Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, очистка и биохимическая характеристика лектина из листьев и стеблей Coriandrum sativum

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение, очистка и биохимическая характеристика лектина из листьев и стеблей Coriandrum sativum"

Ш'.гпчп НАЛ' ЕЕСПгаШКИ шзш ВИЯИПГТ ШОХШИН РАСТЕНИЙ та. С.В.ДНШЩДЗВ

На правах рукописи УДК 577.15? 581.19.546

ХАШУД Нпзар Шафккошч '

ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И БИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДЕНТИНА ИЗ ЛИСТЬЕВ И СТЕБЛЕЙ СОШАНШШЛ ЗАТ1ТОМ

03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой сгзпекк кандидата биологических наук

ТЗШШСИ - 1992

Работа выполнена на кафедре баохишн и биотехнологии Тбилисского государственного университета им. И.Ддавахишвшга

Научный руководитель: члеи-корр. АН Республшш Грузия,

профессор Н.Г.АЛЕКСИДЗЕ

Официальные оппоконты: доктор биологических наук,

чао. на заседании специализированного совета К 007.04.01 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук в Институте биохимии растений АН Республики Грузия нм.С.В.Дур-квтидзе по адреоу: 380059, г.Тбилиси, Аллея Давида Агшшвив-бели, 10-ый км.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохишш растений АН Республика Груаея.

профессор ХАЧЩШ О.Т. кандидат биологических наук

солтоам р. о. °

Ведущее учреждение: Аграрный имрейтег

Защита состоится " 'Ч " 1992 г. в о о

Автореферат разослал

4

Ученый секретарь специализированного сойота, кандидат биологических паук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность тегш. Изучение дентина в является одной ил актуальных пройдем современной биохимии. Лектини широко ряспрост-ранеии в расгптельном ияиватком кара, но к сожалении, до настоящего времени не? всчерпиваадих•сведений об их функциональной роля з ливой клетзсо. В большей степени это касается растительных лентинов. Лектшщ-нашли широкое применение а медицине, биотехнологии, биохимик, сельском хозяйства и а других отраслях раунк и. гехники. Намечаются больаие перспективы в использовании лекгилов в активации иммунной системы, лечении и диагностике рака а инфекционных болезней. С применением лектииов удалось разработать." цэлый ряд методов зондирования биомембран специфи-чесанкз термииалышш. углеводами, выделена гликопротеннов я др. (Королев Н.П.,1978, Луцик М.Д. и др., 1981). Несмотря ла такие перспективы список применяемых углеводопецифичных коммерческих лектииов не богат. Следовательнос выявление вовнх ивточ-акков лектвнов, их.выделение, очистка к•изучение функциональной роли является•одной из ваянейвях задач.

Цель а задача'исследования." Иель настоящей работы заключается а выделении,.очистке й 0'вохю.отескоЙ харзктзристкхе лекти-яа растения Corlandrua eativura', широко вримеияекого в виде пищевого продукта, преимущественно des предварительной термической обработки.

Перед нами била поставлены следугпдае задачи:

1. Выявление лекттшоЗ активности в грубых экстрактах листьев К СТеблеЗ Uoriandrum eativura. .

2, Фракционирование белковых экстрактов листьев я стооло»? Coriandrum sativum сульфатом шмонил к изучение лентвшс§ ак-

)• тивности в их отдельных фракциях.

3. Установление углеводспецифвчности лекткиов листьев и СТвблОЙ Coriondrum sativum.

4. Очистка белковых вкстрактов и выделение лектина аффишой хроштографгей.

5. Электрофоретическая характеристика локтинов: установление субъедшпщ и их молекулярных масс.

6. Выявление лектййсвязывавдих белков в грубой китохсндри-альной фракции головного мозга крыс и изучение влияния лектияа на Са2+, ¡.%2т-ЛТ0азную активность.

7. Изучение влияния лектина на ииграционнуя способность лимфоцитов. ; " •

Научная новизна работы. Впервые вкявлена гемагглютпшфутаая активность экстрактов листьев и стеблей Coriandrum sativum. Установлено,- что лектинная активность в большей степепи проявляется' во фракции белков, высаливаемых при 40$ насыщении сульфатом аммония, Лектин является галактозоспецнфичннме что дало возмое-ность его очистки более чем в 1000 pas иммобилизованной па трпо--акриле галактозой. Лектин состой? на двух субъедиииц с молекулярными массами 66.83 кД и 74.98 кД. Лектинная активность.инги-бкруется моносахаридом Д-гашк?озоЁ. Леями термостабплок; лектинная активность полностью теряется посла 5-мияутаого нагревания при 70°С. Лектин взаимодействует е белковой фракцией мемб- . рая мозга крыс, зксярагирусьшх Тритоном X-IQO, s резко стииули-руes Са^, Кб2+-ДТФазнув активность грубой шстохондрвальной фракции.

.Йектин Goriondrtun sativum усиливает миграцшшуа актив-. 'сть Т-клеток вплоть до 136$ в модели острого гломерулонефрита. го дало основание для;заключения об -актиг^тии • ï« -зиеток" к-

лозмояюсти целенаправленного использования лектнна в игцуно-коррэкции данного заболевания.

Впервые предложена технология получения лектнна из Corion-drum sativum о высокой степенью чистоты для его массового производства.

Теоретическая и практическая значимость рпботи. Разрябото-на технология получения галактозоспеци.^ичного лектина из растения Сог1апс1гш71 sativum . Исходя из того положения, что Corian-drun aativum широко используется в качество продукта питания, • часто без предварительной термической обработки, представляет Сольной интерес изучение его влияния на функцию яелудка, кииеч-iiijx эпителиальных клеток и на нервно-мышечную ткань. Лекткн mor-ло использовать в научных исследованиях с целью выявления наличия терминальной галактозы гликопротеинов клеточшгх и субклеточных мембран и для таздуноноррекции острого глокерулонефрита. В перспективе, выделенный им,га лектпп может стать объектом ком. мерческого бизнеса.

Апробация работн. Материалы диссертации апробированы на биохимическом семинаре кафедра биохиггли Тбилисского государственного университета (1989 г., 1991 г.), на заседании биохимического общества Республики Грузия (1990 г.). Опубликована статья.-

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объекта к етгодов исследования полученных данных, их обсуждения и заклвчеявя. Работа содержит 4 таблицы, 7 рисунков и список цитируемоЯ литератур«..

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и метод» исследования

Объектом исследования служили стебли к листья однолетнего растения Coriondrum sativum.

Лектиноподобные белки выделяли 40 Ш К-фосфагнш буфером, приготовленном на 0.9$ растворе хлористого натрия и содержащего 0.5 Ш ингибитора протеаз (параыетилсульфонилфторнд) и 5 ii.1 ,0-меркаптоэтанола (рН 7,4). Гошгенат центрифугировали пра 25000 g/I5 мин. Надосадочную жидкость ступенчато фракционировали сульфатом аммония при 20, 40, 60, 80 и 0-80 процентном насыщении.

Белок определяли по методу Лоурн и др. (Lowry о. et al., 1951).

Реакцию геыагглютинации выявляли ка трипсинизированных кроличьих эритроцитах по общепринятой методике на планшетах с и-образшши лунками (Рентам w, et al., 1984). Суспензию трипск-низировашшх кроличьих эритроцитов готовили по прописи Луцика (Луцик М.Д. и др., 1981).

Углеводную специфичность устанавливали с помощью гапуен-ш-гнбиторной техники (Kuie A., Boyd Vi., 1964). Гемагглютинирую-щу» активность выражали в виде специфической активнооти (титр-1 х иг/мл"1) (liowuk Th.et al., 1977).

Молекулярные массы лектина определяли ивтодоы электрофореза в градиенте полиакриламидного геля (от 10 до 25%) в присутствии додоцилсульфата натрия (Laeniy U.K., 1970).

Грубую иитохондриалъную фракцию головного мозга крыс получала по методу Уиттекера.

Влияние лектииа ка Са2+, и&2' -АТФазнуи активность грубой а-

нитохондриальной фракции головного мозга крнс определяли по методу Шванна и др. ( Swann А. с. et al., 1975). Активность фермента выражали в мкМ Фн/мин/мг белка.

РЕЗУЛЬТАТЫ ^СЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление лекгинной активности листьев и стеблей растения С priandrum sativum . ЛИСТЬЯ И стебли растения Coriandrum sativum гомогенизировали в фосфатном буфере в соотношение 1:5 (вес/объем). Гомогенат центрифугировали при 25000g/15 мин и супернатант подвергали ступенчатому высаливании сульфатом аммония при насыщении 20%, 40%, 60% и 80$, а такяз 0-80$. Осадочные фракции, полученные при каздои насыщении» растворяли в 40 Ш Н-фосфатном буфере/О,9% Naci (рН 7,4)„ диализировали против того se буфера ют проводили через сефадекс g-25. Измеряли объем (im) не ex образцов, определяли содержание белка (Lowry о, et al., IS5I) и выявляли гемагглвтинирувщуэ активность ( Реи-mana w. et al., 1984). Полученные результата представлены на рво.1.

Как видно из рисунка I наиболее высокая гемагглютшгаруотая активность проявляется во фракции белков, полученных при 40$ насыщении сульфатом 8шония стеблевого и листового экстрактов Corianârum sativum. ,

Судя по данным специфической активности (табл.1), во фракциях балков, выделенных при 40% насыщении, гвьттлотинируваая активность по сравнению с исходным гокоганатом в стеблевом экстракте возрастает в 8 раз, а в листевоы - т 14 раз.

■ Следует отаетить, что специфическая активность в препаратах стеблей выше, чем в препаратах листьев, что объясняется более

Prc.I. Специфическая лектинная активность белковых фракций Goriandrum sativum, выделенных в условиях ступенчатого высаливания сульфатом аммония. А - специфическая лектинная активность белковнх фракций листьев Coriandrum aativum; В - специфическая лектинная активность белковнх фракций стеблей Coriandrum sativum. Специфическую активность рассчитивали - титр х мг/мл~*. На ординате - специфическая активность, по оси абсцисс - процент насыщения сульфатом аммония.

высоким содержанием белка в экстрактах листьев. С учето?л суммарного содержания белков (табл.1) в стеблях и листьях Coriandrum sativum выявляется равномерное. содержание лектина в обоих препаратах. С получешшми данными коррелируют и результаты расчета содержания и дол;: лектина в экстрактах. Лачки'^ па^'.-ртр рассчи-

Таблица I

Лектшшая активность белковых фракций стеблей И листьев Сог1алс1гит эаЬзлилп

Процент Балок Объем Титр-1 Тотальная Специфически насыщения кг/мл V ,мл активность активность

титрах V титр_1х мг/г -Г"'1

Стебель

0 Г,? 46 8 368 4,7

40 0,83 4 32 128 38,55

0-80$ 2,212 8 32 256 14,47

Листья

0 6,52 45 8 360 1,23

40 1,85 5,3 32 169 17,29

0-80?. 4,16 9,5 16 152 3,8

тывали соотношением содержания белка в г,яг в 100 мял к той шльной концентрации белка-лэктииа, которая даэт агглотинш'тп, выраженную в госг/мл. Результаты расчетов приведены в таблица 2. ■

Таблица 2

Содергапиэ лектина в экстрактах листьев и стеблей Сог^апдгит оаиуит. Содержание лектина в;: рале но в агглетпяируотюг единицах

Исследуемые Процент насыщения сульфатом акмов.

экстракты 0 20 40 60 80 с ■ -■. 0

Экстракта стебля Экстракты листьев 3.27 1.79 0.8 0.6 5.8 3.7 3.6 3.0 0.59 2.6 .54

Чувствительность белков с лектинной активностью листьев и стеблей сoríandrum sativum к рН, терыостабильнооть и их углеводная специфичность. В дальнейшей серии опытов предприняли исследование по изучении влияния рН на гемагглютннируадую ал- ■ тнвлость лектинсодераащих белковых фракций. Значение рН среды менялось от 5,0 до 9,0. 0

Показано (рас.2), что как для лектина из экстрактов стеблей (eso ), так и для лектина из экстрактов листьев (CSJI) оптимальным для гетгглюинирувщай активности является рН 7,4, диапазон рН - 7-8.

Известно, что наряду чувствительности к tH, одшш на важных характеристик лекткнов является ого териостабильность.

6г

1

5.0

гАпыИНЧ *| I .........II* ГИЧ

5,0 15 9.0

í .

¿Чю.2. Влияние «Н на гемвхтдагятг/аОД» ахгиваоота üqstüho-нодобньк*белков.лйстьое (I) з «зеблай (2) Corinndraa

aatlvum .

На ордянагв - количество луяе« о аггаэташхавЯ, па оси абсцнез _ рН.

Нами было показано (рис.3), что при инкубирования лектиг" в течение б минут при заданной температуре (от 30°С до Ю0ПС), лектишия активность постепенно снижается и полностью то^яет-оя цр!5 5 ыяяутйои нагревании прг 70°С.

гко.З. Измекекпз специфической активности лекттаов бел'"вых фракцпй листьев и стеблей Сог1апс1гил загний и .:ви-сякоегн от температуря.

I - специфическая активность леятина СЗЛ, 2 - и.цифи-ческая активность лектина СбС. На ординате - сг.л'лфя-ческая активность, на оси абсцисс - температуре ;:пку-бациоякой среда, вропл инкубации - 5 минут.

Представляло особый интерес установление углеводн"!' специфичности выделенные нами леетиноподобных белкоз, что когло способствовать разработке технологии выделения и-очистки локтпка

■я кммобилизировашшх специфических носителях соответствующего моносахарида. В качестве гапгенов использовали Д-глюкозу, Д-га-лактозу, лактозу, Д-рашозу, w -ацетил-Д-глюкозашн, и-ацетил--Д-галактозамин, Д-маннозу и ь -фукозу.

Как видно из данных таблицы 3, гетагглютирующая активность лекгшюподобных белков из стеблей и листьев Coriandrum sativua частично ингибируется глюкозой, галактозой, лактозой и Я -аце-тил-Д-галактозашшом. Наиболее высокая специфичность проявляется по отношению к галактозе, что для esc и для CSJI, соответственно, составляет 9,4 мМ и 2,3 Ш. Полученные данные позволяют заключить, что выделенные лектшш являются галактозоспецифичнымн.

Таблица 3

Влияние углеводов на., гемагглютинируюиую активность лектиноподобных белков из листьев и стеблей

Ooriandrum sativum

Минимальная конечная концентрация Углеводы ' углевода Ы'), ингибируюдая геыагглю-гянирующую активность_

CsC лектин СЭЛ лектин

и -ацетил-Д-глкжозашш - -

к-ацетил-Д-галактозашн 37,5 75 '

Д-манноза -

L-фукоза -

Д-галактоза 9,4 2,3

Д-глвкоза 18,8 18,8

Лактоза 18,8 37,5

Рамноза - -

При хранении выделенных наш лектинов в растворе с азидом натрия (0.05i) при 4°С агглютинирующая активность через 4 шсяца

уменьшалась в среднем на 505?, а на 12-ый месяц хранения - лек-тинная акти&чость как для CSC, так и для СзЛ составила лттъ 12$ от пх исходного уровня (рис.4).

Ркс.4. Изменение лектииной активности растворов СаС (I) и СЗЛ (2) в период ах длительного хранения при 4°С. На ордината ~ специфическая активность лектяна, па оси абсцпсс - продолжительность хранения а месяцах.

Аффинная хроматография лвктинсодераздкх белковых ЙякпиЯ на трто-акрил-гзлактозе. Основиваясь на даяние углеводспецифяч-ности лзктина, мц предприняли попытку виделепия и очистки лек-тина яз леягиясодержшяих беляовмх фракций методом аффоттой хроматографии. В качестве сорбента вобрали гашзбилязованнуп на трпс-акряле галактозу. На колонку (15 х I см) наносили препарат з количества белка до 5 мг/:лл. Колонку пром:валя фосфатном буфером (рН 7,4), а »«язбализоЕатшЯ лехтин элвароваля 0,1 м глнцил-HCI буфером Сplî 3,5) со скорость» потока 0,6 млДгат. Шло установлено (рта.5), что з результата хре'.гатографпи белков;«

60

1 2 3 /, 5 б 7 В 9 12

экстрактов стеблей и листьев с!ог1аш1гит ааЗДуит елаируются три пика: I пик - соответствует не связанному с иммобилизованной галактозой белковой фракции, элвированной 40 Ш К-фосфатшга буфером (40 Ш К-^осфат/0,9% на<Я, рН 7,4); П и Ш пики элюиру-ются 0,1 Ы глицин-НС1 буфером (рй 3,5). Элюцшх лектнна начвнп-ется о рН 6,5*,' после введения в колонку глицин-НС1 буфера (рй 3,5) в заканчивается при рН 3,5.

1 «

Рис.5. Аффинная хроматография лектинсодержащих белковшс фракций листьев и стеблей Оог±ап<1гиш зativuш на грис-ак-рил-галактозе.

Г пик - злецея 40 ьй К-фасф&гпт буфером, приготовленного на 0,9% НаС1 П и Ш пики - злюция 0,1 !.' глицин-КСI буфером (рН 3,5).

В отдельних белковых фракциях» хроматографически вдентифи-цировангалс пиков определяли содержание белка и гекагглптини-.рувдую активность на трипсинизированных кроличьих эритроцитах. Было установлено» что лектннной активностью обладают лтаяъ белковые фракции Пай пиков. Расчет их специфической активности показал, что активпость Пай пиков практически пе различается.

Как видно аз данных таблицы 4, в результате очистки на аффинной колонке галактозы специфическая активность лзктгата СзД повышается в 1040 раз, а СаС - в 272 раза по сравнению с исходным экстрактом и в 640 и 17,7 раз, соответственно, по сравнения с высаленный при 0-80$ наоыяаияя сульфатом аммония.

Таблица 4

Изменение спацифической активности лектинов стеблей и листьев Сог1ап(1гшп ааНуит после аффинной хроматографии

Этапы очистки Специфическая Степень Специфическая Степень

активность очистки активность очистки

лектина СаС лектина СэЛ

Исходный вкстракт 18,8 - 2,46 -

Высаленный при

0-80,1 насыщении

сульфатом аммония 289 15,4 4,0 1,6

Очистка аффинной

ггрот тографиеа 5120 272 2560 1040

Пугач :з,ззх?рсфораза з золяахряламидном геле (ряс.6) а пргсут-

•ягтп додзцалеудьфатд яа?ргд било установлено, что обе фракция Лласз зфззггаезз яз рхълтзхгкя по яодаадностя я обо состоят "лз дзтз зтб*,злтазц с ыолояупришя гяссемя соответственно 66,83 хД

f

1 2 3 4 - 5

Рис.6. Электрофорегромка лектинов листьев и стеблей

Coriandrum sativum в градиенте (от 10 до 2Ъ%) полккриламдного геля.

1,3,5 - смесь стандартных белков (тирооглобултгШ 390 кД, ферритин - ММ 220 кД,' альбумин-Ш 67 кД.ка-талаза-ММ 60 кД, лактатдегидрогеназа - ММ 36 кД) 2 - локтин листьев CsЛ, 4 - лектин стеблей СвС.

и 74,98 кД. На основании полученных данных, а также результатов изучения чувствительности лектинов к рН и температуре, сдё лано заключение, что белковые фракции П и Ш пиков являются одним и тем ке лектином, характеризующимся способностью иммобщц зацил на галактозовом сорбенте.

CsC и CsJI 'лектинсвязцвавдие белки грубой мтохондриалъно?! фракции головного мозга -крыс и влияние лектинов на Са■ АТФазную активность. Установление углеводной специфичности в; деленных-нами лектинов позволило предпринять попнтку зондиров«

mm мембран митохондриальной фракции головного мозга крис с целью выявления CSC и СаЛ лектинсвязиваппих белков. Готовите грубую митохондриальную фракцию головного мозга крыс, которую обрабатывали тритоном Х-100 (конечная концентрация 0,1%)< Белковую фракцию мембран, экстрагируемой тритоном Х-100 по принципу гаптен-ингибиторной техники, апробировали на их способность связывания лектина.

К оттитрованному на планшете с и -образными лунками раствору тритонового экстракта грубой митохондриальной фракции добавляли выделенные нами лектины, концентрация которых была постоянной. Установлено, что торможение агглютинации обнаруживается при соотношении белков лектиновой фракции CSG и экстрагируемых тритон Х-100 белков - 4:1, что соответствует титру 1:512. В последующих лунках вновь проявляется агглютинация. Аналогичная закономерность была обнаружена и в опытах с лектшювой фракцией СзЛ,-что количественно соответствует титру 1:128.

Полученные результаты позволяют заключить, что экстрагируете тритоном Х-100 бежи грубей митохондриальной фракции головного мозга крыс характеризуются наличием гликопротеинов с углеводной детерьотгантой галактозой, проявляющих рецепторную функцию.

Имея в видеоданные литературы (Луцик М.Д. и др., I98I;Holi-an A. et ai., 1979, Guptji в. et al.,1980) о повнтении ионной проницаемости мембран под воздействием лектинов, представляло интерес изучение влияния лектинов СзЛ и CsC на Са2+, ;.:зг+-АКазпую активность грубой митохондриальной фракции головного мозга крыс. Инкубационная среда (2,5 мл) содержала: суспензию грубой г.гато-хендриальной фракции (100-150 ют белка), ионы Са2+" (I ьй) и Ug2+ (2,5 мМ),.АТФ (3,0 j,i.ï), раствор лектяна и 50 мМ трис-ПСГ буфер (пН 7,4). Реакцию инициировали вносенком А?,', с последуп-

«5

„щей Ю минутной инкубацией при 37°С, и останавливали добавлением 20% ТХУ (I мл).

п

I ?

О 10 20 40 80 100 150 200

,2ч-

Mg2+ -АТФазнув

„2ч-

_2ч-

„2+ м „2+

Рис.7. Влияние лектинов CsC и Сsi на Caft

активность грубой ыитохондриальной фракции головного ыозга крыс.

Белые столбики - влияние лектина CSC на Са*

АТФазную активность; Черные столбики - влияние лектина CsJŒ на Са"

АТФазную активность. Активность фермента выражена в ыкМ Он/1 мин/1 ыг белка. На ординате - активность фермента, на оси абсцисс -концентрация лектина (мкг/2,5 мл).

Из рис.7 видно, что при добавлении лектина активность Са^+, -АТОазы резко возрастает. По средним данным, при опткмзль-ной концентрации лектина СзС. и CsJI (32 мкг/мл) активность Са^+, -АТФазы возрастает более чем на 70$. Кривая активности фермента зависит от концентрации лектина и проявляется способность к насыщению. Более вероятно, что это объясняется насг-дагагм лек-

6

4

2

г

' л»

тинсвязывавдих центров мембран хгатохондриальной фракции, о чем свидетельствуют приведенные выше данные о тормозящем влиянии экстрагируемых тритоном Х-100 белков мембран грубой штохондри-альной фракции на геыагглютинирупцув активность лектыюв.

Полученные данные представляют интерес в связи с возможной ролью лектинов в регуляции активного транспорта ионов Се?*. Об этой свидетельствуют и данные экспериментов, в которых нам не удалось выявить достоверных сдвигов в агглютинации трипсинизи-рованных кроличьих эритроцитов в зависимости от концентрации » ионов Са2+, что находится в согласии с данными литературы (Allwood G. et al., 1971).

Имея в виду сложную комплексную природу молекулы АТФазн s ее гликопротеиновуй природу (Куte J., 1972, Jean D. et al,1975) mu предполагаем, что роль лектинов CsC и СзЛ выражается в изменении ориентации АТФазы в мембране (swonn a. et ai., 1975) в результате их связывания с галактозой гликопротеинового компонен-. та ферментного комплекса, что создает благоприятное условие для образования фермент-субстратного комплекса.

Влияние лектика СзД на миграционную активность лимфоцитов. Из данншс литературы (lauens L., 1988, Kortinfi H. et al. 1988, Lageron A. et al., 1989) известно, что лектини находят широкое применение в медицине с целью диагностики ряда заболеваний. При различных заболеваниях в крови больных выявляется едекватная реакция лектинов на функциональное состояние дямроцитоз и лейкоцитов. Для характеристики функционального состояния лш^оцитоа ^окно Еспользовать фактор ингибшдии миграции лиа^оцитоз <ШО), хо-торнй синтезируется Тп -хелпернш.да клеткаш, а для лейкоцитов -(1актор усиления миграции лейкоцитов (СУМ), который синтезируется и секрзтируатся Ти -супрессссгптк клетками. По уровню синтеза

этих факторов судят о функциональном состоянии данных субнопу-ляцнй инмунокоотетентнызс клеток и о преимущественном воздействии тех или иных экзогенных факторов на Тз или 1Ъ - клетки.

В данной серии опытов исследовали влияние лекткна СаЛ. В результате проведенных исследований было установлено, что лек-тин СзЛ вызывает усиление миграционной активности Т-клеток до 136$ а модели острого глоыерулонефрита. Этот факт свидет&льст-вует об активации супрессорных клеток в данной «одели заболевания, т.е. при остром воспалительном процессе с участием аутоиммунных решений. Следует такке отметить, что в этой же модели лекгин-митоген лаконуса вызывал активации Т-хеяпсров (индекс миграции до 0>3%).

Полученные результаты свидетельствуют о возможности пммуно-коррекцта денным лектииом острых воспалительных состояний.

ВЫВОДЫ

1. .В стеблях и листьях растения Сог1апсЗгшп ваиуии выявлена гемагглытинируицая активность. Лектинсодоряащио белковые фракции экстрагируются 40 &&1 К-фосфатннм бугром,' приготовленного на 0,9^ Ипсг и содержащего 0,5 Ш ингибитора протеаз (парамегкя-сульфонилфторид) и 5 Ш /3 -ыеркаптовтакола (рН 5,0).

2. Установлено, что в условиях ступенчатого фракционирования суль<$атом.вммония при 40£, 60?, 80% я 0-80^-ои насыщении иаавнепал лектинная активность на тркпеинизированннх кроличьих аритроцатах обнаруживается в осадочной фракции белков как стеблей, так и листьев при 40%-ои каешкепии.

3. Гедагглотинируипая активность дсктпноп СЗС и СэЛ чувствительна к рН; оптииальннм для лекгшюв СЗС и СаЛ является рН 7,4.

Дектшш термостабильнц, их полная инактивация происходит после 5 минутного нагревания при 70°С. Ионн Са2+ и Mg2+ не оказывают влияния на лекттшуа активность CSC и Сзл.

4. Лектгош СЗС и СзЛ является галактозоспецифичншга. Это дало ссноваппо для их выделения п очистки аффинной хроматографией па трис-акрил-галоктозе.

б. Результаты электрофореза в ПААГ в среде о додецилсульфа-

тса натрия показали, что дактили CSC п Сзл состоят из двух субъ-

f

единиц с молекулярными кассши 66,83 1я 74,98 яД.

Иоходя из донных чувствительное?!? лектшоа Сзс и СЗЛ к pH, •гермостабильности, влияния шояов Ca2-"1 я Mg2+ , а такяв данных аффинной хроглатографта сделано заклгчояие об идентичности лек-тгкез CSG а сзл,

6. Яактотш CSС и Сзл путем связывания с терминальным моносахаридом галактозой рецептора иембран оказывают стщулирувщее Еяшшяа на -АТ^азкуя активность грубой штохоядриаий-иоЗ фракции головаого мозга крас. Кривая активноетз является эа-веспиой or концентрации дэятэтга s ароявляег способность я насыщения.

7. Лекгш! coriandrum sativum усиливаем мяграцЕоянузэ активность Т-клоток до 13о% в модеяя coupon ггокзрулонефр эта.

8. Предложена технология ЗОЯ^ЗНЯЯ ЛОКЗЕНЁ ИЗ Coriandrum sativum с высокой степенья чистоту для его масштабного производства с кошарвдекой цельэ; •

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО TEIS Д1ЖСЕРГА1Щ;

I. ЗЬХашуд, Е.С.Давиташвили, Н.Г.Ллзксидзе. Белковкз фракщга с . . лектшюаой активностью из лиегьзв п гтеблей Coriandrum eati-vim» Сообщения Академии наук Грузии, т.142, ß 3, 19ЭХ, стр. ; . 617-620. / ^ .. V" : - . . ;/

6n8ofin SOßO^pb-do ÙÙ3Q0

¿afínciSQñsd Qô $meo&ní>¿G

адсЙ^оО ¿ópOoSiJ Qó Cmjo&^an

QOO^bnóOQÚÚ

тЪАЗО Qß>i£Q

ООНИальиО-ЭХОЛОК1ЧвОК9Й Шфо^ш ~ 120 27. ОТ. 1291 Г.