladkova J.A., Belich R.A.,Galushka P.P.,Neticsa Б.А. Plaemids of Bacillus thuringiensis.-In: Genetics of Actnomicetes and Bacilli. Erevan,1^78,p.184-193.

95. Dobitsa A.P.,Dobitsa S.V. DNA protection with the DHA met-hylaee M Bbvl.from Bacillus brevis var.G13 against cleavage by the restriction endonuclease Pst I and Pvu II«-Gene,1980, v.10,N 2,p,10>112.

96. Doskocil J.,Forstova J.,Stokrova J. Temperate and virulent forms of the phage The ta, at talcing Bacillus licheniformis.-Mol.Gen.Genet.,1978,v.160,н 3,p.311-317#

97. Ermaкova L.M.,Galushka P.P.,Strongin A.Ja.,Sladkova J.A., Rebentish B.A.,Andreeva M.T*,Stepanov W.M. Plasmide of crystal-forming Bacilli and the influence of growth medium composition on their appearence.-J,Gen.Microbiol.,1978,v.107 j p•836-838.

98. Bskin В.,Linn S. The deoxyribonucleic acid modification and restriction enzymes of Escherichia coli В II.Purification, eubanit structure and catalitic properties of the restriction endonuclease.-J«Biol*Chenw,1972,v.257*N 19»P-6183-6191.

99. Eareed G.C.,Byrne J.C.,Nartin Ы.А. Triplication of a unique genetic segment in a simian virus of human origin and evolution of new viral genomes.-J.Mol.Biol.,1974,v.87,p•274-288.

100. Eaust R.M.,Spizizen J.,Gage V.,Travers R.S. Extrachromoso-mal DHA in Bacillus thuringiensis var, kurstaki var.finiti-mus,var.sotto,and in Bacillus popilliae.-J.Invertebrata Pathol.,1979,v.33,И 2,p.233-238.

101. Eleckenstein B.,Bornkamn G.W.,Ludwig H. Repetitive sequences in complete and defective genomes of Hersvirus Saimiri.-J.Virol.,1975,v.15,p.398~406.

102. Erenkel B.,bavi S.,Winocour E. The host DNA sequences in different populations of serially passaged SV-40.-Virol., 1974,v.60,N 1,p.9-20.

103. Gold M.,Gefter M.,Hausmann R.,Hurwitz J, Methylation of DHA.«* J.Gen.Fhysiolog.,1966,v.43,H 5,p.5-26.

104. Gold M.,Hurwitz J. The enzymatic methylation of the nucleic acid.-Quant.Biol.,1963,v.28,p.149-159.

105. Gruenbaum Y.,Cedar H»,Razin A. Restriction enzyme digestion of hemimethylated DNA.-Bucl.Acids Res.,1981,v.9,N 11, p.2509-2516.

106. Groman H.B.,Eaton M.,Booher Z. Studies of mono- and polylysogenic Corynebacterium diphtheria.-J.Bacteriol.,1958,v.75, N 3,P.320-325.142* Gwinn D.D.,Lawton W.D. Alteration of host specificity in

107. Ljda S.,Arber W. Restriction cleavage analisis of specialized transducing phage PlC.-E:cp6rimentia,1977,v.33,N 6,p.821.

108. Ikawa S.,Shibata T.fAndo T.9Saito H. Genetic studies on si-tespecifdcendodesoxyribonucleases in Bacillus subtilis: Multiple modification and restriction systems in transformers of Bacillus subtilis 168.-Mol.Gen.Genet.,1980,v.177, P#559-368.

109. Kleinschmidt A.K.,Zahn R.K. fiber Deoxyribonuklein-saure Mo~ lekeln in Protein Mschfilmen.-Z.Naturforsch.,1959,14b,H 12, P.770-779.

110. Kleinschmidt A.K. Monolayer techniques in electron microscopy of nucleic acid molecules.-Methods in Enxymology,1968, v.12,N 3,p.361-376.

111. Elier A.F.,Kunst F.,Rapoport 6. Structure of cloned riboso-mal DNA cietorns from Bacillus thuringiensis.-Nucl.Acids Res. 19794,p.997-1010.

112. Kroyer J.M.,Perkins J.B.,Rudinski M.S.,Dean D.H. Physical mapping of Bacillus subtilis phage £14 cloning vehicles: heteroduplez and restriction enzyme analyaes.-Mol.Gen.Genet. 1980,V.177,H 3,P.511-517.

113. Krig A. Identifizirung von Bacillus thuringiensis in micro-biologischen Preparaten durch Kombination von Immunofluores-zenz und Phasenkontrast-Verfahren.-Lbl.f.Bacterid.,I orog., 1965,v.197,H 4,S.527-532.

114. McClelland M. The effect of sequence specific DHA methylati-on on restriction endonuolease cleavage,-Nucl.Acids Res., 1981*v.9,N 22,p.5859-5866•

115. Meselson M.,Yuan R»,Heуwood J. Restriction and modification on DNA*Ann Rev.Biochem. ,1972,v.41,p#447-466.

116. Meynell G.G. Bacterial Plasmide Macmillan,London,1972.

117. Murray N.E.,Murray K. Manipulation of restriction targets in phage Л to form receptor chromosomes for SNA frag-ments.-Nature, 1974,v.251 5475tp.476-485.

118. Nathans D.,Adler S.P.,Brokman W.,Danna K.J.,Lee J.N.,Sack G. H. Use the restriction endonucleases in analyzing the genome of simian virus 40.-Fed.Proc.,1974,v.33,H 8,p.1135-1138.

119. Uorris J.R. Electroforetic analisis of bacterial esterase systems-an aid to taxonomy.-J.Gen.Microbiol.,i972,v.28,IT 4.

120. Panasenko S.M.,Cameron J. R., Da vis R.W.,behman J.R. Fine-handredfold overproduction of DKA-ligase after induction of a hibrid lambda lysogen constructed in vitro.-Science,1977,v.196,N 428б,р.188-189»

121. Perkins J.B.,Larley C.D.,Dean D.H. Restriction endonuclea-se mapping of bacteriophage 0105 and closely related temperate Bacillus bacteriophages £10 and J 14.-J. Virol.,1978,v.28,N 1,p.403-407.

122. Ann.Rev. Genet., 1970, v.4,p.177-193.

123. Reyly B.E. Bacteriophage of Bacillus subtilie as a paradigm of bacteriophage of Bacilli-in nMicrobiology-l976n,Washington , 1 976 , p . 228-237•

124. Reanney D.C.,Ackermann H.-W. An Updated Survey of Bacillus Phages.-Interviol.,1981,v.15,p.190-197.

125. Roberts R.J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequence.-A.Review-Gene, 1980,v,8,11 4,p.429-433 •

126. Roberts R.S. Restriction endonuclease,In: Critical revier-ws in biochemistry (ed by Rasman),1976,p.R 3 164.

127. Rosenwirth B.,Tija S.,Westphal M.,Doerfler W, Inclomplete particles of adenovirus II.Kinetic of formation and polypeptide composition of adenovirus type 2.-Virol.,1974,v.60,11 2, p.431-437.

128. Rosner J.U. Modification-deficient mutants of bacteriophage P1.I.Restriction by cryptic lysogens.-Virol.,1973»v.52, N 1,p.213-222.

129. Rubinstein A.S.,Kaplan A.S. Electron microscopic studies of DNA of defective and standart Pseudorabies virions.-Virol.,1975,v.66,U 2,p.385-392.

130. Scher B.M., Law M.F,,Garro A.J. Correlated genetic and EcoRi cleavage map of Bacillus subtilis bacteriophage $ 105 DNA.-J.Virol.,1978,v.28,N 2,p.395-402.

131. Skare J.,Summers W.P.,Summers W„C* Structure and function of Herpesvirus genome,-I.Comparison of fine HSV-I and two HSV-2 strains by cleavage of their DNA.-J,Virol.,1975,v,15, N 4,p.726-732.

132. Schilling R.,Wiengartner В.,Wander Vliet P.C,,Steenbergh P.H.,Jahsz H.S. Replications of adenovirus type 5 DNA.Cold Spring Harbor Symp.Quart.Biol,,1975,v.39,part 1,p.539-545.

133. Schilling R.,Weingartner B.,Winnacker E. Adenovirus type 2 replication.-J.Virol•,1975>v.16,p.759-760•

134. Sharp A.,Sugden B.,Sambrook J. Detection of two endonuclease activities in Haemophilus parainfluenzae using ana-litical agarose-ethidium bromide electrophoresis.-Bioche-mistry,1973»v.12,N 26,p.3055-3063.

135. Shibata T.,Ando T. In vitro modification and restriction of phage 0 105 С DNA with Bacillus subtilis N cell-free extract.-Mol.Gen.Genet.,1975>v.138,N 4,p.269-279#

136. Shibata Т.,Ikawa S.,Kim C.,Ando T. Site-specific deoxyri-bonucleases in Bacillus subtilis and other Bacillus stra— is.-J.Васteriol.,1976,v.128,N 1,p.473-476.

137. Stahly D.P.,Dingmann D.,Irgens R.,Pild C.,flees M.,Smith G. Multiple extrachromosomal deoxyribonucleic acid molecules in Bacillus thuringiensis.-f!EMS-Microbiol.,Iiett., 1978,v.3,N 3tP*139-141.

138. Thorne C.B. Transduction on Bacillus thuringiensis.-Appl. Environ.Microbiol.,1978,v.35,ff 6,p1109-1115.

139. Thome C.B.fKowalsky J. Temperate bacteriophages for Bacillus licheniformis.-ln Microbiology 1976,Washington D«C., p.303-314.

140. Toura M.,Kawamura F.,Saito H. Genetic instability of arti-fically constracted phage ^11 carrying histidine.A gene of Bacillus subtilis.-J.Gen.a.Appl.Microbiol.,1980,v.26,p.307-310.

141. Thomas M.,Cameron J.R.,Davis R.W. Viable molecular hybrids of bacteriophage lambda and eukariotic DHA.-Proo.Natl.Acad.

142. Sci ., USA, 1974, v. 71, If 11,p.4579-4583.

143. Thomas M«,Davis K.V. Cleavage of bacteriophage lambda DBA with EcoR I restriction endonuclease.-J.Mol.Biol.,1975, v.91,H 3,P*315-328.

144. Trautner T«A.,Pawlek Bron S.,Anagnostopoulos C. Restriction and modification in Bacillus subtilis: Biological Aspects.-Mol.GenGenet.,1974,v.131,N 2,p.181-191«

145. Vinograd J»,Hearst J«E. Equilibrium sedimentation of macro-molecules and viruses in a density gradient.-In Forschrift der Chemie organischer NaturstOj£f6.,Wien,1962,v.20,p.372-422.

146. Wilson G.H.,Williams M.T.,Banay H.W.,Young F.R. Characterization of temperate bacteriophages of Bacillus subtilis by the restriction endonuclease EcoR Is evidence for three different temperate bacteriophages.-J.Virol.,1974, v.14,p.1013-1016.

147. Yamamoto К.В.,Alberts B.,Benzinger R.,Lawhorne L.,Trei-ber G. Rapid bacteriophage sedimentation in the presence of polyethyleneglycol and its application to large scale virus purification.-Virol.,1971,v.40,N 3,p.734-744.

148. Yelton D.B.,Thorne C.B. Comparison Bacillus ceretzs bacteriophages CP-51 and CP-53.-J.Virol.,1971,v.8,U 1,p.242-253.

149. Yoneda Y.,Graham S.,Young P.E. Restriction fragment map of the temperate Bacillus subtilis bacteriophage SPO-2.-Gene,1979,v.7,N 1,p.51-68.

150. Yudelevich A.,Gold M. Methylation of DNA.-J.Mol.Biol., 1969,v.40,U 1,p.77-911. АКАДЕМИЯ НАУК СССР

151. ВСЕСОЮЗНОЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ОБЩЕСТВО

152. Ленинградское отделение ВМОг.Ленинград,1. ноября 1981 г,

153. Выписка из решения конкурсной комиссии городского конкурса молодых ученых и специалистов "Микробиология народному хозяйству"

154. ИНГРАДСКИЙ ОБЛАСТНОЙ СОВЕТ НАУЧНО-ТЕХНИЧЕСКИХ ОБЩЕСТВ1. ВЫПИСКАиз протокола J& п.2 заседания Президиума Ленинградского областного совета научно-технических обществ от 19 августа1982 г.

155. Телефоны: 12-93-77, 12-&S-S5, 12-75-601. И.А.ГЛЕБОВ1. Л.И.КНЯЗЕВАвента.1. ЦЕНТРАЛЬНОЕ ПРАВЛЕНИЕмвучмисшпеского о$цста сельского хозяйства1. Н S К С I А101000 Иоекм, Центр, уд. Клюй. 13 Тшифоаы: 294-ЗМ&, 29&-М-04