Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Перенос, экспрессия и наследование плазмиды RP4: : Mu cts62 у бацилл

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Перенос, экспрессия и наследование плазмиды RP4: : Mu cts62 у бацилл"

суд'"'-

?5 - 3 9 3

РОССИЙСКАЯ АКАД&Ш ^аЩЖСКЖ НАУл

¡^УЧНО-^С^ОБАТШЙШЙ Ор£ЕНА ТРУДОВОГО лРАСКОГО .-ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ЗП1ЩЫЙ1&101':Й И [лИЗКРОБИОЛОГЖх ¡¡ЖНИ ПОЧЕТНОГО АКАДЕМИКА Н.Ф.ГАКАЛЕИ

ПЕРЕНОС, ЭКСПРЕССИЯ И КАШДОВЛНИЕ ТШЬК-ЩЫ НР4::У зб2 У ЕАЦИШ

ОС- л" ' -микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой са-епени кандидата медицинских наук

Ст^о ЯКЕ?!

ЦРИЦКАЯ Валентина Савельевна

!.!ооквя 199.3

Работа выполнена во Львовском медицинском институте и в ШИШ -им. почет, акад. К.Ф.Гамалеи РМШ. •

Научный руководитель: доктор медицинских наук, доцент В.В.ДШЕЕЙЧЕНКО

Каучнкй консультант: доктор медицинских наук, профессор Б.Н.МШЕНКО

Официальные оппонента: доктор мгдзздансклх наук, профессор В.Г.ЛИХОДЕД кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник И.Г.СлВОВ

Ведущая организации- кафедра микробиологии Московской медицинской' академии им. Сеченова

Защита состоится " 1993 г. в^дас

на заседании Специализированного совета К ОС!.07.01 в научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. К.Ф Гамалеи РАЖ ( 1230Э8, г.Москва, ул.Гамалеи ,!■!

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке ¡ЕПШаМ ид.К.Ф.Гамалеи РАШ.

Л*

Автореферат разослан ___1393 г.

Ученый секретать Специализированного совета доктор медицинских наук

Е.Л.ШГШОВА

ОНЦЬЯ ХДРАКЫШСША РАБОТЫ

Актуальность теш. Бацаглн как возбудитеш кнфекцйокяшс заболеваний и объекты- биотехнологического применения е последнее Бремя привлекают поБыше:ж:й интерес. Специфика их клеточной организации и функционирования существенно отличны от хорошо изученная грацклгссутных: бактерий и исследовали недостаточно. Остаются во многом неизвестными механизмы реализации патогенетических функций'у бацилл, синтеза ими биологически активных веществ как токсины, ферменты, возникновения и распсстранения множзст-пенной лекарственной усто^ивости. Бее это затрудняет изыскание ^утей экспериментального управления изменением свойств бацилл, придания нужных признаков и качеств, конструирования продуцентов биотехнологического назначения, разработки приемов преодоления лекарственной устойчивости. Решение всех этих зопросов представляется^ актуальной задачей современной микробиологии.

Основная причина, определяющая отставание в изучении отмеченное аспектов у бацилл, усматривается в ограниченней способности ix клеток к внесению и реализации новой генетической информации. За исключением небольшого числа трансформабельных видов'и штам-.'.оь большинство зздов бацилл инертно в запрограммированном генетическом обмене. Это побуждает искать новые лут::.-и приемы зез-;е!:ствия ка природную конституцию бацилл.

:{ началу выполнения настоящей работы в литературе появились ¡днккчше указам« на возможность феноменологических проявлений ' нетрфлформабельных видов в-сШиз отдельных признаков гибрид-шй илазшцш грацкликутного' происхождения КР4: :Mu cts 62 в усло-яы.\ ее переноса конътзгатавнбподебнтл путеь:. Принципиальная ао-¡изяа талого подхода для бацай побудила нас к обстоятельному мучению этого явления.

о

Црль и задачи исследования. В соответствия с выаеизлояешшм целью настоящей работы явилось изучение переноса генов лекарственной УСТОЙЧИВОСТИ ГИбрИДНОЙ ПЛазМИДК НР4: :Ки otвб2 ИЗ 2зсЬс-г1сЬ1а со11в Зао.ро1уиуха , их передачи йёвду разными видами . бацилл, фенотипнческого выражения и наследования в бациллах.

В -задачи работы входило: -выяснить возможность мезссемгйственного переноса плазмиды :Ми otвб2изE.coli вЗао.ро1ушуха ,стабильность ее фенотппиче-ского выражения' в бациллах и сегрегацию, установить структурные изменения плазмиды в трансципиентах при переносе и термоиндукцш -осуществить меавидовой перенос плазмиды у разных бацилл, определить их донорскую способность к прямой и обратной передаче, провести физическую идентификацию плазмиды у трансцкпиектов; -определить способность плазмиды к транспозиции проката Ми в трансципиентах бацилл и индукции у них ауксотрофных мутаций с их идентификацией по питательным потребностям; -оценить действие плазмиды на скорость роста и размножения ' трансщшизитов, на ультраструктуру их'клеток.

Научная.новизна. Оригинальными результатами работы является следующие:

-впервые осуществлен конъюгативноподобный перенос гибридной плазмиды РРД: :Ш сЬвп2 ИЗЕ.соИ В фирыакуткый ВИД Бпс.ро1утухп с выявлением фенотипического выражения признаков, детерминируемых плазшдсй, ее физической идентификацией в трансципиентах бацилл;

-впервые показана возможность переноса плазмиды И?4::Ми с1;еб2 из тралсцьпиеи'та Вас.сегеия -в йацилли видое Вас. ШиГ.Ш£1ег,з] в,Ег.с. роХутуха, Вье.гг.еЕ^пге.гз.сиг^ гакке обратного ее переноса из трглс-

щшиента Bac.thuriA^lensis в Bac.Cereus о функциональной экспрессией маркеров плазмэды;

-у трансциппентов установлена способность генома фага Ш ots62 с транспозиции и опосредованная им возможность индукции ауксо-грофаых мутантов;

-показанн особенности наследования и экспрессии плаяшдн HP4::iiu otH62 в трансцшшентах бацилл, выракаищиеся в ее кестабкль-юстд, сегрегации и элиминации, возмокности отбора стабильных слонов з условиях селективного давления;.

•обнаружен множественный оффект плазмидя cts62 на низне-

[елтельность трансцигшентов бацилл, проявлящийоя в снягенил ги-1иес.шзсойноот2;ллеток, их ускоренном аутолитическом распаде, за-[эдлении роста и размножения клеток, нарушении улътраструхтури леточной оболочки.

Практическая значимость.Установление зозмояности переноса лазмиды грациликутного происхождения в клетки фирмакутного вода ацилл и приобретение трансципиент&'ди бацилл донорской функция к ередаче плазмздщ с экспрессией ее маркеров по антибиотикорезпс-ентности i/.окет моделировать новнй путь распостранекия мкозес-т-еиной лекарственной устойчивости в природных ассоциациях бакте-г.Л. Подученные результаты обосновывают возможною концепцию о эвнх расширенных горизонтальных путях формирования множественен лекарственной устойчивости у микроорганизмов.

Эффективный выход ауксотрофнкх мутантов в процессе термоин-псции трансциппентов мокет быть использован в научно-практичес-работе с бациллами, имеющими невыраненнуя способность к иу-¡генезу.

Положения, вкносиг.ша на защиту. Обосновала возможность мексемейственного переноса плазмиды ПР4: :Ku cts62 из Es ch erichia coli в Вас. polyrayxa. Полученные транс-

цшшенты характеризуются' нестабильность» наследования- маркеров плазмиды, однако в условиях селективного давления возможно получение ста'щлъннх клонов.

/

2.Доказана возможность коныогативноподобаого переноса.плазмиды грациликутного происхождения у разных вадов бацилл с экспрессией детерминируемых ею признаков -Кт^с11 и термочувствктельнооти, но без продукции полноценного Jara.

3.Показано, что при гехвидовой передаче плазмиды ИЧ« :Ми гЛвбгу ¿бацилл стабильность наследования ее признаков связана с постоянным наличием селективного давления. '

4. Индукция стабильных траксципиентов сопровождается множественными ауксотроФкима ыутециягли.

5 .Подученные траксципиенты характеризуются изменениями скорости роста и размножения, биологичесглх свойств и ультраструктуры клеточной стенки. ;

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения получениях результатов, выводов, списка литературы. Работа изложена на 110 страницах, иллюстрирована 20 рисунками и 4 таблицами. Библиография представлена 160 источниками отечественной и зарубежной Литературы.

. Апробация работу. Материалы диссертации изложены на П.Всесоюзном совещании "Современные вопросы биотехнологии"(Днепропет- ' розск, 1Э89г.); на научной сессии "Медицина и ^.арглацля-достпхз-Ш1Я и перспективы"(Львов, 19Э0г.); на областной научно-практической конференции "Актуальные проблемы развития медицинской науки в современных условиях" Львовского медицинского института я Львовского института эпидемиологии к гигиена (Львов, 1990г); на XII Украинском республиканском съезде микробиологов, эиидзмиологов и

1аразитологоз (Харьков, I9SIr.); на конференции кафедры шжробяо-тогии Льговского медицинского института ( Льеоз, 1992г.).

МАТЕРИАЛЫ И ЫВТОДК.

В работе использовали штамма Bacillus : Bae.cereuo . Bac.thu-irgiensis i Bao. polyinyxn , Вас .m o s e n t er i с ua ; Escherichia co; HBIQI,_gaI20, <JA5?0, CHIII, CSÜO, 20546$; фаг Ш ctoS2; пла-МИДЦ - RP4, HP4! j Ííu cts62.

Дет вырацивания бактериальных штемков использовали твердую . 1,5$) и жидкую среды Brain heart infusion "Bifco" (ЖЕ) ,2% rap Хоттлнгера и Ь-бульон. Минимальной средой злу кала среда А Лиллер, 1976/. Дифференцирующие признаки бацилл определяет со-lacno Bergey ,/1984/.

Б экспериментах использовали антибиотики отечественного про-¡водства: стрептомицин -100ж:г/мл, канампцин -КОмкг/мл, тетра-■лслин -?.0мкг/;лл, рифампицин (ФРГ)-50 мкг/мл; аминокислоты ( Ь ) фмы Calbicchen-behrins (Англия)-Ю мг/мл и ферменты: вндону-[еазы рестрикции - Ес0 HI_ Sttlf) HiEdg ■ f SmaIf Pstí> Knpl.hpnl .рмы Pharmacia (Швеция). Бактериальное скршцкванче осуществляли методом совместного ку-тивпрованЕЯ донорных и реципиентных штаммов в ббъемном соотно-нии 1:1 в Ь-бульоне или BHI. бульоне в течение 72 час при ЗС°С пзрацией. При передаче RF4::Mu cta62 из E.coli в Бас. poly--с* конъюгацию "Осуществляли такке' на фильтрах Millipor (CEA). 2сь бактериальных клеток после совместной инкубации ьысевалк агаризнроваикую среду BHI. .Через 18 час колонии подвергали •лед&ваниа путем пересева-модифицированным v. тодом отг . татков шлер, 1976/ на чашки с тАй не средой и с добавками различных ■ибкотиков -для проведения селекции и коптрселгкции родптельс-

хих штаммов, и при исследовании сегрегации гибридной плазмидк. ■

Индукцию Фага Ku otn62 • у трансконъхзгантов бацилл проводили при 42-44°С в течение I часа и последующей 3-х час инкубацией npi 37°с. Фаг осаждали центрифугированием и титровали на чувствительных культурах E.coli IIB 101 и С600. Получение фага в высоких титрах осуществляли по методу Сабельникова с соавт/1973/ на целлофановых мембранах.

Выделение д электро&орез ДНК. ДКК фага ш oteS2 получали из ■"-йочищенных лизатов, согласно Bukhari et al /1Э77/. Хромосомную ДКК бацилл выделяли фенолъннм методом Ыармура/ 1971,/ в модификации Прозорова /1983/.. Длаямидную ДНК получали по методу Kaspar et al /19Б7/ с последующей делротеинизацией кислым фенолом в низкой ионной силе / Znafcif et оЦ378/ для отделения козалентно замкнутых молекул.

Злектрофоретическое исследование ДНК проводили в горизонтальных 0,1% агаризировшиштс пластинах (Bio-Rad США). Фрагментацию нлазшздвой ДНК осуществляли в течение 2-х час б реаше 1203 и 6.0 ' мА. при комнатной температуре в трис-ацетатном буфера'.

Блот-гиОридизащга ДНК проводили по стандартной кетодже /Маниатис, 1984/. .

Определение скорости роста и колонийобразуицих едкриц бацилл проводили согласно Миллеру/1376/ с изменениями для бацилл.

При электронно-микроскопическом изучении бацилл использозалл-метод фиксации гдутаральдегвдом-и тетраоксидом осинд. Изучение .; улътраструктуры поверхностных слоев клеток осуществляли но методу Лафта /1971/, модифицировав его добавлением в фиксатори 0,2$ раствора рутениевого красного. Ультргтонкие срезы готовили на ультратомг ьззц (Швеция). Контрастирование проводили в 2% растворе уракалацетате /strapae et al, -1354/ и цитрата свинца /кеу-

СтатистическоК обработка подвергли результаты промеров слоев клеточных стенок бацилл, используя критерий Стьэдекта-Фгслера.

РЕЗУЛЬТАТЫ Ч ОТЕИДЕКИЕ.

I.Получение трансципиентов Вас. роЗ-удух* - в системе гетеро-чогичной передачи НР4::Mu. ctgS2 ( из E.coli в Вас.polymyx« ).

I.I.Условия формирования трансципиентов Вас. polymyxa.

Оптимум исходных концентраций клеток доноряшс и решишеатно-го штаммов 1-ЗхЮ^кл/:лл. Хотя мевду hieш. не установлено актого-шстических взаимоотношений, в более концентрированных суспензи-ix клеток выход трансцидиектоз резко снижается.Возмоннс это связано с конкуренцией бактерий по питательным компонентам среды и шгибирунцим воздействием их метаболитов. Температура инкубиро-залия смеси в проверенном диапазоне 30-37°С существенного вяия-1ия на выход трансщшкантов не оказывает. Важную роль играет Физиологическое состояние культур. Максимум выхода траксципиен-ов приходится на конец экспоненциальной фазы роста донора и ре-лпиента. Необходим условием оптимизации формирования транс-ипиентов является применение полноценных обогащенных питатель-ых сред. При совместном инкубировании штаммов донора и раципи-чта в жидкой среде*при 30°С наличие трансц1шив:;.тоз устенавли-ается через I сутки, далее количество их незначительно нараста-т на протяжении 3-х суток, после чего резко падает. Рецитшент-ай штамм бацилл г условиях совместного культивирования на поря-эк' быстрее инактшзируется по сравнению с культурой донора..

Сптида выделения трансципиентов при скрещивании на фильтрах зиходчтся на 5-13 час, что видимо определяется обеспечением )лее тесного контакта мегду клетками, чем в кадкой-среде.

-81.2 .Фанотипическая характеристика траксципиентов Вас .polynyxa.

Поиск трансцшшентов Вас. г-°1утуха проводили в услозиях селекции на чайках с канамицином, тетрациклином и рифачшшином в сочетании с приобретением ими признака термочувствительности к росту при 42°С и отсутствием стрептомицинрезистентнооти, присущей штамму донора. В параллельных опытах в каждом случае оценивалась вероятность спонтанных мутаций реципиента по селекционируемым маркерам.

Установлено, что донорскач способность обоих испытанных штам-mobE^coü СА570 и JC5466 по переносу в Вас. ро1ушухп сочет- .

С D С

тания маркеров Km* Тс Т плазмиды M?4:sHu ots62 практически • одинакова и составляет 2-7x10"''' и 1-5х10~^на клетку. донора соответственно. Выявленные в процессе скрадавакия "первичные" трале-ципиенты характеризуются нестабильностью наследования фзиоита. В ряду последовательных пересевов в селективных условиях исходный родительский фенотип постоянно выявляется только у 10-20$ клонов { табл ). Не менее 50% клонов в этих условиях составляют в суше нежизнеспособные и ревертанты к дикому типу бацяях. У оставшихся 20-45%' обнаружено выщепление сегрегантов с промежуточными фенотипаада почти исключительно с утратой резистентности к кападсщику, и б части с сопутствуют,!»! приобретением термоустойчивости при 42°С ( табл ).

Таблица.

Сегрегация клонов трансц.чпиентов2ао.ро1уиуха íe.HOTiinaíiaRa,oRTá

Оенотипн : Km^Tc^i3; KaSTcRi,fi : :?евертанты :Негшзнеопо-_• ■'_:___ ____собнкг_

" 10-20 ' 5-15 .' 5-10 " 30-40 20-30

niití JJ /0 . • . .. _ . .

Примечание: - пр-здетарлеш результаты со 400 независимо полученным клокалГ траноццпдентов,-

5еноткппческпе характеристики и количественные показатели вы-зпляешх в селективных условиях клонов сохранились почти без эмгнений на протяжении года наблюдения. В отсутствие селективно давления "первичные" трачсципаекты на протяжении кесколь-IX генераций в 95-99^ клонов утрачивают все фенотипические при-1аки плазмиды RP4::Ku cts52.

Выщепление у трансцияиентоЕ Еас.ро1ушуха разнообразных фенолов ревертантов по отдельным маркерам плазмиды свидетельствует барьерах для ее экспрессии в клетках данного вида бацилл. Од-м из них могло бить делегирование плазмиды при ее переносе из soli . При функционировании механизма делегирования HP4:;Mu ctab= клетках бацилл,' очевидно, профаг доляен быть локализован вбли-гена кап , поскольку у сегрегантов он несразнекно чаще инак-зируется, чем ген tet . •

В связи с этим следущим этапом работы явилось установление :сализации профага Ыи cts62 на плазмкде в?4 в донорском штамме о oil. Поскольку в подавляхщем большинстве опытов скрещивания юльзсвали £.ooli GA57Q то для исследования баи выбран именно >т ытамм.

1.3.Локализация и ориентация ncotara Mu c-ts62 на плазмиле ._ KP4i:Mu cts62 у 5. coll С-А570.

Рестрнктаза SmnT расщепляет ДНКР.Р4 на пять фрагментов с разами 21,9; 15,0; 13,1; 6,35; 0,65 и не имеет сайтов узнавания 'ПК фага Ми сгзоЯРестрикция этой эндонуклеаэой гибридной плаэ-л «РД: :!'iu cteG2 характеризуется замещением четвертого фрагмегС на высокомолекулярный, размером 41,8 тпн, что указывает на ло-изатго профага в области ¡¿езду 29,5 и 38,85 тпн на физической те а?4 . Для детализации по^оаения профага глазищу к:4: :l-u сг.«б2 обрабатывали рестриктазой SalT , имеющей два сайта узнавания -

-10в ДНКНР4 и один в Cts. ¡13 Тр£х образующихся при атом рестрк-

ктсь йрагмеит размерил 28,65 тин, располагающийся мазду сайтами 32,3 п 13,85 тин на карте ï£F4 в направлении часовой стражи, не чретарпезает изменений. Следовательно, интеграция ьрофага возможна только в направлении гро-тиз часовой стрелки от So11 сайта 32,2 тпк из участке протяженностью доЗжа I сайта 29,5 тпн карты R?4 . Действительно, второй3al I фрагментRP4 размером 18,35 тпн у RP4•• :Мн cts62 замещается на два других зеличшюй 7,3 и 46,5 тип. Меньший из них мояет включать лишь правый конец ге: ома, поскольку левы!! значительно больше по размерам. В интегрированном состоянии в геноме Mu cte«2_ са£т2а11 рестрикции располагается на расстояния 5.6 тпн от правого его конца. При найденной величине рестрихта 7.3 тпн это означает, что сайт интеграции прогага отстоит от сайтак? 4 32,2 тпн на 1,7 тпн, т.е приходится на точку 30,5 т.га картыКР4 , оудучи ориентирован к ег I3îi элементу правым концом генома в направлении против часовой стрелки ( рис.). — " " .....

Подтверядение правильности заключения об ориентации генома i ctañ2 получено в опытах дополнительно!:-рестрикции Sali фраг-•птоб эндонуклеааой hind Е( данные приведены в диссертации ). ^l-^^^PHa.?..5ecT£6rjbHQCT/=_плакмядн r?4:':Ku eiste ъ

Последующе опыты были напрг&чны tía ьнясненне наличия и про-кеннссти делещШ IíP4: :"u eta 62 в клонах трансцппиентов ?>с.ро-■иуга разного стабилизированного фенотипа.Отсутствие з штам-реципиенте резидентных плазмид давало возможность для дета-iHoro исследования этого вопроса. Дзлецли определяли рестрикционккм анализом пяазмидной ДКК, зи-ленкей из стабильйкх .клонов трансципиентоз бацилл с ф>-енотн-ми j кmSTci4;S, ¡te^lo^I11 .независимо полученных в раз-

х опытах скрещивания. Протяженность делеций рассчитывали как эность медду размерами гибридного фрагмента натизной структуры 4: :iiu ota 52 и соответствующего фрагмента делеииопной ытазмдды. ;1ля трансципиантов фенотипа

присуще сохранение руктурной целостности в гибридной пяагмиде генома EU cts62c де-цнямл з непосредственно прилегающих к нему участках протяжностью 1-3 тпн со стороны его левого плеча и н'амкого рег.е со

ел

:ipci:u правого плеча простота до 3 тин.

Для группы клояоо трансцппиентов фенотипа Ки^сгЧ'5 рестрикцион-

1 анализ обнаруживает большую пролонгацию делеций со стережч того конца профага в область lían плазмццы RP4. Полученные ре-:ьта?н-дам основание полагать, что правое плечо профага не яо-. г-гзно в д.?лецлк. 8лбкгрофорвгракг.!Ы рестриктов со сторонн лезо-::леча црефага демонстрируют, что делеции икцг.-очезс/г участки ¡■змидц ZtS'-l or топки интеграции профага в направлении по чзео^ ; стрелке на протяжении от 7 до 13 тпн. При этом делегируется

-121321 элемент к частично или полностью ген кап, что и определяет специфику фенотипа.

Рестрикционкый анализ плазыэднвл профилей клоноз третьего исследуемого фенотипа _ трансципиентов четко диоференци-

' р

рует их от спонтанных бесплазыидных То мутантов Бьс.ро1уиухаЛ фекотишлескигл восстановлением у трансципиентов способности к росту при 42°С, свойственной ИСХОДНОМУ дикому типу Вас.ро1утпуХй можно связать пролонгации делеций со стороны И4 на левый конец - .лрофага, детерминирующий функцию температурочувствительности юге ток. У.части ¿слонов данного фенотипа было обнаружено делегирование. участка генома 1<1и с его левого конца ка расстояние не менее 1,6 и не более 5,1 тпн в одном случае и между 5,1 и 10,2 тпн в другом. Во всех атучаях концевые делеции профага устраняет область структурного гена термочувствительности репрессора, что и объясняет восстановление термоустойчивости у тонов этого фенотипа. Ка область делаций приходится такяз ген , детерми-нярукдзй эффект убивания клетки-хозяина. Неизвестно, экспрзсси-руется ли этот ген в бациллах, ко в положительном случае это в определенной степени объяснило бы меньшую жизнеспособность и ускоренную гибель клеток трансципиентов Вао> ро1уиухз.

Опосредованная фагом ¿¡ц индукция делеций предусматривает как обязательное условие наличие, в его гекомё структурной целостности обоих концевых участков и функциональную полноценность гена А. Роль гена В в этих процессах менее существенна. Полагают, что Ми индуцирует делеции путем рассечения генетических структур метки хозяина на два циркуляторчых сегмента, которые будучи комплементарны, содержат по профагу На . Данные условия и механизм индукции делеций у природного'¿¿¡г;глилыюго хозяина по всей вероятности прштаимы дяя поведения ми е гетерологцчкнх

ютемах хозяев. Ио крайней мере, у фенотипов кАс^Т3 и Кп3?снт3 >ансципие.нтов Бас, ро1уту>:а физическая структура генома Ни отведет условиям, постулированным для индукции делеций. Бозкойко, . ■и фенотшш способны в свою очередь подвергаться последующим шолнительным делециям, т.е процесс доткет носить многоступенча-:й характер, приближаясь к третьему исследованному фенотипу или угому с утратой одного или обоих концов прсфага. В пользу до-щсния многоступенчатости делеций мсает свидетельствовать наблю-емое в эксперименте вшцепление промежуточных фенотипов, но, еввдно, это не правило и индукция делеций кшет происходить повременно. Мок но полагать, что генетическая к структурко-фук-пональная специфика клетки гетерологичного хозяина не играет глюй роли в индукции делеций гибридной плазмадн с-Ьзбг,

она накладывает существенные ограничения ка репродукцию 1,:и> змохно, и на другие, проявления экспрессии плазмкди и, видюло, юлно.й степени определяет ее элиминации. 2.?Леавидозая передача пяазмццн и?4г:Ни бацилл. Донором послугила культура^ о. саге-аг олбсг,содержащая плазжг НР4::1£и с4вб2 /Тимзкоза Н.Э., о сс?луг., 1931/. В качестве рецептов были взяты близкородственные вида бацилл: Вас.-ИшгАкг!-1о 612, Баа.роХуяуха 514 И Епс.пеяеп1е'.'1(Г1шВКН2й1 ,которыо ха-теризозалиоь природной резистентностью к Пи с^г,о2. 2.1.Селекция и стенотипический анализ трансиипиентов А^иилл^ Траисципкзнтн с маркерами Е1'4::Ки с4з62- £и%вйТ° обнарукк-::сь у гссх трех вгдов бацилл с ■частотой 5х1СГ--1х10~аца глет-гонора. Клона не характеризовались выраженной стабильнссгьэ ив иестзе Я-1Г6' отщеп.талн сегроганты.

Р Г? 2 '

/табильнна клоны траксцдниентоз с фенотипом йа обозначен

I

. №игЗ.П51е>1э1з 612-5, 31У, Вас.иеоеггёегХсия

BiüiB 61-41 и использованы в дальнейшие исследованиях.

2.2.Физическая идентификация пладмады RP4: :Ми с ta ¿2 в транс-ципиентах бацилл.

Невысокая стабильность полученных штаммов и их способность к сегрегации указывай1 на возможность высокой вероятности диссоциации RP4::Uu ctso2 в гзтеролегичных для нее хозяевах на частив но делетированные структуры. Обнарукенное пнщепление клонов у всех изученных штаммоз бацилл с фенотипами утраты одного из дву: , а в редких случаях и обоих маркеров резистентности к антибиотикам лри сохранении фагового I3 признака, указывает на возможнее дополнительных делеций в границах собственно RP4 плазмиды. Оче-випно такие, что в гибридном комплексе монет иметь место и частичная пли дан s полная деления генома фага ita cta62, судя по сегрегации, хотя и редкой, термочувствительных клонов с экспрессией маркеров антябиотикоустойчивости. Наличие у реципиентных шта» КОВ Bac.thuringienaia и Bac.me3enteri.cu6 собственных илазмид затрудряло детальный рестрикционный анализ трансмиссивной :iiu ctm'2 у полученных трансцапиентов. Поэтому задача работы была ограничена установлением самого факта физической делении плазмиды.

На электроферегракме ктадаа трансципиента.BAc.thurinsiensis 612-5,' наряду со свойственными рецчпиентному штамму Bac.thurin-gif;nsii6ï2 резидентны®! илазкидами pVX>3, pVT-2,>jVD1 , обнаружена новая дискретная полоса по подвикноотк преъыиащая натквную ru>4 : :üu ots62 Е.coli,но уступающая подешсности плазмиды НР4 . Ее M.fel соответствует 48-50 МД. т.е близка или полностью сходна с результатами ксньюгативной h?/.: :i.?u cts62.донорского штамма Бзс.сеге-из GA5аг/шмакоза Н.Б. с роаЕТ.. 15ЭТ/. Ез природа четко определяется дшшыми блот-гибрвдизации. Аналогичные результаты были по

-15- '

учены и для других тргнсцшшентов Bac.poIyniyxa.Sl4-19 к Вас. csenteric.ua БККВ 61-41. . ' .

Достоверность результатов инфицирования h?4j :Hu cts62 разучит видов бацилл подкрепляется Tárate спецификой плазмядных рофилей птаммоз реципиентов. TaK,^?Ji£:<terir;us» зкыз"б1 об-здает обнаруженной резидентной плазмвдон с Ш 43МД."

Таким образом, представленные результаты подтверждают юсть внутриродового переноса гибридной плазгляды RP4:?liu ct<:52 бацилл. Дальнейшсл подтверждением этого явились опиты по об-iTHoä передаче ?.Р4: :bíu cts62 их штамгла-трансципиента Вис.-thuri.il-

•епзJx> 612-5 в Bac.cereus 2SM31S. Получен стабильный шхшлм с р т? я

ркергми йг1 Тс Т -Вас. с егеилГ>5ыЗ18-1 прсявлякци¡i все свой- " ва, присущие другим изученным трансципиентам. Критическая азмида рсцлпиентного стажа Вас. oareus2SH31Bc Ш 8ЭД вкявля-сь у транецшиентов Bac.-eereus DSU 318-1. ■ •

2.3.Выявление экспрессии Дата m¿ eto62 в Дзцилляркях транс-пиентзх.

Одним из прямых подходов слукит выяснение гермоикдукши фага i cto623 тракецкпиентах бацилл и продукции -ими полноценных фа-зых частиц,. Ни один аз испытанных шта\мов~транс1Ц!пиентов:_ irlngiensio 612-5, 2ас.£01уЯуха 314-13,Вас. nessn-tericuaEKSB Sill Bao.cereus D3K31G-J не продуцировал полноценный'фаг при 42-'С. Л-. • '

Отсутствие изменений величии оптической плотнее?!! и скиазнке ла аизнеспособных-. клеток у, транецштиентов бацилл за вреш индии фага согласуется с представлениями о массовой гибели кла-. Очевидно, форифованиз инфекционных частиц фага tú ¿*зб?.в ' •ritax. не происходит из-за специфики аппарата эксврзсска,гете-'.: "; огкчнкх видов бецилл, лиоо по причине -делецик иизнедну-кагш.чх

сайтов генома фага.

2.4.Получение и анализ ауксотросТ,ншс мутаций у ^рансципиентов бацилл.

Образование стабильных трансципиентов явилось основанием для поиска^-индуцированных хромосомных мутаций.

Методом реплик все ататаы-траасцшшапту тестирована на ауксо-трофность. Идентифицирована потребности з С1у, Из, Авр, Тгр, ^е-ь, Туг и Су!. Выделенные ауксотрофные мутанты харахтерпзовалиа

_4

.множественной зависимостью. Частота мутаций составила 1x10 •-2x10" . 'Наибольшее число еуксотрофнкх мутантов оплачено у Гас. ^иг1п21«пв1в 612-5« .

З.ь'нохественное действие НР4::Ци сьво2 в инсгицированннх штаммах бацилл. - •

Располагая хюллекцизй штшлов бацилл трансщшиентов: Вас.гъи-г1г.й1епа1а 612-5,Зас.ро1уиуха 814-19,Вас.теееп1ег1сия ВКМВ 65-41 и Зас.сегеиз ют318-1, мы поставили цель изучить возмокное:.гшо-х;ествзнное действие гибридной ллазмэдыР.Р4::На с!;вб2на трансципи-ентные штауми. : -...

й.Т..Изменение'¿иологических свойств бацилл ;гнх морфологии.

Было обн^ртаено, что у штаммов траксципке.чтов, содержащих :Ыи c-.tr;£2 . значительно уменьшена подвшность клеток по сравнению'о исходными реципиентами. Все траксцилиенты приобрели способность продуцировать лецитиназу, хотя такого свойства не было ни у одного реципиентного ¡нтаг.сма. Добавление к среде .5 и 1% НпС:1 оказывало ингибирупцее действие на '/¡рзаеципиенты Вас.Шиап^епс 612-5, Бас.пеьеггЬег!сич ВР1.1В 61--41 И Зос,ро1утуха5;[4-1Э, дая двух последних была отмечена такз.е утрата способности сбраживать макнит.

Проведено.сравнение скорости роста донорских, рецклкенткых и

раксципиеитных штаммов бацилл. Щтамглк-дсноры плазмиды н?4: :Ми. зь2 имеют наименьшую скорость роста, а шташы-реципиенты нанесшую. Трансцкпиектн, пряобревпие КР4: :Ки с<;зб2 отстают от ис-эдных не только по скорости.роста, ко "и по количеству кпзнесгы->бных клеток в стационарной фазе.

В отличие от исходных культур клетки траноцппизнтов Вас.«гиг1п-ВП813 612-5 рас. роХуг.ух?. о 1-1-19 иЗас Л*аепиг1йШ» Ыйй 51-41 еют разрекенную цитоплазтлу о гранулированными внутриклеточными руктурами. Наружный слой этих ¿слеток утрачивает целостность на ределеккых участка:': и разрыхляется, клетки приобретать вид хру-их, нежизнеспособных и достигают 50% в количественном выражении. 'Наблюдаемые изменения биологических свойств стаммов ВасЗДЛиз, ¡пцпрозаккых КР4:: ки ct862 , связепы в определенной степени и структурными нарушениями клеточной оболочки. Как известно, :<с->аЗ- им- базального тельца ягутшсов целиком локализовали внутри" точной оболочки. У фирмакутных бактерий дополнительное укрел-ие стернкя■кгутпка в норме осущеотвляет.ся толстой и прочной таой клетки. По-вздимому, эти не причины з сочетании с устано-ишми локальными нарушениями целостности аоверхчостйого слоя точки, определяют такке ингибировакие роста культур траксципи->в в присутствии повышенной концентрации КмС1 , предают клет-г "хрупкость"; обуславливают меньоую 1«: аязкеспособнооть. Сово-ость нарушений структуры клеточной оболочки бапиля траксци-тов и, следовательно, синтеза ее компонентов, должно отраха-на снижении активности, цитоилазматической мембраны, внеиша! ялением чего, как мы полагаем, являются замедление, скорости 1 и размножения клеток, процессов, тесно связанных с фуякци-'.мбраны. 4

"рудчез поддается объяснении факт приобретения трансцкпиекта-

-IS-

ми бацилл лецитиназной активности. Хотя молекулярная масса гиб-рвдной плозмиды достаточно велика, оснований для ассоциации с ней генетического детерминирования лецитиназной активности нет. Наличие в состава генома фага локуса, ответственного за си* таз лецитиназы, не установлено. В составе генома плазмида RP4 соответствующий локус такке не обнарунен. E.ooli , являющаяся донором плазмвды, tosc не обладает лецитиназной активностью. Ис пользованные в опытах штаммы реципиенты не проявляли лецитиназ-- roil активности, хотя согласно Bargey /1384/, не менее S0£ шта\' мов Bac.thuringiensic и Вас. сегеиз лецитиназополонительлые. Мы предполагаем, что в нашем случае в метках бацилл реципиенте гены синтеза лецитиназы могут пребывать в зарепрессированном сс стоянии, дерспрессия которых происходит в присутствии плазмида, за счет мекгеномных функциональных взаимодействий хромосомы кле тки и комплекса Ии cts62 . с плазмидой КР4. . Эти ыезтеномные взй имодсйствия глы рассматриваем в качестве .первопричины функциональных нарушений хромосомы бацилл .трансципиентов, определяющих у ц.их всю совокупность плейотропных структурных изменений клеток.

3.2.Ультраструктура оеточной стенки различных видов бацилл.

При более детальном изучении клеточной обо.гочкг. была измерен ее толщина и изучена ультраструктура, дополнительным контрастированием рутениевым красным была показана' слристость клеточной оболочки. У всех исследованных штаммов бацилл, кроме основного, присутствуют дополнительные компоненты, которые оформлены в опр деленную структуру, получившую название £_слой '/■ Степаник В.В., с соавт., 193Э/. Величина з-слся у трансципиентов была заметно сшаена по сравнению с исходными реципиентами. На среза/, он выглядит трехслойны!.! с внутренним электронно-прозрачным и двумя электронно-плотными слоями, неодинаковыми по толдане на всем св

;м протяжении. Наружный слой, кроме того, у некоторых штаммов шявляется с незначительными раз разами пли se покрыт образова-шямп е виде электронно-плотных фибрилл или округлых глыбок. Осо->енно четко такие образования выявлены : летках Btc.mesenteri-:U3 Kíl-ГЗ Gl-41.

Полученные нами данные вносят корректировку а представление полной утратз трехконтурного строения поверхностного слоя сбо-очки у бацилл, инфицированных RP4:-.Uuctaßi /Гоцердзишвили М.Г., 959/. Располагая большей коллекцией трансциппентов бацилл.разах видов, мы имели всзмокнссть наблвдать сохранение--,з-слоя у эух из четырех доследованных видов бациял-йЬс. ine з entё г ic из к-св 1-<",1 и Все. oereus DSU 313-1 •

В Ы 3 О Д Ы _

I .Показан конъвгативноподобный перенос плазмиды широкого ,кру-. i хозяев RP4:-На ots62 ИЗЕ.ссИ в Вас. роз.упуж» с частотой :10 на клетку донора, а такке из Зас.сегеиэ с делеционкой прсг годной плазмиды в Бас. thuringienoiy, Бас. polyayxa, Вас. ?Dentericufj. Вс втором варианте устакозлзна возкозноч

Ь Н обратного переноса ИЗ Вас. -thuringiensie з Вас. cereus. й.Трансципиенты бацилл экспрессируют детерминируемые плазми-¡1 RP4: :líu ctaS2 признаки термс&?тойчивости к росту при 4.2°G ка-члцик- и тетрациклинустойчивость, но не продуцируют фага ы-а. З.Ллазизда RP4: :l.lu. cts62 в трансципиентах бацилл наследуется' стабильно, сегрегирует з различных сочетаниях ее компонентов ¡ламинируется, но в условиях постоянного селективного давления ■мокно формирование стабильных клонов трансципиентов. 4Лермош1Дукшиг трацсципиентов сопровождается транспозицией ома о ara Ku cts62 , что обуславливает выход у них ауксотрсхккс антсв.

з.Плазмкда МЧ! :Ыи с$в&2 з трансципиентах- оказывает дополнительный ¡.ло"ествекнш"; аффект, которий выракается. в снижении

жизнеспособности бацилл, ускоренном аутолитвческом распаде кле-

/

ток, замедлении их скорости роста и размножения, нарушении ультраструктуры неточной оболочки.

СПИСОК РАБОТ, СПУБДЖОВАКНЫХ ПО ТЕг.Ж ДТОЕРТАЦИИ.

I.Инфицирование бацилл ¿¡¿агом ци с!е тагсгркроЕашшм а плазш лу// Микроб, нуриал.-1950.-3.-С.5?-63 (ссавт. Данилейченко В.В.

2..Множественный эсйект плазмиды НР4: :Мц с+зь2 в трансциние! тах бацилл //¡ликрсб.журнал.-1990.-4.-С.17-22 ( соавг. Данилейченко В.В., Ксвалииин В.И..Гордий П.Д и др.).

3.Кон'югативне перенесения г1бридно1 шхазм1ди у бацид // Медицина I £армац1я -досягнення 1 персиективи. Льв1в, 1990.-СЛ2С (снХваат. Данилейченко В.В.).

4.Вплив ллазмХди НР^: сЪаЬЗ на клХтгсш бацил /Актуальч! проблзми роззитку кедучн'о! науки з сучасних умовах. Льв1в,1990 С.104 ( сл1лаЕТ. Данилейченко В.З.).

5. Бпзначзння оитимальних умов передач1 плазм1дияР4: :Ш с к /АктуьльнТ проблема розвитку мздично! яауки в су часта умовах, Льв1в, 1990.-C.I05 (си1ваБ?. Данилейченко В.Е).

61олог1чн:5. зластивоотей бацнл п1д вгшшом плазмХд Н?4: :Ки. с4аб2. /'/XII Укра1нський РеспублЬсаксысий з-Чзд м1кро-01олог1в, р.п1дем1олог1в I паразитолог1з. ХаркХв, 1921.-С. 119 ( слТвавт. Данилейченко В.В.).

л

V \