Молекулярно-генетический анализ локуса бета-лактоглобулина у овец различных полутонкорунных пород

Бочкарев, Владимир Вячеславович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Молекулярно-генетический анализ локуса бета-лактоглобулина у овец различных полутонкорунных пород
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Молекулярно-генетический анализ локуса бета-лактоглобулина у овец различных полутонкорунных пород"

• Г К л п •

• ; ° г' На правах рукописи

/ В ШОП 1£ГЛ

Бочкарев Владимир Вячеславович,

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ЛОКУСА 0 - ЛАКТОГЛОБУЛИНА У ОВЕЦ РАЗЛИЧНЫХ ПОЛУТОНКОРУННЫХ ПОРОД

03.00.23 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

ДИССЕРТАЦИИ НА СОИСКАНИЕ УЧЕНОЙ СТЕПЕНИ КАНДИДАТА БИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК

Дубровицы, 1998

Работа выполнена в лаборатории генетики животных Всероссийского научно-исследовательского института животноводства

Научные руководители: .

доктор биологических наук Н.С. Марзанов иностранный член РАСХН, профессор Г. Брем

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор И.Я. Шихов кандидат биологических наук, доцент Л.Ф. Новикова

Ведущая организация: Биотехцентр РАСХН

Защита диссертации состоится íUÚUüL 1998 года в

часов на заседании диссертационного совета Д. 020.16.02 по защите диссертаций при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института:142012 Московская область. Подольский района

п. Дубровицы. ВИЖ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа. Автореферат разослан Ш-СН-С-Л^ 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета,-доктор сельскохозяйственных наук

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы. Главной проблемой в области генетики сельскохозяйственных животных и связанных с ней разделов биотехнологии является установление детерминации биологически важных и хозяйственно-полезных признаков.

В этой связи, одним, из подходов оценки животных является их характеристика по генетическим и физиологическим маркерам. Она включает в себя оценку по группам крови, полиморфным системам белков, а в последнее время и по молекулярно-генетическик маркерам (1?оус1к>ис111игу А.К, Ие1М.. 1988; Марзанов Н.С., 1991,-1994; С01Чаг1 М..7. с!е а1.. 1997).

Выявление генотипов животных по ряду аллелей позволяет вести поиск "генов кандидатов" для локусов количественных признаков сельскохозяйственных животных. Выявление таких генов позволит эффективно использовать их в качестве маркеров признаков продуктивности. что в конечном счете позволит повысить эффективность ведения селекционной работы.

Среди целого ряда молекулярно-генетических методов наибольшее распространение для оценки животных по генотипу, вследствие быстроты и точности оценки, а также использования небольшого г--личества исходного материала, получил метод полимеразной цепной реакции(11ЦР-анализ). Этот метод позволяет увеличивать в миллионы раз количество копий детектируемого участка ДНК с.помощью фермента ДНК-полимеразы, что делает возможным его визуализацию.

Большой интерес для науки и практики представляет исследование полиморфизма генов белков молока. Уже выявлены закономерные связи между вариантами белков молока и хозяйственно-полезными признаками у крупного рогатого скота. • Что касается других видов животных, то работы в этом направлении ведутся менее интенсивно.

Данная диссертационная работа направлена на создание банка ДНК из крови, разработку экспресс-метода аллелеспецифической полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) для выявления аллелей р-лак-тоглобулнна и изучения методом электрофореза в яолиакриламидном геле(ПААГ) полиморфизма белков молока у овец.

1.2 Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование различных пород овец с использованием в качестве маркера гена р - лактоглобулина и других белков молока.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: 1. Создать банк ДНК крови овец породы ромни-марш, цигайская и синтетической полутонкорунной популяции. 2. Разработать экспресс метод аллелеспецифической ПЦР для диагностики вариантов р-лактоглобулина овец. 3. Провести характеристику пород овец по частотам встречаемости различных аллелей и генотипов р-лактоглобулина и других белков молока. 4. Выполнить статистические расчеты с целью выявления корреляционных связей между вариантами р-лактоглобулина и хозяйственно-полезными признаками.

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые в данной работе предложен метод АС-ПЦР для анализа р-лактоглобулина у овец. Создан банк ДНК от нескольких популяций овец. Проведен популяционно-генетический анализ 7 локусов белков молока. Выполнен статистический анализ для установления корреляционных связей между генотипами по р-лактоглобулину и хозяйственно-полезными признаками.

1.4. Положения, выносимые на защиту. Создание банка ДНК из крови овец различных пород. Генотипирование р-лактоглобулина и других белков молока у пород и половозрастных групп овец с использованием методов ДНК-диащостики и гельэлектрофореза.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на научно-практической конференции "Повышение конкурентноспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения", РАМЖ, Быково, 16-20 июня 1997 г.; на восьмой международной конференции "Новые направления биотехнологии", Москва, 27-29 апреля 1998 г.

1.6. Публикация материалов. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

1.7. Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения. трех глав, выводов, практических предложений, списка литературы. Материал изложен на. 03. страницах машинописного текста, содержит Л'З таблиц, /Л: рисунков. Список литературы включает Тл? источника, в том числе на иностранных языках.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ

. В качестве объекта исследований были выбраны следующие породы полутонкорунных овец: ромни-марш из ГПЗ"Котовский" Рязанской .облает (п=241), цигайская из Биотехцентра(п=25) и синтетическая

популяция овец из э/х"Кленово-Чегодаево" ВНИИ животноводства (финский ландрас х линкольн х ромни-марш х тексель) (п=160). Исследования были проведены по схеме представленной на рис.1.

I-1 I-•-1

I Хозяйственно-f

(-1-полезные |

I признаки |

I Химический I I анализ молока I

I-,-1

_I_

I Гельэлектрофорез |белков молока в ПАГ

I Генотипирование I белков молока

I Статистическая Нобработка получен-Iных данных

I_'

ПОРОДЫ ОВЕЦ

т-Г

J_ .. . I

~t I---1 I--1

Н популяция I 1-1-1 1-■-1

I___I

_1_

Взятие крови и выделение ДНК

Н ПЦР - анализ Н | I--,-) г

I--1

I Создание! I банка | —11 ДНК | 1ПДРФ -I |АС - ПЦРi Юднопроби-11-1

1 г

л.

I- ПЦР I 1-Г

1-1 I

J|рочный | АС-ПЦР

~г

I—---1

I Гельэлектрофорез продуктов ПЦР |

I_,_;_I

Определение генотипов по ß-Lgl

Рис.. 1. общая схема исследований.

Для выделения ДНК из крови использовали два метода: феноль-но-хлороформовыЯ(В11п Ы;, • Stafford D.W., 1976) и солевой экстракции (Miller S.A., 1988). Концентрацию ДНК определяли на спектрофотометре при длине волны 260 нм, а для характеристики степени очистки использовали показатель соотношения оптической плотности раствора ДНК при длине волны 260 и 280 HM(Sambrook J. et al.,1989).

С целью идентификации полиморфизма гена . ß-лактоглобулина овец применяли: стандартный метод ПЦР-ПДРФ, метод ПЦР-анализа с

использованием аллелеспецифических праймеров(АС-ПЦР), а также модификацию стандартного метода АС-ПЦР-"Single tube", предложенную Зиновьевой H.A. и др.(1996). Для проведения реакций использовали прецизионный программируемый термостат "Cyclo Temp 106". Разделение продуктов амплификации выполняли в 235 агарозном геле.

Полиморфизм белков молока у овец изучали методом электрофореза в полиакриламидном геле при pH 8,б(Иолчиев Б.С., 1993).

Процентное содержание жира, белка, лактозы и сухого вещества в молоке овец определяли с помощью прибора Milko-Skan 203(Дания).

Цифровые материалы обрабатывали общепринятыми методами(Пло-хинский H.A.,1978) с применением персонального компьютера IBM PC.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Подбор праймеров и оптимальных условий проведения ПЦР-анализа. Для оптимизации реакционной смеси и условий проведения ПЦР, выполняли серию экспериментов с различными концентрациями компонентов реакции и различной температурой отжига праймеров.

Правильный подбор праймеров является залогом успешного выполнения ПЦР. Для амплификации фрагментов гена ß-лактоглобулина овец нами были выбраны два "наружных" общих праймера BLG5 и BLG3, а также два •"внутренних" • аллелеспецифических праймера BLGA и BLGB. Последовательности и позиции праймеров в гене ß-лактоглббу-лина овец (EMBL Х12817) представлены в табл. 1.

Таблица 1. Характеристика праймеров, используемых для ПЦР

1 . ■ н 1 Название 1 i 1 ' ....... 1 Позиции в гене | ß-лактоглобулина | овец (EMBLX12817)| ( — — " ■ ,п - - ■ • - " ■ 1 Последовательность (5'-3') 1

1 IBLG5 1 ОТ 1448 ДО 1468 | ТТГГГТ ТЦА ГТГ ТГА ГТЦ ТГГ 1

IBLG3 от 1880 до 1899 | AAA АГЦ ЦЦТ ГГГ ТГГ ГЦА ГЦ 1

1 BLGA от 1596 до 1617 ЦТЦ ЦАГ ГТГ ГЦГ ГГГ АЦТ ТАГ Т' 1

IBLGB 1 ОТ 1617 до 1637 ГГЦ ЦГЦ ЦАТ АГЦ ЦАА ГГА ТТГ I 1

С учетом температуры плавления праймеров, для всех используемых в исследовании модификаций ПЦР-анализа опытным путем подби-•рали оптимальные температурный и временной режимы ПЦР(табл. 2).

Одним из моментов успешного выполнения реакций является концентрация ионов Mg2* в реакционной смеси. Для выяснения оптимальной концентрации ионов Mg2* выполняли серию реакций с концентрацией Mg от 0,5 до 5.0 мМ с шагом 0,5. Наилучшее чтение результа-Таблииа 2. Температурный и временной режимы ПЦР

1 1 Шаг 1 Температура ! Время шага в ■ i циклах 1

(°С> h 1 —i-1

1 1 1 2-35 1 36 1 i i

1 Денатурация 1 94 ! '5 1.1 I I

1 Отжиг праймеров 61*.63. 5*', 1 1 1 i

65* " Г

1 Полимеризация 72 1 1 11

1 Доводка 72 1 - I 13 1

1 Охлаждение 1 6 | 1 - i . ....... 1 6 1 1 1

* - для праймеров BLG3 и BLG5; '«« - для праймеров BLG5 и BLG В «♦* - для праймеров BLG 3 И BLG А. . тов реакций было при 1.5 мМ концентрации ионов Mg2*. Превыш :ие этого значения способствовало образованию неспецифических продуктов амплификации, в то время как недостаток ионов магния приводил к ослаблению полос амплифицированных фрагментов.'

Оптимальную концентрацию Taq-полимеразы определяли выполнением серий реакций с концентрацией фермента от 0.5 до 5,0 Ei на реакции с шагом 0.5 Ед. По результатам опытов для данных праймеров она составила 1 Ед. При более высокой концентрации Taq- поли-меразы наблюдался неспецифический отжиг праймеров, в результате чего искажалась интерпретация результатов.

3.2. Анализ аллелей гена В - лактоглобулина овец методом ПЦР. Полиморфизм гена ß - лактоглобулина обусловлен точковой мутацией в позиции 1617 соответствующего кодона в экзоне II. В результате этого вариант К белка ß -лактоглобулина имеет в позиции 20 аминокислоту тирозин, в то время как вариант В - гистидин Wolde H.J.. Braunltzer G.. 1983].

Для выявления вариантов гена ß-лактоглобулина овец были использованы впервые следующие подходы: стандартный метод анализа ПДРФ и методы аллелеспецифической ПЦР (однопробирочный."Single

tube" и двухпробирочный).

3.2.1. Анализ ПДРФ. Для анализа методом ПДРФ были использованы два праймера BLG 5 и BLG 3, которые амплифицируют фрагмент ДНК гена р -лактоглобулина овец длиной 452 п.н. Температура отжига для этих праймеров, выбраная опытным путем, составила 61°С.

Рестрикционная эндонуклеаза Rsal с последовательное:™ узнавания GT/AC имеет сайт рестрикции в экзоне II варианта'А гена р -лактоглобулина(позиция 1617 по EMBL X 12817). В результате точко-вой мутации Т-С в варианте В произошла утеря сайта рестрикции. Кроме указанного выше сайта рестрикции в аыплифицируемом фрагменте присутствуют еще два сайта узнавания Rsal, которые являются общими для обоих вариантов р -лактоглобулина (рис. Z). Таким образом. после гидролиза продуктов ПЦР Rsal образуются фрагменты, длины которых в зависимости от генотипа суммированы в табл. 3.

Рисунок 2. Схема локализации праймеров при диагностике гена р-лактоглобулина овец методом ПДРФ

V&r А

Uar В

•452 п.н."

Праймеры BLG А и BLG В изображены черныш прямоугольниками; локализация шочкоеой мутации Т-С показана зеезЗочкой; участки узнавания ресшрикшазой RSA I маркированы стрелками (позиции указаны по EMBL К 12817); длины фрагментов даны в парах оснований.

3.2.2. Стандартный(двухпробирочный) метод АС-П11Р. Для анализа вариантов гена р- лактоглобулина овец нами был также использован стандартный двухпробирочный метод аллелеспецифической ПЦР (АС-ПЦР) с модификацией в локализации аллелеспецифических примеров, что позволило в дальнейшем использовать их для "Single tube" метода АС-ПЦР. Данный метод требует выполнения двух независимых

Таблица 3. Длины фрагментов в зависимости от генотипа при анализе гена (Ьлактоглобулина овец методом ПДРФ

1 I Генотип 1 ß~ Lg --------------------------- ■ ■■ - - ■ Длины фрагментов (п.н.) 1 1

1 Без рестрикции 1 1 Гидролиз Rsal 1 1

1 АА 1 AB 1 ВВ 1 1 452 | 452 I 452 | ... 1 175 170 66 236 175 170 66 236 175 | 41 | 41 1 41: ) 1

реакций для каждого из образцов с праймерами ВЬСЗ/ВЬСА с целью установления наличия аллеля А и ВЮБ/ВЬСВ для выявления наличия аллеля В гена р- лактоглобулина. .

Специфические для двух аллелей.праймеры ВЬвА и ВЬйВ прихо-, дятся своими последними нуклеотидами на 3'-конце на точковую мутацию. Введенные нами в каждый из праймеров в позиции 3 - 3'-конца нуклеотидные замены, усиливали их аллелеспецифичность.

Применяя двухпробирочный метод. АС-ПЦР, при гомозиготном состоянии по аллелю А {5- лактоглобулина овец, мы обнаружили одич фрагмент длиной 304 п.н.. при гомозиготности по аллелю В - также один Фрагмент длиной 190 п.н. В случае гетерозиготного состояния выявили два фрагмента длиной 304 п.н. и 190 п.н.

Предложенная модификация стандартного метода - АС-ЛЦР"5ш£1е Пиве" основана на использовании в одной реакции четырех различных праймеров: "наружных" В1,С 5, В1Л 3 и "внутренних" ВЦ] А и ВУЗ В (рис. 3).

Такое расположение праймеров способствует тому, что специфический для аллеля А Фрагмент ВЬСА-ВЮЗ отличается по длине от амшшфицируемого с аллеля В фрагмента ВЬСВ-ВЮ5 (табл. 4). Зависимость длины фрагментов от аллеля делает возможным непосредственное определение генотипа животного по данному признаку по результатам одной одноступенчатой реакции (рис.: 4а. Ь).

3.2.4. Преимущества и недостатки используемых модификаций ПЦР-анализа. Опытным путем мы пришли, к заключению о том, что метод ПЦР-ПДРФ имеет недостатки. К ним можно отнести необходиость наличия сайта рестрикции в точке мутации, а также затрата времени

Рисунок 3.

Схема анализа вариантов гена ß-лактоглобулина овец методом АС-ПЦР _

BLG В

дпь*

BVG 5

BLG А

•190 п н -

BUG 3

■304 п.н/

452 п.н.-

"Внутренние" специфические для двух различных аллелей прай-меры BLG А, BLG В (выделены серыми прямоугольниками) своими последними нукпеотдами на 3'-конце приходятся на шочковую мутацию (указана стрелкой); в комбинации с наружными прашерами BIG 5 и BLG 3 (показаны черными прямоугольниками) они приводят к амплификации фрагментов различной для каждого из аллелей длины (Зается в парах нуклеотиЭое - n.Hj; показана длина общего §ля обоих аллелей фрагмента BLG 5/BLG 3.

Рисунок 4 а, ъ.

Анализ вариантов гена ß-лактоглобулина овец методом ПЦР .12 3 4 5 6

-304 п.и.

■190 п.м.

im >90 п.н.

A. Двцхпробирочный метод АС - ЛЦР с праймероми BLG 3/BLG А (дорожи 1, г. 3) и BLG 5/BLG В (Эорожки 4. 5, 6).

Дорожки:!, 4 - животное с генотипом АА; 2, 5 - AB; 3, 6 - ВВ.

B. ОднопробирочнШ мето9 АС -. ПЦР с праймераш BLG 5/BLG В и BIG А/BIG 3.

Дорожки:1 - животное с генотипом АА: 2 -животное с генотипом АВ; 3 - животное с генотипом ВВ.

Амплифилированные фрагменты маркированы стрелками и их длины в парах нуклеотидов (п. н.) обозначены справа. и реактивов на проведение рестрикционно-энзиматического гидролиза продуктов ПЦР (3 часа и более).

Использование аллелеспецифической'полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР) для диагностики различных аллельных вариантов исклю-Таблица 4. Длины фрагментов в зависимости от генотипа гена р-лактоглобулина овец однопробирочным методом АС-ПЦР

1 I Праймеры 1(в одной реакции) ( " ' 1 Длины амплифицируемых фрагментов (Ьр)|

Генотип

АА 1 " 1 АВ 1 ) вв |

1 ВЮб/ВЬСЗ 1 ВЬСА/ВЬСЗ 1 ВЬС5/ВЮВ 1 452 304 1 1 1 452 I 304 1 190 | 452 I 190 | . . .. ._ 1

чает выше указанные недостатки. Вывод о генотипе животного в случае двухаллельного признака делался на основании сравнения ре-, зультатов двух реакций.

Поскольку при использовании однопробирочного метода АС-ПЦР зависимость длины фрагментов от аллеля делает возможным непосредственное определение генотипа животного в одной реакции, то это приобретает решающее значение при анализе большого числа проб при выполнении популяционно-генетического анализа.

3.3. Сравнительный анализ результатов ПЦР с результатами электрофореза белков молока в ПААГ.

В нашей работе был проведен сравнительный анализ полиморфизма р- лактоглобулина овец синтетической популяции из э/х "Клено-' во-Чегодаево" (п=43) методами ПЦР (на уровне ДНК) и электрофореза белков молока в полиакриламидном геле. Несовпали результаты ПЦР и электрофореза у 6 животных из 43 (13,9%). При изучении генотипов потомков в сопоставлении с генотипами родителей в четырех случаях была установлена неточность метода электрофореза белков молока б

ПААГ, в то время как результаты ПЦР-анализа генотипов р-лактогло-булина у родителей и потомков полностью совпадали(табл. 5).

* Коэффициент ассоциации(гА) при оценке генотипов р-лактогло-булина овец ПЦР-анализом был равен 1, а при гельэлектрофоре-зе-О,94, что также указывает на ошибку оценки генотипов с помощью ПААГ. Разница в результатах, очевидно связана с ошибкой определения белковых вариантов. Это может быть из-за того, что фрагменты белка при электрофорезе расходятся не достаточно далеко друг от друга, что иногда затрудняет чтение генотипов. Кроме того, при Таблица 5. Анализ точности сравниваемых методов по потомкам

г—-г-1-:-1

I Инд. номер и|Инд. номер и|Инд. номер и I Iгенотип матери|генотип отца¡генотип потомков!

4208, форез-АА|445. ПЦР-АВ 16425, ПЦР-ВВ ПЦР- АВ |

-1-1-

1119, форез-АВ|435, ПЦР-АА |6411, ПЦР-АА ПЦР-АА | (6412, ПЦР-АА

--:-1-1—-

32, форез-АВ |18, ПЦР-АА ¡621, ПЦР-АА ПЦР-АА | |622, ПЦР-АА

13228, форез-АВ|3114, ПЦР-АА|6241, ПЦР-АА I

I ПЦР-АА | II —:-1_|__1

электрофорезе трудно регулировать оптимальный режим проведения разгонки белка. Ошибка скрининг при использовании метода ПЦР практически исключается, так как олигонуклеотидные праймеры отжигаются на ДНК-матрице строго специфично.

3.4. Анализ аллелей р-лактоглобулина в различных популяциях овец. Исследование генотипов р-лактоглобулина было проведено на 241 овцах породы ромни-марш из ГЛЗ "Котовский" Рязанской области, 160 овцах' синтетической популяции из э/х "Кленово-Чегодаево" и 25 овцах цигайской порода из Биотехцентра РАСХН. Распределение генотипов и аллелей по р-лактоглобулину в данных популяциях представлено в табл.6.' . •

Как следует из данных, представленных в табл. 6, во всех

Таблица 6. Распределение генотипов и аллелей по р-лактоглобулину

»■■"■ ■ ■ — 1 I Порода 1 1 - п i 1 "i I Частоты генотипов | Частоты аллелей |

liil | АА | AB | ВВ I 1 1 i 1 А i i 1 в ! i i

1 1Ромни-марш 241 1111 10,560 10.369 10,0705 I 0. 7448 i i 10.2551 |

I Синтетическая 1 1 1 1 1 1

1 популяция 160 10.7562510,2187510,0283 | 0,8656 10,1343751

1Цигайская 1 , , , 25 10.48 10.52 | - | i i i I 0.74- 1 0.26 I i —i

исследованных популяциях овец частота аллеля А была больше по сравнению с аллелем В. Преобладание аллеля А в популяциях можно объяснить, с одной стороны, использованием родственных баранов-производителей. с другой стороны, действием отбора в сторону уменьшения частоты аллеля В. По всей видимости, проводимый в популяциях отбор по селективным признакам продуктивности косвенно поддерживает аллель А.

Согласно закону Харда - Вайнберга все три изученных популяции овец находятся в генетическом равновесии.

Поскольку в стаде не проводился отбор на основе типов р-лак-тоглобулина, можно предполагать, что реже встречающийся генотип ВВ был нежелательным по какому-то из селекционируемых признаков (живой вес. настриг, качество шерсти и т. д.).

Анализ результатов, полученных в наших исследованиях и другими авторами выявил определенную закономерность. В популяциях полутонкоруиных и тонкорунных пород овец частота аллеля А преобладает над частотой аллеля В. В популяциях полугрубошерстных и грубошерстных овец, напротив, наблюдается тенденция к увеличению частоты аллеля В.

3.5 Установление связи между аллелями 6- лактоглобулина и хозяйственно-полезными признаками. Сравнение баранов ромни-марш по живой массе в возрасте 1-5 лет выявило тенденцию к увеличению живой массы у гетерозигот по сравнению с гомозиготами. Если в возрасте одного года различия по живой массе не проявлялись, то в последующих возрастных группах они были очевидными. При этом жи-Еотные с генотипом ВВ характеризовались наименьшей живой массой. При сравнении маток по живой массе в . трасте 1-6 лет также бы-

ла выявлена тенденция к пониженной живой массе у животных с генотипом ВВ.

Как видно из данных табл. 7, ярки, полученные от матерей с генотипом АВ, характеризовались на 12.8% более высокой живой массой при рождении по сравнению с молодняком, полученным от матерей с генотипом АА (Р>0,99) и ВВ. Ярки от гетерозиготных матерей превосходили по живой массе при отъеме ярок, полученных от матерей с генотипом АА на 11,955 (Р>0,95) и с генотипом ВВ - на 9,6%.

Таблица 7. Живая масса ярок при рождении и отбивке в зависимости от генотипа матери по р-лактоглобулину

С ...... ■ ■ ■ 1....... 1 Генотип | ■ " - ■ -.......-........ ■ ' 1 Живая масса ярок 1

1 1 при рождении 1 при отбивке 1

| г| 1 1 п 1 1 1 ! кг 1 1 1 п 1 1 ' кг 1

1 1 1 1АА | 27| 1АВ I 12| 1ВВ I 5! 1 1 1 1 3,9 ± 0.10* | 4,4 + 0,15* I 3,9 + 0,24 | 1 1 261 121 51 1 23,5 ± 0,94" 1 26,3 ± 0.80** I 24,0 ± 2,47 1

1 II (В среднем | 44| I 1 1 1 4,1 + 0,08 | 1 1 431 1 24,4 ± 0,68 |

1 * АВ>АА (Р>0,99) 1 ; * * АВ>АА (Р>095) |

Определенная закономерность была выявлена при анализе баранов и маток по тонине шерсти. При бонитировке маток в возрасте 1 - 1,5 лет, а также ярок по достижении ими возраста бонитировки (1 -1,5 лет) среди животных с генотипом АА 40,0% (30/75) имели более тонкую шерсть (56/58 качества), в то время как среди животных с генотипами АВ и ВВ - соответственно 27.7% (13/47) и 16,7% (2/12). Данные о качестве шерсти баранов в зависимости ,от,,фенотипа по р-лактоглобулину в различном возрасте представлены в табл.8.

Как следует из данных табл. 8, при анализе качества шерсти у баранов прослеживается тенденция, подобная маткам (АА>АВ>ВВ).

В связи с тем, что в статистических исследованиях овец синтетической популяции из э/х "Кленово-Чегодаево" генотип ВВ р-лак-тоглобулина присутствовал у маток и ягнят в единичном случае, по-

Таблица 8. Процентное распределение баранов ромни-марш по тонине шерсти в зависимости от вариантов Р- лактоглобулина

-г-;-1

IКоличество Саранов с шерстью 50/56 качества (в X) от общего числа баранов с шерстью 46/48+50/56 качества в зависимости от варианта р^лактоглобулина

I Возраст

АА

п 150/56 (55)

АВ

п|50/56 (%)

ВВ

В среднем

—I-г—1-

п150/56 (%) I п150/56 (%)

Ч-1—I-:-

И год |2 года |3 года |4 года |5 лет

91 100 14179+10,9* 16|37+12,1 12|33+13,6" 6133+19,2

_I_

16|88±8,1 16|37±12,1* 16|31411,6 9| О" 2| О

—I-

3|67±27,2 3|33+27,2 3| О 2|50±35.5 II О

128|39±5,9 |33|55±8,7 |35|31±7,8 |23|22±8,6 | 9)22+13,8

I I_

* - АА>АВ (Р>0,95); ♦# - АА>АВ (Р>0,99)

этому мы не использовали его в анализе с другими генотипами.

Изучение у животных синтетической популяции взаимосвязи живой массы с генотипами по р-лактоглобулину. выявило в большинстве случаев большее значение этого признака у животных с генотипом АА по сравнению с генотипом АВ р-лактоглобулина(табл.Э). У маток с Таблица 9. Живая масса овец синтетической популяции и ее связь с генотипами р-лактоглобулина

1 1 |Живая масса в раз-| Генотип 1 - /.....1

1 личном возрасте ( I , 1

1 1 п 1 1 АА 1 п 1 1 1 АВ |

1 |мат- 1 1 год | 1 91 43,3 + 1,96 1 1 1 3 | 46,67 + 5.33 |

|ки 1 2 года | 111' 67.5 + 3, 23* 1 5 I 52.5 ±3,41 |

1 1 1 3 года | 141 63.9 + 21,3 1 5 I | |' 60,7 ±17,9 |

1 |ягня- |при рождении) | 571 3,09 ± 0.09 1 121 2,98 ±0.24 |

1 та г |при отбивке ) I . . 1 56| .. ..1 16,84 0,53 ! 121 1. 1 16,54 + 0,97 |

* - АА>АВ (Р>0.99)

генотипом АА в возрасте 2 года живая масса была достоверно выше, чем.у животных с генотипом АВ р-лактоглобулина(Р>0.99). Такая же тенденция отмечена и при изучении живой массы ягнят при рождении и отбивке в зависимости от генотипа матери по р-лактог-лобулину (табл. 10). Показатели живой массы у потомков от матерей с генотипом АА были в большинстве случаев выше. Так, масса при отбивке ярок от матерей с генотипом АА была выше, чем у ярок от матерей с генотипом АВ (Р>0,95). Хотя в остальных случаях различия были незначительными.

Таблица 10. Живая масса ягнят при рождении и отбивке в зависимости от генотипа матери

Г................. 1 Живая масса 1 Генотип 1

1 1 • 1 1 п 1 1 АА 1 ) 1 п 1 1 1 АВ

1 1 ярки: (при рождении |при отбивке 1 1 • Г 181 ■181 1 2, 92 ± 17,56 ± 0,15 0,74* 1 1 1 1 1 7 I 1 7| ■ | 2,97 ± 14,29 ± 0.26 I 1.16 1

1 I баранчики: 1 при рождении 1 при отбивке 1 1 1 191 181 .1. 3,21 ± 18.28 ± 0.19 0,97 1 1 1 1 1 6 1 16 1 .1 .1 3.10 ± 17,33 ± 0.46 I 1,99 I |

* - АА>АВ (Р>0,95)

Сравнение тонины шерсти у животных из этой популяции в зависимости от генотипов по р-лакюглобулину выявило такую же связь, как и в популяции овец ромни-марш из ГПЗ "Котовский". Самая топкая шерсть у овец синтетической популяции была выявлена у особей с генотипом АА (табл. 11).

Изучение у овец синтетической популяции зависимости состава молока от генотипа по р-лактоглобулину показало, что такие параметры как жир, белок и сухое вещество коррелируют с генотипами по р-лактоглобулину (табл. 12).

Так, животные с генотипом ВВ по р-лактоглобулину характеризо вались меньшим процентом жира и белка в молоке, а также содержа нием сухого вещества. Наибольшее количество исследуемых парамет ров отмечалось у животных с генотипом АВ.

Таблица 11.

Тонина шерсти у маток синтетической популяции и их генотипы по ß-лактоглобулину

1 1 I Тонина шерсти в Iразличном возрасте 1 Число от животных с шерстью 50/56 качества | общего числа животных с шерстью | 46/48 + 50/56 качества |

1 1 ' Г п 1 1 АА 1 1 In I 1 | i AB i 1

1 1 матки (50/56) 1 1 год 1 2 года 1 3 года ч 1 1 9 1 111 14| I 9 (100 %)' 6 (54,5%) 10 (71,4%) 1 1 I I I 3 I I 5 I I 5 | 1 . 1 1 1 (33.3%) | 3 (60. 0%) | 2 (40.0%) 1 i

* - АА>АВ (Р>0.95)

Таблица 12. Показатели состава молока у овец з/х "Кленово-

Чегодаево" в зависимости от генотипа по ß-лактоглобулину ---,-:-

1-Г

I Параметр

Вариант ß-лактоглобулина

АА

ВВ

Примечание

I Количество

1Жир (%) 15. 76i0,32 |6.17±0, 33 |3,85+0,34 I АА И АВ>ВВ(Р>0,999) IБелок (%) |4.39±0,07 |4.55+0,11 |3,94+0,05 |АА и АВ>ВВ(Р>0,999) I Лактоза(%) 14.62Ю, 03 |4, 63+0, 04 |4. 72±0, 09 | I Сух. B-BO 115,13±0, 27115,64±0,39113,25±0,431 АА>ВВ (Р>0, 9£ 0 .

| | 1 АВ>ВВ (Р>0,99)

I-1_I_:_I_1--1

3.6.Анализ полиморфизма белков овечьего молока с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. В результате электрофореза сывороточных белков и казеина молока овец синтетической популяции из э/х "Кленово-Чегодаево" были выявлены следующие системы: ß-лактоглобулина; а-лактальбумина; иммуноглобулина(сывороточные белки); а31-казеин; ß-казеин; Х-казеин; а,2-казеин(фракции казеина). Из изученных 7 систем, полиморфными оказались 4 (табл. 13).

Таблица 13. Популяционно-генетический анализ полиморфных систем * белков молока у овец

г 1 Локус ...... Аллель Частота 1.......... I Генотип г-— ..... 1 1 Частота |

1 а-1-а А 1.0 I АА 1 1.0 |

1 >-1* А 0,8 | АА 1 0.64 1

В 0.2 Г АВ 1 0.32 1

1 вв 1 0.04 I

1 1ё А ' 0.8 I АА 1 0.90 |

В 0,2 I АВ 1 0,10 1

1 а^-Сп А 0,35 1 АА 1 0,16 1

В 0, 28 1 АВ 1 0.39 I

| с . 0,12 I АС 1 0,07 |

о.-- 0, 25 I вв 1 0.09 I

I ВБ 1 0,11 I

I ВС 1 0.07 I

1 CD 1 0,11 1

1 Р-Сп Р,-Сп 1,0

Рг-Сп 1,0

1 Х-Сп А 0, 52 I АА 1 0.30 |

В , 0. 48 I АВ 1 0.45 I

1 вв 1 0.25 I

I Оаг-Сп 1.,, А . 1.0 1 АА 1 1 1.0 1 | |

ВЫВОДЫ

1.Впервые, с целью широкого внедрения метода ПЦР-анализа в овцеводство, создан банк ДНК от различных пород овец.

2. Предложенный однопробирочный метод АС-ПЦР не требует в .отличие от метода ПЦР-ПДРФ необходимости наличия сайта рестрикции

в точке мутации, а также затрат времени и реактивов на проведение рестрикционно-энзиматического гидролиза продуктов ПЦР. При одноп-•робирочном. методе в отличие от стандартного двухпробирочного метода АС-ПЦР, зависимость длины фрагментов от аллеля делает возмог. м \ непосредственное определение генотипа животного в одной

реакции, что является важным при анализе большого числа проб.

3. Наилучшее чтение результатов ПЦР-анализа достигается при 1,5 тМ концентрации ионов Мз2*. Оптимальная концентрация фермента Taq-пoлимepaзы составила для выбранных нами праймеров 1 Ед. Высокая концентрация данного фермента приводит к неспецифическому отжигу праймеров, в результате чего искажается интерпретация результатов ПЦР. Введение в каждый из праймеров в позиции 3 на 3'-конце нуклеотидной замены, некомплементарной исследуемой ДНК-матрице, способно усиливать их аллелеспецифичнссть.

4. Сравнительный анализ локуса р-лактоглобулина методами ПЦР и■электрофореза белка в полиакриламидном геле, показал в 6 случаях из 43(13,9%) несовпадение результатов. Коэффициент ассоциации (гА) при оценке генотипов р-лактоглобулина овец ПЦР-анализом составил 1, а при гель-электрофорезе.- 0,94, что указывает на ошибку оценки белков молока.последним методом. Ошибка при использовании ПЦР практически исключается, так как олигонуклеотидные праймеры являются строго специфичными к исследуемой ДНК-матрице.

5. Ягнята породы ромни-марш, полученные от матерей с генотипом АВ(4,4±0,15), характеризовались на 12,855 более высокой живой массой при рождении, чем молодняк полученный от матерей с генотипом АА(3,9±0,10) и ВВ(3,9+0,24). Ярки от гетерозиготных матерей превосходили по живой массе (26,3±0,80) при отъеме своих сверстниц, полученных от матерей с генотипом АА(23,5±0,94) на И,9%(Р>0,95) и с генотипом ВВ(24,0±2,47) на 9,6%. У синтетичес-' кой популяции наиболее высокой живой массой при рождении и отбивке обладали ягнята полученные от матерей с генотипом АА, чем с АВ(Р>0,95), что очевидно связано с проводимой селекцис ;ной. работой. .

6. У овец породы ромни-марш с генотипом АА по р-лактоглобулину количество особей с шерстью 50/56 качества в возрасте 2 и 4 года было достоверно 'больше, чем среди животных с генотипом АВ(Р>0,95, Р>0,99, соответственно). У овец синтетической популяции такая же закономерность выявлена в возрасте одного года, количество животных с шерстью 50/56 качества было достоверно больше среди овец с генотипом АА, чем с генотипом АВ(Р>0,95).

7. Среди овец с генотипом АА и АВ содержание в молоке жира, белка и сухого вещества было достоверно больше, чем у животных с генотипом ВВ(Р>0,999).

8. Генотцпирование 7 систем белков молока показало, наличие полиморфизма в локусах с^ -казеина, Х-казеина. р-лактоглобулина и иммуноглобулина. Мономорфными оказались локусы а-лактальбумина; р-казеина; а„ 2-казеина. Локусы контролирующие экспрессию данных белков могут быть использованы в качестве дополнительных маркирующих систем при характеристике овец различных популяций.

1. При молекулярно-генетическом анализе большого числа образцов крови, ■ рекомендуем использовать предложенный однопробирочный метод АС-ПЦР, как наиболее экономичный и простой метод. Семь локу-сов белков молока можно использовать в качестве дополнительных генетических маркеров при изучении аллелофонда различных пород овец.

1.Бочкарев В.В.. Зиновьева H.A.. Марзанов Н.С., Попов А.Н..Брем Г. Изучение полиморфизма гена ß - лактоглобулина овец методом ПЦР-анализа // Тез. докл. науч.- практич. конф."Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения". Быково. - 1997. - С.105-106.

2.Бочкарев В.В., Зиновьева H.A., Попов А.Н. .Марзанов Н.С., Брем Г.';' Новые молекулярно-генетические подходы для анализа вариантов гена р - лактоглобулина у, овец // Восьмая международная конференция "Новые направления биотехнологии". Тез. докл. Москва,- 1998.С.41.

3.Бочкарев В. В., Зиновьева H.A., Попов А.Н., Марзанов Н. С., Эрнст Л.К.. Брем Г. Сравнение двух методов изучения полиморфизма ß -лактоглобулина овец // Доклады РАСХН. - 1998. - N3. - С.27-29.

4.Марзанов Н.С., Щеткин В.Я., Бадалов Я.М., Ковалева М.А.. Марза-нова Л.К.. Гладырь Е.А., Бочкарев В.В.. Т.А. Магомадов // Аллело-Фонд породы ромни-марш // Вестник РАСХН. -1998. - N3. - С.61-63.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Информация о работе

Бочкарев, Владимир Вячеславович
кандидата биологических наук
Дубровицы, 1998
ВАК 03.00.23

Автореферат

Похожие работы