Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и очистка комплекса противогангренозных антител методом поливалентной иммуносорбции

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и очистка комплекса противогангренозных антител методом поливалентной иммуносорбции"

На правах рукописи

ШЛНДРЕНКО ВЛАДИМИР ДМИТРИЕВИЧ

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА КОМПЛЕКСА ПРОТИВОГАНГРЕНОЗНЫХ АНТИТЕЛ МЕТОДОМ ПОЛИВАЛЕНТНОЙ ИММУНОСОРБЦИИ

03.0ССТ- микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Пермь -1997

Работа выполнена в Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения РАН, г. Пермь

Научные руководители: доктор биологических наук И. И. Райхер, доктор медицинских наук, член-корреспондент РАН, профессор В.А.Черешнев

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Р.А.Пшеиичнов, кандидат медицинских наук, доцент Р.С.Кузяен

Ведущая организация - НИИ микробиологии Министерства обороны РФ

Защита,диссертации состоится ......................... 1997 г.

в Щ..гчасов на заседании диссертационного Совета по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук К 200.46.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН в конференц-зале института по адресу: 614081, г.Пермь, ул.Голева, 13.

С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Института экологии и геиетики микроорганизмов УрО РАН.

Автореферат разослан 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, у* / Р г __________.

старший научный сотрудник И.Б.ИВШИНА

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. До настоящего времени одним из основных средств лечения газовой гангрены, вызываемой в подавляющем большинстве случаев Cl.perfringens, Cl.oedematiens и Cl.vibrio septicum, являются специфические антитоксические препараты, получаемые из сыворотки крови иммунизированных животных (лошадей).

Ксеногенные антитоксические противогангренозные сыворотки применяются уже более 80 лет. Как и аналогичные сывороточные препараты против других бактериальных токсинов ( а также против укусов змей), за прошедшее время они были в значительной мере усовершенствованы. При этом основное внимание исследователей, наряду с вопросами повышения активности, сосредоточилось на снижении их анафилактогенности. Последнее обусловлено тем, что такие препараты представляли собой комплекс чужеродных для человека белков из сыворотки крови лошади. В этой связи работы по очистке гетерологических антитоксических сывороток проводились практически с начала их применения.

Существенным достижением на этом направлении было применение ферментативного расщепления сывороточных белков пепсином. Это позволило получать менее реактогенные и более очищенные и концентрированные препараты (I.Parfentiev, 1937, С. Роир, 1939, Бейлинсон А.В. 1954).

Метод ферментативной очистки антитоксических сывороток в различных вариантах применяется до настоящего времени.

Однако, несмотря на положительные результаты, которые были получены в процессе усовершенствования антитоксических сывороточных препаратов, им присущи еще и определенные недостатки. В первую очередь, это весьма значительное содержание (до 80%) неактивных чужеродных для человека белков, могущих быть причинами нежелательных иммунологических осложнений (И.И.Райхер, 1973).'Кроме того, выпускаемые в России концентрированные и очищенные с помощью пепсина антитоксические сыворотки "Диаферм" контаминированы групповым веществом крови, близким по антигенным характеристикам эритроцитам человека группы А. Наличие его, при введении

препаратов, также может стать причиной иммунологических конфликтов. ( Г. Христова, !968).

Таким образом, проблема получения ксеногенных противогангренозных сывороток повышенной степени очистки остается достаточно актуальной.

В то же время выполнение этой задачи осложняется тем, что примесные белки в противогангренозных сывороточных препаратах (очищенных с помощью ферментолиза) являются теми же молекулами Б/ав/г-фрагментов иммуноглобулинов, но не имеют направленности противогангренозных антител. Поэтому удаление их с помощью физико-химических методов практически невозможно.

Единственным путем, в данном случае, может быть разделение иммуноглобулинов по специфичности с помощью иммуносорбции.

Приложение упомянутого метода к очистке гетерологи-ческих противогангренозных сывороточных препаратов и составляет основную задачу настоящей работы.

Цель работы. Экспериментальное и методическое обоснование иммуносорбционного выделения Р/ав/г-фрагмснтов противогангренозных антитоксинов перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум с помощью поливалентного иммуносорбента. Характеристика физико-химических и иммунологических свойств полученного комплекса аффинно очищенных антитоксинов в сравнении с антитоксинами поливалентной противогангренозной сыворотки " Диаферм".

Основные задачи исследований.

1. Разработка иммуносорбентов на основе геля гидроокиси алюминия и гангренозных анатоксинов перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум и выделение соответствующих антител, а также проверка кратности использования иммуносорбентов.

2. Разработка трехвалентного иммуносорбента на основе геля гидроокиси алюминия и смеси трех гангренозных анатоксинов.

3. Выделить с помощью трехвалентного иммуносорбента комплекс аффино очищенных Б/ав/ 2-фрагментов гангренозных антител.

4. Подобрать способ концентрации элюатов антител.

5. Изучить иммунологические свойства (протективные, анафилактические, токсические), полученного комплексного антитоксина и присутствие в нем группоспецифического вещества крови типа А+Н в сравнении с коммерческой поливалентной противогангренозной сывороткой "Диаферм".

6. Провести лиофилизацию комплекса противоган-гренозных антител.

Научная новизна н практическая ценность. Впервые на основе геля гидроокиси алюминия и соответствующих анатоксинов разработан оригинальный трехвалентный иммуносорбент для бдномоментного выделения комплекса противогангренозных антител (авторское свидетельство N 1370841). С помощью такого иммуносорбента одномоментно выделен комплекс Р/ав/2-фрагмен тов антител, по удельной активности в 2-3 раза превосходящий антитоксины коммерческой поливалентной противогангренозной сыворотки "Диаферм". Показано, что очищенный антитоксин свободен от групповых веществ крови, имеет сниженные анафилак-тогенные свойства. Установлена возможность лиофилизация очищенных антител.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработка принципа одновременного выделения комплекса аффинно очищенных Р/ав/2-фрагментов противогангренозных антител(п/перфрингенс, п/эдематиенс и п/вибрио септикум) с использованием трехвалентного иммуносорбента.

2. Иммунологическая характеристика комплекса аффинно очищенных Р/ав/2-фрагментов противогангренозных антител в сравнении с коммерческими антитоксическими поливалентными противогангренозными сыворотками "Диаферм".

Апробация работы. Основные материалы исследования были представлены на итоговых научных конференциях Пермского НИИВС в 1983, 1985, 1987, 1990, гг.; на научной конференции Ташкенского НИИВС в 1986 г., на межлабораторном совещании института экологии, и генетики микроорганизмов Ур.О РАН в 1997 г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 10 работ и получено одно авторское свидетельство.

Структура работы. Работа состоит из введения, пяти глав и заключения, выводов и приложения. Глава 1 содержит обзор литературы. В главе 2 описаны материалы и методы. Глава 3 посвящена получению моновалентных аффинно очищенных противогангренозных антитоксинов. Глава 4 содержит материалы по очистке комплекса противогангренозных Г/ав/г-фрагментов антител на поливалентном иммуносорбенте. Глава 5 посвящена исследованиям иммунологических свойств комплекса аффинно очищенного противогангренозного антитоксина. Список литературы включает 212 источников. Приложение включает акт испытания препарата и отчет о проведении доклинического испытания препарата Г/ав/2-фрагментов антител. Работа изложена на 99 страницах, содержит 26 рисунков и 20 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы, использованные в работе; нативные поливалентные (противоперфрингенс, противоэдематиенс и противо-септикум) противогангренозные сыворотки лошадей, полученные в НПО "Биомед", поливалентная антитоксическая противо-гангренозная сыворотка "Диаферм" производства НПО "Биомед", сыворотки и эритроциты крови человека, полученные из донорского отдела предприятия НПО "Биомед", противовидовые сыворотки, полученные иммунизацией кроликов белками сыворотки крови лошади, анатоксины перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум производства НПО "Биомед", гель гидроокиси алюминия из цеха анатоксинов НПО "Биомед", пепсин для производства антитоксических сывороток, сефадекс С-200 и цианбромированная сефароза - 4В фирмы "Фармация"(Швеция), агар для диффузионной преципитации и иммуноэлектрофореза "Дифко" (США), набор реактивов для электрофореза в полиакриламидном геле фирмы "Реанал" (Венгрия).

Животные. Для оценки свойств сывороточных препаратов были использованы аутбредные морские свинки и белые мыши, а также кролики породы Шиншилла.

Методы исследования. Для определения фракционного состава сывороточных препаратов использовали; электрофорез в иолиакриламидном геле по Орнштейну (1982) и в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (1984), гельхроматографию на сефадексе 0-200. Для очистки и концентрации элюатов антител использовали ультрафильтрацию и диафильтрацию на установках АР-2 с полыми волокнами ВПУ- 15. Приготовление иммуносор-бентов на основе геля гидроокиси алюминия и полиакриламидного геля проводили по методам И.И.Райхер (1973); Ю.А.Хавкина с соавт. (1972); на основе цианбромированной сефарозы - 4В по фирменной инструкции.

Специфическую активность анатоксинов и антитоксинов перфрингенс определяли в реакции нейтрализации (лецитиназная "активность анатоксина) с эмульсией желтка, а также в реакции коагглютинации ( Л.И.Райхер с соавт. 1987). Активность (титр) анатоксина и антитоксина эдематиенс определяли в реакции флокуляции, а анатоксина и антитоксина вибрио септикум - на белых мышах по регламентированной методике.

Контроль токсичности, стерильности проводили согласно "Сборнику инструкций по общим методам контроля медицинских иммунологических препаратов" МЗ России. (1982).

Острую токсичность препаратов определяли по методике, предложенной И.Л.Корзой (1982).

Протективную активность комплекса очищенных гангренозных антитоксинов проверяли на морских свинках и белых мышах по методике Л.А.Черной (1950).

Оценку анафилактогенных свойств проводили путем сенсибилизации морских свинок противогангренозной сывороткой "Диаферм" и комплексом очищенных антитоксинов, а разрешение проводили на 21 день введением, соответственно, очищенных противогангренозных сывороток "Диаферм" и комплекса очищенных антитоксинов. Интенсивность анафилактического шока оценивали по четырехкрестной системе и рассчитывали индекс интенсивности (Э.Н.Шляхов,1964). Статистическую обработку данных проводили по методам, рекомендованным И.П.Ашмариным и А.А.Воробьевым (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Метод получения аффинно очищенных Р/ав/г-фрагментов антитоксинов из гипериммунных сывороток, совмещающий частичный ферментолиз с иммуносорбцией (иммуносорбент на основе геля гидроокиси алюминия), разработан в Пермском НИИ вакцин и сывороток (И.И.Райхер, 1973). В Пермском НПО "Биомед" он применяется для производства Р/ав/г-фрагментов аффинно очищенных антител-антитоксинов (дифтерийного), используемых в изготовлении высокочувствительных и высокоспецифических диагностических препаратов.

В настоящей работе этот метод впервые был использован для получения Р/ав/г-фрагментов гангренозных антитоксинов (перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум).

В первой группе опытов были получены моносорбенты на основе геля гидроокиси алюминия и анатоксина перфрингенс, а затем - анатоксинов эдематиенс и вибрио септикум.

Первоначально определяли пределы прочности связи сорбент-анатоксин при кислой реакции среды ( рН 2.0 -3.0 ), а также максимальные пределы сорбции анатоксинов гелем.

В опытах с полученными моноимуносорбентами было показано, что прочность связи каждого из анатоксинов с носителем достаточно велика и, что в последующем для отделения сорбированных антител вполне можно использовать элюирующие растворы срН 2.5-3.0.

Р/ав/г-фрагменты аффинно очищенных моновалентных противогангренозных антител перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум выделяли из сыворотки (плазмы) крови лошади, иммунизированной тремя соответствующими анатоксинами.

Сыворотку . (плазму) предварительно подвергали ферментативному расщеплению пепсином по сокращенной схеме метода "Диаферм". Иммуносорбцию (выделение Р/ав/г-фрагментов антител) проводили непосредственно из засоленого сернокислым аммонием ферментата. Для элюции антител использовали 1% раствор хлористого натрия с рН - 2.9±0.5.

При работе с иммуносорбентом перфрингенс отмечено, что для истощения ферментированной .сыворотки требовалось более чем- пятикратное его количество (по титру).

Иммуносорбенты эдематиенс и вибрио септпкум позволяли истощать ферментаты в эквивалентных количествах.

Средний выход антител достигал 25-30% (по отношению к титру истощаемого ферментата) при более чем четырехкратной их очистке (табл. 1.)

Таблица 1.

Характеристика протнвогаигренозиых моноантитоксинов, полученных

иммуносорбцией

Моноапгитсла Удельная Выход антитоксина,в % Коэффициент очистки

(антитоксинов) активность _

МЕ|мг белка к фермен- к нативной к фермен- к нативной тагу сыворотке тату сыворотке

Перфрингенс 25,0 ±2,5 29,0+8,5 16,0+4,0 4,8+0,3 5,5+1,1 Эдематиенс 27,б±2,7 28,0+6,2 13,0+3,1 7,8+1,0 12,7±0,7 Вибрио септпкум 18.6+4,5 24,3±6,0 13,0±5,2 5,8±2,6 9,9+2,6

По результатам физико-химического и иммунно-химического анализов монопрепараты обладали высокой чистотой.

Следует отметить, что полученные моновалентные противогангренозные очищенные антитоксины могут быть использованы для создания различных диагностических систем; в качестве антительных реагентов, в том числе и иммуноферментных системах.

В следующих опытах была оценена возможность одномоментного выделения двух очищенных антитоксинов Р(ав)г-фрагментов перфрингенс и эдематиенс с помощью одного, но уже двухвалентного иммуносорбента, включающего анатоксины перфрингенс и эдематиенс.

Эксперименты, проведенные с иммуносорбентами такого вида, показали,что при фиксации двух антигенов (анатоксинов) на сорбенте их специфические детерминанты не перекрываются.

Более того, если при работе с иммуносорбентом перфрингенс, для истощения ферментата его необходимо было брать в увеличенных по титру количествах, то при работе с бивалентным иммуносорбентом, он истощал ферментат в эквивалентных количествах по титру для обеих составляющих. Возможно, это было связано с особенностями одновременной

сорбции на геле двух анатоксинов, существенно отличающихся по молекулярной массе (анатоксин эдематиенс по молекулярной массе в 2 раза превосходит анатоксин перфрингенс). При элюции комплекса двух Р(ав)г-фрагментов антител показано, что выход антитоксинов перфрингенс и эдематиенс также был в пределах 30%. По удельной активности бивалентный препарат превышал исходный ферментат в 2,5-3 раза.

Результаты экспериментов с двухвалентным иммуно-сорбентом послужили основанием для изучения возможности одномоментного выделения всего комплекса антител, состоящего из трех аффинно очищенных Р(ав)г-фрагментов антитоксинов перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум.

Проверка прочности связи трех анатоксинов с носителем показала, что они хорошо удерживаются гелем в условиях кислой реакции среды, и это предопределило возможность использования такого рода комплекса в качестве активного иммуносорбента.

Уже в первых опытах по истощению ферментата трехвалентным иммуносорбентом было установлено, что активные детерминанты всех трех анатоксинов на сорбенте также не перекрываются, и он присоединяет антитела в количествах, эквивалентных титру каждого из анатоксинов, фиксированных на геле. Выход комплекса противогангренозных антител составил около 30% к исходному ферментату (таб.2). Была установлена достаточно удовлетворительная активность иммуносорбента, позволяющая использовать одну и ту же его порцию до шести раз.

Таблица 2.

Характеристика противогангренозных Р/ав/г-фрагментов, полученных специфической сорбцией

Препараты Удельная Выход, в % Коэффициент

антитоксинов активность к ферм-ту к нат.сыв-ке к ферм-ту к нат сыв-ке МЕ/мг

Бивалентный антитоксин (перфрингенс, эдематиенс) Комплекс гангренозных антитоксинов (перфрингенс,эдематиенс,септикум)

26.0±6.0 16.0+4.0

!2.0±2.5 11.3+2.6 11.7+1.8

38.0+8.0 30.0+4.0

30.0±8.3 24.1+7.0 22.4+3.3

17.0±4.0 14.0±1.0

15.0+4.3 12.1+3.5 11.2±1.6

7.2±1.7 4.4±1.2

4.2± 0.7 3.4+0.5 3.3±0.5

13.0+2.1 7.4+2.1

7.0±1.2 6.0±0.6 5.5±0.9

По данным гельхроматографии на сефадексе 0-200 и электрофореза на бумаге, электрофореза в полиакриламндном геле по Орнштейну и в присутствии с додецилсульфата натрия по Лэммли, диффузионной преципитации и нммуноэлектрофореза с соответствующими антигенами и кроличьей сывороткой против белков сыворотки лошади препараты обладали высокой физико-химической и иммунохимической чистотой. Таким образом, в принципе была решена основная задача настоящей работы, а именно; впервые показана возможность одновременного выделения трех специфических различных антител в виде Р/ап/г-фрагментов с помощью одного трехвалентного иммуносорбента.

Схема выделения комплекса Р/ап/:- фрагментов аффшшо очищенных противогянгренозпмх антител

Гнпериммуная поливалентная (перфрингенс,эдематиенс,вибрио

септикум)

■ противогангреиозная сыворотка крови лошади

Осаждение балластных термолабильных продуктов расщепления

сывороточных белков в течение 45 минут при 58° С и добавлением сернокислым аммонием до 14% насыщения

Ферментативное расщепление пепсином при рН 3.2 в течение часа

Ферментат

'ерментат

Осадок отбрасывают

Ферментат (Р/лп/г-фрагменты антител перфрингенс, эдематиенс, вибрио септикум и др.)

Иммуносорбция ( сорбент; гель гидроокиси

алюминия с фиксированными анатоксинами перфрингенс, эдематиенс, вибрио септикум)

Истощенный КОМПЛЕКС; гель гидроокиси

алюминия- анатоксины ферментат перфрингенс, эдематиенс, виб-

отбрасывают рио септикум-Р/ав/г-фрагменты

анатоксинов перфрингенс, эдематиенс и вибрио септику^.

Элюция 1% хлористым натрием при рН 2.9

Элюат Р/ав./г-фрагментов комплекса Осадок

аффинно очищенных антител перфрин- свободившийся, гене,эдематиенс и вибрио септикум иммуносорбент

используемый повторно до браз

Концентрация

В специальных опытах было проведено сравнение иммуносорбентов, приготовленных фиксированием смеси трех гангренозных анатоксинов на различных основах; геле гидроокиси алюминия (сорбционная связь антигенов с носителем); полиакриламидном геле (включение антигенов в решетку геля в момент образования последнего); на цианбромированной сефарозе 4В (ковалентная связь антигенов с носителем). Истощению иммуносорбентами подвергали один и тот же ферментат поливалентной противогангренозной сыворотки. Результаты сравнительных экспериментов приведены в таблице 3.

Сравнительная характеристика аффинно очищенного комплекса Р/авЛ-фрагментов противогангренозных антител, выделенных с помощью иммуно-сорбентов, приготовленных фиксированием трех гангренозных анатоксинов на

различных основах

Иммуносорбент Кратность Выход Удельная Коэффициент

на основе использован, антиток- активность очистки

на в% МЕ/мг белка

геля гидроокиси до 6 раз 30* 30 б

алюминия 32 30 4

24 18 3

полиакриламидного более 7 раз 50 25 б

геля 30 20 6

14 18 4

цианбромированнон более 9 раз 50 28 б

сефарозе 4В 40 14 4

20 14 4

* первая строка - антитоксин перфрингенс, вторая - эдематиенс, третья -вибрио септикум

Приведенные опыты показали, что основные характеристики комплекса трех противогангренозных антител, очищенных с помощью различных иммуносорбентов, практически близки. С учетом того, что иммуносорбент на основе геля гидроокиси алюминия наиболее доступен по исходным компонентам и 'прост в изготовлении, он и был избран для получения препаратов практического назначения.

Следующим этапом было проведение опытов по концентрации элюатов комплекса аффинно очищенных антител. В работе был использован метод ультра- и диафильтрации на отечественных установках с полыми волокнами ВПУ-15, позволяющими отделять вещества с молекулярной массой 15 кД. Этот метод оказался высокоэффективным, позволяя проводить концентрацию антител и диализ одновременно с минимальными потерями (до 10%). Более того, происходило некоторое увеличение удельной активности конечного продукта за счет удаления низкомолекулярных пептидов.

Было проведено сравнение комплексного противоган-гренозного антитоксина и. поливалентной антитоксической противогангренозной сыворотки "Диаферм", полученных из одного и того же исходного сырья. Характеристика их представлена в таблице 4.

Таблица 4.

Сравнительная характеристика поливалентных противогангренозных препаратов, полученных из одного исходного материала с помощью метода "Диаферм" и нммуносорбции. (два опыта)

Нативмая противогапгрснозная поливалентная сыворотка

Метод "Диаферм" Фермситолиз с последующе!)

лммуносорбцией

Выход к Удельная Коэффициент Выход к Удельная Коэффициент натшшой активность очистки нативной активность очистки

сыворотке МЕ/мг сыворотке МЕ/мг

в % белка ■ в % белка

35 4.6 2.85 20 20.0 6.8

40 6.0 3.21 18 18.2 '9.42

Приведенные данные свидетельствуют о том, что при получении из одного и того же исходного материала, выход* антитоксина, выделенного методом иммуносорбции в два раза меньше, чем выход антитоксина, полученного методом "Диаферм", но в то же время удельная активность первого увеличивается не менее, чем в три-четыре раза. Коэффициент очистки при иммуносорбционном. выделении комплексного препарата был также в три раза выше.

В ходе научных исследований были изучены иммунологические свойства комплекса аффино очищенных Б/ав/г -фрагментов противогангренозных антитоксинов. Так, сравнительная проверка защитных свойств на морских свинках и белых мышах, призаражении животных живыми культурами трех озбудителей газовой гнгрены (а.регйг^епБ, а.оесЗетайепз, О.уПэпо Бер^сит), а также при инъекции соответствующих токсинов (при

• Существует возможность увеличить выход препарата за счет повторного истощения ферментов, остающихся после 3-6 циклов иммуносорбции.

одновременном и раздельном по времени введении антитоксинов) показала, что во всех случаях полученный комплекс очищенных Р/ав/2 - фрагментов антител не уступал сывороткам "Диаферм" (таблицы 5 -7). Но наряду с этим он имел и существенные преимущества, которые непосредственно связаны с высокой степенью иммуносор-бционной очистки антител.

Таблица 5.

Защитные свойства противогангренозных препаратов при заражении морских свинок культурой С1. РегГпг^епз

Доза комплекс очищенных противо- Поливалентная протнвоган куль- гангренозных антитоксинов гренозная сыворотка

туры 50 МЕ "Диаферм" 50 МЕ

. (ДС1) за 5 суток за 2 суток Одновремен- за 5 суток за 2 суток Одновремн

ное введение ное введе-е

1 0000 00 00 0000 +000 0000 0000

5 ++++ +0 00 +++0 ++++ ++++ ++00

10 ++++ ++++ ++++ ++++ ++ ++ +++0

20 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++

40 ++++ ++++ ++++ ++-++ . ++++ ++++

Примечание;

Условные обозначения; + - погибшие, 0 - выжившие

Таблица 6

Протскшвные свойство комплекса очищенных противоганренозных антитоксинов и поливалентной нропшогаигреиозной сыворотки "Диаферм" при заражении морских свинок культурами.

Наименование культуры

Доза Группа культуры живог-(ДС1) ных

Срок заражения после введения поливалентных очищенных антитоксинов

Срок заражения после введения поливалентной противогангрено-зной сыворотки

за 3 суток одновременно.За 3 суток одновремено

1 ОПЫТ 00000 00000 ооооо ооооо

О.регГгп^епз контроль +++++ +++++ +++++ +++++

5 ОПЫТ ++000 ++000 +++++ +++++

контроль +++++ +++++ +++++ +++++

8 ОПЫТ 00000 00000 ооооо ооооо

CI.oedematiens контроль +++++ +++++ +++++ +++++

16 опыт 00+++ 'ооооо ооооо ооооо

контроль +++++ +++++ +4+++ +++++

1 опыт 00000 ооооо ооооо ооооо

С1лШгю верМсит контроль +++++ +++++ +++++ +++++

3 опыт ++000 ооооо +++++ +++++

контроль +++++ +++++ +++++ +++++

1.Доза очищенных антитоксинов и сыворотки "Диаферм" - 50 МЕ 2.Условные обозначения: 0 - выжившие, + - погибшие.

Протективпые свойства комплекса очищенных протнвогангренозных антитоксинов и протпвогангреиозной сыворотки "Днаферм" на белых мышах при одновременном введении I ДС1 токсина

Доза Количество выживших мышей (числитель) из общего

МЕ числа взятых в опыт (знаменатель)

Токсины

Перфрингенс Эдематиеис Вибрио септикум

очищен- сыворотка очищен- сыворотка очищен- сыворотка н'ый анти "Диаферм" иый анти "Диаферм" ный анти- "Днаферм токсин токсин токсин

0.313 10/10 10/10

0.156 10/10 9/10 10/10 10/10 20/30 21/30

0.078 7/10 8/10 10/10 10/10 13/20 8/20

0.039 7/10 8/10 9/10 8/10 11/20 8/20

0.020 5/10 5/10 8/10 6/10 9/20 2/20

0.010 7/10 6/10 5/10 5/10 9/20 0/20

0.005 5/10 4/10 -

ЕДзо 0.01826 0.01826 0.0108 0.0108 0.0163 0.0729

Одним из существенных недостатков коммерческих ксенногенных ферментированных сывороточных препаратов является их остаточная анафилактогенность. Это определило необходимость сравнительного изучения анафилактогенных свойств полученных нами препаратов и сывороток "Диаферм". В опытах на морских свинках препараты сравнивали в эквивалентных количествах по белку, а также по титру. Последнее оправдано тем, что при введении пациентам препаратов именно этот параметр является определяющим.

При сравнении препаратов в равных количествах по белку сенсибилизацию проводили подкожным введением поливалентной

противогангренозной сыворотки "Диаферм" и комплексом очищенных антитоксинов в дозе 0.1 мг белка, а разрешали через 21 день внутрисердечно, соответственно,этими же препаратами в Ю- и 100-кратно увеличенных дозах (1 и 10 мг белка).

Для сравнения препаратов в количествах, уравновешанных по титру, сенсибилизации проводили в дозах 1.6 и 16 МБ антитоксина, а разрешение дозами с 50 и 500 МЕ, т.е. в 30-кратном увеличении.

Показано, что при уравновешивании как по титру, так и по белку, полученные препараты вызывают менее выраженную реакцию, чем сыворотка "Диаферм"( Таблица 8.). Если в первом случае это связано с меньшим количеством вводимого белка, то во втором, по-видимому, объясняется удалением при иммуносорбции ряда неиммунных белков, обладающих видовыми детерминантами.

Следующим основным требованием, предъявляемым к медицинским иммунологическим препаратам, является отсутствие токсичности.

Регламентированным тестом в данном случае является определение массы тела мышей после внутрибрюшинного введения препарата в дозе 2 мл. Однако, по мнению ряда авторов (А.М.Грачева с соавт.,1980; Л.И.Корзая, 1982), этот метод не позволяет достаточно точно оценить токсичность препаратов, особенно в случае использования различных методов очистки.

Более информативным является тест по оценке отека лапки белой мыши,который был предложен Л.И.Корзой (1982). Мы провели определение токсичности препаратов комплекса очищенных противогангренозных антитоксинов и сыворотки "Диаферм", полученных из одного исходного материала, по регламентированному методу и по отеку лапки белой мыши после введения препаратов. В тесте отека лапки выявилось явное преимущество комплекса очищенных противогангренозных антитоксинов. (Таблица 9).

Таблица 8

Анафилактогенные свойство противогангренозных препаратов А - в равных количествах по белку

Доза сенсибил. Разрешение Число Число животных Иммуно-

сыворотки "Диаферм" и живот- логичес-

Препарат Доза ных 0 + ++ +++ ++++ кий ин-

комплекса (голов) декс

в мг в %

0.1 сыворотка "Диаферм" 1.0 12 11 27.1

0.1 10.0 12 3 15 1 58.3

0.1 комплекс

очищенных 1.0 12 5 6 1 16.3

антитоксинов

0.1 10.0 12 9 2 1 33.3

Б- травных количествах по титру

Доза сенсибил. Разрешение Число Число животных

Иммунологический

"Диаферм" комплекса в МЕ и Препарат Доза пых (голов) 0 + ++ +++ ++++ индекс в%

1.6 сыворотка 50 12 1 3 6 2 68.8

"Диаферм

16.0 500 12 1 2 4 5 77.1

1.6 комплекс

очищенных 50 12 2 10 25.0

антитоксинов-

16.0 — ' — 500 12 9 3 31.3

Примечание; Нативная сыворотка-ссрия 690, титр антитоксина - 140 МЕ/мл; удельная активность -1.6 МЕ/ мг белка, Сыворотка "Диаферм"-серия 467, титр антитоксина 700 ME/мл, белок -11.1%; уд.активность -6.3 МЕ/мг . Комплекс очищенных антитоксинов-серия 8, титр антитоксинов -1300 МЕ/ мл, бело5.23 %; удельная активность * 24.9 МЕ/мг белка.

Определение острой токсичности в опытах отека конечности

Препарат

Средняя масса конечности, в мг

Опытные Контрольные

Степень отека

Очищенный антитоксин перфрннгенс

Комплекс очищенных

антитоксннов(иерфрин-

генс,эдематненс,вибрио

септикум);

серия 1

серия 2

серия 3

Поливалентная иротиво-гангренозпая сыворотка "Диаферм"

128.3 ±0,3

127.2 ±0,4

0.90

124.7 ±0,5 122.5 ±0,1 123.7 ±0,3

123.6 ±0,4

123.5 ±0,3 122.1 ±0,2 123.0 ±0,2

121.8±0,5

0.97 0.33 0.61

1.48

Примечание;

- на каждую серию опытов использовали по 20 мышей

Далее, известно, что ксеногенные антитоксические сывороточные препараты "Диаферм" контаминированы групповым веществом крови (ГВК) типа А+Н, родственным антигену эритроцитов человека группы А. Это вещество попадает в сыворотки с коммерческим пепсином на стадии ферментолиза и сохраняется в конечных препаратах.

Наличие групповых веществ крови может стать причиной осложнений на введение сывороток. До сих пор не предложено технологических методов их удаления из препаратов.

В этой связи существенным являлось оценить наличие ГВК сравнительным определением в сывгаротках "Диаферм" и препаратах, полученных иммуносорбцией из того же исходного материала.

Проведенные определения по реакции торможения гемаглютинации - метод количественного определения групповых веществ крови - показали, что если в сыворотках "Диаферм"

групповые вещества обнаруживаются при разведении в 2048 раз и выше, то в препарате, очищенном иммуиосорбцией, они полностью отсутствовали.

Известно, что сыворотки "Диаферм" после лиофилизации обладают плохой растворимостью, вследствие этого они не выпускаются в сухом дозированном виде.

Опыты по лиофилизации комплекса очищенных антитоксинов, проведенные во флаконах, показали, что препараты, высушенные в объемах 8-10 мл, содержащих 10 ООО МЕ (одна лечебная доза), полностью растворялись в течение 5 минут.

Дополнительно к нашим исследованиям Р/ав/г-фрагменты антител прошли доклинические испытания в - научно-исследовательском институте микробиологии МО РФ (г. Киров). Ими была проведена сравнительная проверка превентивной и удельной нейтрализующей антитоксической активности Р/ав/г-фрагментов антител регГг^епБ и соответствующей сыворотки "Диаферм" на морских свинках и белых мышах. Морских свинок заражали живой культурой СКрегГпгщепв, а белых мыщей -соответствующим токсином. При этом установлено, что полученный моноантитоксин перфрингенс обладал, по сравнению моновалентной сывороткой "Диаферм", более высокой антитоксической и превентивной активностью в перерасчете на количество вводимого чужеродного белка.

Таким образом, все проведенные нами исследования, являются обоснованной предпосылкой для получения противоган-гренозных лечебно-профилактических препаратов на основе аффинно очищенных Р/ав/г-фрагментов антител, обладающих высокой удельной активностью, сниженной анафилактогенностью и токсичностью, свободных от групповых веществ крови и обладающих удовлетворительной растворимостью после лиофилизации в дозированном виде..

ВЫВОДЫ

1. С помощью иммуносорбентов на основе геля гидроокиси алюминия и соответствующих анатоксинов из частично ферментированных сывороток лошади впервые выделены и охарактеризованы аффинно очищенные Р/ав/г-фрагменты моноантител перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум с высокой удельной активностью 24.5-27.6 МЕ/ мг белка (удельная активность

сыворотки "Диаферм"-6.0-6.5 МЕ/мг белка). Показана возможность шестикратного повторного использования иммуносорбен-тов.

2. Разработан оригинальный трехвалентный иммуносор-бент на основе геля гидроокиси алюминия и смеси трех гангренозных анатоксинов. Показано, что на таком иммуносорбенте антигенные детерминанты анатоксинов не перекрываются.

3. Из ферментата поливалентных противогангренозных сывороток с помощью трехвалентного иммуносорбента впервые одномоментно выделен комплекс аффинно очищенных Б/ав/г-фрагментов антител перфрингенс, эдематиенс и вибрио септикум /Авт. свид. 1370841/. Выход по активности составлял до 30 % по отношению к исходному ферментату.

4. Показана высокая эффективность концентрации элюатов комплексного препарата с помощью ультрафильрации на отечественных аппаратах АР-2 с применением полых волокон ВПУ-15. Потери активности в данном случае не превышали 10%. Высокая производительность метода сочеталась с дополнительной очисткой от ннзкомолекулярных неактивных примесей.

5. Защитные свойства комплекса противогангренозных антитоксинов в опытах на экспериментальных животных не уступали коммерческим сывороткам "Диаферм".

6. Комплекс очищенных противогангренозных антитоксинов обладал сниженными анафилактогенными свойствами в сравнении с сыворотками "Диаферм". Индекс интенсивности анафилактической реакции у животных при введении полученного препарата составил от 16.7 до 33.3%, а при введении сыворотки "Диаферм" от 27.1 до 58.3% при испытаниях в равных дозах по белку, а при введении в равных количествах по титру соответственно от 25.0 до 31.3% и от 68.8 до 77.1% .

7. В препаратах очищенных противогангренозных антитоксинов полностью отсутствовало группоспецифическое вещество крови типа А+Н, в то время как в сыворотках "Диаферм" оно обнаруживалось в разведениях 1 : 2048 и выше.

8. Показана возможность лиофилизации комплекса очищенных противогангренозных антитоксинов с удовлетворительной растворимостью.

9. Проведенные работы экспериментально обосновали возможность создания технологии поливалентной иммуносорб-ционной очистки гангренозных антитоксинов.

ОПУБЛИКОВАННЫЕ РАБОТЫ, ОТРАЖАЮЩИЕ ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Шапдренко В.Д., Ефимова Н.П., Райхер И.И., Шарапова А.И. Высокоочищенный антитоксин перфрингенс, полученный с помощью нммуиосорбента на основе геля гидроокиси алюминия. //Материалы научной конференции, посвященной 85-летию Пермского НИИВС. -Пермь, I983.-C. 14-15.

2. Шапдренко В.Д., Ефимова Н.П., Райхер И.И. Получение высокоочищенного антитоксина эдематиенс методом иммуносор-бции.// Материалы итоговой конференции ПНИИВС. -Пермь, 1985 .-С.9.

3. Шапдренко В.Д., Ефимова Н.П., Раихер И.И., Николаева A.M. Авт.свид. № 1370841: " Способ очистки поливалентной антитоксической сыворотки".- приоритет изобретения 5 февраля 1986г..

4. Шапдренко В.Д., Ефимова Н.П., Райхер И.И. Получение гангренозных антитоксинов с помощью иммуносорбции. II Сборник " Научно-производственные проблемы улучшения качества вакцинно-сывороточных препаратов. Ташкент: "Медицина", 1986 . - С. 142..

5. Шапдренко В.Д., Малыш B.C., Пугачева A.B., Райхер И.И. Опыт применения ультрафильтрацин через полые волокна при очистке и концентрации антитоксических сывороток. II Тезисы докладов научной конференции ПНИИВС. - Пермь, 1987 . -С. 22-23.

6. Шапдренко В.Д., Пугачева A.B. Определение белкового глико - и липопротендного состава F/ав/г- фрагментов аффинно очищенных противогангрепозных антител // Тезисы докладов научно-практической конференции НПО " Биомед ". - Пермь, 1990 . - С.8.

7. Шапдренко В.Д., Шилышков Л.В., Пушкарева Е.В. Физико-химическая и иммунохимическая харектеристика комплекса очищенных гангренозных антител ( перфрингенс, эдематиенс, вибрио септикум ).// Тезисы докладов научно-практической конференции " Теоретические и прикладные исследования в иммунологии." -Пермь, 1990 . - С. 10.

8. Шапдренко В.Д., Райхер И.И., Полякова А.Г. Физико-химический и иммунохимическин анализ противогангренозных антитоксинов, выделенных с помощью иммуносорбции из ферментированных иммуных сывороток. Тезисы докладов научной конференции "Экспериментальная и прикладная иммунология". -Пермь, 1991 .-С. 41-42.

9. Райхер И.И., Пугачева A.B., Малыш B.C., Шапдренко В.Д. Очистка антитоксических сывороток с применением диа- и ультрафильтрацин. //Тезисы докладов научно-практической конференции " Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии." Пермь, 1994 г. с. 60-62.

10. Райхер И.И., Райхер Л.И.,Шандренко В.Д., Полякова А.Г. Получение аффинно очищенных Р(ав)1-фрагментов противогангренозных антитоксинов в виде монопрепаратов и в поливалентном комплексе.// Тезисы докладов научно-практической конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной иммунологии". - Пермь, 1994 . -С.

11. Шандренко В.Д., Райхер И.И. Физико-химимический и иммунохимический анализ комплекса противогангренозных антител, выделенных с помощью иммуносорбции. // Сб. XI11 Российской конференции "Факторы гуморального и клеточного иммунитета при различных физиологических и патологических состояниях". - Челябинск, 1997.-С.57,

65-67.

Тираж 100 экз.