Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение, культивирование и идентификация Heliobacter Pylori

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение, культивирование и идентификация Heliobacter Pylori"

РГО OA

слнкг - пег ешггсш гоаудАгльгнйнг АИР 193-'i cAmAFHC"гтшрюжл ¡юяющвжя :гн;.т;г::'т

На права:-: руксппск

ДОИ'АЛЬ С нетлан Г: Гек нз^ь е п кя.

УДК Г)7Г). «51.-Ii

еыде г.е:ж, культ лестговашо;

'Л ЩРЛ^ТВДККДЦКЯ НЕМСО.°ЛСГЕК PYLORI

üííz lisr3SZb КОС C-.J. uO. O' ~ Tí CpC'-'l'i'0ЛГТ i Г/Т

АВТОРЕФЕРАТ

дкссвр-.-'ацж; на зоисканне рннюл степаки каидида-га шдициьтсют наук

СШСТ- ПЕТЕРБУРГ Ш4

Работа выполнена в Санкт-Петербургском научно-исследоват сксм институте имени Пастера.

Научный руководитель доктор медицинских наук, профессор Л Б. Хазенсон.

. Официальные оппоненты:

д. м. н. , член-корреспондент РАЕН, профессор ВВ. Тэц, к. м. н. А. А. ГЬрин

Ведущее учреждение - Санкт-Петербургский государственный педиатрический медицинский институт.

Защита состоится ■ ■ ¿394 г- в .... часов

на заседании специализированного совета К. 084. 21. 01 по присужде ученой степени кандидата наук при Санкт-Петербургской государст ном санитарно-гигиеническом медицинском институте по адресу: 195067, Санкт-Петербург, Пискаревский проспект, 47.

С. диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПБГСГМК.

Автореферат разослан "...."................ 1994 г.

Ученый секретарь специализированного совета д. м. н. , профессор

А. Г. Бойцов

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Язвенная болезнь и гастриты занимают значительное место в структуре гастродуоденальных заболеваний. Преобладание среди больных лиц трудоспособного возраста, затягивание процессов обострения на многие недели и даже месяцы, частое рецидивиров&ние и тяжелые осложнения превращают эти заболевания в серьезную проблему как для самих больных, так и для лечаших врачей. Высокая медико-социальная значимость данной проблемы подтверждена многочисленными исследованиями по распространенности гастродуоденальных заболеваний и возрастному составу больных.

Современные представления о патогенезе язвенной болезни и гастритов базируются на взаимодействии многочисленных факторов, влияк«цих на состояние слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. Предлагалось множестве! теорий язвообразования, но ни одна из них не выдержала испытания временем. В ряде случаев этиология этих заболеваний известна (аутоиммунные заболевания, нестероидные противовоспалительные препараты). В большинстве случаев, однако, причины возникновения гастритов и язвенной болезни неясны. Последнее десятилетие характеризуется возникновением новых аспектов этиологии и патогенеза воспалительных и эрозивно-язвенных повреждений гастродуоденальной зоны. В 1983 году австралийски» учение Marshall и Warren впервые выделили изогнутые бактерии,сходные по морфологии с кампилобактерами, из биоптатов слизистой оболочки желудка больных гастритами и язвенной болезнью. Они выдвинули гипотезу, что эти бактерии, впоследствии названные Helicobacter pylori, являются важным агентом в этиологии гастродуоденальных заболеваний. Связь Н.pylori с воспалительными и эрозивно-язвенными повреждениями гастродуоденальной зоны была быстро подтверждена во многих странах (Burnett,1984J Kasper,1984; О'Connor,1984; Thomas, 1984). В дальнейшем было показано, что при гастритах типа В хеликобактеры обнаруживают в 60-90'/., при язвенной болезни желудка - в 50-90%, при 'язвенной болезни двенадцатиперстной кишки - в 60-100"/; случаев (Andersen,1987; Booth,19B6; Fiocca,1987; Rauws,19B9). Значительно реже эти микроорганизмы обнаруживаются у лиц с гистологически нормальной слизистой оболочкой гастродуоденальной зоны (0-87.) (Jones, 1984; Price, 1985; Rokkas,1987) и при гастрите типа А (4-2Г/.) (Ri ей, 1989; Aymard,1988).

Открытие Н,pylori позволило по новому подойти к рассмотрению всех аспектов инфекционных форм гастродуоденальной патологии (этиологии, эпидемиологии, патогенеза, профилактики, лечения, лабораторной диагностики).

Диагностика хеликобактериоза во многих странах мира стала в последние годы шмрокораспростраиенным методом исследования. В России в ряде клиник для обнаружения Н.pylori используют уреазный тест или микроскопию окрашенных мазков-отпечатков биоптатов. Однако, основным диагностическим критерием является выделение чистой культуры. Практическое здравоохранение до сего времени все еше не располагает простыми и экономичными методами выявления хеликобак-теров. Отсутствие широкой лабораторной диагностики хеликобактерио-за в нашей стране не позволяет составить суждение, о его месте в ряду гастродуоденальных заболеваний, эпидемиологической значимости для населения отдельных возрастных групп, резервуарах и путях передачи.

ЦЕЛЬЮ НАСТОЯЩЕЙ РАБОТЫ является разработка методов лабораторной диагностики хеликобактериоза и определение роли этого заболе-

вания в структуре гастродуоденальной патологии северо-западного региона России.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ:

- конструирование питательной среды, пригодной для выделения и культивирования Н.pylori, на основе отечественных ингредиентов;

- выбор оптимальным условий транспортировки материала и сохранения штаммов;

- разработка атравматичного и безопасного способа экспресс-диагностики хеликобактериоза.

- оценка роли хеликобактериоза в структуре гастродуоденальной патологии в нашей стране с помощью разработанных методов лабораторной диагностики;

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. Впервые в стране сконструирована питательная среда для выделения и культивирования Н.pylori.

Впервые разработан атравматичный и безопасный способ экспресс-диагностики хеликобактериоза - аэротест. Аэротест может быть использован для первичной дифференциальной диагностики, оценки эффективности выбранного метода лечения и прогнозирования течения послеоперационного периода, а также в эпидемиологических целях для установления уровня инфйцированности различных групп населения.

Определена роль хеликобактериоза в структуре гастродуоденаль-ной патологии в Санкт-Петербурге. Установлено, что у взрослых терапевтических больных Н. pylori обнаруживают в 6Г/. случаев при гастрите, в 84% при язвенной болезни желудка, в 85"/. при язвенной болезни дуоденум; у детей - в £>37. при гастритах, в 79У. при язвенной болезни желудка и дуоденум. У хирургических больных хеликобак-териоз выявляют в 92% случаев при язвенной болезни желудка и в 1ИИ % при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ. По результатам проведенной работы оформлены 2 заявки: на изобретение "Питательная среда для выделения Helicobacter pylori" получено положительное решение о выдаче патента от 15.04.93 г., на изобретение "Способ лабораторной диа!— ностики хеликобактериоза" - приорететный N 93029859 от 29.06.93 г.

На основании результатов проведенной работы составлены методические рекомендации: "Диагностика и лечение кампилобактериозной инфекции у больных язвенной болезнью и хроническим гастритом", утвержденные Врачебно-санитарной службой Белорусской железной дороги (опубликованы в 1991 г.). Подготовлена "Инструкция по клинике, диагностике и лечению хеликобактериоза - инфекционной формы острых и хронических гастритов, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки".

В результате настоящего исследования разработана методика лабораторной диагностики хеликобактериоза, готовая для внедрения в практику здравоохранения России.

Результаты работы внедрены в гастроэнтерологических отделениях городской Мариинской больницы, детской областной больницы и детской инфекционной больницы N 3 Санкт-Петербурга, а также используются в учебном процессе на кафедре хирургии Педиатрического медицинского института, на кафедре микробиологии Санкт-Петербургского Государственного медицинского санитарно-гигиенического института.

По результатам исследований опубликовано 14 работ, в том числе 4 за рубежом.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАШИТЫ:

.- для - выделения и культивирования Н.pylori сконструирована

Эффективная питательная среда; '

- предложены оптимальные условия транспортировки материала, содержащего Н.pylori, выбраны методы длительного сохранения штаммов хеликобактеров; -

- изучение биологических свойств 2В0 выделенных штаммов Н.pylori свидетельствует об их общности со свойствами штаммов, циркулируюцих в других регионах мира;'''»'близкое антигенное родство выделенных штаммов позволяет отнести их к одному серологическому варианту.

- разработан новый неинваэивный метод индикации- хеликобакте-риоза, основанный на определении уреазной активности in vivo;

- установлено, что в структуре заболеваний гастродуоденальной зоны в Санкт-Петербурге хеликобактериоз занимает значительную дожи у взрослых он обнаружен в 617. при гастрите, в 837.-100% при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, в ВАУ.-92У. при язвенной болезни желудка; у детей - в 627. при гастритах и гастродуоденитах, в 79Я при язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы работы доложены и обсуждены на:

1) итоговой научно-практической конференции института им. Пастера. Ленинград,1990;

2> заседании секции микробиологии и эпидемиологии Санкт-Петербургского отделения Всероссийского научного общества микробиологов, эпидемиологов. Санкт-Петербург,1993;

3) научно-практической конференции института им.Пастера, посвященной 70-летию института.

'СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, S глав собственных исследований, заклкнения и выводов. Объем работы, включая рисунки и таблицы, составляет 135 страниц. Список использованной литературы включает 242 источника, из них 42 отечественных и 200 иностранных авторов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

В работе использованы сконструированная нами питательная среда для культивирования и выделения Н.pylori на основе эритрит агара с добавлением крови и дополнительных источников питания, две коммерческие отечественные среды - КД и АГВ, сердечно-мозговой агар ср^рмы Di fco, в качестве транспортных сред - сердечно-мозговой бульон, тиогликолевая среда для контроля стерильности, модифицированная среда Cary-Blair. Среды проверены с эталонным штаммом Н.pylori NCTC 11637, а также со штаммами, выделенными от больных.

Апробация разработанных методов лабораторной диагностики хе-ликобактериоза проведена на клиническом материалу, довольных гаст-родуоденальными заболеваниями й практически здоровых людей. Исследовано 603 пробы от 400 больных гастродуоденальной патологией взрослых (26В) и детей (132) и лиц контрольной группы (15>, в том числе! 381 биоптат слизистой оболочки желудка ( антрального отдела -361, тела - 20 ), 41 биоптат слизистой оболочки двенадцатиперстной кишки, 19 проб слизи с поверхности желудка, 162 резецированных во время операции «фрагмента слизистой оболочки антрального отдела (54), тела (54) желудка или двенадцатиперстной кишки (54). С целью выявления 1дБ антител к Н.pylori исследованы 97 сывороток крови больных гастродуоденальной патологией.

Материал получали от больных с диагнозами: хронический гастрит, гастродуоденит, язвенная .болезнь желудка или двенадцатойере-

тной кишки. Контрольной группой служили лица без жалоб на патологию гастродуоденальной зоны.

Выделено и идентифицировано 280 штаммов Н.pylori. Изучены их биологические свойства. Получены гипериммунные кроличьи сыворотки к 7 штаммам Н.pylori, выделенным от больных с разными формами гас-тродуодена;)^ной,„. патологии.

Лабораторное испытание сконструированной нами среды, предназначенной для выделения и культивирования Н.pylori, проводили в соответствии с методическими рекомедациями ГИСК им. Тарасевича "К контролю питательныхи5р^д;'по биологическим показателям", М., 19В0 г. Среды оценивали по следующим показателям« чувствительность, скорость роста (время формирования колоний), эффективность накоп-ления';'ч'*£табильностк биологических свойств. Среды для транспортировки материала, содержащего'».pylori, оценивали по стабильности биологических:свойств и длительности выживания хеликобактеров. В экспериментальных исследованиях с целью определения пригодности сред для культивирования и транспортировки материала использовали количественный микробиологический метод.

Сбор и ¡хранение материала. Биоптаты и слизь с поверхности слизистой оболочки желудка получали при эндоскопическом обследовании больных с помощью фиброгастродуоденоскопа фирмы "Olympus" (Япония) . Эндоскоп и биолсийные типцы дезинфицировали спиртовым раствором хлоргексидина. В ряде случаев, с целью сопоставления различных методов определения обсеменениости, полученный биоптат асептически разделяли на две части так, чтобы в полученных фрагментах сохранялась послойная структура слизистой оболочки. Фрагменты слизистой оболочки желудка и дуоденум получали также при операции резекции желудка по поводу язвенной болезни. Полученные при эндоскопии и при резекции желудка биоптаты помещали в пробирки с транспортной средой и в тот же день доставляли в лабораторию.

Выявление ферментативной активности уреазы в желудочной слизи и в биолтатах слизистой оболочки желудка и дуоденум проводили с помошью модифицированной среды Кристенсена (мочевины - 6,0 г, 0,57. водного раствора фенолфталеина - 18 мл, В,01М фосфатного буфера -до 180 мл)

Бактериологический метод. Посев материала осуществляли в тот же день путем растирания биоптата или взвеси, полученной при асептическом измельчении биоптата в физиологическом растворе, шпателем по поверхности^чашки с той или иной средой. Засеянные чашки инкубировали при 37* С в микроаназростатах МИ-17, заполненных газовой смесью (57. 02, 1ВУ. С02, 857. N2). Чашки просматривали с третьего по пятый день. Часть характерных колоний пересевали на те же среды и инкубировали в тех же^словиях. Остальной материал использовали для постановки тестов"на" присутствие ферментов, определение подвижности и морфологии.

. ..- АйЗлиз" специфического иммунного ответа организма на проникновение антигенов И. pylori в"Слизистую оболочку желудка проводили иммуноферментнйм^метрдом с помощью набора "Анти-Н.pylori ИФА ДИАп-лхзс"-| . предназначенным для определения титра антител класса IgG к Н.pylori- -в сыворотке человеческой крови по методике, описанной в приложении к набору. В работе использовали реактивы и оборудование фирмы "ДИАплюс".

- 7 -

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

Конструирование питательной среды для выделения и культивирования Н.pylori. Лабораторное испытание сред проводили в соответствии с- методическими рекомедациями ГИСК им. Тарасевича "К контролю питательных сред по биологическим показателям", М., 1780 г. Среды оценивали по следующем показателям: чувствительность, скорость роста (время формирования колоний», эффективность накопления, стабильность биологических свойств. Контролем служил коммерческий сердечно-мозговой агар фирмы Oifco.

В качестве основы испытаны три отечественные коммерческие среды: КД (на основе гидрояизата кормовых дрожжей), АГВ (на основе гидролизата кильки), эритрит агар. Во все среды добавляли 5Х крови при 60 С (шоколадный агар).

В результате проведенных испытаний установлено, что на эритрит агаре рост единичных колоний Н.pylori диаметром 1,0-2,0 мм был при высеве из взвеси, содержавшей десятки тысяч клеток в 1 мл через 72-96 часов инкубации. На двух других испытуемых средах рост был из разведений, содержавших сотни тысяч клеток через 120 часов инкубации, диаметр колоний - 0,5-1,0 мм. По скорости роста и диаметру формирующихся колоний эритрит агар не уступая контрольной среде, однако его чувствительность была ниже.

С целью улучшения ростовых и снижения токсических свойств выбранной среды для культивирования Н.pylori (шоколадный эритрит агар) нами испытаны 4 добавки: растворимый крахмал, активированный уголь, гемин и стимулятор роста чумного микроба (Противочумный НИИ, г.Ростов-на-Дону). Шоколадный агар на основе сердечно-мозгового агара использовали в качестве контрольной среды.

Добавление крахмала или/и активированного угля не влияло на чувствительность среды. Наилучшие результаты получали при использовании 52 шоколадного эритрит агара с добавлением 5-15 мг/л геми-на и 500-700 мг/л стимулятора роста чумного микроба. Колонии Н.pylori на этой среде крупнее (до 2,5-3 мм в диаметре) и число колоний, выраставших при высеве миллиардной взвеси больше, чем на других исследуемых средах. При многократных пересевах в течение 13 месяцев на этой среде штаммы Н.pylori сохраняли культуральные, морфологические и биохимические свойства.

Оптимальное количество выраставших колоний штаммов Н.pylori, характерная морфология этих колоний, возможность длительного культивирования свидетельствовали о том, что шоколадный эритрит агар с добавлением 5-15 мг/л гемина и 500-700 мг/л стимулятора роста чумного микроба пригоден для культивирования хеликобактеров пилори.

Предлагаемая среда испытана также для первичного выделения Н. pylori иэ биоптагов слизистой оболочки желудка больных язвенной болезнью двенадцатиперстной кишки. Каждый из 12 исследованных би-оптатов стерильно растирали в 0,6 мл физиологического раствора и высевали по 0,1 мл взвеси на чашку с шоколадным эритрит агаром с теми или иными добавками. Машки инкубировали в микроаэрофильных условиях при 37 С. Результаты учитывали на 3, 5 и 7 сутки инкубации. Оптимальные результаты получены также при использовании шоколадного эритрит агара с добавлением 5-15 мг/л гемина и 500-700 мг/ л стимулятора роста чумного микроба. На этой среде колоний Н.pylori вырастало больше и формировались они раньше, чем на других испытуемых средах.

По данным Price и соавторов, в большинстве случаев посев би-

оптатов слизистой оболочки желудка на среды без элективных добевок дает рост чистой культуры хеликобактеров (70"/.). В 30Х случаев рост отдельных колоний' посторонней микрофлоры связывают с контаминацией в процессе эндоскопии (Price,1985). Поэтому, многие авторы предпочитают использовать для выделения Н.pylori среды без ингибируюцих добавок <Buck,19B6j Fitigibbone,19BBi Taylor,1937). В нашем исследовании уровень контаминации биоптатов был не более 20%. В большинстве случаев это были единичные колонии (чаше всего стафилококки) , и только в 0,5'/. наблюдали сплошной рост контаминантов, затруднякщий оценку роста Н.pylori. Учитывая факт снижения процента находок при использовании элективной среды, мы посчитали возможным не вводить в сконструированную среду добавки, ингибируюцие рост контаминантов.

Результаты данного раздела работы позволяют заключить, что разработанная нами на основе отечественных коммерческих компонентов сред», вклкнаюцая эритрит агар, кровь и ростовые добавки, пригодна для выделения Н.pylori из биоптатов слизистой оболочки желудка и двенадцатиперстной кишки, а также для культивирования эталонных и выделенных штаммов.

Выбор оптимальных условий транспортировки материала. Наличие эффективной питательной среды для культивирования и выделения хеликобактеров иэ биоптатов слизистой оболочки гастродуоденальной зоны позволило оценить модифицированную среду Cary-Blair, тиогли-колевую среду для контроля стерильности, физиологический раствор и сердечно-мозговой бульон в качестве транспортных сред. Их использование является необходимым условием диагностики хеликобактерио-за, так как хеликобактеры в нативном материале быстро теряют жизнеспособность. Это определяет результативность бактериологических исследований.

В пробирки со средами вносили взвеси культур хеликобактеров иэ расчета 10 микробных клеток на 1 мл среды. В физиологическом растворе штаммы сохраняли жизнеспособность в течение 6 часов в условиях бытового холодильник«, и 4-5 часов - при комнатной температуре. Хранение штаммов в сердечно-мозговом бульоне при 4 С давало возможность высевать единичные колонии Н.pylori через 24 часа. Оптимальные результаты получены на тиогликояевой среде для контроля стерильности и модифицированной среде Cary-Blair. На этих средах штаммы стабильно сохраняли жизнеспособность при 4 С в течение 2 суток. Так, в течение первых 6 часов высев с этих сред давал рост более 100 колоний хеликобактеров. Через 48 часов при высеве иэ тиогликолевой среды вырастали единичные колонии. На модифицированной среде Cary-Blalr штаммы сохраняли жизнеспособность до 3 - 4 суток. Отмирание микроорганизмов при хранении при комнатной температуре происходило быстрее. Так, тиогликолевая среда стабильно поддерживала жизнеспособность хеликобактеров только первые 6 часов, а модифицированная среда Cary-Blalr - 24 часа.

Установлено, что через 48 часов хранения на тиогликолевой среде и модифицированной среде Cary-Blair при 4 С биологические свойства штаммов оставались такими ж», как и при первичном посеве: грамотрицательные, изогнутые палочки с характерной стремительной подвижностью, уреазо-, оксидазо- и каталазо-позитивные, рост при 37 С и на среде с 0,57. глицина, отсутствие роста при 25 С и на среде с 3,5У. хлористого натрия, чувствительные к цефалотину и резистентные к налидиксовой кислоте.

Таким образом, модифицированная среда Cary-Blair обеспечивала стабильность биологических свойств и максимальную длительность выживания чистых культур хеликобактеров при 4 С в сравнении с другими транспортными средами.

При первичном посеве 10-биоптатов слизистой,гжелудка-, полученных при фиброгастродуоденоскопии, хеликобакт^ры-выделены в 8 случаях: в 5- ти - высеяны из обеин^сред, в 2-х - только из модифицированной Сагу -Blair и в одном - только из тиогликолевой-среды (2 колонии). При исследовании резецированных <{рвгментов слизистой желудка хеликобактеры обнаружены во всех Д9 случаях при транспортировке материала в модифицированной ср*де Cary-Blair, ив 18 из 19 случаев - в тиогликолевой- среде. Количество выраставших колоний было значительно*больше при высеве иэ среды Cary-Blair (в 10 из 19 посевов - больше 100 , в 9 - десятки колоний на^ашке). Из тиогликолевой среды всего в двух случаях получен рост "более 100 колоний, в 5 случаях отмечен рост единичных колоний.

Сопоставление длительности выживания хеликобактеров в 19 положительных пробах, полученных при резекции желудка, и помещенных в две опытные транспортные среды, показало, что при хранении в среде Cary-Blair первые 2 дня возбудитель обнаружен в 1007. проб, на третий день - в 89Х, на шестые сутки -.в. 3ZV.I . в двух . пробах Н.pylori выделяли через 10 дней хранения. На тиогликолевой среде отмирание хеликобактеров происходило быстрее! так, на 2-й день Н.pylori высевали из ЗЗХ проб. На £>-й день ни в одной иэ проб не удалось обнаружить Н.pylori.

Таким образом, уровень высеваемости Н.pylori был выше из биоптатов, помещенных в модифицированную среду Cary-Blair. Эта же среда обеспечивала более длительную выживаемость возбудителя в би-оптатах.

Анализ сроков и условий сохранения жизнеспособности клеток хеликобактеров в биоптатах, полученных при фиброгастродуоденоско-.пии, помещенных в транспортную среду, выполнен на модифицированной среде Cary-Blair. При первичном посеве Н.pylori обнаружены в 11 из 12 изученных биоптатов. Первые 6 часов хеликобактеры высевали из всех 11 положительных проб. Через сутки возбудитель сохранился в 64X проб, через 48 часов - в 27'/., а на третий день его можно было высеять лишь из 2-х биоптатов.

Суммарный анализ результатов проведенного-исследования подтверждал прямую зависимость между длительность&эвыживания на транспортной среде хеликобактеров, количеством помещенного в нее конта-минированного материала и содержанием в нем ч^,л^н»микробных клеток. Так, при внесении резецированных при операции фрагментов слизистой желудка размером 2S мм2 хеликобактеры выживали в 100 7. проб на протяжении 2 суток. В биоптахах-, полученных при фиброгаст-родуоденоскопии, размером 1-2 мм2 они сохраняли жизнеспособность за аналогичный срок лишь в 34 У. проб. Более чем в половине проб (в 9 из 16) с низкой обсемененностью хеликобактераод^дд 50 колоний на чашку) эти микроорганизмы выживали всего 6-48 часов. Когда же концентрация хеликобактеров в исследуемом материале достигала более 100 колоний, то они сохраняли жизнеспособность в течение 3-6 суток.

Методы сохранения выделенных штаммов Н.pylori. Испытание шоколадного эритрит «гара с 10 штаммами H.pylorji,. выделенными от больных показало, что эта среда может быть использована для хранения

-......- 10 -

чистых культур при А С без пересевов всего 2 суток.

С целью более длительного сохранения жизнеспособности 32 штаммов, выделенных от вольных, нами испытан метод лиофильного высушивания. 96-часовые культуры, выращенные на шоколадном эритрит агаре суспендировали в сахарозо-желатиновой среде, разливали в ампулы по 0,2 мл и подвергали лиофильной сушке. Запаянные ампулы хранили ежемесячно рассевая по 3 ампулы каждого штамма.

Через 2 месяца Хранения жизнеспособными оставались все 32 йгтамма. Половина штаммов выживала -в течение 4 месяцев, и лишь 3 -в течение полугода.

Наиболее надежней ^" методом длительного хранения штаммов Н.pylori является замораживание при -70 С. 5 штаммов Н.pylori суспендировали' в глицериново-сывороточной среде (20% глицерина - 50%, фетальной лошадиной сыворотки'- 507.) и разливали в микропробирки по 0,3 мл.'.-Нерез 10 месяцев хранения (срок наблюдения) при -70 С все S штаммав;оставались жизнеспособными.

Таким ебрБзом, по нашим данным, длительное сохранение жизнеспособности штаммов Н.pylori (более 10 месяцев) обеспечивается замораживанием в глицерин-сывороточных средах при -70 С.

Апробация сконструированной нами питательной среды для диаг— ностики хеликобактериоэа проведена при обследовании 400 больных с гастродуоденальной патологией - взрослых (263) и детей (132), лиц контрольной группы <15). Всего изучено 584 пробы биоптатов и резецированных фрагментов слизистой оболочки гастродуоденальной зоны. Установлено, что сконструированная питательная среда пригодна .для выделения Н.pylori, а выпускаемые отечественные химические реактивы позволяют проводить идентификацию выделенных штаммов.

Результаты, полученные при бактериологическом обследовании больных с использованием нашей среды, совпадали с данными уреазно-го теста биоптатов и серологического метода в 907. случаев.

Культуральные.морфологические и биологические свойства 2S0 выделенных штаммов Н.pylori. В настоящем разделе представлены результаты изучения 280 штаммов Н.pylori, выделенных от больных гастродуоденальными заболеваниями ( взрослых - 193, детей - В7 ), которые сопоставлены со свойствами эталонного штамма Н.pylori NCTC 11637.

Морфология колоний. Все выделенные штаммы хорошо росли на богатых аминокислотами питательных средах, содержавших ЗУ. лизирован-ной крови. Колонии всех штаммов были негемолитические, плоские, влажные, блестящие, прозрачные, сходные с каплями конденсата водяных паров. При большой, количестве хеликобактеров в исследуемом материале наблюдался сплошной рост в виде влажной прозрачной пленки на поверхности питательной среды.

В,.мазках, окрашенных по Гриму. 72-96 часовые культуры первых пассажей представлены грамотрицательными, слегка изогнутыми, тонкими палочкам^-одного размера.. Более старые культуры <5-7 суточные, или после,-3-4 пассажей) выглядели полиморфными! палочки разных размеров^кокковые формы.

При микроскопии в темном поле - определялась стремительная подвижность клеток.

При электронной микроскопии 18 штаммов Н.pylori имели изогнутуюi, В-образную, U-образную или кокковидную <в старых культурах) форму. Поверхность клеточной стенки - гладкая. Жгутики расположены-

униполярно, покрыты чехлами и имеют характерные колбообразные утолщения на концах.

Все выделенные штаммы обладали каталазной и оксидазной активностью. Все они быстро разлагали мочевину (от нескольких секунд до 2-3 минут)Штаммы хорошо росли в микроаэрофильных условиях при 37 С и не росли при 25 и 42 С . В аэробных и строго анаэробных условиях рост- при 37 С отсутствовал. Штаммы были толерантны к И,5'/. глицина, но не росли в присутствии 3,5% NaCl или ВХ глюкозы.

Таким образом, морфологические, биологические и культуральные свойства выделенных штаммов полностью совпадали со свойствами эталонного штамма.

Для исследования антигенности Н.pylori готовили гипериммунные кроличьи сыворотки к штаммам, выделенным от больных с разными формами гастродуоденальной патологии. Все приготовленные сыворотки обладали видовой специфичностью, т.е. реагировали не только со штаммом, к которому приготовлена сыворотка, но и с любым другим штаммом Н.pylori в титрах равных титру гомологичного штамма. Эти .данные согласуются с результатами, полученными Hook и Blomberg <19В9). В нашем исследовании все 2В0 штаммов Н.pylori, выделенных от больных, агглютинировались полученными антисыворотками. Нами сделано заключение, что Н.pylori обладает общим антигеном. Этот факт может быть использован при разработке диагностических ИФА-тест систем.

Разработка неинвазивного теста для диагностики хеликобактери-оза. Необходимость получения эпидемиологических данных по распространенности, популяционным различиям и другим особенностям Н.pylori-инфекции со всей остротой ставит вопрос разработки быстрого неинвазивного безопасного несложного в исполнении скрининго-вого теста. Иы предлагаем такой тест, основанный на высокой эндогенной уреазной активности Н.pylori. При разложении транссудиро-ванной из плазмы крови в слизистую оболочку желудка мочевины уреа-зой Н.pylori выделяется аммиак, который определяют в ротовой полости пациента с помощью одноразовых индикаторных трубок.

При обследовании практически здоровых лиц (79) и больных гастродуоденальными заболеваниями (63) с помощью предложенного аэротеста, установлено, что средний показатель аммиака у больных гастритом типа В и язвенной болезнью был достоверно выше, чем у здоровых и больных гастритом типа А.

Сопоставление результатов обследования 35 больных параллельно тремя методами! бактериологическим и с помощью уреазного и аэротеста, свидетельствовало о высокой информативности последнего. Результаты всех трех методов совпадали в 94Я случаев.

Преимущества аэротеста, как метода диагностики хеликобактери-оза, заклкнаются в следующем!

1) для его выполнения не требуется инвазивных процедур, необходимых для бактериологического, гистологического и уреазного тестов ,

2) аэротест интегрирует ответ всей слизистой оболочки желудка и даже низкий уровень инфицированности может быть определен,

3) метод не радиоактивен, в отличие от дыхательных тестов, предложенных Bell (1987) и Marshall (198S).

4) значительно сокращается время обследования (15-20 минут) в сравнении с неинвазивными дыхательными тестами (1,5 часа).

Полагаем, что аэротест может быть использован для первичной

дифференциальной диагностики хеликобактериоза, оценки эффективности выбранного метода лечения и прогнозирования течения послеоперационного периода, а также в эпидемиологических целях для установления уровня инфицированности различных групп населения.

Достоверность используемых нами методов диагностики хеликобактериоза подтверждена результатами теста на уреазную активность биоптатов и данными серологического обследования .с помощью ИФА тест-систем фирмы "ДИАплкс".

Ни один из вышеперечисленных методов диагностики хеликобакте-риоза не универсален и пределы их возможностей ограничены не только чувствительностью, но зависят от стадии заболевания, применявшегося перед обследованием лечения, индивидуальных особенностей течения инфекции и т.д. Поэтому, наиболее достоверные результаты могут быть получены при использовании комплекса диагностических методов.

Распространение хеликобактериоза в Санкт-Петербурге. При исследовании биоптатов, полученных с помощью фиброгастроскопа Н.pylori обнаружен у взрослых в 61,17. при гастрите, в 63,67, при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки, в 84,67. при язвенной болезни желудка) у детей - в ¿2,7'/. при гастритах и гастродуодени-тах, в 78,67. при язвенной болезни желудка или двенадцатиперстной кишки. При исследовании постоперационных биоптатов хеликобактериоз диагностирован при язвенной болезни желудка - в 92"/., при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки - в 1И0Х.

По нашим данным, процент выделения * хеликобактеров от лиц, подвергшихся операции по поводу гастродуоденальной патологии, несколько выше, чем от терапевтических больных. Мы предполагаем, что это обусловлено с одной стороны действительно ростом инфицирован-ности при утяжелении патологии, с другой - возможностью бактериологического обследования более обширных фрагментов слизистой. Есть свидетельства тому, что Н.pylori заселяет слизистую оболочку желудка мозаично, образуя микроколонии. Такое представление объясняет некоторое ограничение возможности обнаружения этих бактерий в биоптатах, полученных при фиброгастроскопии (размером 1-2 мм2), по сравнению с постоперационными биоптатами (20 и более мм2>. Наши данные, полученные при изучении выживаемости Н.pylori в биоптатах, подтверждают прямую зависимость положительных результатов от размера биопсийного материала. Следует отметить, что специфичность уреазного теста при обследовании постоперационных биоптатов (97,4%) выше, чем при изучении фиброгастроскопических образцов (67,7'/.), очевидно, вследствие большего процента выделения Н.pylori.

Заслуживает внимания тот факт, что при инфицировании Н.pylori этот патоген в 1007. случаев мы высевали из антральных биоптатов, реже - из биоптатов тела желудка (537.). С тех пор, как Warren и Marshall установили, что изогнутые бактерии могут встречаться в любом отделе желудка, но чаще всего - в антруме (Warren, Marshall, 1983), большинство исследований проводилось на антральных биоптатах. Отдельные публикации, посвященные изучению распространения Н. pylori в слизистой желудка, подтверждают полученные нами результаты (Fiocca,1987; McNulty,1985). Из биоптатов слизистой дуоденум возбудитель мы выделяли чаще при язвенной болезни двенадцатиперстной кишки (67'/.), чем при гастрите (257.) (р=0,07). Этот факт нажег быть объяснен тем, что в краях, дуоденальных язв почти в 1007. случаев обнаруживают желудочную метаплазию эпителия, к которому этот микроб имеет особую тропность (Звартау,1992; Phi Hips,1984; Steer,

1984). Колонизация участков гастральной метаплазии хеликобактерами является причиной дуоденитов и дуоденальных язв (Marshal 1,19B4¡ Wyatt,1987).

При бактериологическом обследовании 15 практически здоровых лиц выявлена значительная инфицированность хеликобактерами бессимптомных пациентов (33,3/О , однако это наблюдается лишь при наличии гистологических проявлений воспаления слизистой оболочки желудка. При гистологически нормальной слизистой и при атрофическом гастрите, очевидно имек«дем иную этиологию, мы ни в одном случае из 8 не обнаружили этот микроорганизм. Такие же результаты получены и другими исследователями (Doolеу,1989¡ Rauws,1989>, однако встречаются сообщения о выделении Н.pylori из биоптатов без признаков гастрита (Burnett,1984).

Таким образом, результаты, представленные в aeihhom разделе, свидетельствуют о том, что хеликобактериоз занимает значительную долю в структуре гастродуоденальной патологии в нашем регионе. Процент инфицированных согласуется с показателями, зарегистрированными в других странах мира.

ВЫВОДЫ.

1. Сконструирована питательная среда, пригодная для выделения Н.pylori из биоптатов слизистой оболочки желудка и дуоденум, длительного культивирования этих микроорганизмов в лабораторных условиях и накопления биомассы. Показано, что по основным признакам указанная среда не уступает соответствующем зарубежным коммерческим аналогам.

2. Выбраны условия транспортировки исследуемого материала, инкубации посевов, а также среды и условия для длительного сохранения жизнеспособности выделенных штаммов.

3. Разработан новый неинвазивный метод диагностики, основанный на определении уреазной активности in vivo, пригодный для первичной дифференциальной диагностики хеликобактериоза, оценки эффективности выбранного метода лечения, прогнозирования течения послеоперационного периода, а также для установления уровня инфи-цированности различных групп населения в эпидемиологических целях.

4. Показано, что лабораторное подтверждение хеликобактериоза должно вклкнать комплекс приемов - первичную диагностику с помощью аэротеста и/или ИФА тест-систем, а затем бактериологическое и биохимическое исследование биоптатов.

5. Установлена роль хеликобактериоза в структуре гастродуоде-нальных заболеваний в Санкт-Петербурге : у взрослых - 61'/. при гастрите, 84У.-100'/. при язвенной болезни дуоденум, 857.-92Х при язвенной болезни желудка; у детей - 637. при гастритах и гастродуоде-нитах, 797. при язвенной болезни желудка или дуоденум.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ!

1. Detection of Helicobacter pylori in the biopsy specimens •from the patients with gastritis and peptic ulcers.//In: Dani pre-ventivne medicine,XXIV sastanak.- Nis,1990.-p.30. (Соавт. Сафонова H.Б., Хазенсон Л.Б., Петрутик A.B., Арсеньев Ф.В.).

2. Campylobacter pylori при гастродуоденальной патологии.// Клин.мед.-1990.-N12.-с.46-4В. (Соавт. Нестеренко А.О., Сапроненков П.Н., Арсеньев Ф.В. и др.).

3. Опыт выделения и культивирования кампилобактеров пилори. В сб.: Тезисы докладов VI Всероссийского съезда микробиологов, эпидемиологов и паразитологов.- Ни*.Новгород,1991.-т.1.-с.73-76. <Соавт. Сафонова Н.В., Хазенсон Л.Б., Жидков И.П., Петрутик A.B., Арсеньев Ф. В.).

4. The role of the helicobacteriosis in the gastro-entero-pathology in St-Petersburg.//Ini Workshop "Helicobacter pylori and the new concepts in gastro-duodenal diseases".-1992,Praque.-p.31. (Соавт. Сафонова H.B., Жебрун А.Б., Носков Ф.С. и др.).

5. Методы лабораторной диагностики хеликобактериоза.//В сб.: Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб: НИИЗМ им.Пастера, 1993.-т.1.-с.21. (Соавт. Сафонова Н.В. , Жебрун А.Б. , Пайков В.Л.

и др.)

6. К морфологической характеристике маломанифестных форм хеликобактериоэов.//В сб.! Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб: НИИЭМ им.Пастера,1993.-Т.1.-с.87. (Соавт. Цинзерлинг В.А., Васин Ю.В., Жебрун А.Б.и др.).

7. Комплексное обследование семей для выявления инфицирован-ности хеликобактером пилори детей различных возрастных групп.//В сб.: Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб: НИИЗМ им. Пастера, 1993.-т. 1.-с.69. (Соавт. Сафонова Н.В., Пайков В. Л., Мельникова И.Ю. и др.).

8. Антигенность и связывание сывороточных белков клетками и экстрактами клеток хеликобактера пилори.//В сб.! Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб: НИИЗМ им.Пастера,1993.-т.1.-с. 2S. (Соавт. Жебрун А.Б., Сафонова Н.В., Гончарова Л.Б.).

9. Новый тест для диагностики хеликобактериоза.//В сб.: Актуальные проблемы инфекционной патологии.-СПб: НИИЭМ им. Пастера, 1993.-т.1.-с.45. (Соавт. Милейко В.Е., Сафонова Н.В., Жебрун А.Б. и др.).

10. Эндоскопия верхних отделов желудочно-кишечного тракта у детей с гломерулонефритом.//В сб.: Охрана здоровья населения и оздоровление окружающей среды.- СПб: СПбГСГМИ,1993.-с.55. (Соавт. Пайков В.Л., Мельников* И.Ю., Хаким Амаль-Аль., Сафонова Н.В.).

11. Поражение пищеварительного тракта у детей с дерматоаллер-гозами.//В сб.: Охрана здоровья населения и оздоровление окружан>-шей среды.- СПб! СПбГСГМИ,1993.-с. 59. (Соавт. Соколова М.И. , Самарин Г.Я., Гончар Н.В. и др.).

12. "Aerotest" for Helicobacter pylori diagnosis.//Acta Gast-ro-entarologica Bélgica.-1993.-V.56.-p.84. (Соавт. Жебрун А.Б. , Сафонова Н.В., Милейко В.Е. и др.).

13. Association with serum proteins and haemagglutinating activity of Helicobacter pylori.//Acta Sastro-entarologica Bélgica. -1993.-V.56.-p.123. (Соавт. Жебрун А.Б., Сафонова H.B., Гончарова Jl. Б. и др. ).

14. Гастрит, язвенная болезнь и хеликобактериоз.-СПб.,1993. -40 с. (Соавт. Сафонова Н.В.,Жебрун А.Б., Гончарова Л.Б.).