Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ЛОКУСА B - ЛАКТОГЛОБУЛИНА У ОВЕЦ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛУТОНКОРУННЫХ ПОРОД

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИИ АНАЛИЗ ЛОКУСА B - ЛАКТОГЛОБУЛИНА У ОВЕЦ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛУТОНКОРУННЫХ ПОРОД"

А-&2РД9.

■ На правах рукописи

Бочкарев Владимир Вячеславович.. МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТНЧЕСХМВ АНАЛИЗ ЛОКУСА Р - ДАКТОГДОБУЛННА

- 1 овец различных полутмкорушшх пород ■

03.00.23 - Биотехнология ... ■

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ И* СОИСКАНИЕ УЧЕИОК СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ в а» к

Дубровицы, 1996

•••л .

Работа выполнена в лаборатории генетики животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства

/ ' ' , . , Ч'

Шучтв руководители:

* н 1 *

! ' доктор биологических наук Н.С. марзанов иностранный член РАСХН. профессор Г. Брем

Офнцналывге оппоненты:

г

доктор биологических наук, профессор И.Я. ПИхов кандидат биологических наук, доцент Л. Ф. Новикова

Ведуч&я организации Биотехцентр РАСХЦ

* Защита диссертации состоится ' 1998 года в

/У часов на заседании диссерташониого совета Д. 020.18.02 по зацнте диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства. '

Адрес институт»: 142012 Московская область. Подольский рэ?^;"

п. Дубровицы. ВИД. ,

С диссертацией южно ознакомиться в библтотепз Г'"'-а. Автореферат разослан

. 1998 года.

" Ученый секретарь диссертационного совета,-

доктор сельскохозяйственных нау!Ц1х^Ыу /У/, Н.В.

I. ОБЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ .

• j.l. .Актуальность теми. Главное проблемой в области генетики сельскохозяйственных животных и связанных с ней разделов биотехнологии является установление детерминации биологически важных и хозяйственно-полезных признаков. '

В этой связи, одним, из подходов оценки животных является их1 характеристика по генетическим и физиологическим маркерам. Она включает в себя" оценку по группам крови, полиморфным системам, белков, а в последнее время и по молекулярно-генетическим маркерам {Roychoudhury A.K. Hei Ы,. 1968; Иарзанов Н.С.. 1991.* 1994; Gortarl М. J. de et ai.. 1997).

Выявление генотипов животных по ряду аллелей позволяет вести поиск "генов кандидатов* для локусов количественных признаков. сельскохозяйственных животных. Выявление таких генов позволит эф- ' фективно использовать их в качестве маркеров признаков продуктивности, что в конечном счете позволит повысить эффективность веде-;., ния селекционной работы.

Среди целого ряда молекулярно-генетических методов'наибольшее распространение для оценки животных по генотипу, вследствие быстроты и точности оценки., а также использования небольшого количества исходного материала, получил метод полимеразноп цепной реакции(ПЦР-анализ). Этот метод позволяет увеличивать в миллионы раз количество копий детектируемого участка ЛНК с помощью фермен-. . та ДИК-полимеразы. что делает возможным его визуализацию.

Большой интерес для науки и практики представляет исслелова-, ние полиморфизма генов белков молока. Уже выявлены закономерные-связи между вариантами белков молока и хозяйственно-полезными. признаками у крупного рогатого скота. • Что касается других видов животных, то работы в этом направлении ведутся менее;интенсивно. ' Данная диссертационная работа направлена на создание банка ДНК из крови, разработку экспресс-метода аллелеспецифической по--лимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) для выявления ■ аллелей р-лзк-тоглобулика и изменил методом электрофореза в полиакриламидном геле(ПДАГ) полиморфизма белков'молока у овец. ■ . ,;,-*

\.2 Цец^,я. ?адау» исследования. Целью работы являлось иссле-

дование различных пород И8ец.№яоне«ед№ваки|м в .качестве маркера гена {) - лактоглоби' 'других iijifölEWftioi

f_«)OC!t. . . . 1ДОЫМ4

И,*. .

Инэ. Na*

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: I. Создать банк ДНК крови овец породы ромни-марш. цигайская и синтетической полутонкорунной популяции. 2. разработать экспресс метод аллелеспециФической ПЦР для диагностики вариантов р-лактоглобулина, овец. 3. Провести характеристику пород овец по частотам встречаемости различных аллелей и гекотипов р-лактоглобулина и других-белков молока. 4. Выполнить статистические расчеты, с целью выявления корреляционных связей между вариантами р-лактоглобулина и хозяйственно-полезными признаками.

1,3 Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в данной'работе предложен метод АС-ПЦР для анализа р-лактоглобулина у овец. Создан банк ДНК от нескольких популяций.овец. Проведен популяциоино-генетический анализ 7 локусов белков молока. Выполнен статистический анализ для установления корреляционных связей между генотипами, по р-лактоглобулину и хозяйственно-полезными признаками.

1.4.: Положения, выносимые на защиту. Создание банка ДНК из крови овец различных пород. Генотипированне р-лактоглобулина и других белков молока у пород и половозрастных групп овец с использованием методов ДНК-диагностики и гельэлектрофореза.

1.5. Апробация работа. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции ['Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи.кадрового обеспечения", РАНЖ, Быково. 16-20 июня.1997 г.: на восьмой международной конференции "Новые направления биотехнологии".. Москва. 27-29 апреля 11998 г.

1.6. Публикация материалов. *По:материалам.диссертации;опубликовано 4 научные работы.

1.7. Объф! работа. Диссертационная работа состоит из введения. трех глав, выводов, практических предложений, ■списка литературы. Материал изложен на .33, страницах машинописногоТекста, содержит таблиц, рисунков. Список литературы включает источника, в томчисле иностранных, языках.

• II- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

Г В качестве объекта исследований были выбраны .следующие поро-; ды полутонкорунных овец: . ромни-марш из ГПЗ"Котовский" . Рязанской: - .облает (п—24.1}. цигайская из Биотехцентра(п»25) и синтетическая

популяция овец из э /X" Кленов о -Чегодаево' . ВНИИ животноводства (финский ланлрас х линкольн х ромнм-марш х тексель) <п-160). Исследования были проведены по схеме представленной на рис.1.

i ;i

t Хозяйственно-h Ч-полезные I 1 признаки t i___________-.........i

ПОРОДЫ 1-

ОВЕЦ Н

I Синтетическая| Нпопуляция I

1Ромни-марш) t---•

i-1-1

(Цигайская! i---1

I Химический I I анализ молока| i___i_i

i-1-:-1

I Гельэлегсгрофорез I (белков молока в ПАГ| i-п->

i-'-1

I Генотишрование | I белков молока 1

I . Взятие крови и выделение ДНК (

r-f ПЦР - анализ

1ПДРФ -I

I- ПЦР I i—--1

-1 Hi

J Г

]

I-■-1

(создание I I банка I

тi—;-il дик I

I АС - ГЩР| IОднопроби-1'-ц

-1 (рочный

1 АС-ПЦР

Т-

<-

I---1 I—*-----1

I статистическая | | Гельэлектрофорез продуктов ПЦР (

(обработка получен-- 1 1-1-:—--1

|ных данных ' | (-1-;-1

1-1-1 Определение генотипов по р-Ьв)

Рис.. общая схема исследования.

Для выделения ДИК из крови использовали два метода: феколь-но-хлороформовый(В11п1К,-Stafford D.W., 1976) и солевой экстракции (МШег S.A., 1988). Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре при длине волны 260 нм, -а для характеристики степени очистки использовали показатель соотношения оптической плотности раствора ДНК при длине волны 260 и 280 нм(5атЬгооК J. et al..1989).

С цель» идентификации полиморфизма гена , ß-лактоглоСулкна овйц применяли: стандартный метод ПЦР-ПДРФ. метод ПЦР-анзлпзз с

использованием аллвлеспецифических /1раймеров(АС-ПЦР), а такае модификацию стандартного метода АС-ПЦР-''Slngle tube*. предложенную Зиновьевой H.A. и др.(1996). Для проведения реакций использовали прецизионный программируемый термостат "Cyclo Temp 106". Разделение продуктов амплификации выполняли в 255 агарозном геле.

Полиморфизм белков молока у овец изучали методом электрофореза вполиакриламидном геле при рн 8.6(Иолчиев Б.С.. 1993)'.

Процентное содержание хира. белка, лактозы и сухого вещества в молоке овец определяли с помощью прибора Milko-Skan 203<Дания).

Цифровые материалы обрабатывали общепринятыми методами(Пло-хинския H.A.,1978) с применением персонального компьютера IBM PC.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3-1- Подбор праймеров-., и,,оптимальных условий_проведения

Пцр-зщцщза, Для оптимизации реакционной смеси и условий проведения ПЦР. выполняли сери» экспериментов с различными концентрациями компонентов реакции и различной температурой отхига праймеров.

Правильный подбор праймеров является залогом успешного выполнения ПНР.- Для амплификации фрагментов гена р-лактоглобулина овец нами были .выбраны два "наружных" общих праймера BLC5 и BLG3. а также два '"внутренних" • аллелеспецифических праймера BLGA и BLGB. Последовательности и позиции праймеров в гене р-лактоглобу-лина овец (EKBL Х12817) представлены в табл. 1.

Таблица i. Характеристика праймеров, используемых для ПЦР

(Название .1 I

1-Г—

Позиции в гене ß-лактоглобулина ; овец (EHBLX12617)

Последовательность (5*-3')

IBLG5 : 1ELG3 . IBLGA IBLGB

ОТ 1448 ДО 1468 ■. ОТ 1880.до 1899.

ОТ 1596 .до 1617 '.

от 1617 до 1637 .

ТТГ ГТТ ТЦА ГТГ ТГА ГТЦ тгг AAA АГЦ ЦЦТ.ПТ ТГГ ГЦА ГЦ " ЦГЦ ЦАГ ГТГ ГЦГ ГТГ, АЦТ ТАГ Г. ГТЦ ЦГЦ ЦАТ АГЦ ЦАА ГГА ТТГ

■■■;■- С учетом:температуры .плавления праймеров, для всех используемых в исследовании модификаций ПЦР-анализа опытным путем подбивали оптимальные температурный и временной режимы ПЦР(табл. 2), .

Одним из моментов успешного выполнения реакций является концентрация ионов Ив®* в реакционной смеси. Для'выяснения оптимальной * концентрации ионов И^* выполняли серию реакций с концентрацией Мв от 0.5 до 5.0 МИ с шагом 0,5. Наилучшее чтение результа-Таблит г. Температурный и временной режимы ПЦР

1 1 I Шаг , . | -г- Температура 1 (°С) .. Н 1. ~---X Время^шага в циклах. 1 1 ' 1 ( . I 2-35 Г 36 1

I Денатурация: ' 1 1 94 1 '.5 1 .. 1 1 1

I Отжиг праймеров 1 61*;63,5'М 1 . 1. 1 1 1

65***; t ч *

1 Полимеризация | . 72 | 1 1 - 1 1 • , 1

I Доводка 1 ' .72 1 - - .1 .- 1 3 |

1 Охлаждение: . | . 6 I . - 1 . - 1 .6 1

1 _ 1 ...... '

«■ - ДЛЯ праймеров BLG3 и BLG5: .»» - ДЛЯ праймеров BLG5 и BLG В »»» - для праймеров BLG 3 и BLG А.. тов реакций: было при i.5 ми концентрации ионов Mg®*. Превш :ие этого значения способствовало■образовании неспецифических продук-. тов амплификации. вто время как недостаток ионов магния приводил к ослаблению полос амплифишфованнюс Фрагментов.'

Оптимальную концентрации Taq-полимеразы определяли выполнением серий реакций с концентрацией фермента от 0.5 до 5.0 ЕЬ на реакцию с шагом 0.5 Ел.. По результатам опытов для данных прайме-, ров она составила ! Ед. При более высокой концентрации Taq~ поли-меразы наблюдался неспецифический отжиг праймеров. в результате чего искажалась интерпретация результатов.

Диализ аллелей ген^ g - яактпглобуднна овец методом ГО1Р. Полиморфизм . гена р - лактоглобулина обусловленточковой мутацией в позиции:1617 соответствующего кодона в экзонеП. В результате этого вариант К белка (S -лактоглобулина имеет в;позиции 20 аминокислоту тирозин, в то время как:вариант В - гистидинШоМе Н. J.. Braunltzer С;.. 19831. •■. ■}-,:. - 'f

Для выявления вариантов гена р-лактоглобулина овец были использованы впервые следующие подходы: стандартный метод, анализа ПЛРФ и методы аллелеспецифической ПЦР (одиспробирочный."Single

tube" и двухпробнрочный). ;

3.2.1. Анализ ПДРФ. Для анализа методом ПДРФ были использованы два прайнера BLG5 и BLG 3. которые амшшфицируют фрагмент ДНК гена р -лактоглобулина овец длиной 452 п.н. Температура отжига для зтихпраймеров. выбраная опытным путем, составила 61°С.

Рестрикционная зндонущеаза Rsal с последовательно с.тю узнавания GT/AC имеет сайт рестрикции в зкзоне-II варианта'А гена р -лактоглобулина(позиция 1617 по EHBL X 12817). в результате тонко-вой-мутации Т-С в варианте В произошла' утеря сайта рестрикции.. Кроме указанного выше сайта рестрикции в амплифицируемом фрагменте присутствует еще два сайта узнавания Rsal, которые являются общими для обоих вариантов 0 -лактоглобулина (рис. 2). Таким образом, /после гидролиза продуктов ПЦР Rsal образуются Фрагменты, длины которых в зависимости от генотипа суммированы в табл. 3.

Рисунок 2. Схема локализации' лраймеров при диагностике гена ^-лактоглобулина овец методом ПДРФ

U*p А

V** В

■ «2 л.н.-

. Праймеры BLG А и BLC В изображены черныш прямоугольникат:-аокализация точкоеой мутации-Т-С показана зеезЭочкой; участки узнавания рестриктазой USA'I ■ маркированы, стр&лкаш: (гюзшяш указан и по EHBL X 1S817); блины фрагментов дани в пара! оснований.

3^2.-Стандартный (двухпробирочный) метод ДС-ГШР. Для анализа вариантов гена. р- лактоглобулина овец нами был также. использован стандартный двухпробирочный метод аллелеспецифической-ПЦР. (АС-ПЦР) с модификацией в локализации аллелеспецифических прйме-■ ров.. что позволило в дальнейшем использовать их для ■ "Single tube" .метода АС-ПЦР.: -Данный метод требует выполнения двух ., независимых

Таблица з. Длины фрагментов в зависимости от генотипа при анализе гена р-лактоглобулина овец методом ПДРФ

I-----------;-|- I Генотип | 1 а » - 1 Длины фрагментов (п.н.) ' —,

1 г V» 1 1 I Без рестрикции 1 » t ■ Гидроли31 Rsal

t АА I АВ I ВВ * 1 1 1 » 452 ) 452 | 452 | 1 ••• ; 175 170 236 175 170 '"'236 175 66 66 1 4t " 41 .41;.'. . <

реакций для каждого из образцов с праймерами BIG3/BLCA с целью' установления наличия аллеля А и BLC5/BLGB для выявления, наличия : аллеля В гена р- лактоглоСулина. . - J .

Специфические для двух' аллелей.праймеры BLGA и BLCB прихо-v дятся своими последними нуклеотидами'на 3*-конце на!точковую .му- . тацию. Введенные нами в каждый из праймеров в позйции 3 - Э'-кон--" ца нуклеотияные замены, усиливали их аллелеспецифичность.•

Применяя двухпробирочный метод, АС-ПЦР. при: гомозиготном' состоянии по аллели А р- лактоглобулина овец, мы обнаружили один фрагмент длиной 304 п.н.. при гомозиготности по аллели В - также один Фрагмент длиной 190 п.н. В случае гетерозиготного состояния выявили два Фрагмента длинсй 304 п.н. и 190 п.н. ;

3.2.3. Оцжифобирочцый метод аллелесп^шнЬической ПШ>. Предложенная модификация стандартного метода - AC-nUP"Slngle tube" основана на использовании в одной реакции четырех различных' прапмеров: "наружных* BLC 5, BLG 3 и "внутренних? BLG А и BLG В (рисЛ 3).

Такое расположение прзйнеров способствует тому, ' что специфический для аллеля А фрагмент BLGA-BLG3 отличается по длине от амплифицируемого с аллеля в фрагмента BLGB-BLG5 (табл» 4). Зависимость длины фрагментов от аллеля делает возможным непосредс-.твентее определение генотипа животного по данному, признаку по результатам одно!) одноступенчатой реакции (рис.; 4а.' Ь(.

3,g,4. Преимущества и недостатки используемых нопиликаний Опытным путем мы пришли к заключение.о том. что ментол ПЦРтПДРФ имеет недостатки. К ним можно отнести- необходиость наличия сайта рестрикции в точке мутации, а также затрата времени

Рисунок 3. Схема анализа вариантов гена ß-лактоглобулива овец

"Внутренние" специфические Зля двух различных аллелей прай-меры BLG А. BLG В (выделени серыми прямоугольниками) своими последними нуклеотоЗат на 3'-конце приходтся ш точковую мутацию (указана стрелкой); в комбинации с наружными праймерат-BIG 5 и BLG 3 (показаны.черныш прямоугольниками) они приводят к амплификации фрагментов различной Оля каждого из аллелей блины (дается е парах щклеошдов - п.к. J; показана длина общего i^M-обоих аллелей фрагмента BLG 5/BLG3.

Рисунок 4 a.b. ' ,

Анализ вариантов гена ß-лактоглобулина овец методом ПЦР

ЧШ.

О ЛЛ.

А. ДвмспроацрочнШ . метод АС - ПЦР с праШаераш BLG 3/BLG А (<5оро«ки 1. 2. 3) и BLG 5/BLG В (Порошки 4, 5, 6).

Морожки:.!. 4 - животное с генотипом ЛА; г, 5 - AB; 3, 6 ~ ВВ. ■ В. Отопробирочкиа метод АС ПЦР с праймерами BLG 5/BLG В и. BIß A/BLS 3.

Дорожки: 1 - животное с генотипом АА: 2 - животное с генотипом -АВ; 3 — животное с генотипом ВВ.

Амплифицироеонмые ¡ррагмекты маркированы' стрелками и. их длины -в парах нцклеотОов (п. н.) • обозначены справа, и реактивов на проведение реетрикционно-энзиматического гидролиза. продуктов ПЦР СЗ часа и более). • .

Использование аллелеспецифической'полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) для диагностики различных аллельных вариантов исклю-Таблица 4; Длины фрагментов в зависимости от генотипа гена (Кпактоглобулина овец однопробирочным методом АС-ПЦР

1- I Праймеры 1-:-:—г-*-~1 1 Длины амплифицируемых фрагментов (Ьр) 1

||В одной реакции) 1 1 1 Генотип

I АА I АВ | . 1 вв |

1 1 ВЬС5/БЬСЗ 1 В1ЛА/ВиЗЗ 1 В1£5/В1£В 1 452 I 304, | 1 I 452 1 304 I 190 452 1 190 | »

чает выше указанные недостатки. -Вывод, о генотипе животного в случае двухаллельного признака делался на основании сравнения ре-, эультатов двух реакций. .* '

Поскольку при использовании однопробирочного метода АС-ГЩР зависимость длины фрагментов от аллеля делает возможным непоо-, родственное определение генотипа животного в одной реакции, то это приобретает решающее значение при анализе большого числа, проб при выполнении популяционно-генетического анализа.

3-3- Сра^ник^ьте^ адаяи? ' результатов 1П№ с результатами электрофореза белкой молоуа в ПААГ.

В нашей работе бил проведен сравнительный анализ полиморфизма р- лактоглобулина овец синтетической популяции изэ/х. "Клено-во-Чегодаево" (п-43) методами ПЦР (на уровне ДНК) и электрофореза белков молока в полиакриламидном геле. Несовпали .результаты ПЦР и электрофореза у 6 животных из 43 (13,93). При изучении генотипов потомков в сопоставлении с генотипами родителей в четырех случаях была установлена неточность метода электрофореза белков молока в

ПААГ. в то время как результаты ПЦР-анализа генотипов р-лактогло-булина у родителей и потомков полностью совпадали(табл. 5).

. Коэффициент ассоциациипри оценке генотипов р-лактогло-булина овец пЦР-анализом бшг равен 1. а при; гельэлектрофоре-зе-0.94, что также указывает на ошибку оценки генотипов с помощью ПААГ. Разница в результатах, очевидно связана с ошибкой определения белковых вариантов. Это может быть из-за того, что фрагменты белка при электрофорезе расходятся не достаточно далеко друг от ' друга, что иногда затрудняет чтение генотипов. Кроме того, при Таблица 5. Анализ точности сравниваемых методов по потомкам

г--г-1-:-1

I Инд. номер и|Инд. номер и|Инд. номер и I {генотип матери)генотип отца!генотип потомков! . I—-1-1-I

14208. фореэ-АА|445, ПЦР-АВ 1&425, ПЦР-ВВ 1 I * ПЦР- АВ | I

I-:-1--1-1

11119. форез-АВ|435. ПЦР-АА 16411, ПЦР-АА 1 I ПЦР-АА | (6412. ПЦР-АА |

>-:-1--1

; 132, форез-АВ |18. ПЦР-АА (621. ПЦР-АА ( .1 ПЦР-АА | 1622. ПЦР-АА 1

Н--—-1--1-1

. ,13228. форез-АВ13114. ПЦР-АА16241. ПЦР-АА | .,

I . ПЦР-АА 1 | | V . Ь—:---;-1-1_;_J

электрофорезе трудно регулировать оптимальный режим проведения разгонки белка. Ошибка «финиша при использовании метода ПЦР практически исключается, так как олигонуклеотидню праймеры отжи-гавтся на днк-матрице строго специфично.

4 .-Анализ;аллелей ртяахтоглобулина в различных популяциях овец.. Исследование генотипов 0-лактоглобулина было проведено на ,241 овцах породы ромни-марш иэ-ГПЗ "Котовский" Рязанской области, .160 овцах синтетической популяции из э/х "Кленово-Чегодаево" и 25 овцах цигайской породи из Виотйсцентра РАСХМ. Распределение генотипов и аллелей по. р-лактоглобулину в данных популяциях, представлено в табл. 6." '. /

Как следует из данных, представленных в табл. 6, во всех

Таблица е. Распределение генотипов и аллелей по р-лактоглобулину

I-1-г--:-1-;---1

1 I I Частоты генотипов I Частоты аллелей. I

| Порода 1 п I-1-1-1-1-1

I I I АА I АВ [ ВВ | А I В |

(----1-1-1-1-1-Ц--Ч

|РомнИ-марш [241 10.560 (0.369 |0,0705 | 0.7448 10,2551 ( (Синтетическая) 1 | | | I

IПОПУЛЯЦИЯ■ |160 10.7562510.2187510,0283 | 0.8656 (0.1343751

[Цигайская- I 25 |0.48 10.52 [ - [ 0.74' [ 0.26 ( ♦ ' ■ * ' ■ ■ ■

исследованных, популяциях овец частота аллеляА была больше по сравнению с аллелен В. Преобладание аллеля А в популяциях можно объяснить, с одной стороны, использованием родственных баранов-производителей, с другой стороны, действием отбора в сторону уменьшения;частоты аллеля В. По всей видимости, проводимый в популяциях отбор по селективным признакам продуктивности' косвенно поддерживает аллель А.

Согласно закону Харди - Вайнберга все три изученных популяции свец находятся а генетическом равновесии.

■ Поскольку в стаде не проводился отбор на основе типов р-лак-тоглобулина. можно предполагать, что реже встречаются генотип ВВ был нежелательным по какому-то из селекционируемых.■признаков (живой вес, настриг, качество шерсти и т. д.).

Анализ результатов, полученных в наших исследованиях и другими" авторами' выявил определенную закономерность. В популяциях полутонкорунша я тонкорунных лород овец частота аллеля А преобладает над частотой аллеля В. В популяциях полугрубошерстных и грубошерстных овец, напротив; наблюдается тенденция к увеличению частота аллеля В.

3:5 устанррленнв связи аллеляииб- лактоглоФУЛННЗ-Н'

хозяйственно-полезными признаками. Сравнение баранов ромнитмарш по живо? массе в возрасте 1-5 лет выявило тенденцию к увелнче-. нию живой массы у гетерозигот по сравнению с гомозиготами. Если в возрасте одного года различия по живой массе не проявлялись, то в' последующих возрастных группах они бцяи очевидными. При этом «и-' вотные с генотипом ВВ, характеризовались наименьшей живой массой; При сравнении маток по живой массе> в лзрасте 1 - 6 лет также бы-

ла выявлена тенденция к пониженной «ивой массе у животных с генотипом ВВ.

Как видно из данных табл. 7, ярки, полученные от матерей с генотипом АВ, характеризовались на 12.ВХ более высокой лживой массой при рождении по сравнение с молодняком, полученным от матерей с генотипом АА (Р>0.99) иВВ. Ярки от гетерозиготных матерей превосходили по живой массе приотьеме ярок, полученных от матерей с генотипом АА на 11,9% (Р>0,95) и с генотипом ВВ - на 9.6Х.

Таблица 7. Кивая масса ярок при рождении и отбивке в зависимости от генотипа матери по 0-лактоглобулину

г-:-г-:-1

I Генотип | Живая масса ярок I

.1 матери |-1-:-1

I | при рождении | при отбивке | | ■ |-,-.--,-[

I I п1 кг \ п I *кг 1 I-Н—Н--1—I-1

IАА ( 271 3.9 ± О.Ю* I 261 23,5 ±-0.94*4

1АВ I 121 , 4.4 ± 0,15* ) 12| 26.3 ± 0,80" |

|ВВ | 51 3.9 ±0.24 | 5| 24.0 * 2.47 |

1-Н-1-1-1-:-1

|В среднем | 44| 4.1 ± 0.08 | 431 24.4 ± 0,66 1 |--1—-I-(-1-(

1 *АВ>АА (Р>0.99): **АВ>АА (Р>095) I

I_:_:_I,

Определенная закономерность была выявлена при анализе баранов и маток по (тонине шерсти. При бонитировке маток в возрасте 1

- 1.5 лет. а также ярок по достижении ими возраста бонитировки (1

- 1.5 лет) среди животных с генотипом АА 40,ОХ (30/75) имели более тонкую шерсть (56/58 качества), в то время как среди животных с генотипами АВ и ВВ - соответственно 27,1% (13/47) и 16,7« (2/12). Данные о качестве шерсти баранов в зависимости от генотипа по р-лактоглобулину в р&злкчнок возрасте представлены в.табл.8.

Как следует из данных табл. 8, при.анализе качества шерсти у баранов прослеживается'тенденция, подобная маткам»(АА>АВ>ВВ).

В связи с тем. что в статистических исследованиях овец синтетической популяции из.э/х "Клеково-Чегодаево* генотип ВВ 0-лак-тогдобклина присутствовал у м&ток и ятоят в единичном случае, по-

Таблица в. Процентное распределение баранов рсини-марш по тонине шерсти в зависимости от вариантов р- лактоглобулина

Возраст

Количество баранов с шерсть» 50/56 качества (в X) от общего числа баранов с шерстью 46/48+50/56 качества в зависимости от варианта р-лактоглобулина. - '

АА

I

AB

~г--i-

Г)150/5в (*) | П|50/56 (*)

+

Sil 100 14 ¡79110.9* 16 (37112,1 12(33113,6** 6]33±19,2. —I-

н—н |16|88±8,1 ¡16137112, Ц613Ш1.6 I 9| О"' I 2| О

J—I_

вв

(В среднем г

П|50/56 (X) I п]50/56 (X)

+

3(67127,2 3|33±27,2 3| О 2 J50135,5 II О

"f—f

12818915,9 |33|55±8,7 |35|3U7.8 |23í2218.в j 9)22±13,8

11 ГОД

|2 года |3 года 14 года

(5 лет-■_

'» - АА>АЭ (Р>0.95): м - АА>АВ (Р>0.99)

этому мы не использовали его а анализе с другими генотипами.

Изучение у животных синтетической популяции взаимосвязи *и-воЯ массы с генотипами по р^лактоглобулину, выявило в большинстве случаев большее значение этого признака у животных с генотипом АА по сравнению с генотипом AB р-лактоглобулина(табл.9). У наток с Таблица 9. Живая масса овец.синтетической популяции. и ее связь с генотипами р-лактоглобулина

t-:-1-;-1

IЖивая масса в раэ~| Генотип- . | .

(личном возрасте- (-1-:—i-1-Н

I j П i АА Inf AB j

I-.-1-1-:-1-1-1

!мат- | 1 год l 91 43,3 1.1.96 |3,( 46.67 i 5,33 |

(КИ ( 2 года . | III* 67.5 1 3,23* | 5 t 52. 5 i 3.41 |

||3 года 1 141 63.9-1 21.3 1 5 | 60.7 1 17.9 |

|-1-1-1--.-

1ягня-1при рождении! 57t 3,09 i 0,09 l 12| 2.98 i 0.24 |

|та | при отбивке | 561 16.84 10.53 j 12] 16.54 10.97 j i< i i 1 ii i

* - AA>AB-i(P>0,99) -

генотипом- АА в возрасте 2 года живая масса была достоверно выше, чем.у животных с генотипом АВ р-лактоглобулина(Р>0.99). Такая же тенденция отмечена и при изучении живой массы ягнят при рождениии отбивке в зависимости от генотипа матери по р-лактог-лобулину. (табл. 10), Показатели живей массы у потомков от матерей с генотипом АА были в большинстве случаев выше. Так,, масса при отбивке ярок от матерей о генотипом АА была выше, чем у ярок от матерей с генотипом АВ (Р>0.95). Хотя в остальных случаях различия были незначительными.

' Таблица'10. Живая масса ягнят при рождении и отбивке -в зависимости от генотипа матери

| Живая масса

»——^——

I. - ярки: (при рождении |при отбивке

' " ,"■ -Генотип..

п 1

АА

I П I

АВ

I. . : I 1—•———

г -V: г V;. .• I I

18) 2.92 ± 0.15 17}. 2,97 ± 0.26

18| : 17.56 г 0,74* I 7 1 14,29 ± 1; 16

1 , -I баранчики: |при рождении (при отбивке

—Ь ■I

191

181

, »,

I I . I I I б 1 Г6 I

3.21 ±.0.19 18.28 * 0,97

3.10 + 0.46 •17.33 ± 1;99

, < - АА>АВ (Р>0.95) \ ..• , .. .

Сравнение тонины шерсти у животных из этой популяции в зависимости от генотипов по р-латоглобулину ваявило такую же связь, как и в популяции овец ромни-марш из ГПЗ "Натовский". Самая тонкая шерсть у овец синтетической популяции бала выявлена у особей с генотипом АА (табл. 11).

Изучение у овец синтетической популяции зависимости состава * молока от генотипа по р-лактоглобулину показало, что такие параметры как жир, белок и сухое вещество коррелируют с, генотипами'по р-лактоглобулину (табл.. 12). .

■ Так; животные с генотипом-ВВ по р-лактоглобулину характеризо 'вались меньшим процентом жира и белка в молоке, а также содержа йием сухого вещества. Наибольшее количество исследуемых парамет ров отмечалось у животных с генотипом АВ.

. .' Таблица и. Тонина шерсти у маток синтетической популяции ■ и их генотипы по р-лактоглобулину '. . -:*

' Тонина шерсти в различном возрасте

Число животных с шерстью 50/56 качества от общего числа животных с шерсть» 46/43 + 50/56 качества

т

нг

п I

АА

N I

АВ

—Ь I

9 I 111 141

4—I-—

I I

1 3 1 1 (33,33!) | 5 | 3 (60. ОХ) I 5 | 2. (40. ОЖ)

маТКИ (50/56)

1 год

2 года

3 года

9 (100 %)• 6 (54,5%)

10 (71,4»)

*-- АА>АВ (Р>0,95) Таблица 12. Показатели состава молока у овец з/х "Кленово-Чегодаево" в зависимости от генотипа по р-лактоглобулину

| Параметр

I

I

I-

IКоличество Ь

1Жир (X) (Белок (X) IЛактоза(X) (Сух. в-во I

.Вариант р-лактоглобулина 1

-1

АА

,28

АВ

12

ВВ

I

-I

2 I +

Примечание

5.7640,32 |6.17±0.33 |3.85±0,34 1АА И АВ>ВВ(Р>0,999) 4,3920.07 I4.55i0.ll |3.94±0,05 |АА И АВ>ВВ(Р>0,999) 4,6210,03 |4,63±0,04 14,72±0.09 I 15.13±0,27115,64±0,39113,25±0,431АА>ВВ (Р>0,9С.') . - ) * .1 (АВ>ВВ (Р>0,99)

3-6. Диализ рсдо-юрАЦЭН? белков рвечьрго молока с помощью электррйореза в по^зурилрмндном геле. В результате электрофореза сывороточных белков и казеина молока овец синтетической популяции из э/х "Кленово-Чегодаево* были „ выявленыследующие системы: р-лактоглобулша: а-лактальбушна;• иммуноглобулина(сывороточные белки): а^-казеин: р-казеин: Х-казеин: .аг,?-казеин(фрахшш казеина). Из изученных 7 систем, полиморфными оказались 4 (табл. 13). ■ !

Таблица 13. Популящонно-генетическиЙ анализ полиморфных систем * белков молока у овец

1 I Локус -I--— | ; Аллель * 1 1 Частота —1 I Генотип 1 —г--1 1 Частота: 1

1 а-Ьа ? •• А 1 1.0 | АА 1 1.0 |

1 »-1е 1 А 1 0.8 I АА 1 0.64 |

1 ' в 1 0.2 Г АВ . . 1 0.32 |

1 ев 1 0.04 |

1 1« 1 А ' 1 о.е I АА 1. 0.90 |

| л 1 В I 0.2 1 АВ 1 0.10 |

1 А 1 . 0.35 ' 1 АА 1 0.10 1

1 В I 0.26 I АВ 1 0.39 |

1 С 1 0.12 1 АС 1 0,07 |

1 0 1 0,25 1 вв 1 0.09 1

I ВО 1 0.11 1

1 * ВС 1 0.07 |

1 1 со . I 0.11 |

I р-Сп 1 0,-Сп 1 г. о . 1

1 Рг-Сп 1 \;0

1 г-сп 1 А 1 0.52 | АА Г о.зо 1

I В 1 0.48 I АВ 1 0,45 |

.1 ВВ Г . 0.25 |

1. 0,,-СП I А 1 ' -1;0 ' 1 ' АА 1 1,0 |

1 —1__ ■ ■ - ■ _-1

'V вы вод ы

1.Впервые, с цель» широкого внедрения метода ПЦР-анализа в: овцеводство, создан банк ДНК; от различных пород овец,

г. Предложенный однопробирочный метод- АС-ПЦР не-требует в .отличие от метода ПЦР-ПДРФ необходимости наличия сайта рестрикции в точке мутации; а также затрат времени и реактивов.на проведение рестрикодонно-энзииатического гидролиза продуктов ПЦР. При однол--робирочнон. методе в отличие от стандартного двухпробирочного метода АС-ПЦР. зависимость длины фрагментов от аллеля делает> воз-мох .м у непосредственное определение генотипа животного в одной

- 1Й -

реакции, что является важным при анализе большого числа проб.

3. Наилучшее чтение результатов ПЦР-аяализа достигается при 1,5 шИ концентрации ионов Ма2*. оптимальная концентрация Фермента Тад-лолимеразы,составила для выбранных нами лраямеров 1 £д. Высокая концентрация данного фермента приводит к неспецифическому отжигу праймеров. в результате чего искажается интерпретация результатов ПЦР. Введение в каждый из праймеров в позиции 3 на 3'-конце нуклеотидной замены, некомплементарной исследуемой ДНК-матрице, способно - усиливать их аллелеспеадфичность.

4. Сравнительный анализ локуса 0-лактоглобулина методами ПЦР и электрофореза белка в полиакриламидном геле, показал в 6 случаях из 43(13.930 несовпадение результатов. Коэффициент ассоциа-' ции(гА) при оценке генотипов р-лактоглобулина овец ПЦР-анализом составил 1, а при гель-электрофорезе,- 0,94; что указывает ка ошибку оценки белков молока.последним методом. Ошибка при использовании ПЦР практически исключается, так как олигонуклеотидные праймеры являются строго специфичными к исследуемой ДНК-матрице.

5. Ягнята породы ромни-марш. полученные от матерей с генотипом АВ(4,410. 15); характеризовались на 12,6% более высокой живой массой при рождении, чем молодняк полученный от матерей с генотипом АА{3.9±0. 10) и ВВ(Э,9±0,24). Ярки от гетерозиготных матерей превосходили по живой массе(26,з±0,ВО) при отъеме своих сверстниц. полученных от матерей с генотипом АА(23,5±0,94) на 11;9Х(Р>0,95) и с генотипом ВВ(24.0±2.47) на 9,6Х. У синтетичес-' кой популяции наиболее высокой живой массой при рождении и отбивке обладали ягнята полученные от матерей с генотипом АА, чем с АВ(Р>0.95), что очевидно связано с проводимой' селекцис ;ноа работой. . .

6. У овец породы ромни-марш с .генотипом АА по р-лактоглобу-лину количество особей с шерстью 50/56 качества в возрасте 2 и 4 года было достоверно больше, чем среди животных о генотипом АВ(Р>0.95, Р>0,99, соответственно). У овец синтетической популяции такая же закономерность выявлена в возрасте одного года, количество животных с шерстью 50/56 качества было достоверно больше среди: овец с генотипом АА,. чем с генотипом АВ(Р>0.95).

7. Среди овец с генотипом АА и. АВ содержание в молоке жира,' белка и сухого вещества было достоверно больме, чем у животных с генотипом ВВ(Р>0.999). ■ л ■

8, Генотипирование 7 систем белков молока показало, наличие полиморфизма в локусах a,t-казеина./Х-казеина, р-лактоглобулина и иммуноглобулина, МономорФнымн оказались локусы а-лактальбумика; ß-каэеина; Одг-казеина. Локусы контролирующие экспрессию данных белков могут быть использованы в качестве дополнительных маркирующих систем при характеристике овец различных популяций.*

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

г

1. Яри молекулярно-гепетическом анализе большого числа образцов крови, рекомендуем использовать предложенный однопробирочный метод АС-ПЦР, как наиболее экономичный и простой метод. Семь локу-ссв белков молока можно использовать в качестве дополнительных генетических маркеров при изучении аллелофонда различных пород овец.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1 кБачкарев В.В.. Зиновьева H.A.. Марзанов Н.С.. Попов А.Н-.Брем Г. Изучение полиморфизма гена' ft -' лактоглобулина овец методом' ПЦР-анализа // Тез. докл. науч. - практич." конф. "Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения". Быково. - 1997..- С. 105-106.

2-Бочкарев В.В.." Зиновьева H.A.,Попов А.Н. .Марзанов Н.С., Брем ПГ Новые нолекулярно-генетические подходы для анализа вариантов гена Р - лактоглобулина у, овец // Восьмая международная конференция "Новые направления биотехнологии". Тез. докл. Москва,- 1998.С.41. З.Бочкарев В.В.Зиновьева H.A.. Попов А.Н., Марзанов Н.С.. Эрнст Л.К.. Брей Г. Сравнение двух методов изучения полиморфизма {( -лактоглобулина овец // Доклады РАСХН. - 1998. - ИЗ. - С.27-29. . '4.Марзанов Н.С.. Щеткин В.Я., Бадалов Я.И.. Ковалева К.А., Марза-иова Л.К.. Гладырь Е.А.. Бачкарев В.В.. Т.А. Магомадов // Аллело-Фонд породы ромни-марш // Вестник РАСХН. -1998. - НЗ, - С. 61-63.

Seic,yi22 Twp.I00 »K8. I.O y,п.л. Ten.ITOflt HITO "Луч" г.Подольск М;0.