Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и структурная характеристика к ДНК-копии транскрипта гена бета-лактоглобулина овец

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и структурная характеристика к ДНК-копии транскрипта гена бета-лактоглобулина овец"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОЮЗЯЙСТ ВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТ йЛЬСЮ» ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА.

На правах рукописи. - УДК. 575. 113 / 636. а 082.12

БИСЕНОВ УТБПБЕРГЕН КУШЕРЕАЕВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА КДНХ-КОПИИ ТРАК? КРИПТА ГЕНА БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА ОВЕЦ

03.00.04 Биохимия.

; АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологически* наук

ДУБГОБЙШ 1994

о?

Работа*выполнена -ва Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Научный руководитель- доктор биологических наук, профессор - . Шихов И, Я

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Яковлев А. Ш. кандидат биологических наук Букаров Н. Г.

Ведущее учреждение: Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Защита диссертации состоится ** ¿Ь- 1994 г.:. в

час. на заседании специадиэированно/о совета Д 020.16.02. при Всероссисноы научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес; 142012, Московская область, Подольский район« поселок .."■ Дубровицы. ■ "'

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Автореферат разослан 1994г.

Ученый секретарь ' . ' - : '.

специализированного совета - *■'■",

кандидат биологических наук И. И. ИЬыгин.

: . ■ 3 - . 1. Обшая характеристика работы

1.1. Актуальность темы:

Одной иэ основных проблем современно^ генетики в плаке решения прикладных задач селекции, является выяснение закономерностей работы генов,; возникновения их устойчивых ассоциаций, обуславливающих формирование генотипов с желаемым комплексом признаков. В установлении закономерностей формирования таких устойчивых ассоциаций, а такте функционирования генных комплексов ведущую роль должны сыграть генетические модели, раскрывающие.Функциональные свяви на макро-, микро- и молекулярном уровне.

Изучение структуры генов связанных с полезными признаками сельскохозяйственных животных представляет несомненный интерес как в теоретическом плане, так и для практического применения. Особо в -.атом,отношении;привлека»г; внимание исследователей белки ^юдока. "как псггенциальныа генетические маркеры. Наиболее надежные результаты б1Ш1.подучены яри оценке, полиморфизма .белков молока* каэеинов(Сп),бета-лактоглосулинов (Ut), альфа-лактоалъСуминов (LabJ оказывающих определённое влияние на качество продукта, его выход..'...- .' ■-.';'." -...■'.-"

- Белокбета-дактогдобулин проявляет полиморфные -свойства, имея генетические варианты А. В. По данным ряда учен ызс указанные ' генотипы обнаруживают связь 'с 'молочными качествами животных. Установлено, что селективная ценность;коров по типам бета-лактог-лобулина, - лль4а Ч и каппа-казеина определяется отбором по удою и количеству . молг>'-шого : тара , преимущество имеют коровы ¿'типами бета-ЦВВ. альфа -СпАА, калпа-СпАА / Иаринчук Г. Б. 1079/.

В то .'же-.бремя некоторые авторы /Иаринчук Г. Б., 1992; ,■ Qraml R. et aî.v 1986; Hines H. С. ' et al.. 1931/ высказали предположение о нетесном сцеплении между казеиновым комплексом и локусом Ое-та-лактоглэбулмна. ....

Достижения молекулярной генетики, позволившие конструировать и клонировать рекомбингчгные JEîK. вводить эту генетическую информацию в геном, открыли принципиально новые возможности :

ЦЕНТРАЛЬНАЯ НАУЧАЯ БИБЛИОТЕКА Л-îocK. соль :;:о.;оз ачадвими

направленного изменения наследственности. При атом особый интерес представляют приемы создания . и интегрирования в геном;*ивотных . различных генных конструкций, в первую очередь анологичных имеющимся в их наследственной информации,'т.е. гены той же специали-вации, но.других видов животных и человека с разными регулятор- ; ними последовательностями. . V '

При целенаправленном переносе генов, к примеру, под молоч-но-специфическим промотором, их экспрессия будет происходить в молочной железе трансгенных животных, « вместе с молоком будут выделяться необходимые белки. При этом выделенные из молока реком-Синантные бедки, как зго ужз отмечено, обладают специфической активностью. что указывают на способность ферментных систем клеток' молочной язлезы к посттрансляционной модификации . ;'■,■

Исходя из этих предпосылок иа уча кие ; структур« генов к. их представительства в геномнойДНК данной популяции, контролирупцей синтез лактопротекнов, ученые считают важной задачей современной генетики, с. другой точки эрения актуальны работы по созданию и клонировании молекулярных - зондов, позволяющих идентифицировать изучаемые последовательности, а также .исследовать полиморфпость-рестриктных фрагментов изучаемых генов. * ; V-

•Б назей работе была предпринята попытка получения представительных кДНК- библиотек из .ткани лактирующзй молочной жолегы ов-> • цы, и выделения клона комплементарного к ыРШ'бета-лактогдоОудкна, изучения его структурных последовательностей' методом рестрмктного анализа. Слот-гибридизации и секвекировання. , .

. И&Ль и задачи исследований ■ */

' Цель» нашей работы-являлось' выделение и изучение структуры кЛИК: гека бета-дактоглобулина овща Дяя достижения этой цели предполагалось, решить' следушие задачи: .■/ .;'

: 1. Выделение поли > (А)+ РШшлочной железы овцы и характеристика транскрипции гена бета-Цг с помощью" "нозери** V. 6ЛОТ-гибридизации. ■' ■ ' ^ .'-V: '■ V

. 2.; синтев и клонирование полноразмерной кДНК молочнъвгбелков овец в Фаговом векторе лямбда-ей О. .

а Проведение скрининга для выделения иа кЛНЛ-Сиблиотеки Фрагментов гомологичных последовательностям кДНК бета-лакгогдобу-

. .: V ' '■' - б - ; ■ -У". ;. _ .;

4- Структурная харакхеристика вьщелекьа фрагментов 'кДНК бета-лаотоглобулина спомощьп рестрикции, блот-гибридизации и сек-• вевироваиия. V"-'.-. ■ .

б. Игпользовакие кДШ фрагшнтов в качестве молекулярных зондов для . изучения ГОСРФ { полиморфизмадлины рестрикционных фрагментов)гена бета-лактоглобулинь резных порол овец. ^* V ^

. Научная ровиэна и практическая ценность работы

. • В фаговом векторе лямбда-®ио быадсоздана кИК библиотека из молочной железы овца, выделен один клон. ' имеюший последовательность, гомологичную кДНК бета-лактоглобулина овец.' Были охарактеризованы последовательности ДНК этого клона методом рестрикцион-у ного анализа и на этой основе построена рестрикционная карта., Рестрикционная карта соответствует данным, которые приведены в : ■ работе вауе et а1. ( 198в )♦ Были частично секвенированы последо- * - вательности ДНК этого клона. V Впервые изучен полиморфизм гена бе' та-лактоглобулина овцы в> мемюродном и внутрипородном аспекте.

. ДНК породы эди^Оаевских» . каракульских' и романовских овец ' /' после расщепления рестрикгаэами Есо1?1 »г Руц11 гибридизовались ; с ; кДНК бета-лактоглобулина..- У романовской породы овец был выявлен ■.-■'■■ ^ полиморфизм длин рестриктных фрагментов при .использованк • рест-риктазы Есой! (фрагменты 2800 пар нуклеотидов и 4600 п. к.) и при использовании Руч 11 -" 3000 п. н. ~ и 1900 п. н.. . У' эдильбаевских Г овец, после раешэплекия ДНК рестриктазой ЕсоР!,..также установлены

два фрагмента - 2800 п.н. и 4600 п.н... При использовании эндонук- . - леазы ■руиП найден*только один фрагмент с длиной 1900 п. и. • А у каракульских овец при;рестрикции'ЕсоЯIV-найден1*;один фрагмент т. 2800 п. ш* и при рестрикции руиП - 1900 п. н.. -; Г ■ V

Апробация работы . : "".-.У-'1-;"' ."■ V ■ '-''.■■'■:• "■ ■ "V.

" Основные результаты работы докладывались па 44-й научно-мето- ■ дической конференции аспирантов, и на семккаре отдела Сиотехноло-. гии ВИЖа..' Шлучежшй. экспериментальный 'материал представлялся на ■ Г - Всесоюзном научно-технкч«сю:м совещании ко проблеме, развития биотехнологии в животноводстве ( Дубровицы 1990 г.)Республи-канской научно-практической конференции!молодых ученых и слециа-; листов ( Алма-Ата-1991 и. .•' : . ■';•'.' ■

Публикация

lb теш диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Объем и структура работы .

Диссертация изложена настраницах машинописного текста и состоит из введения, -литературного обзора, материалов и методов, результатов работы и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 11 рисунками и содержит 2 таб лицы. Список литературы содержит 111 источников зарубежных и отечественных авторов,

2. ЫАТЕРИАЛ И ЫЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Бактериальные пггаыш и плаэмвды. Шгаиос E.cou1 NM-514. E.coli L-87, Е.coli TG. Для работы , испольвовались ДНК фага Ш3гр18 и плавмнда р1ХМ9 полученные от НПО " Еиопол ■ ■

Ферменты для рестрикции и клонирования: Е coR I, Hind III; Sma I, Rsa 1 , Pvu I, Pst I, ALu t получены от НПО- "Фермент" (ВильнюсЛ Рестриктазы Bell, Btrl II, Нае.Ш, Фрагмент Кленова получены от фирмы "Anersham **, а также пвлочная фосфагаза от фирмы "Sigma

Матричную РНКвыделяди из свеяевамороменной ткани молочной лелевы овцематок породы финский ландрас на Î3-15-й день лактации с помощью гуанидинийтиоционата. Поли (А)+ РНК выделена методом хроматографии на олиго(йТ)-целлюлозе. . . / '

Гибридизации. РНК с кДНК бета-лактоглобулияом коровы осуществлялись "Northern" блот-гибридизавией. Использованы нитроцедашоз-ные фильтры " Hal bond и фирмы "Amershart'V

. Синтез кДНК проводили в один этап, с помощью набора для синтеза молекул комплементарных ДНК* ( ,НПК Виоцевтр" Новосибирск ). -

Клонирование кДНКв фаговом векторе ' лябда-etlO осудзетвля-ли с помощь» набора■ cDHAolontn? system -,etlO" фирмы "Arorsham U. К. Для упаковки фаговой ДНК испольвованыуваковоч-ный экстракт набора "ДИагвостикум". 1

Процесс скринирования кДНК-овой ОиОлиотеки генов молочных

желез овец включал три этапа: приготовление фильтров-реплик для гибридизации, лизис клеток и денатурация'ДНК. гибридизация библиотеку с ДНК вондом. ■ Мечевие зондов проводили с помощью реакции ник-трансляции по метод:«е, предложенной Т. Манизтисом с соавтора-•ми С 1984) либо согласно инструкции к набору для радиоактивного течения фирмы " Amersham U. К.".

Гибриднаанионной анализ рекомбинантноя фаговой и геномной ДНК ( Southern, 1976) проводили в изотопном варианте на нейтро-целлюлозных фильтрах ( Schleicher and Schuell ВА 85.). В качестве зонда использовали участки 3*- конец кДНК бета-лактоглобулина ко- ' ровы (любезно предоставленный Городецким С.FT., ИЕГ РАН) и введенный кДНК фрагмент бета-лактоглобулина овцы.

." При выделении ДНК бактериофага исходили из методики, предложенной Т.Маниатис с соавторами с некоторыми мог :фикациами. - Работа включала 2 этапа. IIa первом этапе выделяли, бактериофаг путем осаждения с помощью ПЭГ и NaCl. На втором этапе из препарата бактерифага выделяли ДНК. [Ьсле осаждения фаговой частицы осадок растворяли & 5-10 мл ТЕ. Экстрагировали равным объемом хлороформа-изоамилового спирта. В водную фазу добавляли ЭДГА (20 ыЫ}И очящзли путем фенол- хлороформной экстракции. ' Гидролиз плазындной, - фаговой и геномной ДНК рестриктазами, электрофорез и лигирование проводили в стандартных условиях ( Ма-ниатис и др., 1664 )'. оптимизируя условия реакции согласно прописям фирм-изготовителей.. ;

■■-_■. Для выделения фрагментов ДНК необходимой длины из агарозного .геля и полиакриламидного гелей использовали метод злектроэлоции ( Цаниатис и др., 1984).

Трансформацию ЕсоИ ■ проводили по стандартной методике ' помощь» хлористого кальция.. . Плазмидную ДНК бактерий выделяли с помощь» "палочного лизиса с' модификациями' ( Маниатие и др., 1984). ■■ '

' Доя выделения геномной ДНК овец использовали метод Блика и Стаффорда (1976).

.; -. При секвекированин клонированной последовательности ДНК использовали метод иэнгера основанный на синтезе. ДКК с пометь» полшеразы в присутствии смеси обычных дезоксинуклеозид трифосфа-тов ( <ЗЫТР), и, аналогов -2,3- дидеэоксинуклеозид трифосфатов (ddNTP). Использован набор НПО " Фермент

, ~ в - ■■ =.-'. 1 . ■ Л v "

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОВСУДЛЕНИЕ 3.1. ВДделение матричной РНК и изучение транскрипции гена бета-лакгоглобулина овцы . у.' • ■ .-.ц:',. .

В нашей работе использовали метод вцдехения РНК о примененией солей гуанкдиния. Метод основан на.способности солей гуванам-иия в высоких концентрациях и других денатурирупза агентов раз-, рушать комплекс риСонукдеопротеияов, что особенно.шлесообразно ' для клеток с высоким 'уровнем 7 эндогенной ■ рибонуклеазной шстна-. воет Молочная железа относится к такому виду тканей. Суышряуо . поли ( А) + РНК выделяли после ее очистки двумя циклами хроматографии на олиго (бТ)-цедшлозе. Всегобыло выделено из ЗО г ыолоч-ноа железы около too «кг РИС [ По результатом эксперимента ш ио^ лучили высокоочищенныя и стабильньй ripenaparPHK, и » результате была синтезирована ишюкудо полно^иерюй от

. боо до 3000 нукдеотидных пг.р! . . ' . v -

Для изучения транскрипции гена б;»а-лактоглоОул^ . ГСьйа проведена. нозерн- гибридизация: тотальных u пола (А) ♦ ,'РКЙ' с нпкг - ' транслированоЯ 3*-концевой областью;«^ ^а^лмсто^^ вы ( рис. 1). > •. -V V*•'' v;'/; .

■ При этой НчЧблцаался слабый сигнал вблот- панели, гкбршоаша! с тотальной РНК, в'случаесполи (А)РЩ'вшвдявса.Роде» тенсивной;'сигнал гибридизации.это Ьэначает,'.:что сггйосктелькое /содержание матричной РНК бега-лакгоглобудяиа увеличено и прэодсо» , дит обегавдниемолекул шли ( А) .+: PHJL .i- i 1J « й Траккрипцаониь» ; области в обоих молекулах РЫК имели ОАшатдо.-ршиери^. , 800 нуклеотидних оснований. В работ« <3ау* Л ^ tjt®se) uPHK б«-та-лактоглобулина овец имела juiay,.^. ия^сгс^ •

3.2.Конструирование* • кик.' . ¿излвртекя шадчмоаг:?;.

Синтез двухцепочечной; кДНК - щ»водшюя оД1К)ей»№НИо ® одира ^ реакции с помосыо набора решетюов. дм . синтеза ^ЛНК <НПК Вюцевтр Л Новосибирск). •. v Продукты синтеза были анализировамяы в 1Х-; Wapos^;' ном геле, -и в качестве маркерного; ДНК,использовали ДВД фагаГ JBitfK да, расщепленного EcoRI й Hind: 111. ?Синтеэированная :двухцеп6ч9ч4,: ная кДНК име?а молекулярный вес от. 500 до бСЮО.нукгеотйлта nap.: . В реакционную смесь для синтеза вводили '5-6 ыкг. РНК и выход кДНХ V оптимальных условиях синтеза составлял до 15 X rto отнооенио.к ко*' : личеству внесенной в реакционную систему. РНК цатрицы ( ьис. 2). :V ¡:

( -

- о -

f

o.'V »avi:

■ ■'■■'■ ■•ала

....... л . . . : ,. • 9.0»

t

■ I :

РиаЛ. Радаоартограф новери-гиОридизацда тотальных и поли "(À)+:'r РНК ^модачяой aajréeu /овда" бе-

та-лактогсюоу.вша коровы. 1.3-я колонка тотальных РНК, 2,4-гч ко-

лонка поли (А)+РШ.

» ;

"Í ..'

YY: i -У

- . \ h: V

Щ.. 2, ' ИШ : » J1:

...

'»/«г

#1

' • • r'wvk. * Y

■ . ;< ' X'S::

L , V tf Г?*.' '

1 '."■.'-. fJtifx

г íí г1"" -

»

ùiis^L,,

'. ' Pix. 2. Гадпоавтограф синтезированной наыатрице поли < . (А ï )+, 1Ш шда<шоЛ лэхэаы óoeiit 1.3 колонка — ДНК лякйда -> . роггх-лзшшя по EcoRI и Hind III.. 2 колонка- кДНК

Клонирование полученной кПНК в фаге лямбде jtlO осуществляли с помощь» набора " cDNA Clonlnr system- etlO" . Двухшпочечные молекулы .,кДНН с пришитыми по тупым концам EcoR I линкерами, имеющие липкие концы, использовали для лигирования при помощи ДНК-ли-га^'фага Тч. В качестве вектора взято эквимодярное соотношение ' левого и правого плеча ДНК Фага лямбда-ftlO, ! толе растепленного „ТО"сайту.EcoRI; после этого рекомбинатные ДНК упаковывали в фаго-частиц^). Упаковочный .экстракт ; непосредственно , использовали для амплификации библиотеки, высевая последнюю на чашки с агари-эованной YT-средой и клетками двух штаммов Б. coli.

Схема клонирования фрагментов кДНК белков молочной железы овцы приведена на рис. 3.

з. а скрининг кднк библиотеки .

Гибридизацию проводили не на самих бляшках, а. не разрушая их, на фильтрах -репликах. Рассев библиотеки генов, получение необходимого количества и размера бляшек при вторичных и третичных скринингах, требовало отработки методики адсорбции фага дямб-^ да-gtlO, а также изучения различных факторов, влияших на рост . бляшки.

Фаговые бляшки содержат не только амплифицированные частицы фага, но и значительные количества неупакованной свободной фаговой ДНК. Эта ДНК, даже если она в некоторой степени повреждена, представляет сс^ой неплохой субстрат для гибридизации. Поэтому.в наших экспериментах мы использовали в качестве гонда лишь' очищенный Pstl -Pstl кДНК фрагмент бета-лактоглобулина коровы.' Для отбора искомого клона, мы начинали поиск среди популяции 50 ООО. ре-комбинантных фаговых клонов. Исходя из титра рекомбинатных фагов в MV514 клетках, мы делали расчеты: если в 1 мо было 200000 фаговых частиц, то 50 ООО фаговых частиц содержалось в 250 мкл фагового экстракта упаковочной смеси, которую рассевали на 5 чашках.

При первичном скринировании библиотеки генов, высевали около 10 ООО фагсвых частиц на чашку Петри диаметром 9 си. На первом этапе скрининга в пяти таких чашах было получено 6 положительных сигналов. При вторичном высеве около 2000 Фаговых частиц на чашку было получено около 30 положительных ответов в каждой чашке Петри. На третьем этапе скрининга высевали около 200 частиц на чашку, и. в. результате гибридизации было получено ю положительных ответов только в одной чашке, соотететвующей одному изшести пер-

«ДНК псвос-гтсчо

^¿Ма .+ ШШт -

| лигировйиис

правое плечо

упаковочные экстракты

•С!_У + ~ +

I гмодификаций ФАГОВОЙ ДНК и к ДНК ,

Рмс.З. Схема клонирования к ДНК-библиотеки ' молочном жслеэм овцы.

воначалъных. рекоибинантких поло житель них клоков. Другие исходные бляшки.при гибридизации значительно уменьшим выявляемое количество сигналов.' ' '".■■..*'■■"■■. ' ;

/В результате скрининга кДНК библиотеки выделен 1 клон, хорошо гибридизующийся с зондом бета-лактоглобулина корова.

. В качестве отрицательного контроля взяли ДНК фага лямбда' еЬЮ. Методом дот-гибридизации, гибридизовали ДНК фага лямбда с зондом, при этой сигнала гибридизации не отшчалаеь. Эгады скрининга показаны в рисунке 4..

Рис.4. Радиоавтографы этапов скрининга кДКГС библиотеки. а)1-этап скрининг, б) II- этап скрининга.

^■

Ж- .. ••

J .«К /V.--'

1

'■■.«А« ■■ К , ■.-.'■

■¿•-"Л-;-;

- Ч

Рис. б. радиоавтограф блот-гибридизации рекоьйиназтшк ^ С. клонов е 3* -фрагиентои кДШ1бета-лактог^улша1«ровк1-Е1И ^ Фага лямбда расщепленная по Hind III, 2,3,4,6,6 - ДНЯ ровоШв-нантиых клонов, расщепленная по EcoR I. -Ь^'".;;^:"^

■ .-.13 - ': Анализ рекоибинантного клона " Из единичных фвговы* бляшек ¿исцеляли рекомбинантные фаговые ДНК,распвйлядиих андонуклеазой EcoR I, и гибриднаовали с ради-аатшю-шчеяым «ДНИ фрагментом сета-лактоглобулика коровы. В результате опредалэны наличие иразмер вставки, которая составила длияу окода г.З т.^п. Елот-гибридизация вставки представлена на

рисунке 5. : -. •'•• _—и.-.: л; "

Дм йссяедовшш структуры фрагмента использовали метод рестрикции перекрывавдпсс?! фрагментов^ ДЕШ, : В результате проведенного.; рвстрдацюитэгЬ; анализа установлено наличие сайтов для рестрнхтази i;; Нае III и Rsa I и была построена рестрикцион-иаа карге. (рте.б). .••..' ; "•/.'.;: ... . у у' :

е : ^ . ^

'^--У^Прмосвол» умлстжм клоннроавнйя. 1".;. -

-Р-.lCH^lOO«.л"у\^ СЬ'-EcoRl." Н, -Heel I г teal. .^aj^ijjp^ ..

••; ЛХВ* ^агменте. отсутствовал»: сайты BcoRl /Hi ^ шТ^ЙГ^п I r: Pst i ; ; HäKoTopujc * рестркктаз: ( Aya' No i; I, = Ava 11 v We I. ) которые npHBOiatca.-e.poOw et .а1.'(1в8б)в "наоем' распоряжении не имелось*:, 'поэтоц/-рамные ° понкын® . приводятся," рестриктаза Bgl I от-• носится:к редкоеаеояс^м ферментам,f ее сайты узнавания состоят, из 'сдедуйсзк нл^отшаш^г ¿снован^ сайты яв-

. ляюгсУ более иаркерншш^.' илм Солее информативны»» пежели : часто V встречаяояеся V сайты других рестриятаз. ,; эти! сайты редко "ветре ча-" юггея в ЬослеЬзватель ностях шлекул Присутствие' в последова-

тельности i кДНК фрагме нта тага» сайтов,: как » • Rsa I, и Нао III, и количества фрагментов ^после- расщепления этими' рестриктаэаш спадает с; аналогичными данньада. - которыо приводятся в работе

.Gay© P. et аЩЗвб).

Для научения-первичной структуры фрагмента нами было проведено субклонирование Bel¡-EcoR I фрагментов в Фаговом векторе Ш3мр16. А также было субклонирование It» 111- Нае III фрагментов в ллаэмнде pUC-lft, Полученной рекомзинантной ДНК трансформировали "штамм бактерии-хозяина ( Е coli TG 1 ), и в фаге 1Ü3 подучили около 30 белых бляшек. Из 30-г и отобранных и ' размноженных трансформантов методом щелочного лизиса выделяли плазмидную ДНК. Путем рестрикционного анализа сравнили их и отобрали для дальнейшей работы конструкции, содержащие вставку 1600 н.п. и ТОО u.a. Шделяли двухиитевую реяликатквиую форму ДНК фага ШЗ, содержащую вставку и„частично секвенировали ДНК с помощью прямого прайыера. □селе трансформации реномбинантов ( Нае111-Ка»Ш Фрагментов-»' pUC19 ) получили десятки белых колоний. Путем рестриктного анализа установили наличие в них вставки 600 м. п. и 400 н. п. Один .. клон, имеющий длину 400 я.п., секвенировали с помощью прямого цраймера. Этот НаеШ-НаеШ фрагмент частично перекрквал боль пой Bgll-E coRI фрагмент кДНК. Таким образом, мы определяли нукдеотид-нш. последовательности Bgll-HoelN фрагмента кДНК. Сравнивали секвенированныа последовательности ДНК с последовательностями гена бета-лактоглобулина овец из банка данные с помощью компьютерной программы MicroGeni«. В секвенированном участке кДНК, мы наш-V -ли-кодирующие последовательности, соответствушие 4-му, 5-му, и 6-му экзонам, а также некодирудае районы, гомологичние_>иштротшя районам. . ________—' . . ~ — ■ .

Также частично секвенировали второй; Е coRI- BjII фрагмент клонированный в векторе ШЗ с помощь» прямого праймера. В этом отрезке кДНК кодирующих.последовательностей не. встречалось, а были последовательности гомологичные нитронам.

1. ■ - • ■■'■■. GTOOTXGTCATCQCCATCATCGGCGTCT^ '

СОД AG AGG AQCGCC АААТТСХШТОТСССТ AT AQTQAGT CGTATT ACCTTGAAT GAGAACAAAG

T CC Г TGTGCT ПйА0*АС06.\СТ AC AAAAAGT АССГССТСТICTCC АТвЗАА A ACAÜTGCTGAQOC

______ j _•_ __ ____'____._• i_____ ^ _^_-

ШЛ'¡ОАААПССГ GGCCT GCCA3T OXT OCT С АСЗАШХХ/Й AGGTtitiACAACCAQOXCTGG A

. - 15> . .

ОАМТТСйАС АААСХХГГС ААОЭСОСТОСССАТ ЭС АС АТССЯЗСТТ(ЭОСТТ ААСССОАСССАНЗ .

ТО13АВЭООС№ГСССАО01СТ АОЭЗТ ААбСЮСТССС АТ АТТТ АС А03СТС

2,

АДААТТССОАТОСТССОСПАТССССТООБТАБСйГСАОСТТТАСАТСООССТСАСА

САВЭСТООСТССТТССДОССТСАТСОАСТСОСАТЗАТОЗАбАТТССОССТАТОААА

ОСТО(^(ЗАСЯЗВСАОСТСО6ССГСООСТ6(^00ТТТА1ТВОТОАТАААТСТБОАЗ

ССа31ОАКШ000ТАТ0СА1ЭСАСТ6^^

ОТТАТСТ ААОТСАСЗОСААСТА

Рис.7.. Первичные нуклеотидные последовательности кДНК фрагментов, подчеркнутые линей -последовательности кодируших районов.'- • . .

■ 3. 6. Изучение полиморфизма длин - рестрикционаых фрагментов гена бета-лактоглобулина овец '

Для,исследования;ЩР® нами.была взята кровь от овцематок породы каракульской, эдильбаевской, и романовской пород овец. Гест-рикш» ДНК в количестве 10 икг проводили эвдонуклеаэой Есой Руи II, разделяли фрагменты ДНК в О,6.Х-ном агарозном геле. В качестве специфических'зондов использовали клонированной 3'-концевой участок КДНК Оета-лакгоглобулина.коровы , а также "использовали, выделэной нами (Е,соЙ1-Вг11)'фрагмент кДНК Сета-лактоглобули-на овцы. Для усиления сигнала 'гибридизации использовали БО л-ный формамид в составе гибрвдиэационной смеси и гибридизацию проводи-* ли при 42* С.': Результаты авализа г'рестрикционяых. фрагментов ДНК приведены в таблице 1:•. V".'

Таблица 1.

ГЬлишрфкзм гена бета лактоглобулина овец после рестрикции геномной ДНК рестриктазами Е со(?1 и РуиП. ."",''

!

Рестриктаэа! Порода

■'■■ ■■■ .1 ■ X

-£-

I I В т.ч. животных имеших

I . I ------------—------

I п . I: фрагшнты ДШ« фрагменты ДНК 1 1 2800 Н. П. I 4600 и. п. ; ,

(.'Романовская I 5 I '5

■ 4

Б CORI

I

I

I Эдильбаевская! 10 t . 10

■ I ' ,.'■■ . Г ".л.'.'

(Каракульская I 10 I 10 •

I

г

I « • I фрагменты ДНК! ' фрагменты ДНК

I ; I i ЗООО К. П. I 1000 И. П.

(Романовская ! 6 I 8' '-:•■'■.'-* ' ■ "-^''2■ I Pvuïï 'I ■'■■;■■■ ";.

■ кЭдильбаевская! 9 г . 9 '. :'-■■'^-^г'.-V-^'i..:-

' : ! Г "i.;;! ' ^^y^Ajiyy- ' " ^

"■. IКаракульская » 9 « 9 '■■ \ --л ".é;."-.-1 I

■ ' " t ■, : ■.; . ïi v ' /Л■ ; ■ :-.^ ■ - ■ -^ '^■ *

Из таблицы, видно, что у некоторых особей романовской породы овец были выявлены полиморфные сайты для рестрикгаз ЕсоШ и РуиП. При испольвоваяии ЕсоЯ! - 2800 п.н., 4600 п. н., и Р\гиП -- 3000 п.н., 1900 п.н.. У эдильбаевских овец. . после расцепления ДНК рестрикгазой Есо1?1. установлены 2 сайта (2800 п. и., 4600 п.н.). Каракульские овцы отличались консерватизмом изучаемого гена.

Исследованные овцы относятся ;.к : древним породам-. домашних ; овец. -Едильбаевская порода;' : выведена как порода мясо-сального направления продуктивности на територни Западного ; Казахстана : и ■ совершенствовались с помощью народной селекции.! Каракульская по-.

; • , - ..■.: : Л,'-/ -17-

.рода толю выведена иного веков назад в Средней Азии в районе Бухары. История разведения этих мхвотных указывает на консо- • лидацгао породных признаков, на изолированную систему стад каракульских овёц, что могло отразиться неустойчивой структуре генома. '■'•.".■'■. 1 *'■■ ■ : '■ -. : - ■ ,, ■

-V-. также можно сказать,'что,-по известной рестриктной карте гена бета-лактоглобулина овец,-. EcoRI сайт отсуствует в структурной части гена и обнаруженный полиморфизм с использованием рестрикгаз EcoRI,': не, проявляется .на белковом уровне, н обусловлен изменением нуклеотидной. последовательности по дополнительным сайтам рестрикции для данной вндонукдеааы в некодирующэа области гена.

^против сайт CAgIctq для рестриктазы PvuII расположен внутри 5-го зкэона гена бета-лактоглобулина овцьг /33,34,81 /. Различия по длине рестрикционных фрагментов после расцепления ДНК овец рестриктазой PvuII обнаруживаются в результате точечной мутации в кодирующей части гена,', что может, приводить к полиморфгэду белка. По полученным данным можно сделать*вывод о том, что использование 1ЩРФ' уникального гена бета-лактоглобулина по сайтам EcoRÍ и PyuII,.: расширяет возможности молекулярного маркирования животных в гек^тико-селекционных исследованиях. ■

■¡■•■Л.' _■'■■"■-. выводы , • '.■■■'-

.1. Осуществлен^ молекулярный ; синтез ДНК комплементарных мРВК интенсивно - лавирующей ; молочной. ■ железы; овцы. Была подучена кДНК-библиотека генов в фаге/лямбда gtlO с представительностью 200000 рекомбинавтных клонов." ^ ; ..

2. Из полученной библиотеки;.выделен рекомбинантный клон, содержащий фрагмент:кДНК бета-лактоглобулина овец. .• з. .Иетодом рестриквдонного?анализаохарактеризована реюэмб*!-. нантная 'ДНК '¿.'составлена, ее,рёстрикгная карта.

. Щ. Субклонированы отдельные. фрагменты кДНК полученные после .■' расщепления рестриктазой Bell.и Нае III.в фаге "■ ШЗ мр18 и в ■ * плазмиде;pUC-19. * ;Выделены , несколько рекокбинантных клонов и сек-■вею^ваны\пмледователанмти^

V:" 'Шкмана воэможность^ использования; клонированного фрагмента в'качестве гибркдизаЫонкого эокда'для,' »?зученяя полиморфизма .гена.бета-лактоглобулина по структуре ДН&

6. У романовских ояец выявлен полиморфизм по структуре гена бета-лактоглобулика по сайту ЕсоИ в 80% случаев, 1 по Руц! I - в 25Х случаев, у адилабаевских овец по ЕсоЯ! сайту в 20Х случаев. Полиморфизм по 1МШ не был обнаружен. У каракульских овец не вявлен полиморфизм по сайтам ЕсоЯ! и РуцП.

Список работ, опубликованных по теш диссертации:

1. Бисенов У. К,, Чичилов А.В Выделение и характеристика поли (А)+ РНК из молочной желгвы овцы / Сб. тезисов Всесоюзного яа-учно-технического совещания по проблемам развития.биотехнологии животноводстве.-Дубровицы.-1990. -NZ, -с. 31. ч'

2. Висенов У. К. Выделение к клонирование кДНК бета-лзкгог-лобулияа овец // Бюллетень научных трудов ЕШа. -Дубровицы. -1092. - N10e.-c.124. ■ .-'..■;

3,. Висенов У.К., Шихов & Я., Чйчшюв А. 3., Пэпов А. Н. Удаление и характеристика поди (А) + РНК из молочной железы овцы //Еилетень научных трудов ВШа. - Дубровицы. -1992.-И. 106.' -с. 105.

4. Висенов У. К., Бакаева Т. Г.. Шихов Н^Я.. и др. Выделение и изучение структуры к-ДНК копий гена бе та- дактоглобулина овцы./ Сельхоэ. биология. 1S94 ( в печати).

г

Подписано*^печет*; . OI.Í 99 4т. - :}■' ■ J':', Заказ 549 , Тира* 75 Объём 0,9 уч. .-. изд. л.

вниша . . ;