Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и структурная характеристика кДНК-копии транскрипта гена бета-лактоглобулина овец

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и структурная характеристика кДНК-копии транскрипта гена бета-лактоглобулина овец"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СБЛЬСКОЮЗЯЛСТВЕШШ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО- ИССЛЕДОВАТБЛЬСШ ИШТОТУТ

яивотноводства.

На правах рукописи. • УДК. 575. ИЗ / 636.3.082.12

ексенов утепберген купер баев!«

ЕЬЩЕЛЕНИЕ И СТРУКТУРНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА кДШ-КОПИИ ТРА1ГСКРИПТЛ ГЕНА БЕТА-ЛАКТОГЛОБУЛИНА ОЕЕЦ.

03.00. 04 Биохимия.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

дуеробэды 1994

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Научный руководитель- доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Яковлев А. Ф. кандидат биологически наук Букаров К Г.

Ведущее учреждение: Всероссийский НИИ физиологии, биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Защита диссертации состоится " уЗ^¿¿¿¿/ТМ/^01- 1994 г. в ... . час. на заседании специализированного совета Д 020.16. 02. при Всероссиском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес: 142012, Московская область, Подольский район, поселок Дубровицы.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.

Шихов И. Я

Автореферат разослан

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

И. И. Шмыгин.

- з -

1. Общая характеристика работы 1.1. Актуальность темы:

Одной из основных проблем современной генетики в плане решения прикладных задач селекции, является выяснение закономерностей работы генов, возникновения их устойчивых ассоциаций, обуславливающих формирование генотипов с желаемым комплексом признаков. В установлении закономерностей формирования таких устойчивых ассоциаций, а гага© функционирования генных комплексов ведующую роль должны сыграть генетические модели, раскрывающие функциональные свяэи на макро-, микро- и молекулярном уровне.

Изучение структуры генов связанных с полезными признаками сельскохозяйственных животных представляет несомненный интерес как в теоретическом плане, так и для практического применения. Особо в этом отношении привлекают внимание исследователей белки иолока, как потенциальные генетические маркеры. Наиболее надежные результаты были получены при оценке полиморфизма белков молока-казеинов (Сп),бета-лактоглоСулинов (Lg), альфа-лактоальбуминов (Lab) оказывающих определенное влияние на качество продукта, его выход.

Белок бета-лактоглобулин проявляет полиморфные свойства, имея генетические варианты А, В. По данным ряда учен ых указанные генотипы обнаруживают связь с молочными качествами' животных. Установлено, что селективная ценность коров по типам бета-лактог-лобулина, альфа - и каппа-казеина определяется отбором по удою и количеству молочного жира , преимущество имеют коровы с типами бета-LgBB, альфа -CnAA, каппа-СпАА / Маринчук Г. Е. 1979/.

В то же йремя некоторые авторы /Маринчук Г. Е. , 1992; Graml R. et al., 1986; Hiñes H. С. et al., 1931/ высказали предположение о нетесном сцеплении между казеиновым комплексом и локусом бе-та-лактоглобулина.

Достижения молекулярной генетики, позволившие конструировать и клонировать рекомбинауные дик, вводить эту генетическую информацию в геном, открыли принципиально новые возможности

направленного изменения наследственности. При этом особый интерес представляют приемы создания и интегрирования в геном животных различных генных конструкций, в первую очередь анологичных имеющимся в их наследственной информации, т.е. гены той же специализации, но других видов животных и человека с разными регулятор-ными последовательностями.

При целенаправленном переносе генов, к примеру, под молоч-но-специфическим промотором, их экспрессия будет происходить в молочной железе трансгенных животных, и вместе с молоком будут выделяться необходимые белки. Щ>и этом выделенные ив молока реком-бинантные белки, как это уже отмечено, обладают специфической активностью, что указывают на способность ферментных систем клеток молочной железы к посттрансляционной модификации .

Исходя из зтих предпосылок изучение структуры генов и их представительства в геномной ДНК данной популяции, контролирующей синтез лактопротеинов, ученые считают важной задачей современной генетики. С другой точки зрения актуальны работы по созданию и клонированию молекулярных зондов, позволяющих идентифицировать изучаемые последовательности, а также исследовать полиморфность рестриктных фрагментов изучаемых генов.

В нашей работе была предпринята попытка получения представительных кДНК- библиотек из ткани лактирующей молочной железы овцы, и выделения клона комплементарного к мРНК бета-лактоглобулина. изучения его структурных последовательностей' методом рестриктного анализа, блот-гибридизации и секвенирования.

Цель и задачи исследований

Целью нашей-работы являлось выделение и изучение структуры кДНК гена бета-лактоглобулина овцы. Для достижения этой цели предполагалось решить следующие вадачи:

1. Выделение поли (А)+ РНК молочной железы овцы и характеристика транскрипции гена бета-Ь? с помощью "нозерн" блот-гибри-дизации.

г. Синтез и клонирование подноразмерной кДНК молочных белков овец в фаговом векторе лямбда-^10.

3. Проведение скрининга для выделения из кДНК-Сиблиотеки фрагментов гомологичных последовательностям кДНК бета-лактоглобу-

лина.

4. Структурная характеристика выделеных фрагментов кДНК бета- лактоглобулина с помощью рестрикции, блот-гибридизации и сек-венирования.

5. Использование кДНК фрагментов в качестве молекулярных зондов для ..изучения ПДРФ ( полиморфизма длины рестрикциониых фрагментов) гена бета-лактоглобулина разных пород овец.

Научная новизна и практическая ценность работы

В фаговом векторе лямбда-gtlO былдсоздана кДНК библиотека из молочной железы овцы. Выделен один клон, имеющий последовательность, гомологичную кДНК бета-лактоглобулина овец. Были охарактеризованы последовательности ДНК этого клона методом рестрикцион-ного анализа и на этой основе построена рестрикционная карта Рестрикционная. карта соответствует данным, которые приведены в работе Gaye et al. ( 1986 ). Были частично секвенированы последовательности ДНК этого клона. Впервые нзучен полиморфизм гена бета- лактоглобулина овцы' в межпородном и внутрипородном аспекте.

ДНК породы эдильбаевских. каракульских и романовских овец после растепления рестриктазами EcoRI и PvuII гибридизовались с кДНК бета-лактоглобулина. У романовской породы овец был выявлен полиморфизм длин рестриктных фрагментов при использованк рест-риктазы EcoRI (фрагменты 2800 пар нуклеотидов и, 4600 п. н.) и при использовании PvuII - 3000 п.н. и 1900 п.н.. У эдильбаевских овец, после расщепления ДНК рестриктазой EcoRI, также установлены два фрагмента - 2800 п. н. и 4600 п. н.. При использовании эндонук-леазы PvuII найден'только один фрагмент с длиной 1900 п. н. А у каракульских овец при рестрикции EcoRI найден один фрагмент -2800 п. н. и npi рестрикции PvuII - 1900 п. н..

Апробация работы

Основные результаты работы докладывались на 44-й научно-методической конференции аспирантов, и на семинаре отдела биотехнологии БИЖа. Полученный экспериментальный материал, представлялся на Всесоюзном научно-техническим совещании по проблеме развития биотехнологии в животноводстве ( Дубровицы 1990 г.), Республиканской научно-практической конференция молодых ученых и специалистов С Алма-Ата-1991 п.

Публикация

Пэ теме диссертации опубликовано 3 печатных работы.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 8i страницах машинописного текста и состоит из введения, -литературного обзора, материалов и методов, результатов работы и их обсуждения, выводов, списка использованной литературы. Работа иллюстрирована рисунками и содержит 2 таблицы. Список литературы содержит 111 источников зарубежных и отечественных авторов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Бактериальные штаммы и плаэмиды.

Штаммы: E.COL1 NM-514, ELcoll L-87, Е.coll TG. Для работы использовались ДНК фага Ш3лр18 и плазмида pUC-19 полученные от НПО " Биопол *\

Ферменты для рестрикции и клонирования: Е coR I, Hind III, Sma I, Rsa I , Pvu 1, Pst I, ALu I подучены от НПО- "Фермент" (Вильнюса Рестриктазы Bell, Bel II, Нае III, Фрагмент Кленова подучены от фирмы "Amersham ", а также щелочная фосфатага от фирмы "Sigma ".

Матричную РНК выделяли из свежезамороженной ткани молочной железы овцематок породы финский ландрас на 13-15-й день лактации с помощью гуанидинийтиоционата Поли (А)-»- РНК выделена методом хроматографии на олиго (dT)-целлюлозе.

Гибридизации РНК с кДНК бета-лактоглобулююм коровы осуществлялись "Northern" блот-гибридизацией. Использованы ниТроцеллюлоз-ные фильтры " Halbond " фирмы "Amersham".

Синтез кДНК проводили в один этап с помощью набора для синтеза молекул комплементарных ДНК („НПК Еиоцентр^' Новосибирск ).

Клонирование кДНК в фаговом векторе лябда-etlO осушэствля-ли с помощью набора " cONA cloning system - gtlO" фирмы "Arrersham U.К.". Для упаковки фаговой ДНК испольвованы упаковочный экстракт набора "Диагностикум".

Процесс скринирования кДНК-овой библиотеки генов молочных

»лез овец включал три этапа; приготовление фильтров-реплик для 'ибридизации, лизис клеток и денатурация'ДНК, гибридизация библиотеки с ДНК зондом. • Мечение зондов проводили с помощью реакции иик-трансляции по методике, предложенной Т. Маниатисом с соавторами ( 1984) либо согласно инструкции к набору для радиоактивного мечения фирмы " Amors hau U. К.".

Гибридизационной анализ рекомбинантной фаговой и геномной ДНК ( Southern. 1975) проводили в изотопном варианте на нейтро-

а

целлюлозных фильтрах ( Schleicher and Schuell ВА 85 ). В качестве зонда использовали участки 3'- конец кДНК бета-лактоглобулина коровы (любезно предоставленный Городецким С. И., ИБГ РАН) и выделенный кДНК фрагмент бета-лактоглобулина овцы.

При выделении ДНК бактериофага исходили из методики, предложенной Т. Маниатис с соавторами (1984) с некоторыми йот :фикациями. Работа включала 2 этапа. На первом' этапе выделяли, бактериофаг путем осаждения с помощью ПЭГ и NaCl. На втором этапе из препарата бактерифага выделяли ДНК. После осаждения фаговой частицы осадок растворяли в 5-10 мл ТЕ. Экстрагировали равным объемом хлороформа-изоамилового спирта. В водную фазу добавляли ЭДГА (20 мМ)и очищали путем фенол- хлороформной экстракции.

Гидролиз плазмидной. фаговой и геюмной ДНК рестриктазами, электрофорез и лигирование проводили в стандартных условиях ( Ма-ниатис и др., 1984 ), оптимизируя условия реакции согласно прописям фирм-изготовителей.

Для выделения фрагментов ДНК необходимой длины из агарозного геля и полиакриламидного гелей использовали метод злектроэлюции ( Маниатис и др., 1984).

Трансформацию Ecoli проводили по стандартной методике помощью хлористого кальция. Плазмидную ДНК бактерий выделяли с помощью щелочного лизиса с модификациями ( Маниатис и др. , 1984).

Для выделения геномной ДНК овец использовали метод Блика и Стаффорда (1976).

При секвенировании клонированной последовательности ДНК использовали метод Сэнгера основанный на синтезе ДНК с помочью полимеразы в присутствии смеси обычных дезоксинуклеозид трифосфа-тов ( dNTP), и аналогов -2,3- дидезоксинуклеозид трифосфатов (ddNTP) Использован набор НПО " Фермент ".

- 8 -

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 3.1. Выделение матричной РНК и изучение транскрипции гена бета-лактоглобулина овцу

В нашей работе использовали метод выделения РНК с применением солей гуанидиаия. Метод основан на способности солей гуанщда-ния в высоких концентрациях и других денатурирующее агентов разрушать комплекс рибонуклеопротеинов, что особенно целесообразно для клеток с высоким уровнем эндогенной рибонуклеазной активности. Мэлочная железа относится к такого виду тканей. Суммарную .поли ( А)+ РНК выделяли после ее очистки двумя циклами хроматографии на олито (dT)-целлюлозе. Всего было выделено из 20 г молочной железы около 100 мкг РНК. to результатом эксперимента ш получили высокоочищенный и стабильный препарат РНК, и в результате была синтезирована молекула полноразмерной iíshkлковдаз flsaiy от ■•. 500 до 3000 нуклеотидных пар.

Для изучения транскрипции гена бета-лагаоглобуллна вами била проведена . нозерн-гибридизация тотальных и поли (А) + РНК с ша«-транслированой 3'-концевой областью кДНК бота-лактоглобудацп коровы ( рис. 1).

При этом наблюдался слабый сигнал вблот-панглп гибридизации с тотальной РНК. в случае с поли (А) + РЩ выявлялся болго интенсивной сигнал гибридизации, зто означает, что отзюситеяькое содержание матричной РНК бета-дазстоглобудщц» увеличено и пропехо- . дит обогащение молекул поли (А)+ РНК.. (р;:е. 1). Транскрипционные / области в обоих молекулах РНК имели одинаковы*? размеру в районе 800 нуклеотидных оснований. В работе Gayo ot al.UCSS) uPHK Оо- .'. та-лакгоглобулина овец имела д&П1у ..785 иуклеотидиых. оснований.

3.2. Конструирование кДНК б::бл::отс-й; молочной ; ■ ■ келёзи овцы

Синтез двухцепочечной кДНК проводился одноврэмгшю в одной ;; реакции с помощью набора реактивов для синтеза/¡U¡HK (НПКЕлоцэнтр Новосибирск). Продукты синтеза были анализировании в 12-arápo?-.. ном геле, и в качестве маркерного ДНК, использовали ДЩ1 Сага ляиЭ- . да, расщепленного EcoRI и Hind 111.. Синтезированная двухцепочеч-ная кДНК имена молекулярный вес от 500 до 5000,нуклеотидных пар. В реакционную смесь для синтеза вводили 5-6 мкг РНК и выход кДНК оптимальных условиях синтеза составлял до 15 X по отношению к количеству внесенной в реакционную систему РНК матрицы С рис. 2).

я* £1

•«.к

• 9.«

• e.ss

s? •a.sa

• 3.01

• 0.5S •0.4J

■ü

Рис. 1. Радглавтограф нозерн-гибридизации тотальных и поли (Л)+ РНК молочной пэлезы овцы с 3'-концевой областью кДНК бе-та-лактогяобулипа норови. 1.3-я колонка тотальных РНК, 2,4-п ко-ЛСШ'Л поли (А)+ РНК.

. ..-¡v.-v-

jf.rv.l : . ¿1XG

ЧШ гул' "itir

к-й! Ш: #f . 12М . ]Sio ■ iOlt • 1JC1

. utr :

М ■ '.}</'■"

s п

, i - 4

г М-

|

Ж t'Si'-v ч;; " " ; к»'sr" reri'-'

■'.•Vi

Pitz.2. Радиоавтограф кДНК,' синтезированной на матрице поли (а К РНК ггагочпой яэлззы овец. 1,3 колонка - ДНК лямбда рас;г;,:.-эппая по EeoRI и Ilind III, 2 колонка- кДНК

Клонирование полученной кДНК в фаге лямбде etlO осуществляли с помощью набора " cDNA Cloning system- gtlO" . Двухцепочечные молекулы кДНК с пришитыми по тупым концам EcoR I линкерами, имеющие липкие концы, использовали для лигирования при помощи ДНК-ли-газы фага Тч. В качестве вектора взято зквимолярное соотношение левого и правого плеча ДНК фага лямбда-gtlO, тоже расщепленного по сайту EcoRI; после этого рекомбинатные ДНК упаковывали в фаго- <

частиц^!. Упаковочный экстракт непосредственно использовали для амплификации библиотеки, высевая последнюю на чашки с агари-зованной YT-средой и клетками двух штаммов Е.coli.

Схема клонирования фрагментов кДНК белков молочной кэлезы овцы приведена на рис. 3.

3.3. Скрининг кДНК библиотеки

Гибридизацию проводили не на самих бляшках, а, не разрушая их, на фильтрах -репликах. Рассев библиотеки генов, получение необходимого количества и размера бляшек при вторичных и третичных скринингах, требовало отработки методики адсорбции фага лямб-да-gtlO, а также изучения различных факторов, влияющих на рост бляшки.

Саговые бляшки содержат не только амплифицированные частицы фага, но и значительные количества неупакованной свободной фаговой ДНК Эта ДНК, даже если она в некоторой степени повреждена, представляет сг"*ой неплохой субстрат для гибридизации. Поэтому в наших экспериментах мы использовали в качестве зонда лишь очищенный Pstl -Pstl кДНК фрагмент бета-лактоглобулина коровы. Для отбора искомого клона, мы начинали поиск среди популяции 50 ООО ре-комбинантных фаговых клонов. Исходя из титра рекомбинатных фагов в NM514 клетках, мы делали расчеты: если в 1 мл было 200000 фаговых частиц, то 50 ООО фаговых частиц содержалось в 250 мкл фагового экстракта упаковочной смеси, которую рассевали на 5 чашках.

При первичном скринировании библиотеки генов, высевали около 10 ООО фаговых частиц на чашку Петри диаметром 9 см. На первом этапе скрининга в пяти таких чашках было получено 6 положительных сигналов. При вторичном высеве около 2000 фаговых частиц на чашку было получено около 30 положительных ответов в каждой чашке Петри. На третьем этапе скрининга высеЕали около 200 частиц на чашку, и в результате гибридизации было получено 10 положительных ответов только в одной чашке, соотетствующей одному из шести пер-

- и -

левое плечо УШШ/т

правое плечо

+ Щ>м/Л

| лигирование »2222223 упаковочные экстракты

| амплификация фаговой ДНК и кДНК

ШИШ^ШШШ

Рмс.З. £ясма клонирования кДЯК-вивлиотеки деолочмоя «слезы овцы.

воначальных рекомбинантных положительных клонов. Другие исходные бляшки при гибридизации значительно уменьшили выявляемое количество сигналов.

В результате скрининга кДНК биЗлиотеки выделен 1 клон, хоро-ио гибридизующийся с зондом бета-лаотоглобулина коровы.

В качестве отрицательного контроля взяли ДНК Фага лямбда дИО. Методом дот-гибридизации гибридизовали ДНК фага лямбда гИО с зондом, при этом сигнала гибридизации не отмечалось. Этапы скрининга показаны в рисунке 4.

а)1-этап скрининг, б) II- этап скрининга.

f,--

1

) .ш

1

Рис.5, радиоавтограф блот-гибридизации рзкоыбинантшя клонов с 3'-фрагментом кДНК бета-лактоглобулина коровы. 1-ДНй фага лямбда расшэпленная по Hlnd III. 2,3.4,6,6 - ДНК реиоыби-нантных клонов, расшрпленная по EcoR I.

-.133.4. Анализ рекомбинантного клона 1!з единичных фаговых бляшек выделяли рекомбинантные фаговые ЛНК, рао-ейдяли lix эндонуклеазой EcoR I, и гибридизовали с ради-сазсгиБПО-иэчгт.'м 1{ДНК фрагментом бета-лакгоглобулина корова В результате опрэдолены наличие и размер вставки, которая составила длзиу озаэло 2,3 т. п. п. Вдот-гибридизация вставки представлена на рисункэ 5.

Для исследования структуры фрагмента использовали метод растрищзш пэрегфивахгцихся фрагментов ДНК. В результате проведенного рэстризщионного анализа установлено наличие сайтов для ргстрпэтази Ejl I, üao III и Rsa I и была построена рестрикцион-«ая !?арта (рис.6).

Б- й ёв 1

• В-—Г— t, е

ПризгЙЕны участки клонирования.

Р;:с. 6. Рестр:::гг!'ая карта кДНК фрагмента бета-лактоглобулина озцу. lcu-lCOn. п.

. B.-SCCRI. И.-НаэШ. R.-Rsal. B.-B2II.

В Срзгмзлто отсутствовал! сайты , EcoRI, HtndHÏ, Вам HI, Pst I. Некоторых рестргепаз ( Ava I, Met I, Ava II, Dde I ) которые приводятся а рейотз Gayo ot al. (1986)в нашем распоряжении не имелось, ; поэтому дашгыэпо икм lis приводятся. Рестриктаза Bgl I от-4 косится,' к редкб0?пя0Ш фэршгсам, ее сайты узнавания состоят из следуггега кугигеотидиих основашй: -GCCNNNMÍNGGC. Такие сайты являетсяболее** маркерныул" или более информативными нежели часто встречаются' сайты других рестриктаз. Эти сайты редко встречается з последовательностях ьгалекул ДНК. Присутствие в последовательности кДНК фрагмента таких сайтов, как Bgl I, Rsa I, и Нае . III, и количества фрагментов после расцепления этими рестриктазами спадает с аналогичными данными, которые приводятся в работе

.бауе Р. et al.(1086).

Для изучения первичной структуры фрагмента нами было проведено субклонирование Bel1-EcoR I фрагментов в фаговом векторе Ы13мр18. А также было субклонирование Кае III- Нае III фрагментов в плазмиде pUC-19. Полученной рекомбинантной ДНК трансформировали штамм бактерии-хоэяина ( Е coli TG 1 ). ив фаге ШЗ подучили около 30 белых бляшек. Из 30-ти отобранных и размноженных трансформантов методом щелочного лизиса выделяли плазмидную ДНК. Путем рестрикционного анализа сравнили их и отобрали для дальнейшей работы конструкции, содержащие вставку 1600 н. п. и 700 н. п. Выделяли двухнитевую репликативную форму ДНК фага ШЗ, содержащую вставку и частично секвенировали ДНК с помощью прямого праймера. Шсле трансформации рекомбинантов ( НаеШ-НаеШ фрагментов-»-PUC19 ) получили десятки белых колоний. Путем рестриктного анализа установили наличие в них вставки 600 н. п. и 400 и. п. Один клон, имеющий длину 400 н. п., секвенировали с помощью прямого праймера. Этот НаеШ-НавШ фрагмент частично перекрывал большой Bgll-E coRI фрагмент кДНК. Таким образом,мы определяли нуклеотид-ныг. последовательности BelI-Hael11 фрагмента кДНК. Сравнивали секвенированные последовательности ДНК с последовательностями гена бета-лактоглобулина овец из банка данные с помощью компьютерной программы MicroGenie. В секвенированном участке кДНК, мы нашли кодирующие последовательности, соответствующие 4-му, 5-му, и 6-му зкзонам, а таюке некодирудае районы, гомологичные к интронньгм районам.

Также частично секвенировали второй Е coRI- Bgll фрагмент клонированный в векторе М13 с помощью прямого праймера. В этом отрезке кДНК кодирующих последовательностей не. встречалось, а были последовательности гомологичные интронам.

1.

cggcgecgtcatcggcatcatcqgcqtct6cttcaaaqatgag3cgaccagacaagcgtcakx3 i'(iaagagc"affigc(;aaattc;cggt(:tccctatagtgagtcgtartacc'rtgaatgagaacaaag

tlxu'tg'i'gl'atwaijaccgaotacaaamgtacc^gctcttctcc^alggaaaacagtgctgagcc

(ЗАМТТСОАСАМСССТСМОбСССТбСТОАТВСАСАТССВбСТТОССТТААСССбАСССАОС

ТВ0А6В00САБТ6ССАСХЗТСТА0С6ТАА6СТ0СТССХ!АТАТПАСА06СТС

2.

А^ТТСХХЗАТбСТССВбТАТССССТБбЗТАе^ВССАВСТТТАСАТСВВСбТСАСА САООСТО6СТСЕГТССАБС6ТСАТСОАСТСОСАТ6АТ66А6АТТСООССТАТ0ААА аЛ6ССТ0АГС0САВСТС6вСССГабСТ6(ЗСТ(ЗСТТТАТТ66Т6АТАААТСТ60Аа ССЭЗТ (ЗА(ЗС(5Т НЗЗТ АТСЗСАСЗСАСП ОЗБ(5СС АВАТ БОТ ААОСССТ СССБТ АТ СЗТ А ОТТАЮТ ААСТСАОвСААСТА

Рис. 7.. Первичные нуклеотидные последовательности кДНК фраг-• ментов, подчеркнутые линей -последователхнэсти кодирующих районов.

3.5. Изучение полиморфизма длин рестрикционных фрагментов гена бета-лактоглобулина овец

Для исследования ПДРФ наш была взята кровь от овцематок породы каракульской, эдильбаевской, и романовской пород овец. Рестрикцию ДНК в количестве 10 мкг проводили эндонуклеазой Есой т, Руи II, разделяли фрагменты ДНК в 0,8 Х-ном агарозном геле. В качестве "специфических зондов использовали клонированной 3'-концевой участок кДНК бета-лактоглобулина коровы , а также использовали, выделеной нами (Е соИ-В^П) фрагмент кДНК бета-лактоглобулина овцы.. Для усиления сигнала гибридизации использовали 50 Х-нЫй формамид в составе гибридизационной смеси и гибридизацию проводи-^ ли при 42°С. Результаты анализа рестрикционных фрагментов ДНК приведены в таблице 1.

Таблица 1.

Полиморфизм гена бета лактоглобулина овец после рестрикции геномной ДНК рестриктазами Е сой! и РуиП.

1 1 1 6 В т.ч. животных имеющих 1

! Рестриктаза! Порода 1 1 -.......... !

! 1 п ! фрагменты ДНК! фрагменты ДНК 1

! .1 1 2800 н. п. ! 4600 н. п. 1

1 Романовская 1 5 ! б 4 1

1 Е со!?1 1 1

1Эдильбаевская! ! | 10 1 10 2 .1 1

1 Каракульская 1 10 1 10

1 1 1 фрагменты ДНК! фрагменты ДНК 1

1 1 1 3000 н. п. 1 1900 н. п. 1

!Романовская 1 8 ! 8 2 1

1 РуиП ! 1 . 1 !

• Эдильбаевская) 1 ■ 9 : 1 9 - 1

1 Каракульская 1 1 : 9 1 1 < 9

Из таблицы, видно, что у некоторых особей романовской породы овец были выявлены полиморфные сайты для рестриктаз ЕсоЯ1 и РуиП. При использовании ЕсоРМ - 2800 п. н., 4600 п. н., и Р/и11 -- 3000 п. н. , 1900 п. н.. У эдильбаевских овец, после расщепления ДНК рестриктазой ЕсоЯ1, установлены 2 сайта (2800 п. н., 4600 п. н.). Каракульские овцы отличались консерватизмом изучаемого гена.

Исследованные овцы относятся к древним породам домашних овец. Эдильбаевская порода, выведена как порода мясо-сального направления продуктивности на територии Западного Казахстана и совершенствовались с помощью народной селекции. Каракульская по-.

рода тоже выведена много веков назад в Средней Азии в районе Бухары. История разведения этих животных указывает на консолидацию породных признаков, на изолированную систему стад каракульских овец, что могло отразиться на' устойчивой структуре генома.

■ ' Также можно сказать,' что, по известной рестриктной карте гена бета-лактоглобулина овец, EcoRI сайт отсуствует в структурной части гена и обнаруженный полиморфизм с использованием рестриктаз EcoRI, не проявляется на белковом уровне, и обусловлен изменением нуклеотидной последовательности по дополнительным сайтам рестрикции для данной эндонукдеазы в некодирующэй области гена.

Напротив сайт CAG^CTG для рестриктааы PvuII расположен внутри 5-го экзона гена бета-лактоглобулина овцы /33,34,81 /. Различия по длине рестрикционных фрагментов после расщепления ДНК овец рестриктазой PvuII обнаруживаются в результате точечной мутации в кодирующей части гена, что может приводить к полиморфизму белка. . Пэ полученным данным можно сделать* вывод о том, что использование ПДРФ' уникального гена бета-лактоглобулина по сайтам EcoRI и PvuII, расширяет возможности молекулярного маркирования животных в генётико-селекционных исследованиях.

ВЫВОДЫ

1. Осуществлен молекулярный синтез ДНК комплементарных мРНК интенсивно лактируюшэй молочной железы овцы. Была получена кДНК-библиотека генов в фаге лямбда gtlO с представительностью 200000 рекомбинантных клонов.

2. Из полученной библиотеки выделен рекомбинантный клон, содержащий фрагмент кДНК бета-лактоглобулина овец.

3. Методом рестрикционного анализа охарактеризована рекомб--нантная ДНК и, составлена ее рестриктная карта.

tf. Субклойированы отдельные фрагменты кДНК подученные после расщепления рестриктазой Bgll и Нае III в фаге ШЗ мр18 и в плазмиде pUC-19. Выделены несколько рекомбинантных клонов и сек-венированы последовательности ДНК этих субклонов.

5. Показана возможность использования клонированного фрагмента в качестве гибридизационного зонда для изучения полиморфизма гена бета-лактоглобулина по структуре ДНК

6. У романовских овец выявлен полиморфизм по структуре гена бета-лактоглобулика по сайту EcoRI в 80Х случаев, по PvuII - в 25X случаев, у эдильбаевских овец по EcoRI сайту в 207. случаев. Полиморфизм по PvuII не был обнаружен. У каракульских овец не вявлэн полиморфизм по сайтам EcoRI и PvuII.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Бисенов У.К., Чичилов А.Е Выделение и характеристика поли (А) + РНК из молочной железы овцы / Сб. тезисов Всесоюзного научно-технического совещания по проблемам развития биотехнологии в животноводстве. -Дубровицы. -1990. -N2. -с. 34.

2. Бисенов У. К. Выделение и клонирование кДНК бета-лактог-лобулина овец // Бюллетень научных трудов ВШа. -Дубровицы. -1992.- N106.-с. 124.

3. Бисенов У. К. , Шихов И. Я , Чичилов А. а , Попов А. Н. Выделение и характеристика поли (А)+ РНК из молочной железы овцы //Бюлетень научных трудов ВИНа. - Дубровицы. -1992.-М. 108. -с. 105.

4. Бисенов У. К., Бакаева Т. Г. Шихов И.,Я. и др. Выделение и изучение структуры к-ДНК копий гена бета-лактоглобулина овцы. / Сельхоз. биология. 1994 ( в печати).