Белковый комплекс семян фасоли и испытание биологической активности его компонентов

Гагарина, Ирина Николаевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Белковый комплекс семян фасоли и испытание биологической активности его компонентов
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Белковый комплекс семян фасоли и испытание биологической активности его компонентов"

На правах рукописи

ГАГАРИНА ИРИНА НИКОЛАЕВНА

БЕЛКОВЫЙ КОМПЛЕКС СЕМЯН ФАСОЛИ И ИСПЫТАНИЕ БИОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ЕГО КОМПОНЕНТОВ

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Орел - 2005

Работа выполнена в ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» и Всероссийском научно-исследовательском институте зернобобовых и крупяных культур РАСХН.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Павловская Нинэль Ефимовна

Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук,

профессор

Лысенко Николай Николаевич

кандидат биологических наук, Голышкина Любовь Владимировна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Орловский

Государственный университет »

Защита состоится « 3 » С^ДЬрсчЦЦЗ 2006 г. в часов

на заседании диссертационного совета КМ 220.052.01 в ФГОУ ВПО «Орловский государственный аграрный университет» по адресу: 302019, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Орловского государственного аграрного университета.

Автореферат разослан« » декабря 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат сельскохозяйственных доцент

Макеева Т.Ф.

%о'¿ЬМ463

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Приоритетной задачей биотехнологии является обеспечение сельскохозяйственного производства дешевыми, экологически чистыми и эффективными препаратами для обработки посевного материала, гарантирующие формирование высоких и стабильных урожаев. С целью выявления дополнительного источника биологически активных веществ многие ученые мира занимаются биоскринингом растений. Фасоль является одним из таких объектов. По химическому составу семена фасоли уникальны и включены в группу важных продуктов, обеспечивающих население полноценным белком. Однако белковый комплекс фасоли содержит ряд токсичных и антиалиментарных факторов питания, блокирующих активность пищеварительных ферментов, которые и, возможно, принимают участие в защитных механизмах растения. Наличие антипитательных веществ (ингибиторов гидролаз, лектинов и цианогенных гликозидов) с высокой активностью в семенах фасоли делает ее перспективной с точки зрения биотехнологической переработки и получения фитопрепаратов.

Для разработки технологий получения в промышленных масштабах лектинов и ингибиторов фасоли необходимо не только выявить перспективные сорта и формы, но и установить фазу развития, их локализацию в органах растения, изучить химический состав сопутствующих веществ, рассчитать выход и дать конкретные рекомендации по методикам выделения. Решение этих проблем позволит дополнить знания в области биохимии фасоли и будет способствовать дальнейшему повышению рентабельности сельскохозяйственного производства.

Цель и задачи исследований. Цель работы - охарактеризовать белковый комплекс семян фасоли и испытать его антипитательные компоненты: ингибиторы гидролаз и лектины на биологическую активность.

Задачи:

1.Провести биоскрининг сортов и форм фасоли на содержание белка, антипитательных и токсичных веществ

.. П..ПТ..ГГТ нян^щ. щр.

РОС. 1 ц . » ИЛЬНАЯ I

ь и 5., ✓ОТЕК А I

спективные для промышленного получения лектинов и ингибиторов гидролаз.

2.Изучить динамику накопления токсичных веществ: лектинов, ингибиторов гидролаз и цианидов по фазам развития семян у различных сортов и форм фасоли.

3.Выявить полиморфизм образцов фасоли по белковым и ДНК-маркерам.

4.Выделить и очистить ингибиторы гидролаз и лектины из семян фасоли.

5.Установить полипептидный состав ингибиторов гидролаз, лектинов и углеводную составляющую лектинов.

6.Провести испытание белковых компонентов фасоли на биологическую активность.

7.Сформулировать рекомендации по рациональному использованию лектинов и ингибиторов гидролаз фасоли.

Научная новизна работы. Впервые проведен биоскрининг районированных сортов и форм фасоли на содержание и активность антипитательных и токсичных веществ: лектинов, ингибиторов гидролаз и цианидов, осуществлена регистрация местных сортов и форм фасоли по белковым и ДНК - маркерам. Выделены лектины и ингибиторы протеиназ и амилаз из семян фасоли, установлен полипептидный и углеводный состав, испытана их биологическая активность.

Практическая значимость работы. Выявлены сорта и формы фасоли с высокой активностью лектинов и ингибиторов с целью использования их в качестве сырья для промышленного получения препаратов различного назначения, в том числе и диагностикумов для определения групп крови человека. Предложены модифицированные и адаптированные к изучаемой культуре биотехнологические схемы выделения лектинов и ингибиторов. Установлено положительное влияние компонентов фасоли на урожайность и устойчивость к патогенам и фитофагам гороха Р1зшп зааииш, что является перспективным направлением в создании биопестицидов.

Апробация работы. Материалы диссертации были доложены: на 1-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002), на V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003), на международном форуме «Биотехнология и современность» (Санкт - Петербург, 2003), на 2-ом Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2003), на научно практической конфе-

ренции молодых ученых и аспирантов «Биологические основы современной агрономии» (Орел, 2004), на международной конференции «Физиологические и молекулярно-генетические аспекты сохранения биоразнобразия» (Вологда, 2005), на 3-ем Международном конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2005).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 20 печатных

работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 147 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов, предложений для производства, приложения, списка литературы, включающего 114 отечественных и 71 иностранныя источник. Работа иллюстрирована 16 таблицами и 31 рисунком.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Диссертационная работа выполнена в период с 2001-2005 г.г. в рамках программ: 1. ГНЦ 3. (2003г.) по теме: «Разработка методов повышения иммунных свойств, диагностики и интегрированных систем защиты зернобобовых и крупяных культур от болезней и вредителей»: 3.4. «Влияние белковых компонентов фасоли на иммунные свойства гороха»; 2. (2004 г.) «Разработка методов диагностики и повышения иммунных свойств на основе биологических систем защиты зернобобовых и крупяных культур от болезней и вредителей»: 2.4. «Выявление природных сигнальных систем устойчивости гороха»; программы РАСХН 08.02.03. «Провести комплексную биохимическую и технологическую оценку генофондов зернобобовых (горох, фасоль, чечевица, вика яровая, кормовые бобы) и крупяных культур (гречиха, просо), выделить источники высокой белковости, отличных пищевых и кормовых достоинств, провести паспортизацию сортов гороха, фасоли, просо и гречихи по белковым формулам и ДНК-маркерам». Экспериментальная работа проводилась в НИИЛ ОГАУ, опытные посевы размещены во ВНИИ ЗБК.

Материалом исследований являлись образцы фасоли селекции ВНИИ ЗБК (11) и коллекции ВИР (13), всего 24 образца. Схема эксперимента представлена на рис. 1.

Содержание сырого протеина в семенах фасоли определяли методом Кьельдаля; гемагглютинирующую активность - по Э.И. Выскре-бенцевой (1983); активность ингибиторов протеиназ - казеинолитиче-ским методом М.Л. Какейда (Бенкен, 1982); активность а- амилазы -спектрофотометрическим методом в модификации А.И. Ермакова (1983); идентификацию и регистрацию образцов фасоли - по полипептидному составу белков в созревающих семенах методом БОБ-ПААГ электрофореза по прописи ВИРа (Конарев и др. 2000) в модификации; идентификацию образцов по ДНК маркерам - методом ПЦР; статистическую обработку результатов проводили методами дисперсионного анализа (Доспехов, 1985) с использованием компьютерных программ «Ехе1» и «Вм№Я -Б».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Скрининг образцов фасоли на содержание сырого протеина, антипитательных и токсичных веществ. Исследования 2001-2003 г. г показали, что содержание белка по годам выращивания в зависимости от генотипа варьирует в довольно широких пределах (от 19,9 до 29,3%) и в среднем составляет 26%. В благоприятные по погодным условиям 2001 и 2003 г.г. содержание белка в семенах фасоли несколько выше и в среднем составляет 27%. В засушливых условиях 2002 г. этот показатель снижается до 23 %. Такие резкие колебания в накоплении протеина связаны не только с погодными условиями выращивания, но и с генотипом расте-

ний. Образцы фасоли с наиболее высоким содержанием протеина: Оран, Рубин, Ока, Шоколадница и Л-179 (28,4...29,1%) (табл. 1).

Таблица 1

Содержание белка в семенах фасоли (% к абсолютно сухому веществу), 2001-2003 гг.

Название образца Содержание белка, %

2001 2002 2003 Среднее

Оран - 24,1 27,2 25,7

Рубин - 22,9 26,4 24,7

Ока - 27,1 29.1 28,7

Нерусса - 24,2 26,1 25,2

Шоколадница - 26,0 28,6 27.3

Вельская 16 29,3 23,9 28,4 27.2

Л 135 - 21,9 - 21.9

Л 162 24,3 20,1 - 22,2

Л 179 - 24,8 27,4 26,7

Л 202 - 21,7 24,2 23,0

Л 543 - 20,0 23,9 22,0

Л 714 - 23,1 25,7 24.4

К 13627 26,0 21,6 24,1 23.9

К 14098 27,9 26,1 - 27,0

К 15038 26,1 22,4 25,4 24.6

К 15077 28,9 25,2 28,1 27.4

К 15104 24,4 21,9 - 23,2

К 15121 25,8 20,9 - 23,4

К 15127 27,6 23,2 26,2 25.6

К 15175 27,1 22,9 - 25,0

К 15186 28,4 21,4 - 24,8

К 15196 29,9 27,2 29,1 28.7

Краснодарская 5 28,5 - - 28,5

К 14694 25,5 21,9 - 23,7

Проведенный биоскрининг семян фасоли на гемагглютинирую-щую активность лектинов (ГА) выявил перспективные сорта и линии фасоли среди образцов коллекции ВИРа и ВНИИЗБК. Установлено, что образцы фасоли урожая 2001-2003 годов значительно различаются по ГА. Так, показатели активности по второй группе крови оказались самыми высокими на всех образцах (33,33...51,54 [мг/мл]"1), актив-

ность лектинов с использованием третьей и четвертой групп крови примерно одинакова: (21,22...33,71 [г/мл]"1) - по третьей, и (2,22...38,42 [мг/мл]'1) - по четвертой), что несколько ниже показателей по второй группе. Данные по активности на первой группе оказались ниже других (17,04...27,82[мг/мл]').

По результатам биоскрининга дальнейшему исследованию подвергались 15 сортов и форм фасоли. Семена испытывали на ГА в различные фазы спелости семян (середина налива, полный налив, полная спелость), рис.2.

[мг/мл]-1

70 60 50 40 30

середина налива полный налив полная спелость

образцы

Рис. 2. Гемагглютинирующая активность лектинов в созревающих семенах фасоли на второй группе крови

В фазу середины налива активность лектинов низкая, в пределах 3,50 - 5,05 [мг/мл]-'. Семена фасоли в фазу полного налива проявляют более высокую активность гемагглютининов (от 7,18 до 14,38 [мг/мл]-1). В процессе развития семян фасоли наблюдается увеличение ГА лектинов и своего максимума она достигает в фазу полной спелости (58 [мг/мл]-1).

Установлено, что наибольшей ГА обладали следующие сорта и образцы фасоли: Оран, Ока, Нерусса, Шоколадница (от 52,60 до 54,00 [мг/мл]'1). Несколько ниже активность у сортов Рубин, Вельская 16, образцов Л 179, К 15038, К 15127 и К 15196 (от 40,00 до 47,60 [мг/мл]" '), что позволяет рекомендовать их как сырье для получения лектинов.

Активность ингибиторов протеиназ в семенах фасоли незначительно изменялась по годам выращивания 2001 - 2003 г. г. (рис.3), что позволяет сделать вывод об отсутствии влияния внешних факторов на их накопление, и данный признак является генетическим, что подтверждают следующие данные.

середина налива

полный налив

полная спелость

фазы спелости

Рис. 3. Активность ингибиторов протеиназ семян фасоли (среднее по годам)

С наибольшей активностью ингибиторов выделяются образцы Ока, Оран, Л - 179, Шоколадница. Трипсин ингибирующая активность (ТИА) изменяется в среднем от 9,02 до 12,00 мг/г. Химотрипсин ингибирующая активность (ХИА) несколько ниже и варьирует в пределах от 5,12 до 5,60 мг/г. Активность ингибиторов у других образцов ниже и составляет по ТИА (5,01...8,06), ХИА (3,58...5,01). В 2003 году исследованы семена фасоли в процессе их созревания. Величина ТИА в фазу середины налива составляет 1,2 мг/г; ХИА - 1,1 мг/г, в фазу полного налива ТИА - 3,5мг/г, ХИА - 1,2 мг/г, а в фазу полной спелости активность достигает своего максимума (ТИА - 12,2 мг/г и ХИА - 6,5 мг/г).

Активность ингибиторов а - амилаз семян фасоли урожая 20012003 годов варьирует в пределах 74,4...96,8 %. Наибольшей активностью обладают сорта: Оран, Ока (92...96 %). В процессе созревания семян фасоли активность возрастает от фазы середины налива к полному наливу и несколько снижается к полной спелости. Так, у сорта фасоли Оран активность ингибиторов р - амилазы составляет: 18.2 мг/г (середина налива), 92,3 мг/г (полный налив) и 88,5 м г/г (полная спелость).

Известно, что некоторые виды фасоли характеризуются наличием токсичных веществ, особенно лимарином, что делает их опасными для употребления в пищу в необработанном виде, поэтому было проведено исследование изучаемых образцов фасоли на содержание циа-ногенных гликозидов. В результате выявлено, что данный показатель находится в пределах ПДК (0,5...3,33 мг/100г).

Методы выделения и очистки лектинов и ингибиторов. Разработаны усовершенствованные методы выделения и очистки ингибиторов и лектинов применительно к фасоли, позволяющие увеличить выход компонентов, сократить время операции и повысить эффективность очистки. За основу выделения и очистки лектинов был принят метод A.B. Косенко (2002) на бобовых культурах. Базой способа выделения и очистки ингибиторов протеиназ является метод, разработанный И.О. Мельниковой (1982). Количественный метод определения ингибиторов а-амилаз по А.И. Ермакову (1983) для пшеницы адаптирован в новой биотехнологической схеме. Изменения внесены в следующие этапы: выделение белков, их центрифугирование, очистка, осаждение и др.

Данная технология позволяет получать лектины из семян фасоли с выходом 32 мг/100г белка, ингибиторы протеиназ - 18 мг/ЮОг белка, а- амилаз - 14 мг/ЮОг белка.

Характеристика суммарных запасных белков фасоли по полипептидному составу. Методом электрофореза изучен полипептидный состав запасных белков семян 15 образцов фасоли в разные фазы созревания (рис. 4). Для количественного выражения и сравнения образцов со стандартом (районированный сорт фасоли Оран) проведен компьютерный анализ белковых спектров в программе «Biotest - D». Показателем выраженности полипептидных зон является «светимость» в процентах.

а) середина налива б) полный налив в) полная спелость

Рис. 4. Электрофореграммы полипептидного состава семян фасоли в процессе их созревания

Отличие полипептидного состава запасных белков семян разных образцов от стандартного сорта Оран в фазу середины налива минимально и составляет 0,2...0,5%. Полипептидный состав семян образцов фасоли в фазу полного налива отличается от стандарта на 11... 14 %. Анализ семян полной спелости выявил еще большие различия (20...53 %) (рис. 5). Это указывает на эволюционное единство происхождения всех сортов фасоли, проявляющееся в первые сроки созревания семян, и дивергенцию признака у семян полной спелости. Данные исследования подтвердили имеющиеся литературные данные о сортоспецифичности запасных белков в фазе полной спелости, что делает обязательным идентификацию генотипов фасоли по полипептидному составу только зрелых семян.

полная спелость (3) -полный налив (2) 'середина налива (1)

Оран - 0%

я я к к я ¡5 я Ока - 0,3% (1), 11,2%, (2) 33,1 % (3)

Рубин - 0,5%, (1) 12,5%, (2) 40 1 % (3)

-*61288йй8йг. я ? 8

Нерусса- 0,6% (1), 10,7% (2), 46,7% (3) Вельская 16- 0,3% (1), 12,8% (2), 38,4% (3)

Рис. 5. Отклонение спектров полипептидного состава семян фасоли в процессе их созревания (от стандарта Оран)

Результаты электрофоретического разделения белков фасоли показывают, что линии состоят их одного биотипа, а сорта и коллекционные образцы их двух - трех. Определяющим по всем образцам является первый биотип, на долю которого приходится наибольший процент встречаемости. На основе исследований полипептидного состава семян различных сортов фасоли, выявивший их полиморфизм по данному признаку, составлен каталог белковых формул образцов фа-

соли, который может быть использован для паспортизации и идентификации сортов, осуществления контроля сортовой чистоты, решения арбитражных споров.

Полиморфизм сортов фасоли по ДНК-маркерам. Полиморфизм 15 образцов фасоли из коллекции ВИР и селекции ВНИИЗБК устанавливали по ДНК-маркерам ПЦР-анализом. Для амплификации геномной ДНК использовали праймеры 12 разновидностей в различной комбинации попарно и по одному. Сортовые различия найдены с праймером Ваге (рис.6).

1000 п.н. 900 п.н. 800 п.н.

700 п.н. 500 п.н.

400 п.н

100 пн.

10 11 12 13 14 15 16 17

Рис. 6. Продукты амплификации ДНК образцов фасоли с праймером

Bare (1-Контроль, 2-Оран, З-Рубин, 4-JI543/84, 5-Ока, 6-Неруса, 7-Л 202, 8-Л 714,9-Л179,10-Шоколадница, 11-К 15038, 12- К 15077, 13-К 13627,14-К 15196,15-К 15127,16-Бельская, 17-Маркер).

Так, фрагменты продукта амплификации ДНК, соответствующие 500 - 700 п.н., характерны для всех сортов фасоли, а в зоне от 100 до 500 п.н. обнаружены фрагменты ДНК, дающие возможность выявлять межсортовой полиморфизм. Какой - либо связи между фрагментами ДНК и агрономическими признаками фасоли пока обнаружить не удалость.

Полипептидный и углеводный состав антипитательных веществ фасоли. Исследован полипептидный состав ингибиторов гид-ролаз и лектинов семян фасоли сорта Оран. Полипептидные фракции ингибиторов протеиназ распределены равномерно по всей длине элек-трофореграммы и разделяются на 14 компонентов (рис.7,1). Для ингибиторов а - амилазы фасоли характерно преобладание полипептидных фракций, которые по молекулярной массе соответствуют 25...45КДа, и разделяются на 18 компонентов (рис. 7,2). Полиморфизм сортов по данному признаку не изучался.

Лектины по полипептидному составу представляют собой гетерогенный белковый комплекс. Они разделяются на 11 компонентов с различной электрофоретической подвижностью. Доминируют достаточно тяжелые компоненты белка (от 45 до 65 КДа, рис. 7,3).

Рис. 7. Электрофореграммы ингибиторов 1-протеиназ, 2- а-амилаз, 3-лектинов фасоли сорта Оран

Хроматографическое исследование углеводного состава лектинов с использованием стандартных метчиков показало наличие у них мальтозы, глюкозамина, галактозы, арабинозы, фруктозы, глюкурона, рамнозы. От наличия тех или иных углеводов в составе лектинов зависят агглютинирующие свойства данных белков и их значение в растениях и биотехнологии, что является предметом наших дальнейших исследований.

Испытание белковых компонентов на биологическую активность. Как было установлено, активность лектинов фасоли различна по отношению к группам крови человека. Биологическая активность у образцов фасоли имеет разницу по разным группам крови (ГА от 16 до 30 единиц). Контрастные значения выявлены у сорта Шоколадница (рис. 8), а также Оран и Нерусса, которые можно рекомендовать в качестве маркеров для определения групп крови и при разработке диетического питания. Так, для людей с 1-ой группой крови фасоль для питания наиболее предпочтительна, чем для лиц с 3-ей, 4-ой и особенно 2-ой группами.

группа крови

Рис 8. Гемагглютинирующая активность лектинов фасоли сорта Шоколадница

Биологическая активность препаратов, созданных на основе белков семян фасоли, испытана на горохе сорта Орпелла. Установлено, что Эпин и лектин фасоли в низкой концентрации усиливали ростовые процессы проростков и развитие корневой системы гороха. Обработанные лектином более высокой концентрацией и контрольные растения (вода) отставали в росте от других вариантов и в развитии корней и наземной части проростка.

Ранее было установлено (Павловская и др., 2002), что показателем устойчивости гороха к патогенам может служить альтернативная оксидазная система клеток: пероксидаза и каталаза, по активности которых можно судить о жизнеспособности растений. Пероксидаза и каталаза конкурируют за субстрат - перекись водорода и активность отдельно каждого фермента зависит от работы «партнера».

Нами отмечалось увеличение активности пероксидазы гороха при обработке семян раствором лектина фасоли с высокой степенью разведения (рис. 9).

Д. усп.Й11.

4 сутки 5 сутки 6 сутки 7 сутки

р необработанные ■ Эпин в Лектин фасоли 10-2% а Лектин фасоли 10-7% ;

Рис. 9. Активность пероксидазы в проростках гороха

Каталазная активность, напротив, по мере роста проростков существенно снижалась. При этом у контрольных растений это уменьшение происходило более резко и скачкообразно. Наиболее плавно и незначительно отмечалось уменьшение каталазной активности у проростков гороха, обработанных более высокой концентрацией лектина фасоли (рис. 10).

35 30 25 20 15 10 5 I

Каталазное число

11П 1

4 сутки

5 сутки

6 сутки

7 сутки

^необработанные ■ Эпин □ Лектин фасоли 10-2% □ Лектин фасоли 10-7%~|

Рис. 10 Активность каталазы в проростках гороха

Таким образом, лектины фасоли стимулировали ростовые процессы гороха и повышали ферментативную активность клеток, связанную с болезнеустойчивостью (рис. 11).

1- контроль - вода, 2 - контроль - «Бульдок»)

3- ингибиторы а - амилаз, 4-ингибиторы протеинаэ

Рис. 11. Результаты испытания ингибиторов протеиназ и а -амилаз на инсектицидную активность

Испытание препаратов на гороховой зерновке показало их мягкое инсектицидное воздействие. При обработке жуков растворами лек-тинов в исходной концентрации их гибель наступает в 30% случаев, при обработке лектинами с меньшей концентрацией снижается. Обработка жуков гороховой зерновки вытяжкой ингибиторов протеиназ в исходной концентрации приводит к 60 %гибели жуков. Более низкие концентрации менее эффективны

Изучение влияния препаратов на повышение болезнеустойчивости горха к возбудителю корневых гнилей Fusarium oxysporum по активности пероксидазы проростков гороха показало их положительное воздействие. Так, замачивание семян гороха в растворах ингибиторов фасоли приводит к повышению активности пероксидазы в здоровых и зараженных спорами гриба Fusarium oxysporum растениях. Через 7 дней отмечено явное преимущество вариантов с ингибиторами, где активность пероксидазы возрастает в 1,5... 1,8 раз.

В 2003 году в полевых условиях проводилось изучение биопес-тицидных свойств препаратов, приготовленных на основе ингибиторов протеиназ фасоли, на сортах гороха Орпелла и Спрут. Семена замачи-

вали в комплексных препаратах в различных концентрациях, контроль: вода и промышленный препарат БИ - 58 (новый).

Установлено, что ингибиторы протеиназ повышают устойчивость гороха к бледнопятнистому аскохитозу на 16 %, снижают поражение семян гороховой плодожоркой на 12%, увеличивают урожай семян на 20 %.

В 2004-2005 годах на сорте гороха Норд в полевых условиях проводились испытания комплексных препаратов, созданных на основе лектинов фасоли.

Обработка семян гороха сорта Норд препаратами повышает устойчивость растений гороха к аскохитозу на 16 %, снижает развитие корневых гнилей на 10 %,повышает урожайность на 16...23 %.

Таким образом, компоненты белкового комплекса семян фасоли проявляют биологическую активность, повышают иммунитет растений гороха к возбудителям болезней и вредителям, оказывают стимулирующее действие на накопление урожая семян. Отсюда, фасоль может быть не только продуктом для питания, но и сырьем для получения биологически активных компонентов, диагностикумов и экологически чистых, безопасных для здоровья животных и человека биопестицидов мягкого действия, не уничтожающих, как химические препараты, все живое, а регулирующих численность биоты.

ВЫВОДЫ

1. Проведен скрининг 24 образцов фасоли на содержание суммарных запасных белков и антипитательных веществ семян. Содержание белка по сортам колеблется от 22,1 до 29,9% . Активность ТИА -от 6,58 до 11,39 мг/г, ХИА - от 3,75 до 7,02 мг/г, ГА лектинов от 17,03 до 58,8 [мг/мл]"1, цианогенных гликозидов - от 0,5 до 3,33 мг/100г. Наибольшее содержание белка отмечено у сортов: Оран, Шоколадница, JI 179, К 15077, К 15196, а антипигательных компонентов - у сортов: Оран, Ока, Шоколадница. Содержание цианогенных гликозидов в изученных образцах фасоли находится в пределах ПДК (0,5...0,33 мг/100г).

2. Установлен полипептидный состав суммарных запасных белков семян фасоли, состоящий из 25...30 компонентов, и зависящий от генотипа. Белки семян линий состоят из одного биотипа, а сорта и коллекционные образцы из двух - трех. Определяющим по всем образцам является первый биотип, на долю которого приходится наибольший процент встречаемости. Составлены белковые паспорта 15

сортов фасоли, которые могут быть включены в компьютерную базу данных по биологическому разнообразию флоры и фауны планеты.

3. Ранние фазы формирования семян всех образцов фасоли отличаются единообразием ЭФ-спектров белков, что указывает на эволюционное единство происхождения. В поздние сроки созревания проявляется сортоспецифичность и дивергенция признака, что делает возможным идентификацию генотипов фасоли по полипептидному составу семян.

4. Праймером Ваге выявлены ДНК-маркеры фасоли, соответствующие 150-700 п.н., связанные с индивидуальными признаками образцов.

5. Разработаны методы выделения и очистки ингибиторов и лектинов применительно к фасоли. Выход ингибиторов протеиназ составил 18 мг/100г, амилаз - 14 мг/100г лектинов -32 мг/100г.

6. Методом электрофореза установлено, что ингибиторы протеиназ состоят их 14, амилаз - 18, лектины из 11 полипептидов. Хро-матографическое разделение углеводов лектинов выявило наличие в их составе: мальтозы, глюкозамина, галактозы, арабинозы, фруктозы, глюкурона и рамнозы.

7. Испытания лектинов на биологическую активность показало, что гемагглютинирующая активность по второй группе крови самая высокая (33,03...58,8 [мг/мл}'1), по третьей (21.21...38,00 [мг/мл]'1), по четвертой (21,22...32,79 [мг/мл]'1), а по первой самая низкая (17,04...27,62 [мг/мл]1). Сорт фасоли Шоколадница можно использовать в качестве диагностикума для выявления групп крови и при разработке диетического питания.

8. Лектины и ингибиторы гидролаз фасоли повышают перокси-дазную активность, устойчивость растений к патогенам и фитофагам, увеличивают урожайность гороха (на 8...23%).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

1.Рекомендуется проводить идентификацию коллекционных, селекционных образцов и районированных сортов фасоли по белковому «паспорту» методом электрофореза для определения сортовой чистоты, семенного контроля, установления авторства и решения арбитражных споров.

2.Сорта фасоли Оран, Ока, Шоколадница, Нерусса рекомендуется использовать в качестве сырья для получения ингибиторов гидро-

лаз и лектинов, необходимых для производства медицинских диагно-стикумов, лекарственных препаратов и биопестицидов.

3.Разработанные методы выделения лектинов и ингибиторов гидролаз фасоли можно рекомендовать специалистам, работающим в биотехнологической отрасли (медицинской и сельскохозяйственной).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Гагарина, И.Н. ПЦР-аналга для идентификации генотипов фасоли /И.Н. Гагарина, О.А Шалимова, Н.Е. Павловская //1-й Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» : матер, конгресса (14-18 окт. 2002г., Москва). -М„ 2002. -С.111-112.

2. Яроватая, М.А. Лектины зернобобовых культур в биотехнологии / М.А. Яроватая, И.Н Гагарина, М.П. Мирошникова, Н.Е. Павловская // Материалы 68-й межвузовской научной практической конференции студентов и молодых уч.- Курск, 2003.- С. 27-28.

3. Парахин, Н.В. Биотехнологические подходы к решению вопросов переработки растительного сырья зернобобовых и крупяных культур /Н.В. Парахин, Н.Е.Павловская, И.В.Горькова, И.Н.Гагарина 112 Международный конгресс «Биотехнология - состояние и перспективы развития» : матер, конгресса (окт. 2003г., Москва)-М.-С.218 - 219.

4. Яроватая, М.А. Роль компонентов белкового комплекса зернобобовых культур в лечении злокачественных заболеваний / М.А. Яроватая, И.Н Гагарина, М.П Мирошникова, Н.Е.Павловская //Хирургические науки в России: история, современность и перспективы, к 120 - летию научной деятельности П.И. Дьяконова : материалы науч. конф,- Орел, 2003. -С.42-43.

Т. 5 ,ч.2: Вклад земляков - орловцев в становление российской науки, культуры и образования.-2003.-С.62-63.

5. Гагарина, И.Н. Создание и использование экологически чистых иммуномодуляторов при возделывании гороха / И.Н. Гагарина, К.Ю Зубарева, Н.Е.Павловская //Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря: материалы 4 Всеросс. конф,- Астрахань, 2003.- С.64-66.

6. Гагарина, И.Н. Биотехнологическая переработка семян фасоли для получения физиологически активных веществ / И.Н. Гагарина, Н.Е. Павловская //Второй съезд общества биотехнологов России : материалы второго съезда общества биотехнологов России (13-15 окт. 2004г., Москва).-М.,2004. -С.59-60.

7. Гагарина, И.Н. Лектины фасоли как маркеры групп крови / И.Н.Гагарина, Н.Е Павловская, М.П.Мирошникова //Физиологические аспекты продуктивности растений : материалы науч. -метод, конф. [В 2 ч.]), - Орел, 2004. - Ч. 1.- С.254-256.

8. Гагарина, И.Н. Лектины как компоненты, составляющие белковый комплекс фасоли / И.Н. Гагарина, Н.Е. Павловская //Организация и регуляция физиолого-биохимических процессов :международный сб. науч. работ.-Воронеж : ВГУ ,2004.-Вып.6 - С. 51-54.

9. Гагарина, И.Н. Выделение лектинов и ингибиторов трипсина и химотрипсина из семян фасоли для создания природных фитоимму-номодуляторов //Биологические основы современной агрономии : матер. науч.-практ. конф.молодых уч. и аспир. фак. агробизнеса и экологии. - Орел, 2004. -С.7-10.

10. Гагарина, И.Н. Влияние обработки лектиносодержащими и ингибиторосодержащими препаратами на жизненную активность взрослых особей Bruchus pisorum L. ВГУ/ И.Н. Гагарина, К.Ю. Зубарева //Биологические основы современной агрономии: матер, науч,-практи. конф. молодых уч. и аспир. фак. агробизнеса и экологии. -Орел, 2004. -С.19-21.

11. Шалимова, O.A. Иммунокоррекция устойчивости растений гороха и пшеницы с помощью лектинов растительного происхождения/ O.A. Шалимова, И.Н.Гагарина, Е.Г. Прудникова //Пути повышения устойчивости сельскохозяйственного производства в современных условиях: матер. Всеросс. науч.-практ. конф. - Орел, 2005. -С.296-303.

12. Гагарина, И.Н. Перспективы использования биологического сырья для получения фитоиммуномодуляторов /И.Н. Гагарина, Н.Е. Павловская //Пути повышения устойчивости сельскохозяйственного производства в современных условиях: матер. Всеросс. науч.-практ. конф. - Орел, 2005. - С.303-309.

13. Гагарина, И.Н. Биотехнологический подход к использованию лектиносодержащих препаратов / И.Н.Гагарина , Е.Г. Прудникова, Н.Е. Павловская //Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова : матер.третьего съезда общества биотехнологов России (25-27 окт. 2005г., Москва).- М.,2005. - С. 102.

14. Шалимова, O.A. Индуцирование устойчивости у гороха и пшеницы лектиносодержащими препаратами / O.A. Шалимова, И.Н. Гагарина, Е.Г. Прудникова, Н.Е. Павловская //Третий съезд общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова: матер.третьего съезда общества биотехнологов России (25-27 окт. 2005г., Москва).- М.,2005,-С.130-131.

15. Гагарина, И.Н. Использование белковых маркеров в сортовой идентификации бобовых / И.Н. Гагарина , H.A. Корниенко //Научные основы повышения эффективности сельскохозяйственного производства : матер, науч.- практ. конф. молодых уч. и аспир. фак. агробизнеса и экологии. - Орел, 2005. - С. 113-117.

16. Гагарина, И.Н. Прудникова Е.Г. Сравнительный анализ полипептидного состава токсичных веществ зерновых и бобовых культур / И.Н. Гагарина, Е.Г. Прудникова //Научные основы повышения эффективности сельскохозяйственного производства : матер, науч. -практ. конф. молодых уч. и аспир. фак. агробизнеса и экологии. -Орел, 2005.-С. 120-128

17. Прудникова, Е.Г. Идентификация сортов и линий зерновых и бобовых культур по электрофоретическим спектрам запасных белков / Е.Г. Прудникова, К.Ю Зубарева, И.Н.Гагарина //Вклад молодых ученых в решение проблем аграрной науки : матер.межрегиональной на-уч.-практ. конф. молодых уч.- Воронеж, 2005. - С. 107-109.

18. Лабораторный практикум по биохимии растений : уч.пособ. для студ.спец.: Агрономия 310200. Агроэкология 320400 /[Н.Е Павловская, В.П. Наумкин, И.В Горькова, И.Н Гагарина, А. И. Гринблат.]-Орел, 2005. - 136с.

19. Шалимова, O.A. Иммунокоррекция устойчивости растений гороха и пшеницы с помощью лектинов растительного происхождения / О.А.Шалимова, И.Н Гагарина, Е.Г. Прудникова, Н.Е. Павловская //Агрохимия,- 2005.- №12.[В печати]

20.Гагарина, И.Н. Новый биоинсектицид на основе ингибиторов гидролаз / И.Н Гагарина, Е.Г. Прудникова, Н.Е. Павловская //Регуляция продукционного процесса сельскохозяйственных растений : матер, конф. Орловского регионального отделения общества физиологов растений РФ. - Орел, 2005. [В печати].

Выражаю искреннюю благодарность старшему научному сотруднику ГНУ ГНЦ ВНИИЗБК кандидату сельскохозяйственных наук М.П. Мирошниковой за предоставленные для исследований образцы фасоли и заведующей лабораторией защиты и фитоиммунитета растений, кандидату сельскохозяйственных наук Г.А. Борзенковой за проведенные испытания препаратов на горохе.

РНБ Русский фонд

2007-4 5667

Издательство ОрелГАУ, 2005, Орел, Бульвар Победы, 19. Заказ 12/1. Тираж 100 экз.

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Гагарина, Ирина Николаевна

Введение

1. Обзор литературы. 7 1.1 Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.)

1.2. ДНК-маркеры растений

1.3. Полипептидный состав запасных белков зернобо- 16 бовых культур

1.4. Роль лектинов в метаболизме

1.5. Белки ингибиторы ферментов

1.6. Роль белковых компонентов в биотехнологии

2. Объект и методы исследования 38 2.1. Сортообразцы фасоли

J^ 2.2. Условия выращивания

2.3. Биохимические методы исследования

Результаты исследований

3. Скрининг образцов фасоли на содержание сырого про- 45 теина, антипитательных и токсичных веществ

3.1. Содержание сырого протеина в семенах фасоли

3.2. Биоскриниг семян фасоли на гемагглютинирующую 48 активность лектинов.

3.3. Биоскрининг семян фасоли на активность ингибито- 54 ров протеиназ и а- амилаз

3.4. Содержание цианогенных гликозидов (по синильной 59 кислоте) в семенах фасоли.

3.5. Методика выделения, очистки и изучения состава 62 лектинов и ингибиторов гидролаз из семян фасоли

4. Характеристика суммарных белков фасоли

4.1. Формирование суммарного комплекса запасных бел- 68 ков семян фасоли в период созревания

4.2. Полипептидный состав суммарных запасных белков семян фасоли и электрофоретические паспорта по белковым формулам

5. ДНК - маркеры

6. Испытания белковых компонентов из семян фасоли на 77 биологическую активность

6.1. Гемагглютинирующая активность лектинов семян фа- 78 соли по отношению к четырем группам крови

6.2. Влияние лектинов и ингибиторов протеиназ на анти- 80 оксидазную активность гороха

6.3.Действие лектинов из семян фасоли на устойчивость 84 гороха к биоте

6.4.Действие ингибиторов гидролаз из семян фасоли на 92 ^ жизненную активность взрослых особей Bruchus pisorum L.

Выводы

Предложения производству

Экономическая эффективность

Введение Диссертация по биологии, на тему "Белковый комплекс семян фасоли и испытание биологической активности его компонентов"

Одной из приоритетных задач биотехнологии является обеспечение сельскохозяйственного производства дешевыми, экологически чистыми и эффективными препаратами для обработки посевного материала, гарантирующие формирование высоких и стабильных урожаев. С целью выявления дополнительного источника биологически активных веществ многие ученые мира занимаются биоскринингом растений. Фасоль является одним из таких объектов. По химическому составу семена фасоли уникальны и включены в группу важных продуктов, обеспечивающих население полноценным белком. Однако белковый комплекс фасоли содержит ряд токсичных и антиалиментарных факторов питания, блокирующих активность пищеварительных ферментов, которые, возможно, принимают участие в защитных механизмах растения. Наличие антипитательных веществ (ингибиторов гидролаз, лекти-нов и цианогенных гликозидов) с высокой активностью в семенах фасоли делает ее перспективной с точки зрения биотехнологической переработки и получения фитопрепаратов.

При увеличении удельного веса биопрепаратов по защите растений в сельскохозяйственном производстве до 35%, потери урожая от вредителей, болезней и сорняков - сократились бы до 15-20%. Грамотное комплексное применение таких препаратов позволит увеличить урожай на 10-36%, сэкономить до 60 г минерального азота на 1 га и получить в условиях экологически чистого земледелия дополнительно около 4 млн. т биопродукции (Курдюков, 1982).

Диапазон применения белковых компонентов растений достаточно широк. В проспектах ведущих химических и биотехнологических фирм мира, специализирующихся в сфере выпуска биопрепаратов, можно найти большой перечень лектинов, меченых лектинов, ингибиторов и их производных, необходимых для производства лекарственных средств, диагностикумов. Известно, что лектины используются в лабораторном деле для диагностики тех или иных наследственных заболеваний, идентификации некоторых микроорганизмов. Это уже само по себе делает высоким спрос на лектины. Кроме этого лектины в биотехнологии используются в качестве специфических реагентов, избирательно сорбирующих те или иные сложные вещества: гликопротеиды, гормоны, сиалопротеиды и т.д. Таким образом, при помощи препаратов лек-тинов можно получить ценные вещества, используемые при лечении многих тяжелых заболеваний. Перспективно создание нового поколения препаратов - своеобразных гибридов лектинов и антител для воздействия на органы и ткани. Лектины фасоли оказывают радиотерапевтическое действие, стимулируют пролиферацию лимфоидных клеток, обладают иммуностимулирующими свойствами. Ингибиторы также применяются в медицине и фармакологии. Генная инженерия широко применяет растительные ингибиторы про-теиназ для получения устойчивых к насекомым трансгенных растений (Мосолов, Валуева, 2000). Поэтому в настоящее время имеется большая потребность в новых источниках получения лектинов и ингибиторов и дальнейшей биотехнологической переработки.

Для разработки технологий получения в промышленных масштабах лектинов и ингибиторов фасоли необходимо не только выявить перспективные сорта и формы, но и установить фазу развития, их локализацию в органах растения, изучить химический состав сопутствующих веществ, рассчитать выход и дать конкретные рекомендации по методикам выделения. Решение этих проблем позволит дополнить знания в области биохимии фасоли, и будет способствовать дальнейшему повышению рентабельности сельскохозяйственного производства.

Цель исследований: охарактеризовать белковый комплекс семян фасоли и испытать его антипитательные компоненты: ингибиторы гидролаз и лектины на биологическую активность.

Задачи:

1. Провести биоскрининг сортов и форм фасоли на содержание белка, антипитательных и токсичных веществ и выявить наиболее перспективные для промышленного получения лектинов и ингибиторов гидролаз.

2. Изучить динамику накопления токсичных веществ: лектинов, ингибиторов гидролаз и цианидов по фазам развития семян у различных сортов и форм фасоли.

3. Выявить полиморфизм образцов фасоли по белковым и ДНК-маркерам.

4. Выделить и очистить ингибиторы гидролаз и лектины из семян фасоли.

5. Установить полипептидный состав ингибиторов гидролаз, лектинов и углеводную составляющую лектинов.

6. Провести испытание белковых компонентов фасоли на биологическую активность.

7. Сформулировать рекомендации по рациональному использованию лектинов и ингибиторов гидролаз фасоли.

Практическая значимость работы. Выявлены сорта и формы фасоли с высокой активностью лектинов и ингибиторов с целью использования их в качестве сырья для промышленного получения препаратов различного назначения, в том числе и диагностикумов для определения групп крови человека. Предложены модифицированные и адаптированные к изучаемой культуре биотехнологические схемы выделения лектинов и ингибиторов. Установлено положительное влияние компонентов фасоли на урожайность и устойчивость к патогенам и фитофагам гороха Pisum saatium, что является перспективным направлением в создании биопестицидов.

1. Обзор литературы

1.1. Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.)

Химический состав семян фасоли (Phaseolus vulgaris L.) изменяется в зависимости от сорта и условий возделывания. В среднем он характеризуется следующими показателями: белка 20.30 %, у некоторых сортов фасоли до 40 %, жира 1,8.2,0 %, около 60 % углеводов (табл. 1). Углеводы бобовых (главным образом крахмал) хорошо всасываются и используются организмом. (Метлицкий, 1979 , Самарина, 1976, Кольман, Рем ., 2000). Фасоль является достаточно хорошим источником тиамина 3,1.5,0 мкг/г, никотиновой кислоты, кальция и железа (Самарина, 1976, Korytnyk et. al., 1963).

Таблица 1

Средний химический состав семян фасоли (в % веса сухой массы)

Белок Крахмал Жир Клетчатка Сахара Зола

23 55 1,8 3,8 5,2 4,0

В семенах бобовых в среднем в 2-3 раза больше белков, чем в семенах злаков. В соломе и сене бобовых культур содержание белков также в несколько раз больше белков, чем в зерне злаков. Крахмала в семенах бобовых меньше, чем в злаках, Сахаров несколько больше, а количество других веществ не отличается от их содержания в семенах зерновых культур (Самарина, 1976, Жеруков и др., 2003, Devi, Kurup, 1972).

Анализ химического состава семян Phaseolus calcaratus показал, что небелковый азот составляет от 12 до 19,6 % от общего содержания азота (Chat-terjee, Abrol, 1975). Исследованиями распределения различных фосфорных соединений в семенах фасоли установлено, что они характеризуются самым низким содержанием фосфора фитиновой фракции из всех исследованных видов бобовых (Erihsson, Abrol, 1975).

Белки бобовых состоят в основном из глобулинов и альбуминов. Так, у Phaseolus calcaratus на долю глобулинов приходится 80.90 % общего азота, тогда как альбумины, проламины и глютенины составляют соответственно 10.20 %. (Chatteijee , Pohhriyal, 1978). Белки семян бобовых культур почти полностью растворяются в воде и 10 % растворе хлористого натрия, на долю белков, растворимых в 0,2 % растворе гидроксида натрия в разных образцах семян фасоли приходится лишь 1. 13 % общего содержания белков. Проламины в семенах бобовых культур, как правило, отсутствуют. Более легкая растворимость белков бобовых культур в воде и растворах нейтральных солей означает и более легкую их перевариваемость для человека и животных (Alekseeva, Kovarskay, 1979).

Установлена интересная закономерность между составом белков бобовых культур и филогенетическим возрастом вида. Показано, что физиологически более древние формы больше содержат хорошо растворимых белков -глобулинов, характеризующихся физиологически более активными молекулами, чем эволюционно более молодые формы (Элиот, Элиот, 1999). Из семян бобовых культур выделено большое число отдельных глобулинов, отличающихся по ряду свойств. Так, например, из фасоли выделили фазеолин. Глобулины имеют различный элементарный и аминокислотный состав, различаются по молекулярному весу, изоэлектрическим точкам и т. д (Ballester , et. al., 1980).

Известно, что бобовые, и в частности фасоль, содержат много белка, однако их питательная ценность определяется не только количеством белка, но и его качеством, которое, как известно, зависит от сбалансированности аминокислотного состава, содержания незаменимых аминокислот, перевари-ваемости белка и характера влияния на утилизацию белка факторов среды (Конарев , 1981). Аминокислотный состав белка бобовых исследован достаточно хорошо. Установлено, что белки бобовых лимитированы наличием серосодержащих аминокислот и триптофана, но имеют много лизина, которого сравнительно мало в зерновых культурах (табл.2). Общее содержание свободных аминокислот в семенах фасоли варьирует от 0,15 до 0,36 г (Фицев и др., 2003).

В семенах зернобобовых культур находятся и другие азотсодержащие соединения: свободные аминокислоты и их амиды, нуклеиновые кислоты, пептиды, азотистые основания, минеральный азот, но главная масса представлена незаменимыми аминокислотами. Общее содержание свободных аминокислот в семенах фасоли варьирует от 0,15 до 0,36 г и составляет 4.5 % от веса зерна, т.е. 12. 15 % общего азота.

Таблица 2

Содержание незаменимых аминокислот в семенах фасоли (Phaseolus calcaratus), г/100г (Фицев и др., 2003)

Лизин Треонин Валин Лейцин Изолейцин Метионин Триптофан Фенилаланин Аргинин Гистидин

6,7 5,0 5,1 8,0 4,1 0,9 1,6 ,0 9,2 2,8

В семенах некоторых бобовых, содержится довольно много липидов, они представлены группой гетерогенных соединений, общим свойством которых является растворимость в органических растворителях, таких как хлороформ, диэтиловый эфир, петролейный эфир или бензол. Именно это свойство отличает липиды от других компонентов семян - белков, углеводов и нуклеиновых кислот (Erihsson, Abrol, 1975).

К липидам относятся свободные жирные кислоты, моно-, ди- и тригли-цериды, фосфолипиды, стерины, эфиры стеринов и гликолипиды. Липиды семян бобовых подразделяются на несколько классов, таких как нейтральные липиды, фосфолипиды и гликолипиды. Содержание в семенах липидов каждой из этих групп различно и может варьировать в зависимости от сорта. Преобладают нейтральные липиды, однако фосфо- и гликолипиды также присутствуют в значительных количествах (Alves Moreira, Brune, Martins Batista, 1976). У зрелых бобовых растений липиды в основном накапливаются в липидных тельцах или сферосомах, а также в липидосодержащих визикулах, находящихся в семядолях (Eriksson ,1975).

Общее содержание липидов в семенах бобовых культур варьирует от 1,0 до 7,2 %, в фасоли от 1,5 до 2,3 %. Рассматривая бобовые как источник незаменимых жирных кислот, можно сказать, что липиды семян существенно различаются по составу жирных кислот, в зависимости от сорта. В семенах фасоли мунго, фасоли золотистой в качестве главных жирных кислот выступают олеиновая, линолевая, линоленовая кислоты (табл.3). В семенах лущильных сортов фасоли, лимской фасоли, фасоли обыкновенной, калифорнийской мелкой белой фасоли главными жирными кислотами являются линолевая и линоленовая (Korytnyk, Metzler, 1963, Devi, Kurup, 1972).

Таблица 3

Содержание липидов в семенах фасоли (%) (Devi, Kurup, 1972)

Виды Общее содержание липидов Основные жирные кислоты

1 .Высокорослая северная фасоль 3.0 олеиновая, линолевая

2. Фасоль обыкновенная 1.9 линолевая, линоленовая

3. Фасоль пятнистая 1,85 линолевая, линоленовая

4. Фасоль мунго 1.64 линоленовая

5. Фасоль лимская 1.41 линолевая

В семенах большинства бобовых культур главным запасным углеводом является крахмал. В зависимости от условий выращивания количество крахмала в семенах разных сортов фасоли может быть от 41 до 56%. В крахмале бобовых содержится 20.30 % амилозы и 70.80 % амилопектина (Barton, Beachay,Thompson, 1979). Кроме крахмала, в семенах бобовых содержится значительное количество Сахаров. Основным сахаром во всех видах бобовых, в том числе и фасоли, является сахароза, а моносахаридов в них мало. В составе зерна бобовых имеются и другие углеводы - клетчатка, гемицеллю-лозы, пектиновые вещества, пентозаны, которые входят в состав семенных оболочек, клеточных стенок и играют роль запасных веществ (Begdie, 1979).

Количество зольных элементов в семенах фасоли очень сильно колеблется и зависит от почвенных условий, климата и применяемых удобрений. Среднее содержание золы в семенах от 2 до 5 % (табл. 4), (Метлицкий, 1979)

Таблица 4

Количество зольных элементов в семенах (Метлицкий, 1979) в % содержания золы) р205 к2о СаО MgO so3 f203 Na 20 Si02 CI

33.6 40.0 6.1 8.8 3.0 0.5 1.5 1.0 0.8

В зерне бобовых культур много витаминов. Особенно значительно содержание витаминов Bi и В2. Кроме того, в семенах найдены также витамины РР, А, Е, К, D и С (табл.5). Витамины распределены в семенах неравномерно. Витаминов группы. В больше всего в оболочках семян, а жирорастворимых витаминов A, D и Е - в зародышах (Гудвин, Мерсер, 1986).

Таблица 5

Количество витаминов в семенах фасоли (Гудвин, Мерсер, 1986) в мг на 100 г)

Витамин Bj Витамин B2 Витамин PP Витамин E Каротин

0,4 0,1 4,0 -

Вместе с тем семена фасоли могут оказывать токсическое действие на организм человека и животных из-за присутствия в них гликозидов, содержащих синильную кислоту. При выращивании лимской фасоли в тропических районах количество синильной кислоты может быть настолько высоким, что вызывает смертельные отравления при использовании семян в пищу (Донченко, Надыкта, 2001).

Многие виды растений способны синтезировать широкие спектры химических соединений, оказывающих вредное воздействие на организм при использовании их в пищу или на корм скоту. К ним можно отнести лектины, ингибиторы протеиназ и амилаз, цианогенные гликозиды и др (Кнорре, Мы-зина, 1998).

Фасоль является культурой с высокой активностью лектинов. Молекулярная масса лектинов 100 ООО. .150 ООО, они состоят из четырех субъединиц, в каждой субъединице имеется участок, связывающий сахара. Именно это свойство мультивалентности, связанное со способностью лектинов вызывать агглютинацию клеток и осаждать гликопротеиды, утрачивается при диссоциации молекул лектинов на субъединицы. Содержание лектинов в семенах фасоли достаточно велико и составляет 2. 10 % от общего белка (Павловская и др., 2003). Содержание ингибиторов в семенах бобовых растений достигает до 5-10 % растворимых белков. Содержание цианидов в семенах фасоли обыкновенной (Phaseolus vulgaris L.) составляет 2,0 мг/100г (Долго-полова, 1991, Кольман, Рем , 2000).

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Гагарина, Ирина Николаевна

Выводы

1. Проведен скрининг 24 образцов фасоли на содержание суммарных запасных белков и антипитательных веществ семян. Содержание белка по сортам колеблется от 22,1 до 29,9% . Активность ТИА - от 6,58 до 11,39 мг/г, ХИА - от 3,75 до 7,02 мг/г, ГА лектинов от 17,03 до 58,8 [мг/мл]"1, цианоген-ных гликозидов - от 0,5 до 3,33 мг/100г. Наибольшее содержание белка отмечено у сортов: Оран, Шоколадница, J1 179, К 15077, К 15196, а антипитательных компонентов - у сортов: Оран, Ока, Шоколадница. Содержание циано-генных гликозидов в изученных образцах фасоли находится в пределах ПДК (0,5.0,33 мг/100г).

2. Установлен полипептидный состав суммарных запасных белков семян фасоли, состоящий из 25.30 компонентов, и зависящий от генотипа. Белки семян линий состоят из одного биотипа, а сорта и коллекционные образцы из двух - трех. Определяющим по всем образцам является первый биотип, на долю которого приходится наибольший процент встречаемости. Составлены белковые паспорта 15 сортов фасоли, которые могут быть включены в компьютерную базу данных по биологическому разнообразию флоры и фауны планеты.

3. Ранние фазы формирования семян всех образцов фасоли отличаются единообразием ЭФ-спектров белков, что указывает на эволюционное единство происхождения. В поздние сроки созревания проявляется сортоспецифич-ность и дивергенция признака, что делает возможным идентификацию генотипов фасоли по полипептидному составу семян.

6. Методом электрофореза установлено, что ингибиторы протеиназ состоят их 14, амилаз - 18, лектины из 11 полипептидов. Хроматографическое

разделение углеводов лектинов выявило наличие в их составе: мальтозы, глюкозамина, галактозы, арабинозы, фруктозы, глюкурона и рамнозы.

7. Испытания лектинов на биологическую активность показало, что гемагглютинирующая активность по второй группе крови самая высокая (33,03.58,8 [мг/мл]"1), по третьей (21.21.38,00 [мг/мл]"1) , по четвертой (21,22.32,79 [мг/мл]"1), а по первой самая низкая (17,04.27,62 [мг/мл]"1). Сорт фасоли Шоколадница можно использовать в качестве диагностикума для выявления групп крови и при разработке диетического питания.

8. Лектины и ингибиторы гидролаз фасоли повышают пероксидазную активность, устойчивость растений к патогенам и фитофагам, увеличивают урожайность гороха (на 8.23%).

Предложения производству

2.Сорта фасоли Оран, Ока, Шоколадница, Нерусса рекомендуется использовать в качестве сырья для получения ингибиторов гидролаз и лектинов, необходимых для производства медицинских диагностикумов, лекарственных препаратов и биопестицидов.

Экономическая эффективность использования комплексных фитопрепаратов на основе лектинов и ингибиторов гидролаз из фасоли

Загрязнение культурных растений, применяемых в сельском хозяйстве, веществами различной химической природы напрямую зависит от состояния окружающей среды. Неконтролируемое применение средств защиты растений наносит ощутимый, реальный вред здоровью человека и грозит перерасти в экологическую катастрофу. Споры специалистов о снижении применения или же полном запрете пестицидов, сводятся к мысли о замене их на безопасные экологически чистые фитопрепараты.

Предварительные подсчеты показали, что стоимость подобного средства защиты не превышает 500 рублей за грамм. Например, для однократной обработки 1 га посевов гороха необходимо 300 литров раствора фитопрепарата с концентрацией 10"7%. В данном объеме содержится 0, 03 г действующего вещества, его стоимость составляет 15 рублей из расчета рыночной стоимости 1 кг фасоли и соответствующего выхода биологически активных компонентов. Это значительно ниже стоимости используемых в сельском хозяйстве химических пестицидов (затраты на которые составляют 300 рублей).

Для максимального повышения эффективности и применения биопрепаратов и увеличения устойчивости к биоте необходимо проводить предпосевную обработку семян и двукратное опрыскивание растений в течение вегетации. Учитывая низкую концентрацию действия лектинов и ингибиторов гидролаз из фасоли, стоимость препаратов для комплексной обработки может составить около 40 рублей (10 для предпосевной обработки и 30 на опрыскивание).

Прибыль от внедрения подобных разработок в сельскохозяйственное производство может составить 260 рублей на гектар посевов бобовых культур.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата сельскохозяйственных наук, Гагарина, Ирина Николаевна, Орел

1. Авальбаев, A.M. Множественная и гормональная регуляция содержания лектина в корнях проростков пшеницы / А.М.Авальбаев, М.В.Безрукова, Ф.М.Шакирова //Физиология растений.- 2001 -Т. 48, № 5.-С.118-122.

2. Активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в семенах гороха / И.И.Бенкен, О.И.Романова, А.В.Варич, М.А.Никишина // ВАСХНИИЛ: Научно технический бюллетень. Вып. 193- Л 1989. - С.37-43.

3. Алексидзе, Г.Я. Модель организации на мембране тилактоидов цикла Кальвина с участием лектина фотосистемы / Г.Я. Алексидзе, А.И.Литвинов, В.И.Выскребенцева // Физиология растений 2002 - Т. 49, № 1. -С. 148-154.

4. Алешин, В.Н. Лектины: свойства, сфера применения и перспективы исследования / В.Н.Алешин, В.Т.Лобанов, А.Д.Минакова // Изв. вузов. Пищ. технология. 2005- № 1. - С.5-7.

5. Анализ и регистрация линий, сортов и гибридов кукурузы по зеину методом электрофореза: методические указания и каталог белковых формул / под. ред. В.Г. Конарева. СПб.: ВИР. - 1998.-49 с.

6. Антонюк, Л.П. О роли агглютинина зародышей пшеницы в растительно-бактериальном взаимодействии: гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку / Л.П.Антонюк, В.В.Игнатов // Физиология растений. -2001. Т. 48, № 3. - С.427-433.

7. Антонюк, Л.П. Экзогенная функция лектина пшеницы (АЗП) / Л.П.Антонюк, В.В.Игнатов // Гипотеза и экспериментальные данные в ее поддержку: тез. докл. на VI съезде общества физиол. раст., Москва,4-9 окт-Т.18, № 5 С.435-441.

8. Белки как генетические маркеры в решении проблем прикладной ботаники, генетики и селекции / В.П.Конарев, И.П.Гаврилюк, Н.К.Гутарева, Т.И.Пенева // Вестник сельскохозяйственной науки. 1986. - № 12. - С.363.

9. Белковые маркеры признаков растений в селекции яровой пшеницы на зерновую продуктивность и качество / Е.В.Березовская, В.А.Труфанов, Т.Н.Митрофанова, Л.С.Козмирук // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. - Т. 41, № 1. - С.121-126.

10. Белковый комплекс зернобобовых культур и пути повышения его качества / Н.Е.Павловская и др. Орел: ОГАУ, 2003. - 216 с.

11. П.Бенкен, И.И. Активность ингибиторов трипсина и химотрипсина в семенах гороха / И.И.Бенкен, В.В.Мосолов, И.В.Федуркина // Микология и фитопатология.-1976 Т. 10, №3. - С. 198-201.

12. Бенкен, И.И. Антипитательные вещества белковой природы в семенах сои / И.И.Бенкен, Т.Б.Томилина // Бюллетень ВИР 1989 - Т. 149. - С.З-10.

13. Биологический азот как источник белка / Б.Х.Жуков, К.Г.Магомедов, И.Б.Бербекова, З.М.Карданова // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук 2003 - № 2. - С.51-55.

14. Борисова, Н.Н. Субмитохондриальное распределение лектиновой активности в осевых органах проростков кормовых бобов разного возраста / Н.Н.Борисова, Э.И.Выскребенцева // Физиология растений. 1997. - Т.44, № 3. - С.317-331.

15. Вайнтрауб, И.А. Об аминокислотном составе глобулиновых компонентов семян бобовых / И.А. Вайнтрауб, B.C. Шварц // Труды Кишиневского ун-та по химии природных соединений. Кишинев- 1969. - Вып.8-С.52-57.

16. Валуева Т.А., Григорьева Л.И., Потапенко Н.А., Мосолов В.В.// Прикл. биохимия и микробиология. 1989. - Т. 25, №4. - С.477-484. Ингибиторы протеиназ и их роль в защите от патогенной микрофлоры.

17. Валуева, Т.А. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений / Т.А.Валуева, В.В.Мосолов // Успехи биологической химии / Институт биохимии имени Баха РАН. 2002. - Т.42 - С. 193 - 216.

18. Валуева, Т.А. Роль ингибиторов протеолитических ферментов в защите растений от патогенных организмов / Т.А.Валуева, В.В.Мосолов // Биохимия.- 2004.- Т.69, вып. 11.- С.1600-1606.

19. Влияние салициловой кислоты на активность пероксидазы в совместных культурах каллусов пшеницы с возбудителем твердой головни Tilletia caries / И.В.Максимов, Е.А.Черепанова, О.Б.Сурина, А.Р.Сахабутдинова //Физиология растений.-2004.-Т.51, № 4 С.543-540.

20. Вовчук, С.В. Онтогенетические особенности протеолиза белков злаковых культур / С.В.Вовчук, В.Г.Адамовская, А.Е.Вольчевская // Второй съезд Всесоюзн. Общества физиологов, 24-29 сентября, 1990. : тез. докл.— М., 1992.-С.42.

21. Володин, В.И. Биохимические аспекты управления белковым комплексом / В.И.Володин // Биохимия в решении проблем сельскохозяйственного производства: тез. докл. биохим. конференции. Орел. - 1981. - С.28.

22. Володин, В.И. Гетерогенность альбуминовых и глобулиновых фракций белков зернобобовых культур / В.И.Володин, О.И.Гуринович // Растительные белки и их биосинтез. -М.: Наука. 1975. - С.122-126.

23. Володин, В.И. Электрофорез и иммунохимия в анализе селекционного материала зерновых и бобовых культур / В.И.Володин // Эффективность научных исследований по генетике и селекции зернобобовых культур. -Орел. 1978.-С.23-27.

24. Выделение лектинов и их возможных рецепторов из корнеплода сахарной свеклы / Г.Я.Алексидзе, Н.П.Королев, И.Л.Семенов, Э.И. Выскре-бенцева // Физиология растений. 1983. - Т. 30, вып. 6. - С. 1069-1076.

25. Гайденкова, Н.В. Идентификация и регистрация пшениц Крымок по спектрам глиадина / Н.В.Гайденкова // Бюллетень ВИР. Вып. 165 JL: ВИР, 1986.-С.7-9.

26. Гаврилюк, И.П., Сатабалдина С.Т. Белки семян бобовых, их состав и специфичность (по данным иммуноферментного анализа) / И.П.Гаврилюк, С.Т.Сатабалдина // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. -Т. 52, вып. 1. С.107-134.

27. Голынская, Е.А. Белковый комплекс зернобобовых культур / Е.А.Голынская, Н.В.Башкиров, Н.Н.Томчук// Физиология растений 1976-Т.23, вып. 1. - С.88-97.

28. Гоник, Е.Д. Влияние этиленимина на иммунохимические свойства семян гороха / Е.Д.Гоник, С.Н.Агаркова, В.И.Володин // Научные труды ВНИИЗБК. Т.4.- Орел, 1976,- С.39-48.

29. Гостимский, С.А. Изучение организации и изменчивости генома растений с помощью молекулярных маркеров / С.А.Гостимский, З.Г.Кокаева, Ф.А.Коновалов // Генетика. 2005. - Т. 41. - № 4. - С.480-492.

30. ЗКГудвин, Т. Введение в биохимию растений / Т.Гудвин, Э.Мерсер; пер. с англ. А.О. Гонаго. -М.: Мир. 1986. - Т. 1. - 393 с.

31. Гуринович, О.И. Фитогемогглютинины семян зернобобовых культур / О.И.Гуринович // Биохимия в решении проблем с.-х. производства: тез. докл. Биохим. конференции, Орел. 1991. - С.26-28.

32. Гуринович, О.И. Электрофоретический состав и иммунохимическая характеристика белков семян зерновых и бобовых культур / О.И.Гуринович, С.А.Гоник, В.И.Володин //Научные труды ВНИИЗБК.Т.4. Орел, 1976.-С.78-94.

33. ДНК маркеры в селекции картофеля / В.А.Бирюкова и др. // Достижения науки и техники АПК - 2003. - № 10 - С.38-41.

34. Донченко, JI.B. Безопасность пищевой продукции / Л.В.Донченко, В.Д.Надыкта М.: Пищепромиздат - 2001 - 528 с.

35. Доспехов, Б.Ф. Методика полевого опыта / Б.Ф.Доспехов- М.: Агро-промиздат, 1995. 352с.

36. Дука, М.В. Поиск белковых маркеров для генетической системы ЦМС-Rf подсолнечника / М.В.Дука, Ю.В.Поликарпова // Физиология растений. 2004. - Т. 51- № 5. - С.698-701.

37. Зайцев, B.C. ДНК-маркеры гена устойчивости к раку картофеля / В.С.Зайцев, Э.Е.Хавкин // Актуальные проблемы генетики М., 2003 - Т. 2 - С.127-128.

38. Идентификация и локализация гена chill 5 и сцепленных с ним ДНК-маркеров у гороха посевного (Pisum Sativum L.) / К.Чегамирза, О.В.Ковеза, Ф.А.Коновалов, С.А.Гостимский // Генетика.-2004.-Т.40, № 7. С.909-915.

39. Идентификация хромосом генома гороха (Pisum Sativum L.) / Т.Е.Саматадзе, О.В.Муравенко, А.В.Зеленкин, С.А.Гостимский // Доклады АН РАН. 2002. - Т. 387, № 5. - С.714-717.

40. Изоэлектрические спектры белковых ингибиторов протеиназ из клубней различных сортов картофеля / В.И.Ромашин и др. // Доклады ВАСХ-НИИЛ.- 1988.-№9.-С.12-15.

41. Использование маркеров на основе ДНК для идентификации генотипов картофеля / Д.Б. Дорохов, Т.П.Супрунова, А.М.Сентова, А.Форте // Аграрная Россия. 2003. - № 3. - С.31 -32.

42. Карнаухова, Т.В. Фитосанитарное и физиологическое состояние растений пшеницы при использовании защитных средств различной природы / Т.В.Карнаухова, В.А.Шкаликова // Известия ТСХА.-2004. Вып.З. - С. 1785.

43. Кириченко, Е.В. Влияние лектина из семян сои на продуктивность сои / Е.В.Кириченко и др. // Агрохимия. 2004. -№11.- С.58-62.

44. Кириченко, Е.В. Влияние лектинов бобовых растений на проявление симбиотических свойств клубеньковыми бактериями в бобово- ■ ризоблальном симбиозе / Е.В.Кириченко, С.М.Малинченко // Физиология растений. 2000. - Т.47. - № 2. - С.221-225.

45. Клименко, В.Г. Белки семян бобовых растений / В.Г.Клименко // Растительные белки и их биосинтез. М.: Наука, 1975. - С.97-115.

46. Кнорре, А.Г. Биологическая химия / А.Г.Кнорре, С.Д.Мызина. 2-е изд., перераб. и доп. - М.: Высшая школа. - 1998.- 479 с.

47. Ковеза, О.В. Наследования ДНК-маркеров у гороха (Pisum Sativum Ь.)/О.В.Ковеза, З.Г.Кокаева // Аграрная Россия. 2000. - № 3. - С.4-11.

48. Кокаева, З.Т.Создание SCAR-маркера у гороха (Pisum Sativum L.) на основании RAPD анализа / З.Т.Кокаева, С.А.Гостимский, Т.В.Петрова // Генетика. - 2001. - Т. 37, № 4. - С.574-576.

49. Кольман, Я. Наглядная биохимия / Я.Кольман, К.- Г.Рем; пер. с нем. Л.В. Козлова. М.: Мир, 2000. - 470 с.

50. Комарова, Э.П. Лектины стеблей апексов рудбекии и периллы в процессе перехода к цветению под воздействием фотопериодической индукции / Э.П.Комарова // Прикладная биохимия и микробиология. 1998. - Т.34, № 1. - С.108-114.

51. Компонентный состав альбуминов семян гороха и фасоли при индуцированном мутагенезе / В.И.Володин, О.И.Гуринович, А.П.Костромичева, С.Н.Агаркова // Бюллетень научно-технической информации ВНИИЗБК. -Орел, 1978. № 21. - С.3-21.

52. Конарев, А.В. Адаптивный характер молекулярного полиморфизма и его использование в решении проблем генетических ресурсов растений и селекции / А.В.Конарев // Аграрная Россия. 2002. - № 3. - С.4-11.

53. Конарев, А.В. Белки семян как маркеры / А.В.Конарев // Вестник семеноводства в СНГ. 2000. - № 2. - С.24-25.

54. Конарев, А.В. Ингибиторы ферментов как генетические маркеры / А.В.Конарев // Аграрная Россия. 2002. - № 3. - С.44-51.

55. Конарев, А.В. Использование молекулярных маркеров в работе с генетическими ресурсами растений / А.В.Конарев // Сельскохозяйственная биология. 1998. - № 5, с.36-42.

56. Конарев, А.В. Перекрестный анализ взаимодействия компонентов а-амилаз и протеиназ насекомых с белковыми ингибиторами из эндоспермапшеницы / А.В.Конарев, Ю.В.Фомичева// Биохимия. 1991.-Т. 56, вып. 4-С.628-638.

57. Конарев, В.Г. Белки пшеницы / В.Г.Конарев.-М.: Колос, 1980.-350 с.

58. Конарев, В.Г. Ресурсы растительного белка и проблемы его качества / В.Г.Конарев // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. -1981. Т. 70, вып. 2. - С. 71-84.

59. Косенко, Л.В. Сортовые различия углеводсвязывающих свойств лектинов из семян Vicia Jabe / Л.В.Косенко // Физиология растений. 2002 - Т. 49, № 6. - С.859-864.

60. Косенко, Л.В. Сравнительная характеристика углеводсвязывающих свойств лектинов из семян бобовых растений / Л.В.Косенко //Физиология растений. 2002. - Т. 49, № 5. - С.718-724.

61. Костромичева, А.П. Ингибиторы протеиназ семян бобовых растений, их выделения и некоторые свойства / А.П.Костромичева // Бюллетень института информации ВНИИЗБК. Орел, 1978 - №5- С.53-57.

62. Кудрявцев, A.M. Генетика глиадина яровой твердой пшеницы (Tritl-cum Durum Desf) / А.М.Кудрявцева // Генетика. 1994. - Т. 30, № 1. - С.77-84.

63. Курдюков, В.В. Последствия пестицидов на растительные и животные организмы / В.В.Курдюсов М.: Колос, 1982. - 268 с.

64. Лепехин, Е.А. Распределение и активность лектинов в субклеточных корней проростков кукурузы / Е.А.Лепехин // Физиология растений. -1987. Т.34, вып. 1. - С.134-160.

65. Луцик, М.Д. Лектины / М.Д.Луцик, Е.Н.Панасюк, А.Д. Луцик-Львов: Вища школа, 1981. 152 с.

66. Марков, Е.Ю. Лектины растений: предполагаемые функции / Е.Ю. Марков, Э.У.Хавкин // Физиология растений.-1983.-Т.30, вып.5.-С.852-867.

67. Мельникова, И.О. Методы экстракции ингибиторов трипсина и химотрипсина из семян гороха / И.О.Мельникова // Сборник научных трудов ВСГИ. М.,1982. - С. 70-71.

68. Метлицкий, Л.В. Биохимия плодов и овощей / Л.В.Метлицкий. М.: Экономика, 1979. - 271с.

69. Методы биохимического исследования растений / А.И.Ермаков и др.. 3-е изд., перераб. и доп. - Л.: Агропромиздат, 1987. - 430с.

70. Механизмы регуляции накопления лектина в проростках пшеницы при засолении / Ф.М.Шакирова, М.В.Безрукова, А.М.Авальбаева, Р.А.Фатхутдинова// Физиология растений. 2003. - Т. 50, № 3 - С.341-345.

71. Миленина, Н.И. Применение ингибитора протеиназ при хранении японского анчоуса и производства пресервов из него / Н.И. Миленина, Н.Г.Андреев // Рыбное хозяйство 2005. - № 1. - С.66-67.

72. Митранов, Л. Полски фасул. сорт Астор / Л.Митранов // Земледелие.- 1986. Т. 84, № 3. - С.55-56.

73. Молекулярно-биохимические аспекты прикладной ботаники, генетики и селекции / под. ред. В.П.Конарева М.: Колос, 1993. - С.45-63.

74. Молекулярно-генетический анализ разнообразия мягкой пшеницы / П.П.Стрельченко и др. // II съезд Вавилов, о-ва генетиков и селекционеров: тез. докл. СПб., 2000. - Т. 1. - С.128.

75. Москвич, И.А. Защитная роль ингибиторов протеаз из семян подсолнечника современных сортов / И.А.Москвич // Известия вузов: Пищевая технология. 2003. - № 2-3. - С.105-106.

76. Мосолов, В.В. Выделение ингибиторов из семян бобовых /

77. B.В.Мосолов, Т.А.Валуева, Т.В.Колосова // Биохимия. 1982- Т. 47, № 12.1. C.2015-2021.

78. Мосолов, В.В. Ингибиторы протеолетических ферментов / В.В.Мосолов, Е.Л.Малова, А.Н.Чебан А.Н. // Биохимия. 1983. - Т.48, № 10.- С.1680-1686.

79. Мосолов, В.В. Ингибиторы протеиназ и их функции у растений: обзор / В.В.Мосолов, Т.А.Валуева // Прикладная биохимия и микробиология. — 2005. Т.41, № 3. - С.261-282.

80. Мосолов, В.В. Растительные белковые ингибиторы протеолитических ферментов / В.В.Мосолов, Т.А.Валуева. М.: ВИНИТИ, 1993. - 207 с.

81. Мосолов, В.В. Участие протеолитических ферментов и их ингибиторов в защите растений: обзор / В.В.Мосолов, Л.И.Григорьева, Т.А.Валуева // Прикладная биохимия и микробиология. 2001 - Т.37, №2. - С. 131-140.

82. Оценка генетического разнообразия проса обыкновенного (Panicum miliacenum L.) на основе использования ДНК-маркеров / О.А.Введенская, Д.А. Ваухан, А.Ф.Курцева, К.Дой // Сельскохозяйственная биология. Сер. Биология растений 2002 - № 5. - С.56-64.

83. Перуанский, Ю.В. Множественность глиадиновых биотипов у сортов пшеницы / Ю.В.Перуанский, А.И.Абугалиева // Селекция и семеноводство. 1985. -№3.- С. 23-24.

84. Получение устойчивых к насекомым трансгенных растений с использованием генов растительных ингибиторов протеаз Вична, батат, картофель, томат, соя, рис. / Я.Е.Дунаевский, Л.П.Элпидина, К.С.Винокуров, М.А.Белозерский // Агро XII. 2002. - № 1. - С.16-17.

85. Постижения, проблеми и перспективи в селекционно-подобрительна работа при полски фасул / Д.Тенчев и др.. // Селскостол. наука. 1983.-Т. 21, №3.-С. 121-124.

86. Развитие модели генетической организации сложных признаков у культурных растений / А.А.Созинов, А.А.Коргинский, В.В.Моргун, П.П.Литун // Виц. аграрной науки. 1992. - Т. 6. - С.41-43.

87. Растительный белок / пер. с франц. В.Г. Долгополова. М.: Агро-промиздат, 1991. - 684 с.

88. Савельев, Н.И. Применение ДНК-маркеров для оценки генетического полиморфизма яблони / Н.И.Савельев, Д.Б.Дорохов; Рос. акад. с.-х. наук. -Мичуринск Наукоград. - Изд-во ГНУ ВНИИГ и СПР им. И.В. Мичурина, 2004. - 111 с.

89. Самарина, И. Биохимическая характеристика овощных сортов фасоли / И.Самарина // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. -1976.-Т. 65. С.114-118.

90. Соболев, В.В. Использование метода полимеразной цепной реакции для генетического маркирования ремонтантной малины: автореферат на соискание ученой степени кандидата биологических наук / В.В.Соболев. М., 2004.- 15 с.

91. Созинов, А.А. Генетические маркеры у растений / А.А.Созинов // Цитология и генетика. 1993. - Т. 27, № 5. - С. 15-23.

92. Стрельченко, П.П. Молекулярные маркеры в изучении генофонда растений / П.П.Стрельченко, Л.А.Малышев // Генетические ресурсы культурных растений: международная науч.-практ.конф.: тез. докл. СПб., 2001. - С.169-171.

93. Сулимова, Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения / Г.Е.Сулимова // Успехи современной биологии. 2004. - Т. 124, № 3. - С.260-271.

94. Тарлаковская, A.M. Идентификация сортов гороха по электрофоре-тическим спектрам глобулинов / А.М.Тарлаковская // Труды по прикладной ботанике, генетике и селекции. 1987. - Т. 114. - С. 100-106.

95. Титов, У.В. Распределение лектинов по тканям винограда / У.В.Титов, О.С.Соколова, А.Д.Володарский // Физиология растений. Т.39, вып.1.- 1992.-С.40-47.

96. Фабер, С.П. 12 S-Глобулины семян в идентификации сортов капусты / С.П.Фабер // Доклады Россельхозакадемии. 1994 - № 5- С.8-10.

97. Фицев, А.И. Качество протеина и содержание анатипитательных веществ в зерне различных сортов вики яровой / А.И.Фицев, Ф.В.Воронкова, Л.М.Коровина // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. 2003. - № 1. - С. 18-20.

98. Функционирование системы протеолиза в бобовых растениях / В.И.Домаш, О.В.Буснюк, А.В.Ермолицкая, С.А.Забрейко // 4-й съезд общества физиологов растений России, М., 4-9 октября, 1999 : тезисы доклада. -М., 1999.-с. 42.

99. Хавкин, Э.Е. Молекулярная селекция растений: ДНК-технологии создания новых сортов сельскохозяйственных культур / Э.Е.Хавкин // Сельскохозяйственная биология. 2003. - № 3. - С.28-41.

100. Хавкин, Э.Е. Молекулярные маркеры в растениеводстве / Э.Е.Хавкин // Сельскохозяйственная биология. 1997. - № 5. - С.3-21.

101. Щербань, А.Б. Анализ ДНК-маркера, специфичного для G-генома пшеницы / А.Б.Щербань, Е.К.Хлесткина, Е.А.Салина // Генетика. 2004. -Т. 40, № 3. - С.372-379.

102. Элиот, В. Биохимия и молекулярная биология / В.Элиот, Д. Элиот; под ред. А.И. Агаркова; пер. с англ. О.В. Добрыниной М.: Изд-во НИИ биомедицинской химии РАМН, 2000. - 372 с.

103. Эндогенные ингибиторы протеиназ фитопатогенная инфекция у различных генотипов растений / Т.А.Домаш, Л.В.Ермолицкая, Т.П.Шарпио, В.И.Нитиевская // Защита растений проблемы и перспективы. - Гродно, 2002.-С. 23-25.

104. Ямалеева, А.А. Лектины растений и их биологическая роль / А.А.Ямалеева Уфа: БашГУ, 2001.-137 с.

105. Alekseeva, M.V. Proteins of aileron grains from the axial part and cotyledons of pea and soybean seed: A comparative study.Sov. / M.V Alekseeva, N.V Kovarskaya // Plant Physiol. 1979. - V.25. - P.365-370.

106. Alves, Moreira M. Evaluation of methionine contents of beans (Phaseo-lus Vulgaris L.) / Alves Moreira M., W. Brune, Batista C. Martins // Turrialbe-1976.- V26 P.225-231.

107. Ballester, D. Chemical composition, nutritive value and toxicological evaluation of 2 species of sweet lupine J. Agric./ D.Ballester, E.Yanes, R.Garcia // Food Chem. 1980. - V 28. - P.402-405.

108. Barton, K.A. Identification of polypeptides synthesized in vitro from soybean messenger RNA / K.A.Barton, R.N.Beachy, J.F.Thompson // Plant Physiol: Annual Meeting: American Societyof Plant Physiology. Ohio State University. Columbus, Ohio. 1979. -V5.

109. Begdie, R. A non-agueous method of he subcellular fractionatuon of cotyledons from dormant seeds of Phaseolus vulgaris L./ R. Begbie // Planta. -1979. V.147. — P. 103-110.

110. Belit, H.-D. Lebensmittel Wissenschaft Technologie / H.-D.Belit, A.Fuchs, L.Grimm// Planta. 1971.- V. 4, № 3. - P.899.

111. Biodiversity of mannose-specific lectins within Narcissus Species / S. Lopes, C.Codina, J.Bastida, F.Viladomal // J. agr. Food Chem. 2002. -Vol. 50, № 9. - P.2507-2513.

112. Bowles, D.J. Distribution of lectins in membranes of soybean in root, shood and leaftissues at differetnt stades of growth / D.J. Bowles, H.Lis, H.Shron // Planta. 1997. - V. 145, № 2. - P.l93.

113. Brewin, N.J. Legume Lectins and Nodulation by Phizobium / N.J.Brewin, I.V.Kardailsky // Trends Plant Sci. 1997. - V.2. - P.92-98.

114. Bushur, W. Whear cultivar identificatuon by gliadin electrophoregrams. I. Apparatus, method and nomenclature Can. J. / W. Bushuk, R.Zillman // Plant Sci. 1978. - V.58. - P. 505-515.

115. Casnineirfs, L. The origin of Phaseolus vulgares L. in Cuba. Phaseolin patterns and their relationship with morphoagronomical traits / L.Casnineirts, Nasser N Peres, D.Pinero // Pleant Genet. Resources New Sletler Rome. 1969. -№ 99. - P.25-28.

116. Chatterjee, S.B. Amino acid composition of new varieties of cereals and pulses and nutritional potentional of cereal pulse combinations /S.B Chatteriee, J.P.Abrol //J. Fd. Sci. Fech. 1975. - V.12. - P.221-227.

117. Chateerjee, S.R. Changes in the content of protein and amino acids in developing pea seeds / S.R.Chateeriee, T.C.Pohhriyal, Y.P.Abrol // Plant Bio-chim. 1978. - V.5.- P.69-76.

118. Chatterjee, S.B. Protein content and amino acid composition of developing seeds of Bengal gram (Cicer arietinum L.) / S.B. Chatterjee, J.P.Abrol // Plant Biochem. 1997. - V.4. - P.62-71.

119. Childress, C.C. Oxidative and phoshorylative activites of mitochondria isolate from pea root tissues / C.C.Childress, H.J.Steen // Plant Physiol. 1965. -V.40, № 3. - P.752-756.

120. Cooke, R.J. The characteristics of Pisum sativum (L) cultivars by sodium dodecul sulphate polyacriylamide del electrophoresis / R.J Cooke // S. Nath. Jnst. Agrie. Bot.- 1983.-V. 16. P.213-220.

121. Czapaski Janust, Kossan Ruszard. Electrophoretic patters of reseve seed proteins with reference to the taxonomic comparison of bian cultivarce / Janust Czapski Janust, Ruszard Kossan // Acta agrobot. 1986. - 39, № 2. - P.201-206.

122. Devi, K.C. Hypolipidaemic activity of Phaseolus mungo L. (blach gram) in rats fed a high fat - higt / K.C.Devi, P.A Kurup // Cholesterol diet Atherosclerosis. - 1972. - V.15. - P.223-230.

123. Erihsson, C.E. Aroma compounds derived from oxidized lipids. Some biochemical and analitical aspects / C.E.Erihsson // Agr. Cood Chem. 1975-V.23 - P.126-128.

124. Garcia-Olmedo F. Et al / F.Garcia-Olmedo, G.Salcedo, R.Sanchez-Monde // Oxf. Surv. Plant Mot. Cell. Biol. 1987. - V. 4. - 275-334.

125. Gerts, P. Phaseolin-protein variability in wild forms and landraces of the common bian (Phaseolus vulgaris): evidence for multiple centers of domestication / P.Gerts, T.C.Osborn, K.Rashka // Econ.Bot. 1986. - V.40, № 4.- P.451-468.

126. Gepts, P. Dissemination pathways of common bean (Phaseolus vulgaris, Fabaceal) deduced from Phaseolin electrophoretic variability. 1. The Americas / P.Gepts, K.Kmiecik, P.Pereirc // Econ. Bot. 1988. - V. 42, № 1. - P.73-85.

127. Hussain, A. Electrophoretic analysis of field pea cultivars / A.Hussain, S.T.Ali-Kham, W.Bushuk // Pisum Newsletter Geruva. № 1. - 1998. - V. 20. -P.16-19.

128. Kaemmer, D. Oligonucleotide fingerprinting of tomato DNA / D.Kaemmer, K.Weising, B.Beyermann // Plant Breed, 1995.-V.114, № 1. P.12-17.

129. Kahl, G. The potential of gene technology and genome for cool season food legume crops / G.Kahl, D.Kaemmer, K.Weising // Theory and practice Euphytica.-l 994.- V.73, № 2. P. 177-189.

130. Kass, H. Some properties of carbohydrate bilding protein (lectins) solu-bilizied from cell wall of Phaseolis aureus / H.Kass, D.L.Bowles // Planta. 1996. - V.130, №.2. - P. 169-214.

131. Kent, N.J. Structural and nutritional properties of cereal proteins / N.J. Kent // Proteins as Human Food. ed. Laurie. 1970. - Avi. Pull. Cjmp., Inc., Westport. Connec. - P.280-297.

132. Kijum J.W., Schaal V.D.J., De Vries Gr. Pea lectins and the recognition of Rhizobium leguminosarum / J.W.Kijum, V.D.J.Schaal, De Vries Gr // Pleant Sci Lett. 1982. - 18. - № 1. - P.65-74.

133. Kilpatriec, D.C. Tissue and subullular distribution of the lectins from Datura stamonium (thorn apple) / D.C.Kilpatrie, M.M.Nomen, A.B.Gould // Bio-chem. J. 1979. - V.184, № 2. -P.215.

134. Kollipara, K.P. Characterization of trypsin and chymotrypsin ingybitors in the wild perennial Glycine species / K.P.Kollipara, T. Hymowitz // J. Ayric. Food. Chem. 1992. - V. 40. - P.2356-2363.

135. Konarev, A.V. Interaction of insect digestive enzymes with plant protein inhibitors and host parasite convolution / A.V.Konarev // Euphytica. - 1979. -V.92- P.89-94.

136. Konarev, V.G. Seed proteins in genom analisis, cultivar identification and documentation of cereal genetic resources: A Review / V.G.Konarev, I.P.Gavriljuk, N.K.Gubareva // Cereal Chem. 1979.- V.56 - №4. - P.272-278.

137. Korytnyk, W. Composition of lipids of lima beans and curtain other beans / W.Kotytnyk, E.A.Metzler // J. Sci. Tood Agr.- 1972.-V 14.-P.841-844.

138. Kummer, H. Characterization of a lectinbilding storage protein from pea (Pisum Sativum) / H.Kummer, H.Rudiger // Biol. Chem. Hoppe. Seyler. - 1998. - 369. - № 8. - P.639-646.

139. Lakowski, M.Jr. Whear cultivar identificatuon by gliadin electrophore-grams. I. Apparatus, method and nomenclature Can. J/ M.Jr.Lakowski, I.Kato //Annual. Rev. Blockem. 1980. - V. 49. - P.593-626.

140. Lioi, L. Electrophoretic variation and geographical distribution of the seed protein phytoremagglytinin in cultivated Fhaseolus vulgaries / L.Liol // J. Gened Breen. 1991. - V.45, № 2. - P.97-102.

141. Lioi, L. Note the variation of phoseolin amona common bean landrasses collected in Eastern Asia / L.Liol, K.A.Hhammer // Genet. Resources Grop Evo-lup. 1993. - V. 40, № 1. - P.55-57.

142. Lis, H. Lectins as molecules and as tools / H.Lis, N.Sharon // Ann. Rev. Biochem. 1986.- V.55. - P.35-42.

143. Machenzie, S. Higher Plant Mito dria / S.Machenzie, L. Macintosh // Plant Cell. V. 11.- P.574-585.

144. Mateus, V.M. A tripsin and chymotrypsin inhibitor from partial bloc Keyed pea (Vigna Sinensis). Purification and partial characterization / V.M.Mateus, F.T.Hrier // An. Acad, brasil ciens.-1966.- 38.-№ 9-4.- P.553-556.

145. Mayer, H. Untersuchunden zur Binding enzymmazkierter lektine an Yersinia enterocolitica und Yersinia preudotutuberculosis / H.Mayer // Giessen. -1993.-IV, 114 c.

146. Metakovsky, E.V. Blocks of gliadin components in winter wheat detected by one-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis / E.V.Metakovsky, A.Yu.Novoselshaya, M.M.Kopus // Theor. Appl. Genet. 1984. - V.67. - P.559-568.

147. Mosolov, V.V., Loginova M.D., Fedurkina N.V., Benken I.I. Lectins as molecules and as tools // Plant Sei litters. -1976. V.7, №1. - P.77-80.

148. Mosolov, V.V., Loginova M.D., Malova E.L., Benken I.I. Some properties of carbohydrate bilding protein // Plant. 1979. - V.144, №2. - P.265-269.

149. Mosolov, V.V. Composition of lipids of lima beans / V.V.Mosolov, E.L. Gvozdeva//Plant Phisiol. and Biochem. 1992. - V. 30, № 2. - P. 181-185.

150. Mundy, J. . Papand Posters Aume / J.Mundy, I.Svendsen, J.Hejaard // Carlsberg Bus Communs. 1983. - V.42, № 3. - P.81-90.

151. Murdock, L.L. Lectins and proteas inhibitors as plant defenses against insects / L.L.Murdock, R.E.Shade // J. agr. Food Chem 2002 - V.50, № 22. -P.6605-6611.

152. Okeola, O.G. Biological effects of African yam bean lectins on clavi-gralla to mentosi collis. (Hemiptera: Coreidae) / O.G. Okeola, J.Machika // J. econ. Entomol. 2001. - V.94, № 3. - P.724-729.

153. Ortandel, H.H. Functional mechanics of the plant defensive Griffonia simplicifolic lectin / H.H.Ortanderl, H.-D.Belitz // Lebensmittel Wissenschaft Technologie. 1971. - V.4, № 3. - P.899.

154. Park, W.-G. Moleculur marker analysis for resistance of soybean culti-wars to soybean cyst nematode Korean / W.-G.Park, M.-J. Pare, J.-I.Chung // J. Crop Sc. 2002. - V.47, № 4. - P.319-322.

155. Poulsen, G.B. Oligonucleotide fingerprinting of resynthesized Brassica napus / G.B.Poulsen, G.Kahl, K.Wesing // Eupytica.-1993.-V.70,№ 1/2.-P.53-59.

156. Pueppke, S.G. Molecular genetic techniques in relation to sampling strategies and the development of core collections / S.G Pueppke, D.A.Kluepfel // Physiol. Plant Pathd. 1982. - V.20, № 1.- P.35-42.

157. Richardson, M. Papand Posters Aume / M.Richardson // Phytochemistry.- 1977. V. 16, № 1. -P.l59-169.

158. Ruszard, C.E. Seed globulins of the germinal and leguminosal / C.E. Ruszard // Buochem. Jorn. 1949. - V. 4, № 4.

159. Schinkel Christane Gepts P. Phaseolin diversely in the tepalg bean Phaseolus acutifolins A. Gray / Schinkel Christane Gepts P // Plant Breed. 1988.- V.101, № 4.- P.292-301.

160. Sharon, N. How protein bind carbohydrates: lessons from legume lectins / N.Sharon, H.Lis // J. agr. Food Chem. 2002. - Vol. 50, № 22. - P.6691-6886.

161. Tahahashi, T. Proteins of aileron grains from the axial part and cotyledons of pea and soybean seed: A comparative study.Sov / T.Tahahashi, Do Re N. // Phisiol. Plant Pathd. 1985. - V.27, № 1. - P. 1-13.

162. Tirits, H. Evaluation of methionine contents of beans / H.Tirits, I.Yrautschold, E.Werle // Methoden der. Enzvmatischen Analyse. Berlin.1970,- V.2 P.1021-1038.

163. Valueva, T.A. et. at. / T.A.Valueva, M.N. Shylgin, L.I.Grigorjeva // Biol. Zent. Bl. 1988. - V.107, №1. - P.51-52.

164. Ventura, M. A trypsin and chymotrypsin inhibitor and reeralution of earlier. resutts / M.Ventura, V.M.Mateus, E.J.Xaries // An. Acad, brasie. ciens.1971. V.41, №1. - P. 233-243.

165. Vittozzi, L. The phytogenesis of protein a-amylase inhibitors from wheat seed and the speculation of polyploid wheats / L.Vittozzi, V.Silano // Theor. Apll. Genet.- 1976. V.48, № 3.- P.279-284.

166. Wagner, L.P. Phaseolin diversely in the tepalg bean Gray / L.Wagner, J.P.Riehm// Arch. Biochem. and Biophys 1967-V. 121-P.672.

167. Weising, K. Foreign genes in plants transfer, structure, expression, and applications / K.Weising, J.Schell, G.Kahl // Ann Pev. Genet. Palo Alto, Galif, 1988. V.22- P.421-477.

168. Weiselare, R.J. Protein bind carbohydrates: lessons from legume lectins / R.J. Weiselare, A. McGregor, R.D.Hill // Plant Physiol. 1983. - V.72, № 4. -P.809-812.

Информация о работе

Гагарина, Ирина Николаевна
кандидата сельскохозяйственных наук
Орел, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Белковый комплекс семян фасоли и испытание биологической активности его компонентов - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы