Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Поиск и картирование генов-кандидатов в минимальной области локализациигена болезни Альцгеймера типа III (14g24)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Поиск и картирование генов-кандидатов в минимальной области локализациигена болезни Альцгеймера типа III (14g24)"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК НАУЧНЫЙ МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ ЦЕНТР

Р Г Б ОД

На правах рукописи

о УДК 577.214.622

» о !. л'( ¡: .э

Кирьянов Сергей Альбертович

ПОИСК И КАРТИРОВАНИЕ ГЕНОВ-КАНДИДАТОВ В МИНИМАЛЬНОЙ ОБЛАСТИ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЕНА БОЛЕЗНИ АЛЬЦГЕЙМЕРА ТИПА III (14q24).

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1996

Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики мозга Научного Центра Психического Здоровья РАМН и лаборатории генетики Нуslop Р. (Университет г.Торонто,Канада)

Научный руководитель: канд. биол. наук Рогаев Е.И.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Евграфов О.В.

кандидат биологических наук Георгиева С.Г.

Ведущее учреждение: Институт молекулярной генетики РАН

Защита состоится "_"_ 1996 г. в _час.

на заседании Диссертационного совета Д.001.16.01 Медико-генетического Научного Центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье д.1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ЦЕНТРА

Автореферат разослан "_"_1996 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор

Л.Ф. Курило

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Болезнь Альцгеймера (БА) - одно из наиболее распространенных нейродегенеративных заболеваний, поражающих лица среднего и старшего возраста. БА относится'к четвертой ведущей причине смертности в развитых странах мира, встречаемость заболевания - около 8-12 случаев на 1000 человек [Blass J., 1993]. Многочисленные данные свидетельствуют о определяющем влиянии генетических факторов на возникновение и развитие данного заболевания [Breitner J. et al, 1968].

БА относится к этиологически гетерогенным заболеваниям. Мрлекулярно-генетические исследования большого числа родословных и спорадических случаев БА позволили обнаружить как минимум три локуса, ответственные за возникновение одного общего патологического фенотипа, характерного для БА: прогрессирующая деменция, сопровождающаяся такими нейропатологическими чертами, как накопление нейрофибриллярных клубков; амилоидных отложений в виде сенильных бляшек в кровеносных сосудах и отделах мозга, особенно в неокортексе и в гиппокампе; потеря синапсов; массовая гибель нейронов и др. [Blass J.Р., 1993]. Первоначально было обнаружено, что в небольшом количестве семей (<5%) ранняя семейная форма БА (развитие заболевания в возрасте - 30-50 лет) ассоциирована с миссенс-мутациями в гене АРР, хромосома 21 [Goate A.et al, 1991]. Позднее для приблизительно 50% родословных с диагнозом поздняя семейная форма БА (развитие заболевания - после 60 лет), а также для спорадических случаев (менее 50%) была обнаружена ассоциация БА с эффектом "дозы" аллеля е4 АроЕ гена, локус 19ql3 [Saunders A.M. et al, 1993]. В 1992 году рядом авторов было показано очевидное сцепление ранней

семейной формы БА с локусом .14q24. Сцепление было установлено для более, чем 50% семей с.ранней формой БА [St.George-Hyslop Р. et al, 1992; Schelenberg.fi., et.al, -1992; :V^n,. proppkhQy1eJi С. et al, 1992}. Ген, картированной-в области хромосомы 14,.стал рассматриваться как "главный" ген БА. ,

Поиск и выделение данного гена (14q24), исследование его структурной организации и обнаружение сайтов мутации существенно расширит понимание основ патогенеза БА, и в перспективе позволит обратится к проблемам геннотерапевтических исследований.

Поэтому, актуальной проблемой, решением которой в сотрудничестве с другими занимается лаборатория молекулярной генетики мозга НЦПЗ РАМН, является поиск и выделение генов, локализованных в области 14q24, кандидатов на роль "главного" гена БА.

Для .решения данной задачи необходимо было проведение всего комплекса исследований по поиску, картирование, клонирование, мутационному анализу и идентификации гена, ответственного за развитие ранней семейной формы БА (14q24).

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в реализации одного из основных этапов стратегии поиска гена БА, а именно: в выделении транскриптов генов-кандидатов из минимальной области локализации гена ранней семейной формы БА (14q24.3.)

Для достижения поставленной цели необходимо было решить

1) усовершенствовать прямое выделение кодирующих последовательностей из исследуемой области генома;

2) оптимизировать скринирование библиотек полноразмерных транскриптов человека;

3) выделить и картировать в области локализации гена БА (14q24) транскрипты только функционально значимых генов;

4) отобрать кандидатные транскрипты и провести мутационный

анализ;

5) выделить регуляторные 5'- и 3'- участки генов для последующего изучения их структурной организации.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы получены следующие данные:

1) Выделение и картирование в области 14q24 транскриптов девяти новых генов человека, не представленных в данных EMBL/GENbank, позволило получить не только новые EST-последовательности, но может также способствовать проведению последующих исследований по анализу генов-кандидатов для изучения других наследственных заболеваний.

2) Впервые представлена транскрипционная карта минимальной области локализации гена БА типа III (14q24.3). Показано детальное картирование генов TGFb3, с- fos и Е2К, а также картирование других, ранее неизученных генов. Данная информация представляет интерес с точки зрения изучения генной организации малоисследованной области генома человека, локус 14q24.3., особенно в рамках проведения программы "Геном человека".

3) Картирование и исключение из числа реальных генов-кандидатов гена дигидролипоамидсукцинилтрансферазы (Е2К).

ческих аспектов данной работы, хотелось бы отметить следующее: - Построение транскрипционной карты, выделение и клонирование регионспецифичных фрагментов кодирующих последовательностей и 5'- регуляторных участков генов, получение полноразмерных транскриптов генов-кандидатов из минимальной области локали-лизации гена ранней семейной формы БА типа III (14q24.3) -все это, являлось необходимым этапом и составной частью

. С точки зрения научно-практи-

5.-406

совместной работы, которая завершилась выделением гена S-182, гена, ответственного за развитие данного заболевания.

Мутационный анализ гена S-182, проведенный коллегами в Университете г.Торонто (Канада) подтвердил связь обнаруженных мутаций с развитием ранней семейной формы БА типа III [Sherrington R. et al, 1995],

- Разработанный нами метод быстрой детекции CpG-островков

на основе ПЦР- амплификации с использованием "Not-вырожден-ного" праймера позволяет оперативно выделять 5'-регуляторные участки генов непосредственно из фракций геномной ДНК. Данный подход является, по нашему мнении, неплохой альтернативой современным методам выделения 5'- участков генов как с точки зрения эффективности детекции, так и простоты и оперативности использования. Метод Not-ПЦР-детекции позволил получить пробы CpG-обогащенных последовательностей, полезных для скринирования библиотек кДНК и геномной ДНК, а также для последующего изучения статуса метилирирования CpG- островков генов.

1. Выбор стратегии поиска: для целенаправленного скринирования библиотек кДНК человека предложено использование регионспецифич-ных эволюционно консервативных кодирующих фрагментов кДНК.

2. Выделены 12 индивидуальных транскрипционных единиц из минимальной области локализации гена БА типа III (14q24.3).

3. Определение нуклеотидной последовательности транскриптов позволило идентифицировать известные гены: c-fos, TGFb3 и Е2К, а также предположить обнаружение 9 новых генов человека, данные по гомологии с которыми не представлены в EMBL/GENbank.

4. Впервые построена частичная транскрипционная карта минимальной области локализации гена БА типа III (14q24.3) в интервале длиной около 2.6 м.п.н., ограниченном маркерами D14S61 и D14S77.

5. Мутационным анализом открытой рамки считывания ген дигидро-липоамидсукцинилтрансферазы исключен из числа реальных генов-кандидатов на роль гена БА.

6. Предложен метод оперативного выделения 5'-участков генов ПЦР-амплификацией фрагментов геномной ДНК с использованием

"NotI-вырожденного" олигонуклеотидного праймера.

межлабораторном семинаре Института клинической психиатрии НЦ ПЗ РАМН (1996 г.) и конференции РАМН по психическим заболеваниям, посвященной памяти Вартаняна М.Е. (1996 г.). Результаты представлены на Международном Генетическом Конгрессе (Монреаль, 1994

г. )

страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включает таблиц и рисунков. Список цитируемой литературы насчитывает 194 работы.

В работе были использованы: ДНК. 1). Для картирования транскриптов и фрагментов геномной ДНК использовали панели EcoRI-обработанной ДНК YAC клонов, картированных в локусе 14q24.3.(СЕРН Mega YAC, Чумаков И., Париж, Франция).

Результаты исследований доложены и обсуждены на

. Диссертация изложена на

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2). Для отбора фрагментов кДНК по критерию эволюционной консервативности и колирующей цениости использовали панели ДНК животных (ZOO-панели) ("BIOS", США), содержащие EcoRI- обработанную ДНК из соматической клеточной пинии гибрида человек/мышь HMR14. Библиотеки кДНК: 1). Для выделения регионспецифичных кодирующих последовательностей использовали хромосомспецифичную минибиблио-теку кДНК мозга человека, средний размер EcoRI вставок кДНК -около 500 п.н. Клонотека кДНК была любезно предоставлена Ronimens J. (Университет Г.Торонто, Канада). Также была использована клонотека кДНК, сконструированная в ходе данного исследования с применением метода магнитного захвата [Lovett et al, 1992]. Фрагменты КДНК вставок были прямо амплифицированы из бактериальных клонов с использованием М13 универсальных прабмеров. ПЦР-амплификацию проводили в следующем условиях: рекомбинантные клоны суспендировали в стерильной деионизованной воде, проводили, "горячий старт" (100°С- 5 мин.), 35 циклов амплификации (95°С-20 сек., 56°С-15 сек., 72°С-20 сек.) и цикл достройки (72°С-5 мин.)

Для удаления клонов кДНК, содержащих последовательности рибосомальных повторов, проводили гибридизацию с рибосомальной ДНК человека и блокирующим агентом cot1ДНК ("Gibco BRL"), как рекомендовано [ Morgan et al,1992 ].

2). Для выделения полноразмерных транскриптов были использованы библиотеки кДНК мозга человека:

2).1. коммерческая библиотека кДНК "лямбдаZAPII" из гипоталамуса двухлетней девочки (средний размер Есог1-вставок кДНК - около 2000 п.н.) ("STRATAGENE", США];

2).2. плазмидная библиотека "нормализованной" кДНК из коры головного мозга мужчины (средний размер Notl/PstI вставок - около 1800 п.н.) [подарок Soares М.В., Колумбийский Университет, США];

Двойное скринирование библиотек кДНК проводили гибридизацией с пулами индивидуально меченных 32Р регионспецифичных кодирующих фрагментов кДНК против 200000 клонов и против 150-3.00 "бляшек" или колоний, выделенных из клонов в области сигнала, использовав модефицированный метод Carlock L. [Carlock et al, 1992]. Отобранные фагемидные частицы "лямбда ZAPII" были трансформированы в штамм E.coli SOLR с применением ExAssist/SOLR фаговой системы, как рекомендовано фирмой-изготовителем [STRATAGENE, США]. Клоны кДНК отбирали цветной селекцией рекомбинантных колоний по Xgal/IPTG и выделяли плазмидную ДНК методом щелочного лизиса с PEG8000- модефикацией [Маниатис и др., 1986].

Стандартные процедуры по очистке, клонированию кДНК, выделению РНК, получению транскриптов для мутационного анализа, Southern гибридизации с ДНК YAC клонов и ZOO панелями проводили, как рекомендовано [Маниатис и др., 1986]. Все клоны кДНК, картированные в области локализации гена БА (14q24.3), были подвергнуты мутационному анализу ОТ-ПЦР-секвенированием [ Grompe М., 1993 ].

Для выделения 5'-участков генов применяли собственный метод "Ыо^-ПЦР-детекции, основанный на использовании "векторетной" [Rilley et al, 1991] и Alu-ПЦР- амплификации [Nelson et al, 1991](Пояснения представлены в главе "Результаты и обсуждения").

Определение нуклеотидной последовательности клонов кДНК и

фрагментов геномной ДНК проводили по методу Сэнгера [Sanger et

al, 1977]. Определение гомологии и идентификацию транскриптов по

данным EMBLE/GENEbank проводили с использованием компьютерной

программы BLAST. ¿-«06

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

Избранная стратегия поиска генов-кандидатов заключалась в выделении из анализируемого хромосомного участка 14q24.3 всех функционально значимых экспрессирующихся последовательностей (1), построении транскрипционной карты (2), идентификации выделенных генов (3) и проведении мутационнох'о анализа (4). Стратегия реализовывалась, во-первых, выделением регионспецифич-ных кодирующих последовательностей кДНК человека. Для чего проводили Southern гибридизацию фрагментов кДНК мозга человека с панелями ДНК YAC клонов, перекрывающих анализируемый участок локуса 14q24.3. Отбор эволюционно консервативных кодирующих последовательностей проводили гибридизацией с ZOO-панелями, содержащими EcoRI-обработанную ДНК соматической клеточной линии гибрида человек/мышь, хромосома 14 человека. Отбор фрагментов кДНК предварялся удалением клонов кДНК, содержащих рибосомальные последовательности, и реализовывался прескринирующей гибридизацией с рибосомальной ДНК и блокирующим агентом (cotíДНК).

Далее проводили выделение протяженных последовательностей кДНК скринированием библиотек полноразмерных транскриптов человека. В качестве зондов гибридизации использовали наборы индивидуально меченых коротких регионспецифичных фрагментов кДНК. Изолированные клоны кДНК проверялись YAC-картированием. Для организации выделенных транскриптов в индивидуальные транскрипционные единицы проводили дот-гибридизацию клонов кДНК друг с другом и с набором исходных регионспецифичных фрагментов кДНК. Определение нуклеотидного состава и сравнение гомологии с данными EMBL/GENbank было использовано для окончательной идентификации генов. Картирование выделенных транскриптов в

области, ограниченной маркерами D14S61 и D14S268, внутри минимальной области локализации гена БА (14Й24.3), позволило отобрать из их числа гены-кандидаты для мутационного анализа.

Физическое картирование. Для построения транскрипционной карты минимальной области локализации гена БА (I4q24.3), первоначально перекрытой YAC клонами в интервале, ограниченном теломерно маркером D14S53 и центромерно маркером D14S268, воспользовались физическим картированием YAC клонами. Область протяженностью около 3.6 М.п.н. была перекрыта восьмью YAC клонами (СЕРН Mega YAC, Чумаков И., Франция). Суммарные данные о размерах YAC клонов, обнаружении химеризма и наличии делеций в 797dll и 854f5 YAC клонах показаны в таблице N1.

Для обнаружения перекрывания YAC клонов между собой проводили Alu-ПЦР- амплификацию и ПЦР-амплификацию STS-проб. Нами было детектировано перекрывание 854f5 с 797dll, и 797dll с 964е2 YAC клонов (Таблица N1). Детекция YAC-концевых фрагментов проводилось методом "векторетной" ПЦР- амплификации [Rilley et al, 1991] .

кросс-гибридизации с 964Е2, 797D11, 741ВЗ, 854F5, 746В4, 905С2 и 788Н12 YAC клонами и селекции на эволюционную консервативность было отобрано около 100 клонов кДНК мозга человека, содержащих кодирующие последовательности, локализованные в области, ограниченной анонимными маркерами D14S61 и D14S277. Отобранные клоны регионспецифичных кодирующих фрагментов кДНК (размер вставок - 200-700 п.н.) были использованы для скринирования библиотек полноразмерных транскриптов человека.

В ходе скринирования библиотеки кДНК "лямбда ZAPII " и

-Человека. На основании

Таблица 1. YAC клоны, используемые для физического

картирования хромосомспецифичного участка 14q24.3, ограниченного маркерами D14S53 и D14S268.

YAC клоны

Размер (т.п.н.)

Наличие химерного конца

Наличие

делеции

---------+--------+_

932с7 | 900 I

Маркеры

детекции

_+---------_+

| D14S53 '| | D14S42 |

746Ь4

1800

---------+--------+.

854f5 I 750 I

D14S61 D14S76 D14S273

D14S76 D14S273

797dll

800

---------+--------+-

741ЬЗ I 600 I

D14S76

D14S273

rscat3

---------+--------+-

964е2 1 450 I

rscat3 | D14S43/71

I

D14S43/71| rscat3 j

905с2

1800

rscat6 D14S77 D14S277 D14S268

788hl2

1700

| rscat6 | D14S77

| D14S277 -+----------

библиотеки "нормализованной" кДНК "Soares" было отобрано 37 клонов кДНК с размерами.вставок от 900 до 2800 п.н. Клоны кДНК были дифференцированны сравнением сигналов детекции и их количеством на одной дорожке при гибридизации с YAC клонами (1) и ZOO-панелью (2), кросс-гибридизацией друг с другом (3), дот-гибридизацией с исходными регионспецифичными фрагментами кДНК (4), сравнением представленности транскриптов в библиотеке кДНК

+

+

"лямбда ZAPII" относительно частоты сигналов при скринировании 100000 клонов (5). Определение нуклеотидного состава позволило окончательно организовать 12 индивидуальных транскрипционных единиц, содержащих открытую рамку считывания (ОРС). Клоны кДНК, выделенные из библиотек кДНК "лямбдагАРИ" и "Soares", были обозначены, соответственно, как Z- N и S- N.

(размер вставки около 1200 п.н.) был обнаружен гибридизацией с регионспецифичным фрагментом кДНК 854-ЗА-7 (1 сигнал на 100000 анализируемых клонов)..Локализация Z- 2 была определена на основании кросс-гибридизации только с 854F5 и 797D11 YAC клонами

Клон Z- 3, с размером вставки 1800 п.н., был обнаружен пробами кДНК 964-4В-1, 21 и 43 и кросс-гибридизовался только с 964Е2, 797D11 и 741ВЗ YAC клонами с детекцией трех EcoRI-фраг-ментов ДНК на каждом. Данное наблюдение свидетельствовало о наличии в соответствующем гене минимум трех экзонов, разделенных протяженными последовательностями интронов. Детектируемые при гибридизации с YAC клонами EcoRI-фрагменты ДНК соответствовали таковым при гибридизации с геномной ДНК человека хромосомы 14 ZOO-панели. Представленность в библиотеке кДНК "лямбда ZAPII" составила 1 сигнал на 100000 анализируемых клонов. ,

Клон Z-90 (вставка - 1300 п.н.) также гибридизовался с 964Е2, 797D11 и 746ВЗ YAC клонами с детекцией трех EcoRI-фрагментов на них. Отличие от клона Z- 3 состояло в обнаружении дополнительного, интенсивного сигнала при гибридизации с тотальной геномной ДНК человека, что отмечало наличие высокогомологичной последовательности ДНК не на хромосоме 14. Результаты гибридизации клона Z-90 с панелью YAC клонов показаны на Рис. 1.

Z-90 был представлен в библиотеке кДНК "ZAPII" с частотой

4-lt0b

сигнала 1:100 ООО, но не гибридизовался с клоном Z-3 и клонами коротких фрагментов кДНК, которые кросс-гибридизовались с последним. Данные кросс-гибридизации Z-90 с клонами кДНК 964-4А-49, 78 и 964-4В-12, 89 подтверждали предположение о принадлежности клонов Z- 3 и Z- 90 к различным генам.

Определение нуклеотидного состава Z- 90 и перекрывающихся с ним клонов кДНК 9.64-4В-12 и 964-4В-89 обнаружило 93% гомологию с геном субьединица 2 дигидролипоамидсукцинилтрансферазы (Е2К) крысы.

Данные по гомологии клонов Z-2hZ-3c нуклеотидными последовательностями, представленными в EMBL/GENEbank, не были обнаружены, что позволило предположить выделение нами транс-криптов новых генов человека.

Клон Z- 30, размер вставки - около 1600 п.н., выделенный скринированием библиотеки кДНК пробой 854-ЗА-21, был наиболее широко представлен, с частотой более 8 сигналов на 100000 клонов. Локализация Z-30 была определена на основе кросс-гибридизации только с 746В4 и 854F5 YAC клонами. Сравнение нуклеотидной последовательности Z- 30 и ему гомологичных клонов (Z- 39, Z- 45 и Z- 51) с данными EMBL/GEN-bank позволило идентифицировать ген c-fos, анализ и исключение которого из числа генов-кандидатов БА было продемонстрировано ранее [Rogaev et al, 1993].

Как показано на Рис. 2, в области, перекрываемой 964Е2, 741ВЗ и 797D11 YAC клонами был обнаружен еще один транскрипт, клон кДНК S- 71. Данный клон был детектирован пробой 964-4А-30 и не гибридизовался ни с одним из представленных транскриптов.

Кпон S- 130 был обнаружен пробой 746-2А-64 и картирован

Рис. 1. Southern гибридизация клона кДНК Z-90 {Е2К) с EcoRI-обработанной ДНК YAC клонов и панелью EcoRI-обработанной ДНК гибридов.

12 3 4 5« ми

дор.1 - ДНК YAC 741ЬЗ; Дор.З - ДНК YAC 964е2; Дор.4 - ДНК YAC 797dll; Дор.6 - тотальная геномная ДНК человека. Показан дополнительный сигнал гибридизации не на хромосоме 14.

Рис. 2. Southen гибридизация клона кДНК S^71 с EcoRI-

обработанной ДНК YAC клонови панелью EcoRI-обработанной ДНК гибридов.

i 2 3 4 5 6 7 3 9

10 it /2 /а

Дор.1 - ДНК YAC клона 741ЬЗ; Дор.З - ДНК YAC клона 964е2; Дор.4 - ДНК YAC 797dll; Дор.Ю'- геномная ДНК мыши; Дор.11 ДНК линии HMR14; Дор.12 - ДНК хромосомы 14 человека; Дор.9 и 13 - тотальная геномная ДНК человека.

Таблица N 2 Суммарная характеристика клонов кодирующих последовательностей, выделенных из области локализации гена болезни Альцгеймера , тип III, локус 14q24.3, ограниченной маркерами D14S61 и D14S77

Кодирующие последовательности, используемые, для скрининга CI"- перекрывающиеся клоны) Кросс- гибридизация с YAC клонами Клоны, выделенные из "ZAP-U" "Soares" Кросс-гибридизация с YAC клонами к*ЩИ»ИДу- альная транскрип 1ДО»мая единица Общий транскрипта (л.н. ) Сравнение с JlHlliMI EMBVQENbar*

1) 854-3FA-7 854f5 797d11 Z-2 S-21 85415 797d11 Z-2 1200 нет (уникаль.)

964-В-1; 21; 43; 2) 44; 55; 60; 94 964-А-5Ь; 38; 40; 60; 72 964e2 797d11 741ЬЗ Z-3 S-108 (З'-НТР) 964(3) 797(3) 741(3) Z-3 1800 нет ( уникаль. )

964-4Ь-12 964-4Ь-89 3) 964-4а-49 964-4а-78 964е2 797d11 741ЬЗ Z-90 964(3) 797(3) 741(3) Z-90 1400 Е2К

4) 854-F-21 854fS 746Ь4 Z-30 Z-49 Z-35 Z-50 Z-51 854f5 746Ь4 (1) Z-30 1600 c-fos

964-4А10 5) 964-4А-5 964-4В-9 964е2 797d11 85415 Z-112 S-41 S-48' (З'-НТР) 854f5 (1) 964«2(1) 7S7d11(1) Z-112 2200 81% гомология ТО 8142

964-4А-3; 1; 15; 17; 59 6) 964-4А-33; 87; 50; 87 964-4B-22J 68 964е2 7B7d11 85415 Z-113 S-49 >3 клопов 964в2(4) 797 (4) 741 (4) Z-113 2400 нет (уникаль.)

964-48-11/4А-28 7) 964-4В-49 964-4А-94 905с2 788Ы2 964е2 Z-128 S-115 (З'-НТР) 905с2 <2) 788 (2) 964е2 (2) Z-128 2000 93% гомология к EST (HSB94D06I)

964-4А-7/4А-68 8) 964-4А-27 797Й11 964е2 S-15 S-31 S-15 1800 74% гомология EST (Т03705)

9) 964-4А-30 964в2 797d11 854f5 S-81 S-71 >6 кланов 964(1) 797(1) 741 (1) S-71 1300 нет (уникаль.)

10) 746-2А-64 746b4 S-130 S-131 746Ь4 (1) S-.130 • 1600 TGFp3

11) 746-2А-80 746Ь4 S-108 S-113 S-114 746Ь4 (1) S113 1600 нет (уникаль.)

12) 797-400 Ьр 797d11 S-121 S-125 797d11(1) S-125 1450 нет (уникаль.)

13) RMF-14 905с2 788И12 S-171 905с2 788М2 нет ^уникаль.)

кросс-гибридизацией только с YAC клоном 746В4, т.е. в интервале области, фланкированной маркерами D14S61 и D14S76 (Табл. N1). Определение нуклеотидного состава клона S-130 и сравнение с данными EMBL/GENbank позволили идентифицировать 100% идентичность с геном бета-3-тканеспецифичного фактора роста нервов (TGFb3) человека, ранее исключенным из числа кандидатов на роль гена БА [ Haines et al, 1993 ].

Суммарные данные по детекции, локализации и предварительной идентификации всех выделенных транскриптов представлены в таблице (Таблица N2).

Транскрипционная карта минимальной области локализации гена

Dl4S77■Выделенные клоны кДНК были организованы в 12 индивидуальных транскрипционных единиц и картированы на хромосоме 14, внутри минимальной области локализации гена БА типа III (14q24.3). На основании данных физического картирования, кросс-гибридизации клонов кДНК и секвенирования была построена частичная транскрипционная карта исследуемой геномной области протяженностью около 3.0 м.п.н., представляющая локализацию выделенных транскрипционных единиц в интервале между маркерами D14S61 и D14S77 (Рис. 3).

В области локализации гена TGFb3 (клон S- 130) между маркерами D14S61 и D14S76 в интервале около 500 т.п.н., перекрываемым только 746В4 YAC клоном, был картирован транскрипт S-113.

Далее, в центромерном направлении был картирован ген c-fos в области, центромерно прилегающей к маркеру D14S76, перекрываемой только YAC клонами 854F5 и 746В4. Центромерно относительно c-fos гена был картирован транскрипт Z-2 в области, ограниченной

маркерами D14S76 и D14S43/71 и перекрываемой 854F5 и 797D11 YAC.

S-UÛÉ

со ä

E О 0\0 4

lû О

О

2

О

(У

4 *

Ё1 со

¿s -5

а

СХ-

Е -4 =1 ¿Em

vU t

f -л lô

cc

3: 3:

О

3

J

t= л S

Ci-

s №

X ui t>

СО 1Л

со LÍ?. A

1/2 О со CO lO eO CO.

CM Of » i U- О

N О 1/2 t-

81

Nï [

<

Ф en

гт> СО ■Í -J-(O

\ tn ^

SESfroraisíLéSÍ?

л ^ cJ— ^ T" - — cncJu. IN s- О >Л in м LilN N >A <л M VIN О «Л «Ii-

/I

Sí

oO o¡

«а

cOcsl

10 О

СО 00 N

d

t-1-

m -J .

Б

d

Ultn <тю _

\o -- X-&1

fe -5-

д

ЛО-

4J

iL

"Г

ft

> I i

|in

«iCO v£> i

tí> О

IV О

CM CO 0s*

irt \0

< ui

H

Транскрипт S- 125, организованный из перекрывающихся клонов S- 121 и S- 125, был картирован еще ближе к маркерам D14S43/71 на основании кросс-гибридизации только с 797D11 YAC клоном.

Данные о существовании делеций в 854f5 и 797dll YAC клонах (Табл. N1), и специфичная кросс-гибридизация с 854F5, 964Е2 и 797D11 YAC клонами позволили предположительно картировать транскрипт Z- 112 центромерно относительно S- 125 и теломерно относительно транскрипта S- 15. Последний был картирован кросс-гибридизацией с 797D11 и 964Е2 YAC кпонами и показал 74% гомологию EST-последовательности Т03705, представленной в данрых GENbank.

В области, теломерно прилегающей к маркерам D14S43/ 71, перекрываемой 797D11, 741ВЗ и 964Е2 YAC клонами, в интервале около 300 т.п.н. была картирована группа из четырех отдельных

транскриптов Z-3, Z-90 (Е2К), Z-113, S-71.

Также были обнаружены несколько неперекрывающихся с другими клонов кДНК, принадлежащие данной области локализации, но при гибридизации с ZOO панелью не показавшие филогенетической консервативности.

В не менее протяженной области (около 400 т.п.н.), фланкированной маркерами D14S43/71 и D14S77, и перекрываемой 964Е2, 905С2 и 788Н12 YAC клонами, был картирован транскрипт Z- 128, который кросс-гибридизовался с четырьмя короткими регионспеци-фичными фрагментами кДНК (Табл. 2). Кроме того, было выделено несколько неперекрывающихся между собой и с Z- 128 коротких консервативных фрагментов кДНК (RMF-14, RMF- 60, RMF- 62 и др.), дифференцированных на основе сигналов кросс-гибридизации с YAC.

Идентифицированные транскрипты генов TGFb3 и с- fos были исключены из дальнейшего анализа, на основании данных, отрицаю-

щих наличие сайтов мутации БА в указанных генах [Rogaev et al, 1992] .

Картирование и идентификация гена Е2К в минимальной области локализации гена БА типа III (14q24.3), одного из реальных генов-кандидатов [Ali et al, 1994], позволило сконцентрироваться на мутационном анализе именно этого гена (см., ниже).

Таким образом, была построена транскрипционная карта участка локуса 14q24.3 в интервале, ограниченном маркерами D14S61 и D14S77, что составляет около 3/5 длины минимальной области локализации гена БА типа III (Рис. 3). Также были получены пробы кДНК для последующего скринирования хромосомной области, расположенной центромерно, между маркерами D14S77 и D14S277.

Во время написания диссертационной работы коллеги из Университета г.Торонто (Канада) завершили скринирование указанной хромосомной области. Им удалось выделить транскрипт S-182, мутационный анализ которого позволил идентифицировать ген БА типа III [Sherrington R., 1995]. ОТ-ПЦР-секвенирование ОРС S-182 больных членов шести родословных БА, показавших сцепление с локусом 14q24.3, позволило детектировать пять различных миссенс-мутаций при сравнении со значительной выборкой нормальных индивидов (> 180 человек). Мутации локализованы в консервативных областях мембранных доменов постулированного пептида, а также в неконсервативной гидрофильной петле. Было сделано заключение о патогенном характере мутаций, вызывающих нарушение (или потерю) функции кодируемого пептида, что влечет за собой развитие наиболее ранней, названной "агрессивной", формы БА.

Обнаружение гена-гомолога Е5-1 (идентичность аминокислотной последовательности 63%) на хромосоме 1 позволило детектировать '

мутацию Met->Val, у четырех больных членов родословной ранней формы БА итальянского происхождения, не показавшей сцепления с хромосомой 14 [Rogaev Е., 1995]. Также была обнаружена мутация Asn->Ile у больных БА из семей волго-германсксго происхождения. Приведенные данные позволили предположить существование БА типа XV (lql7) [Rogaev E.et al, 1995].

Таким образом, представленная стратегия поиска гена БА типа III (14Й24.3) состояла в выделении из анализируемой области генома всех функционально значимых экспрессирующихся последовательностей, построении транскрипционной карты и идентификации выделенных генов. Последующее исключение "некандидатных" генов (с- fos и TGFb3) и проведение мутационного анализа транскриптов остальных позволило в итоге обнаружить ген S-182, ответственный за развитие болезни Альцгеймера типа III.

Мутационный аналггз и исключение гена Е2К из числа реальных генов-кандидатов БА типа III. При скринироэании библиотеки кДНК "ZAPII" 32Р- меченной пробой 964-4В-12 были выделены клоны Z- 89 и Z-9 0, которые кросс-гибридизовались с тремя другими регионспе-цифичными фрагментами кДНК 964-4А-49, 4А-78 и 4В-89.

Нуклеотидная последовательность клона Z-90 длиной 1300 п.н. показала 93% гомологию с нуклеотидной последовательности гена дигидролипоамидсукцинилтрансферазы (Е2К) крысы и содержала ОРС, но без начала первого экзона и З'-НТР области гена (Табл. 2).

Второй клон Z- 89 не содержал открытой рамки считывания, и, видимо, представлял собой дефектно сплайсированный транскрипт

Перекрывание последовательностей клонов Э64-4В-12 и Z-90," Z-90 и 964-4В-89 позволило организовать единый транскрипт длиной 1800 п.н., который показал 91% гомологию ОРС гена Е2К крысы.

Одновременно с этим появилось сообщение о клонировании транскрипта гена Е2К человека, но без сообщения о проведении мутационного анализа [АН et а1, 1994]. Сравнение иуклеотидной последовательности транскрипта 2- 90 с приведенными данными позволило выявить практически 100% идентичность, а также недостающие в транскрипте г-90 36 нуклеотидов, следующих после старт-кодона, и несколько сот нуклеотидов 3'- НТР области гена.

На основании этого мы заключили, что был клонирован транскрипт гена Е2К человека, картированный в минимальной области локализации гена БА (14д24.3), в интервале около 300 т.п.н., перекрываемым 964е2,741ЬЗ и 797(111 УАС клонами,что соответствует области, теломерно прилегающей к маркерам 014Э43/71 (Рис. 3).

Многочисленные данные свидетельствовали в пользу гена Е2К, как реального гена-кандидата БА [вЬеи еЬ а.1, 1994; АН еЪ а1, 1994]. Нами был проведен мутационный анализ иуклеотидной последовательности полноразмерных транскриптов, выделенных из мРНК постмортальной ткани лобных долей мозга двух больных членов родословной ГА01 (N3 и N5) с клинически и нейропатологически выраженными чертами БА и контрольного здорового индивида (N1).

Генерирование матриц для проведения прямого секвенирования осуществляли ОТ-ПЦР- амплификацией с применением праймеров, специфичных к 5'- и 3'- концам полной копии транскрипта гена Е2К, представленной в опубликованных данных [ АН е! а1, 1993]:

прямой праймер 634 :

5' - ССССАТСССССТСТСТОТ- 3' , с позиции +8 экзона I гена Е2К

человека;

обратный праймер 6 37 :

5'- TGTGGGTTCCTCCTAAAGAT- 3', комплементарный

с позиции +1374.

Полноразмерные транскрипты, были получены ОТ-ПЦР-амплифика-цией с приведенными праймерами при следующих условиях: один цикл денатурации (94°С - 4 мин.), 30 циклов с режимом (94°С - 30 сек. 60°С - 30 сек., .72°С - 40 сек.) й цикл достройки (72°С -7мин.). Результаты ПЦР-амплификации представлены на Рис. 4А'.'

Обнаружение псевдогена Е2К человека, картированного на хромосоме 1 [Ali et al, 1994], требовало проведения дополнительных контрольных экспериментов. Помимо стандартного контроля в отсутствиии обратной ревертазы для детекции возможных контами-нирующих продуктов ОТ-ПЦР как псевдогена, так и геномной ДНК, мы проводили ПЦР-амплификацию с использованием дополнительных внутренних праймеров, обеспечивающих контроль по длине амплифи-цированных транскриптов. Пара праймеров 634/639 (5'-GGCAACAGTGGG ТТТТАС-3') обеспечивала амплифицирование транскрипта длиной более 1000 п.н.и пара праймеров 636 (5'GCTCTTTTGGTACCTGATGG3')/ 63 8 (5'-TGTCAAAGATGCCATGCATC-3') позволяли амплифицировать ОТ-ПЦР- продукт длиной около 800 п.н. в температурном режиме, аналогичном представленному выше. Результаты ОТ-ПЦР-амплификации показаны на Рис. 4Б.

Мы определили нуклеотидные последовательности полноразмерных транскриптов и фрагментов транскриптов, фланкированных представленными праймерами, двух больных индивидов БА (N3 и N5) и одного контрольного (N1). Для определения нуклеотидного состава был использован модефицированный (ОТ-ПЦР- секвенирование с Pfu-полимеразой ("BIOLAB", США)) и традиционный метод Сэнгера

Рис. 4. ОТ-ПЦР-амплификация транскриптов гена Е2К человека.

А ..." Б

1 Я а 4 9 ' € 1 г » 4

А. ОТ-ПЦР-амплификация полноразмерных транскриптов Е2К человека. Дор.3.4.5,6 - полноразмерные транскрипты больных БА N3, N5 и здоровых индивидов N1 и N2, соответственно. Дор.1,2 - размерные маркеры ДНК, л/ Н1пс1111 "и .123 п.н.

Б. ОТ-ПЦР-амплификация транскриптов Е2К с использованием пар праймеров 634/639 и 636/638. Дор.4,5,6 - 636/639 транскрипты индивидов N3,N5,111, соответственно. Дор. 2,7,8, 9 - 63"4/639 транскрипты индивидов N2 ,N3 , N5 и N1, соответственно, Дор.З - полноразмерный транскрипт Дор.1 - 123 п.'размерный маркер ДНК..

(с полимеразой Т7). Применение дополнительных внутренних праймеров обеспечивало секвенирование фрагментов транскриптов длиной около 500 п.н.

Полученные результаты отмечали отсутствие значимых замен в последовательностях транскриптов больных БА (N3 и N5) при сравнении с Z-90 и транскриптом контрольного индивида. Независимые исследования коллег из лаборатории Hyslop Р. (Университет г.Торонто, Канада) подтвердили наши данные.

Мутационный анализ открытой рамки считывания гена Е2К не обнаружил патогенных мутаций в нуклеотидных последовательностях полноразмерных транскриптов больных из родословной FADI, показавшей сцепление с геном БА типа III (14q24.3).

Проблема идентификации ОТ-ПЦР-продуктов генов, принадлежащих высокогомологичным мультигенным семействам. При секвенирова-нии ОТ-ПЦР-продуктов с использованием только внутренних праймеров 636/638 мы обнаружили некоторые различия в нуклеотидных последовательностях транскриптов 636/638 относительно полноразмерного транскрипта Z-90. Были детектированы нуклеотид-ные замены, не приводящие к изменению смысла кодона: кодов 232 (Gin), CAA->CAG и кодон 325 (Arg), AGG->CGG. Другие замены вызывали разночтение в кодировании аминокислот. В кодоне 132 был обнаружен глицин (GGA) вместо треонина (АСА), триплеты 212/213 кодировали глютамат/пролин (GAG/ CCA), а не аспартат/аланин (GAC/GCA), как в Z- 90. В кодоне 359 была обнаружена замена лейцина (СТТ) фенилаланином (ТТТ), и в кодоне 384 детектировали замену треонина (АСС) пролином (ССС). Все обнаруженные различия представлены на Рис. 5.

Рис. 5. Различия в нуклеотидных последовательностях

полноразмерного транскрипта Z-90 и продукта 0Т-ПЦР-амплификации с использованием праймеров 636/638.

132 212 213

asp gly Thr lys val Asp Ala gly

Z - 90 II- GAT GGG АСА AAA GTC - 11-11- GAC GCA GGA

636/638 II- GAT GGG GGA AAA GTC - II-II- GAG CCA GGA

Gly Glu Pro

232 325

met arg Gin arg pro Arg gly

Z - 90 П- ATG CGG CAA CGC -//- -II- CCA AGG GGT -,

636/638 II- ATG CGC CAG CGC -II- CCa CGG GGT

Gin Arg

359 384

glu Leu ala thr Thr ile

Z - 90 II- GAA CTT GCC -//- -II- АСА ACC ATT -//-

636/638 //- GAA TTT GCC -II- АСА CCC АТС -//-

Phe Pro

Исходя из имеющихся данных о существовании высокогомологичной последовательности псевдогена на хромосоме 1 [Ali et al, 1994], наши данные предполагают, что ОТ-ПЦР-амплификацией кДНК Е2К с использованием пары внутренних праймеров 636/638 был получен фрагмент транскрипта псевдогена.

Еще одним примечательным наблюдением является то, что применение метода ОТ- ПЦР-секвенирования для мутационного анализа генов, относящихся к высокогомологичным мультигенным семействам, весьма проблематично. При установлении принадлежности анализируемой нуклеотидной последовательности транскрипта к тому или иному гену-гомологу, не располагая данными о нуклеотидных различиях высокогомологичных генов, вполне возможен

вариант организации химерного транскрипта. Например, составление "правильного" ПЦР- продукта транскрипции с парой праймеров 634/639, принадлежащего гену Е2К человека на основании идентичности с-последовательностью Z-90, и "ложного" ОТ-ПЦР-продукта с праймерами 636/638, видимо, относящегося к псевдогену.

Поэтому, основываясь на нашем опыте, рекомендуем проводить мутационный анализ только полноразмерных транскриптов.

Метод_ПИР-детекпии CpG- островков с использованием "Not-

вырожценного" праймера. Для детекции и клонирования CpG-остров-ков, ассоциированных с 5'-участками большинства генов животных [Bird, 19 86], был применен собственный метод выделения CpG-островков. Наш подход сводился к проведению "векторетной" ПЦР-амплификации и Alu-ПЦР-амплификации фрагментов геномной ДНК человека с использованием праймера, выведенного на основе сайта узнавания рестриктазы NotI. Праймер назван "Not- вырожденным" ("NotP").

Праймер " NotP ":

5 ' - CCGCGGCGGCTCCGGAGGCTGCGGCG-3'.

Hill Mill

CGCCG CGCCG

CGCC GGCC CCGC

GGCG CGCC

Последовательность праймера выведена таким образом, что содержила два пентануклеотидных мотива (CGCCG) и варианты консенсусных тетрануклеотидов (CGCC, CCGC, GGCG, GGCC), как наиболее часто встречающиеся в сайте узнавания рестриктазы NotI. Их положение в последовательности праймера выбиралось так, чтобы обеспечить возможность совершенного спаривания минимум шести 3'-концевых нуклеотидов, в соответствии с критерием Pardee [Pardee

et al, 1992], и наиболее широко представить варианты комплементации 5'- области праймера.

В качестве контроля был использован олигонуклеотидный праймер, состоящий из последовательности, комплементарной сайту узнавания рестриктазы Notl.

Праймер SP: 5'- CGCGCCGGCGCGCCGGC -3'.

ПЦР- амплификацию проводили с использованием двух вариантов обратных олигонуклеотидных праймеров:

Вариант I.

Универсальный "векторетный" праймер ( "vP" ) : 5'- CGAATCGTAACCGTTCGTACGAGAATCGCT-3' [Larsen et al, 1993].

Вариант II. Alu праймер человека 3' : 5'- GATCGCGCCACTGCACTCC-3' [Nelson et al, 1991].

Предложенный наш метод "Not-ПЦР-детекции" реализовнвался в соответствии со схемой на Рис. б.

Первый вариант метода основан на применении "векторетной" ПЦР-амплификации [Rilley et al, 1991]. В соответствии с этим, обрабатывали геномную ДНК эндонуклеазой, образующей "тупые" концы рестрицированного фрагмента (Alul и PvuII). далее ДНК лигировали с универсальными "бабл"- адапторами и амплифицировали с использованием "NotP" и "векторетного" олигонуклеотидных праймеров.

Теоретически, метод позволял детектировать CpG- островки независимо от локализации ближайших Alu повторов.

Второй вариант представлял более простой и оперативный метод обнаружения CpG-островков Alu-ПЦР-амплификацией [ Nelson

«

Рве. 6. СХЕМА "Not - ПЦР - ДЕТЕКЦИИ" CpQ-OCTPOBKOB (CpOi) С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ "Not - ВЫРОЖДЕННОГО" ПРАЙМЕРА.

5'.

Sr CpGI единица транскрипции

-WV—ISC

Alu

-Лг-^-УУ

Alu Sr Alu

Вариант 1

Рестрикция с образованием "тупых концов", где Sr (Pvu 11 или др. эндонукпеазы) CpGi

Лпгирование с "бабл-линкерами" и "NotP"/ "бабл" ПЦР

(с "векторным" праймером)

f^zis и:

:isr

н

YAC-Картирование и идентификация (+) ПЦР-продукта сиквенс-аналидем

Вариант 2 (с Alu праймером)

"NotP" I Alu ПЦР и Alu /Alu ПЦР

CpGi

Alu-Alu l!l WAlU

W W

YAC-Картирование и идентификация (+) ПЦР-продукта сиквенс-аналиэом

et al, 1991]. Проведение параллельных реакций ПЦР-амплификации фрагментов геномной ДНК с использованием "NotP"/Alu и Alu/Alu-праймеров выявляло специфичные ПЦР-продукты "NotP"/Alu.

Эффективность использования обоих вариантов метода была тестирована на фрагментах геномной ДНК человека хромосомы 14. ДНК, выделенная из YAC, PI и космидных клонов, была картирована в участке области 14q24.3 прямой гибридизацией на хромосомах (FISH) или Southern гибридизацией с панелью YAC клонов. Для . поиска CpG- островков были отобраны следующие фрагменты ДНК человека:

1). из 797dl1 YAC клона;

2). из 964е2 YAC клона;-

3). набор из 10 космид, картированных в области перекрывания 797dll YAC клона;

4). набор из 14 космид из области перекрывания 788hl2 YAC;

5). набор из 4 космид, гибридизовавшихся с Z - 112;

6). 2 космиды, гибридизовавшиеся с Z - 3;

7). набор из 5 PI- клонов из области локализации 905с2 YAC клона;

8). 3 космиды из области локализации 905с2 YAC клона.'

Анализ результатов "NotP''-ПЦР-детекции CpG- островков.

Результаты ПЦР-амплификации с использованием "векторетного" и Alu-ПЦР вариантов "CpG''-ПЦР-детекции показаны на Рис. 7. Для оптимизации ПЦР-амплификации фрагментов с повышенным G+C составом реакции проводили в следующих условиях:один цикл "горячего" старта (100°С - 4 мин.), 30 раундов амплификации (98°С - 20 сек., 60°С - 20 сек., 72°С - 30 сек.) и цикл достройки (72°С - 7 мин.).

Рис. 7. ПЦР-амплиифкация фрагментов ДНК человека с

использованием "Not-вырожденного" олигонук-леотидного праймера. ------ - -

1 2 3 4 5

ГТ

|

hLéíiÍ i ни, iif i IMI Д

А.

Alu-ПЦР-амплификация. Дор.2,3 - Р1-клонов с праимерами "NotP"/Alu и Alu/Alu. Дор.4,5 - Р1-клонов с праимерами SP/Alu и Alu/Alu. Дор.1 - 123 п.н. маркер размера ДНК. "Векторетная" ПЦР-амплификация. Дор.9,10 - Pl-ююнов после обработки PvuII или AluI, соответственно. Дор.7,8 - космид 788hl2 после обработки PvuII или AluI. Дор.5.6 - космид Э05С2 после обработки PvuII или AluI. Дор.3,4 - космид Z-3 после обработки PvuII или AluI. Дор.11-14 - отсутствие ПЦР-продуктов отдельных космид. Дор.15-18 - контроли без матриц ДНК, только "NotP" (15); SP (16); "NotP /vP (17); только vP (18). дор.1,2 - Л/HindIII и 123 п.н. размерные

"Векторетная" ПЦР-амплификация. Дор.2,3 - ПЦР-продукты ДНК из 797dll YAC клона после обработки PvuII или AluI, соответственно. Дор.4,5 - космид Z-112 после обработки PvuII или AluI. Дор.1 - 123 п.н. размерный маркер ДНК. Alu-ПЦР-амплификация. Дор.2,3 - космид 788Ь12 с праимерами "NotP /Alu и Alu/Alu. дор.4,5 - космид 797dll с праимерами "NotP'/Alu и Alu/Alu. Дор.6,7 - космид Z-112. Дор.8-13 -ДНК вставок 797dll, 964е2 и 905с2 YAC с "N°tP"{Al" " Alu, соответственно. Дор.1 - 123 п.н. размерный маркер ДНК.

Б

В

Г

Предварительно мы сравнили эффективность применения праймеров "NotP" и SP в Alu-ПЦР- амплификации Р1-клонов, которые были картированы в области перекрывания YAC клона 905с2. использование "NotP" праймера обеспечивало большую представленность специфичных ПЦР-продуктов, в отличии от применения SP праймера, как показано на Рис. 7А. Поэтому в последующих экспериментах было отдано предпочтение "NotP" праймеру.

Детекция специфичных ПЦР-продуктов тестируемых Р1-клонов, космидных клонов и YAC с использованием праймеров "NotP" и "векторетный" показана на Рис. 7Б. Использование в качестве матриц для ПЦР ДНК из PI- клонов и наборов космид позволило получить наиболее специфичные и легко воспроизводимые продукты ПЦР-амплификации. Применение геномной ДНК вставок YAC клонов приводило к амплифицированию в основном неспецифичных сигналов, малопривлекательных для клонирования (Рис.7Б).

Наши данные также свидетельствовали о предпочтительном использовании рестриктазы PvuII для проведения "NotP''/''векто-ретной" ПЦР-амплификации , чем при обработке с AluI (Рис.7В).

Результаты ПЦР-амплификации космидных и Р1-клонов с парами праймеров "NotP"/Alu и Alu/Alu представлены на Рис. 7Г.

Alu-ПЦР-амплификация фрагментов геномной ДНК из YAC клонов (797dll и 9б4е2) в отличии от Р1-клонов и космид вызывала избыточную представленность Alu-ПЦР-продуктов, что ставило под сомнение действенность детекции специфичных "NotP"/Alu- ПЦР-продуктов из материала подобной геномной сложности (Рис.7Г).

Тринадцать специфичных ПЦР- продуктов, полученных при проведении обоих вариантов "CpG-ПЦР-детекции" с праймером "NotP", были очищены в легкоплавкой агарозе и картированы

гибридизацией с YAC клонами в области локуса 14q24.3,

ограниченной маркерами D14S43/71 и D14S277.

Окончательно, после анализа локализации а клонирования выделенных ПЦР-продуктов были отобраны девять клонов, картированных в хромосомспецифичном участке 14q24.3.

Выделение CpG- содержащих клонов из области перекрывания 905с2, 788hl2 и 852f4 YAC клонами позволило получить пробы для скринирования малоизученного участка локуса 14q24.3 в области, фланкированной маркерами D14S786 и D14S268. Так, клон Р8-2, картированный в данной геномной области, предположительно содержит фрагмент промотора, последовательность инициации транскрипции, старт-кодон, экзон I и начало интрона пока неидентифи-цированного гена.

Анализ данных по детекции4 потенциальных CpG-содержащих ПЦР-продуктов с использованием "Not- вырожденного" праймера, позволил отметить следующие особенности метода:

- предложенный метод ПЦР-детекции CpG-островков наиболее эффективно "работал" на фрагментах геномной ДНК, выделенных из PI- клонов или наборов космнд;

- использование "Not- вырожденного" праймера в сочетании с "векторетным" методом обеспечивало большую эффективность детекции, нежели с Alu-праймером, т. к. Alu- ПЦР- метод,

не всегда позволяет детектировать CpG-островки на расстоянии нескольких т.п.н. от Alu повтора;

- показано предпочтительное использование эндонуклеазы рестрикции PvuII для получения матриц ДНК и проведения "NotP''/''век-торетной" ПЦР-амплификации.

Было клонировано пять CpG-обогащенных последовательностей, потенциальных 5'- участков новых генов, картированных в области

.32 * *

перекрывания 905с2 YAC клона, в интервале, ограниченном маркерами D14S786 и D14S268. Данный участок генома длиной около 700 т.п.н. относится к наименее изученным.

Клоны CpG- обогащенных последовательностей, картированные в. области перекрывания 905с2 YAC клона, были предоставлены для последующего скринирования коллегам из лаборатории генетики Hyslop Р. (Канада).

Продемонстрированная простота и эффективность "NotP''-ПЦР-

метода, не уступающего IRP-методу [Valdes et al, 1994], весьма

-Л

удовлетворительны для целей быстрого выделения 5'- областей генов из космидных или Р1-клонов.

Кроме того, предложенный метод вполне удобен для получения минибиблиотек CpG- обогащенных последовательностей для изучения стдтуса метилирования CpG-островков генов.

ВЫВОДЫ

1. Из библиотек кДНК мозга, человека выделены и охарактеризованы двенадцать индивидуальных транскриптов. Определена локализация соответствующих генов внутри минимальной хромосомной области 14q24.3, содержащей ген болезни Альцгеймера.

2. Определение нуклеотидной лоследовательности транскриптов

позволило идентифицировать гены c-fos, TGFb3 и Е2К.

Отсутствие информации ,"qó> очевидной гомологии нуклеотидных

последовательностей о^тал^ных транскриптов с данными

' 1 i

EMBL/GENbank позволило. Предположить обнаружение девяти новых генов в области ,. 14q24.3. •3. Построена транскрипционная карта минимальной области локализации гена болезни ^Альцгеймера тип III (14q24.3)

в интервале длиной около 3 м.п.н., ограниченном маркерами D14S61 и D14S77. Впервые представлена транскрипционная карта с указанием локализации как ранее известных генов (c-fos, TGFb3 и Е2К), так и девяти еще неохарактеризованных генов.

4. Мутационным анализом ОРС ген Е2К человека исключен из числа реальных генов-кандидатов на роль гена болезни Альцгеймера типа III (14q24.3).

5. Предложен альтернативный метод выделения 5'- участков генов ПЦР-амплификацией фрагментов геномной ДНК с применением "Not-вырожденного" олигонуклеотидного праймера.

6. Методом "CpG''-ПЦР-детекции обнаружены и клонированы CpG-обогащенные последовательности ДНК, потенциальные 5'-участки пяти новых генов, картированные в наименее исследованном участке локуса гена болезни Альцгеймера типа III (14q24.3), в пределах маркера D14S268. В данном участке локуса 14q24.3 в последствии был обнаружен ген S-182, ген, ответственный за развитие болезни Альцгеймера типа III.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Rogaev E.I., Kerianov S.A. and Moliaka Y.K. Dinucleotide repeat polymorphisms at the SLP1, Hbel and MYH7. Hum. Molec. Genetics, 1992, Vol. 1, N 4, p. 1008.

2. Rogaev E.I., Kerianov S.A., St. George-Hyslop P. Expansion of the primitive repeatitive DNA elements in genomeá and utility for genotyping of eucariots and procariots. Genomic Fingerprinting Workshop, Madrid, 1993, p. 58.

3. Rogaev E.I., Lukiw W., Rogaeva E.A., Kerianov S.A., St. George-Hyslop P. Mapping and searching candidate genes for

Familiar Alzheimer's disease. World Congress of Psichiatric Genetics, New Orlean, 1993, p. 38.

4. Rogaev E.I., Sherrington R., Rogaeva E.A., Kerianov S.A., et al. Isolation of a novel family of genes (presenilins) bearing mutations in Alzheimer's disease. Complex Genetics Diseases, Symposium, Berlin, 1995, p. 16.

5. Rogaev Б.I., Sherrington R., Rogaeva E.A., Levesque G., Kerianov S.A., Liang Y., et al. Isolation and analysis of a novel family of genes (presenilins) bearing mutations in Familiar Alzheimer's disease. 28th Annual Meeting of Euaro-pian Society of Humam Genetics, 1996, p. 34.

6. Kerianov S.A., Liang Y., Rogaev E.I., et al. Physical mapping and nucleotide sequencing analysis of the human dihydrolipo-amide succinyltransferase gene. Hum. Mol. Genetics, 1996

(in press).

- 7. Кирьянов С.А. и Рогаев Е.И. Быстрое выделение CpG-островков с использованием "CGD-вырожденного" олигонуклеотидного праймера. .Генетика, 1996, в печати.

8. Кирьянов С.А., Лиааг Е., Лукив У., Рогаева Е.А., Ромменс Д., Чумаков И., Хислоп П. а Рогаев Е.И. Транскрипционная карта минимальной области локализации гена болезни Альцгеймера (14q24.3). Генетика, 1996, в печати.

Типография ордена «Знак Почета» Издательства МГУ. 119899, Моек», Воробьевы гори Заназ 1106 Тираж 100