Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гемопаразитоценоз овец и иммунобиологические свойства антиидиотипических антител и диагностикумов при спонтанном и экспериментальном анаплазмозе овец

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Гемопаразитоценоз овец и иммунобиологические свойства антиидиотипических антител и диагностикумов при спонтанном и экспериментальном анаплазмозе овец"

АКАДЕМИЯ НАУК КАЗАХСКОЙ ССР ИНСТИТУТ зоолош

На правах рукописи

ШАБДАРБАЕВА ГУЛЬНАР САБЫРОВНА

ШОПАРАЗИТОЦЕНОЗ ОЕЁЦ И ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА АНТШдаО'ШШЧЕСКЙХ АНТИТЕЛ И ДОЛГ-НОС ТИКУМОВ ПРИ СПШТАННСМ и ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОМ АНАПЛАЗМОЗЕ ОВЕЦ

03.00.19 - паразитология

АВТОРЕФЕРАТ

дисовртации на ооиокание ученой отепени кандидата биологических наук

Алма-Ата - 1990

Работа выполнена на кафедра паразитологии и в лаборатории паразитоценодогш Алма-Атинского ордена Трудового Краевого Знамени зооветеринарного института.

Научный руководитель - заслуженный деятель

науки Казахской ССР, доктор'биологических наук, профессор

М.В.ХВАН

Официальные оппоненты - доктор диалогических

наук С.М.ПАК

- кандидат ветеринарных наук Ю.А.ПОПОВ

Ведущая организация - Киргизский научно-исследовательский ветеринарный институт

Защита состоится __1990 г.

в__ часов на заседании специализированного совета

К.008,17,01 по присуждению ученой степени кандидата биологических нйук в Институте зоологии АН КазОСР,

Адрес: 480032, г. Алма-Ата,

Академгородок, Инотитут зоологии АН КазССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института зоологии АН KasßCP.

Автореферат разослан " " 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

: А

Р ,'Т, АШЕТНЕКОВА

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРНО ТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. На современном этапе в нелегком ро-щально-эконшическом и политическом состояния отранн первоочередной задачей партийных, советских, хозяйственник органов, всего народа является настойчивое выполнение Продовольственной программы СССР. Ватное место при этом занимает предотвращение потери продуктивности и падежа животных от различных заболеваний. Значительную роль в выполнении поставленных задач должна сыграть правильно организованная, научно-обоснованная, диагностическая и лечебно-профил&кти-, ческая работа ветеринарной службы. В программе оздоровления стад животных большое значение отводится борьбе о гемопара-зитозами.

Среди кровепаразитарных заболеваний животных анаплазмоз овец занимает особое место, его возбудитель встречается во всех зоогеографических зонах, где обитают ооновные позвоночные хозяева этого паразита - овцн,

В Казахстане, важном овцеводческом регионе страны, анаплазмоз составляет большой удельный вео среда паразитарных заболеваний. Ущерб от этой инвазии исчисляется в миллионах рублей и складывается, в основном, из снижения мясной и ' шерстной продуктивности, а также падежа.

Несмотря на широкое распространение анаплазмоза овец, значительный экономический ущерб, наносимый им овцеводству, многолетнюю работу советских и зарубежных исследователей по этой проблеме, практика до сего времени не располагает высокочувствительными методами диагностики анаплазмоза, коммерческими антигенами-даагноотикумами,' вноокоэФ^ктившши средствами и методами борьбы с этой инвазией.

Лабораторные метода диагностики анаплазмоза не нашли широкого применения для массовых обследований животных из-за трудоемкости микроскопии, трудностей обнаружения и дифференциации возбудителя и в связи с отсутствием коммерческого ан-тигена-даагностикума для серологических исследований, поскольку его выпуск связан о необходимостью использовать в качестве исходного материала кровь большого количества инваэи-рованных доноров-овец а высокой паразитемией, что сопряжено о определенными техническими и финансовыми трудностями.

В связи с этим перспёктивным представляется использование для диагностики анаплазмоза рогатого скота новых генно-инженерных и иммунологических подходов, в частности, введение антиген-специфичных фрагментов ДНК паразита в микробные и дрожжевые клетки с последующим культивированием и сбором экспрессированного отрезка ДНК антигенного активного биополимера. Технически проще и намного дешевле использование в качестве антигена антиидиотипических антител, получаемых путем гипериммунизации дешевых лабораторных животщгх, требующих малого расхода антигена.

Наш исследования, направленные на использование в диагностике анаплазмоза животных "феномена антиидаотилии" являются новыми и представляют определенный теоретический и практический интерес, дают возможность определить методологические подходы в конструировании диагноотикумов.

Цель и задачи работы. Целью нашего исследования явилось уточнение эпиэоотячеокой ситуации по анаплазмозу овец на юго-востоке Казахстана и усовершенствование методов серологической диагностики анаплазмоза. Для достижения поставленной цели требовалось решить следувдие задачи:

1. Выяснить распространение анаплазмоза овец на юго-востоке Казахстана известными методами.

2. Получить и испытать в различных иммунологических тестах очищенные анаплазменные антигены.

3. Приготовить антиидиотипн к возбудители анаплазмоза

овец.

4. Испытать антийдиотипы в качестве антигена в различных сероиммунодогических тестах.

Научная новизна. Изучено распространение анаплазмоза овец на юго-востока Казахстана; получен иммунохимичэски очищенный и активный анаплазменный антиген; изучена динамика идиотипов (ATj) к A.ovls при различных схемах иммунизации; получены реактанты из антиидиотипов; приготовлен сухой ан~ тиидиотипический анаплазменный антиген; установлена возможность использования его для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинация (РИГА) и в методе иммуноферментного анализа (ИйА).

Практическая ценность. На основании полученных данных. подготовлены методические рекомендации: по получению антиидиотипов к анаплазменному антигену для диагностики анащюа-моза рогатого скота; по способу очистки анадлазменвого антигена; по использованию антиидиотипов к A.ovls в качестве антигенов в РИГА и ИФА. Оформлена заявка на предполагаемое изобретение по способу получения анаплазменного антигена. • Согласовано с Всесоюзным государственным научно-контрольным институтом ветпрепаратов и утверждена Главным управлением ветеринарии при Государственной комиссии Совета Министров СССР по продовольствию, и закупкам нормативно-техническая документация на "Сухой антиидиотипический анаплазменный анти-

ген".

Апробация работы. Материал диссертации доложены:

- на Ш и 1У съездах Всесоюзного общества протозоологов (Вильнюс, 1882; Ленинград, 1987);

- на конференции, посвященной 50-летию Института зоологии АН КазССР (Алма-Ата, 1982);

- на научно-практической конференции молодых ученых и специалистов КазНИШ и АЗЕИ (Алма-Ата, 1984);

- на всесоюзной научно-технической конференции молодых ученых (Москва, 1986);

- на IX научно-практичоской конференции молодых ученых Я специалистов Дагестана (Махачкала, 1986);

- на заседании Казахского, отделения ВОПР (Алма-Ата, 1982, 1983);

- на научной конференции молодых ученых и специалистов АЗШ (Алма-Ата, 1985); . .

- на республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (Алма-Ата, 1989);

- на научных конференциях профессороко-преподавателъ-ского состава Алма-Атинского ЗШ (Алма-Ата, 1982-1989);

- на расширенном межкафедральном заседании в Алма-Атин-'' оком ЗШ (Алма-Ата, 1990);

• - на рабочем совещании при зам. директора но гооудар-отвеннаиу контролю НЕНКИ ветпрепаратов (Москва, 1990),

Публикации. По теме даосертации опубликовано 7 научных работ, подготовлено и сдано в печать 3 работы, оформлена заявка на предпологаемое изобретение.

Структура и объем работы. Диссертация соотоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обоун-

дения результатов исследований, выводов, практических предложений, списка использованной литературы (136 отечественных и 55 зарубежных авторов), приложения. Работа изложена на 139 страницах машинописного текста, иллюстрирована 5 рисунками и 26 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в Алма-Атинском зооветеринарном институте в плане научных исследований кафедры паразитологии с клиникой■по теме № 296 "Разработать и внедрить в животноводческих хозяйствах Казахской ССР комплексные меры борьбы о паразитоценозом мелкого и крупного рогатого окота" (задание ГКНТ СССР, гос. регистрационный № 01.8.80 0796114)., .в твча-•ние 1982-1989 гг.

В хозяйствах Алма-Атинской, Талды-Курганской, Джамбул-ской областей исследовано на спонтанную зараженность анаплаэ-мами клинически 10000, микроскопически 577 овец разного воз-г раста в разные оезоны года.

Для уточнения переносчиков кровепаразитов изучали видовой ооотав икоодовых клещей, их сезонную динамику, круг хозяев-прокорлителей в разные месяцы, года путем сбора клещей с различных видов сельскохозяйственных животных. Определение их производили о помощью определителей Г.В.Сердюковой (1963), Б.Момеранцэва (1946), М.А.Филипповой (1985).

Воспроизведение более интенсивной паразитемий у опон-танно инБазированных кровепараэитами.овец проводили у 20 овец казахской тонкорунной порода применяя оплензктсмию. Изучали у опытных животных температурную и паразитарные реакции, проводили полный гематологический анализ на 1-ый,

5-ыЙ, 10-ый, 15-вй, 20-ый, 23-ий, 26-ой, 30-ый и 51-ый дни посла сплвнэктшии, Подсчет эритроцитов, лейкоцитов, определение гемоглобина и исследование мазков крови проводили по общепринятым методикам. Для изучения экспериментального анаплазмоза и приготовления антигенов было использовано 23 овцы казахской тонкорунной порода в возрасте от 2-х месяцев до 5-ти лет, приобретенных в совхозе "60 лег СССР" Курганского района Алма-Атинской области.

Вое овцы перед опытом были обследованы на бруцеллез, гакьшштоаы, эктопаразитозы, а также на анаплазмоз путем исследования фекалий, мазков крови и сывороток в РСК с ана-плазмеанш антигеном. Опытные животные содержались в клиниках Алма-Атинского ЗВИ.

Для заражения опытных животных использовали штамм Апа-piaema ovia, полученный из лаборатории протозоологии и арахноэнтомологии КазНИШ от к.б.н. Т.Т.Сулейменова.

Опыты выполняли во все сезоны года.

Для приготовления аналлазмеиного антигена из крови у животного удаляли селезенку. Сплензктомию овец проводили по методике, описанной в методических указаниях, рекомендованных ГУВ ЫСХ СССР (IS76),

Анашшамешше антигены из крови готовили по методу Н^И.Степановой (1970). Специфичность приготовленных серий антигена проверяли , в .РСК о сыворотками крови овец, больных анаплазмозом, саркоцистозом, бруцеллезом, а также о ана-плазмоанши сыворотками крупного рогатого скота. Постановку РСК, титрацшо гемолизина, антигена и комплемента проводили по общепринятой схеме в обьвмв I мл.

Параллельно по той же методике Н.И.Степановой (1970)

приготовили "нормальный" антиген иэ эритроцитов крови здоровых овец. Затем для изучения некоторых физико-химических свойств полученных анаплазменных и нормальных антигенов, проводили гель-фильтрацию их на хрсматографической колонке (2,6x100 см) восходящего типа, заполненной оефадексом G-200. Элюцюо проводили 0,05М Трис-HCI буферным раствором £Н 8,6. Содержание белка во фракциях определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм или по методу O.Lowry et al. (1951).

Антигены, приготовленные из A.ovia озвучивали'ультразвуком в течение 15 мин на УЗДН-2Т и использовали для иммунизации лабораторных животных (кроликов и морских овинок) с целью наработки анаплазменных антител (идиотипов).

Иммунизацию лабораторных животных анаплазменным антигеном проводили по методам Fey et al. (1976), А.М.Сафронова с соавт. (1976) и Г.Фримеля (1987). Кровь получали опирт-ксилольным методом из ушной вены. Динамику титра идиотипов-при всех трех схемах ишуниеации изучали через каждые 3 дня 'в течение месяца путем постановки реакции количественной превдпитации (РКП) по. методу M.Heideiberger (1938).

Сорбцию анаплазменных антител (ATj) из гипериммунных сывороток крови проводили по методу s.Avrfflneaa (1969) о попеременным применением иммуносорбентов, приготовленных из анаплазменного и "нормального" антигенов по методу 3.Avrameae and T.Terwynck (1969). ЭЛЮЦИЙ балластных И Па-разитарннх (анаплазменных) антител проводили о помощью 0,1М фосфатно-лимоннокислого буферного раствора 2,6. В каздом элюате замеряли оптичеокую плотность на • спектрофотометре СФ-26 при 280 нм, определяли количество беЛка и ней-.

трализов&вд антитела Трис-НС1 до рН 7,0.

Контроль степени сорбции анаплазменных антител, контроль степени чистоты полученных антител проводили с помощью дополнительной сорбции их о ишунооорбентом из нормального антигена и эритроцитов барана, приготовленных по общепринятой методике.

Полученные анадлазмещше антитела использовали для иммунизации лабораторных животных с целью приготовления антиидао-типического едаплаамецного антигена на основе т.н. "феномена антиидиотипии", Ищгниаацию проводили с полным адъювантом фрейнда (ПАФ) до методу Рву et &1. (1976) и с гидроокисью аллювдния (ГА), четырехкратно о недельным интервалом. Кровь от иммунизированных животных получали через каждые 3 дня в течение месяца опирт-ксидольным методом из ушной вены.

Изучение динамики антиидиотипичеоких антител (АТ2), полученных в результате иммунизации с ПАФ и ГА проводили в РКП ПО М.Не1<1еГЬегвег (1938).

Сорбцию антиидаотйпических антител из каждой пробы антисывороток проводили по методу З.Аугшпеаа et а1, (1969) с попеременным применением иммуносорбентов, приготовленных о включением идиотипов и дистиллированной воды в матрицу по-лиакриламидйого геля по методу А.Н.Маянского с ооавт. (1976). Для элюции антител попользовали 0,1М фосфагно-лимоннокислый буферный раствор рН 2,6. В каждом элюате замеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-26 при 280 нм, определяли количество белка и нейтрализовали антитела Трис-НСГ до рН 7,0.

Контроль качества сорбции антител проводили путем истощения их с применением иммуносорбента на основе включения дистиллированной вода в матрицу полиакриламидного геля, при-

готовленного по методу А.Н.Маянского о еоавт. (1976).

Из очищенных антиидиотипйческих антител (АТд) путем Высаливания сульфатом аммония (50$) ввделялй гаша-глобулино вую фракцию по общепринятой методике й концентрировали его в диализных трубках на полиэтиленгликолв (ПЭГ)-600 до содержания белка I мг/мл.

Полученный антиидиотипйческий анаплазмейныЙ антиген расфасовывали в стерильные ампулы по 2 сма о содержанием белка I мг/мл, подвергали лиофильной сушке и запаивали под вакуумом.

Нативнцй и сухой антиидиотияический анаплазмеййый ая- -тиген испытывали с позитивными анаплазменными и негативными сыворотками крови овец для диагностики анаплазмозов с/х животных в реакции связывания, комплемента (РОК)., в реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и в иммуноферментном анализе (ИФА).

Постановку РСК о антиидиотипом проводили в двух вариантах: первый - сыворотки крови овец бралй в раэведенйи 1:6, а антиидиотип титровали от Is10 да 1:2560j второй - антиидиотип брали в разВбденш 1:10, асыворотки крови титровали в разведении от 1:10 до 1:2560* Тиграции комплемента проводили по общепринятой методике.

Для постановки РИГА из пула' антисывороток о АТ2 спиртовым методом выделяли гамма-глобулин отдельно из. двух партий, полученных в результате иммунизации кроликов с ПАФ и ГА. Для насадки исполЬзовалй зритроциты, приготовленные по Фили и по Вайнба^у.-сепсибилизировали их риванольгош методом. . ■

ИмцуноферментныЙ анализ (ИФА) ставили по методике, описанной А.Voller-et ai,. (1976) с использованием полистироло-

вше ивдукологичвекше планшетов отечественного производства.

Вначале иммунологические планшеты инкубировали в течение 18 ц при 4°С с 200 мкл приготовленного нами антиидиоти-дачвекого ацацлазманного антигена, разведенного 1:200 в нар-бонатнон5олевом буферном растворе. После инкубации несвязав-шийоя антиген триады отмывали порциями фосфатно-солевого буферного раствора, содержащего твин-60 (<КЖ-Т) по 400. мкл. В подготовленные та«им образом тест-платы вносили по 200 мкл разведенной 1:100 ФСВ-Х исолэдуемой сыворотки и инкубировали в течение I ч при 37°0. Затем триады промывали порциями ФСБ-Т по 400 мкл. После внесения- исследуемых сывороток плашки сенсибилизировали альбумином.

. Конъюгацию кроличьей антисыворотки и выделенного иа неё гамма-глобулина о пероисидазой из хрена проводили по методу р.к.Ыакапв в^ в1. (1974). Для конъюгации использовали перокоидазу из хрена Олайнокого производства с показателем чистоты На - 2,7-3,2,

В качестве субстрата использовали субстрат, предложенный А,АЪгаНаш (1984).

Результаты реакции ищуноферментного анализа учитывали визуально.

ивдадм вдрадо^щй,

НЕКОТОРЫЕ ВОПРОСЫ ЭПИЗООТОЛОГИИ АНАПЛАЗМОЗА ОБЕЦНА ЮГО-ВОСТОКЕ КАЗАХСТАНА ..

Были исследованы мазки из периферической крови 577 овец различного возраста казахской тонкорунной породы ряда хозяйств юго-востока Казахстана, считавшихся благополучными по кровепараэитам.

Выявлены возбудители анаплазмоза, бабезиоза, пироплазмоза, тейлериоза и ассоциированные инвазии. Общая заражен-' ность животных кровопаразитами составила 33,4$. Из кровепа-разитов в чистом виде чаще встречаются анаплазмы - 39, бабезии - 18,8$ и тейлерии - 14,6$. Пироплазмы отмечались только у 7 овец (3,6%). Анаплазмы у исследованных овец встречались в ассоциации с бабвзиями (4,2$), о тейлериями (11,9$), в единичных случаях с пироплазма?® (2,2%). Смешанные инвазии бабезий с тейлериями отмечет» у 6 овец (3,1$) и бабезий с пироплазмами у 2 животных (1,1$). В.трех олучаях (1,6$) встречали гемопаразктоценоз,.составленный тремя видами пара. зитов: анаплазмы + тейлерии + бабезии. Зараженность эритроцитов варьировала от 0,0025 до 0,16$.

Исследованы 33 пункта региона, где осмотрена на заклей щевание 1114 животных, из них закл&щеваНо 181 или 16$. Собрано й определено 2020 клещвй. Индекс обилия колеблется от 1,00 до 122,33, а в среднем .по группе он ооот&ввл 12,16.. В сборах преобладали клещи р. Юеяпасвп1;ог и НаетарЬуа&Нв

рипоЪа^а. .

Результаты микроскопического исследования показали, что наиболее часто встречается анаплазмоз овец, как самостоятельное заболевание, так я в сочетаяиис другими кровепара-зитами и имеет наибольшую практическую значимость. Поэтому в дальнейшем все наши исследования сосредоточены на анаплазмозе овец. ;

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ АНАПЛАЗМОЗ 7 ИНТАКТНШС И (ШЛШКЗШ^ОВШШ ОЕЕЦ

Яосколькуу спонтанно инвазированних интактных ове^-кровепарэзитрносйтелёй зараженность эритроцитов, была очень

слабой, дай подтверждения диагноза и экспериментального воспроизведения бодее интенсивной паразитеши нами применялся . метод хирургачаонаго удаления селезенки (спленэктомия). Хотя литературно* дадназс о течении экспериментального и спонтанного анашшвдаа много, в условиях юго-востока Казахстана имеются о»эа оообеннооти в породном соотаве овец. Поэтому щ считаем интересным проследить течение экспериментального анапшавмрза в езда* уалозэида.

У |30 овец изучали и паразитемию при спонтанном

анапдаамоае, у 23 - воспроизводили вксперимеитальный анаплазмоз,

Состояние вивотных после солецзктоьщи. было удовлетвори-тельное.ашивление операционной раны шло по первичному натяжению. Б основном, на З-б день после сшюнэктомии у овец найлюдал? цовше1ше те{й?9ратура теладо 41-41,5°0.

При изучении диналйки паразитеши установлено, что до спленэктомий у опытнфс животных анаплазмы встречались до 2-х паразитов в 200 п.а. микроскопа, тейлерии до I экземпляра, бабеэки до сЯЛенйктомии не обнаруживали.

Резкое увеличение количества »наплазм в 3-4 раза против исходного наблхщали на 2-оЙ и 3-ий дай после спленэктомии, затем наблвдалось почтя стабильное число паразитов в мазках крови на 6-оЙ, 8-ой, 11-ый. и 16-ый дни. О 22-го дня . после спленэктомии иайлюДали постепенное снижение паразитеши.

. Параллельно наблюдалось, увеличение количества тейлерий в 2-2,5 рада й незначительное увеличение числа бабезий.

Гемоглобин у овец-паразитонооителей снизился до 8,1-6,1, т% в перша 6-15 дней после спленэктомии, что в 1,8 раза ыэньше исходного количества, затем постепенно увеличивалось

до 6,4 млн/мм3 на 26-ой день после спленэктомии, но исходного рубежа не достигло.

Лейкоциты наоборот резко увеличиваются до 18-21 тыс/мм3 и держатся в этих пределах о небольшими колебаниями в течение продолжительного времени.

Таким образом, сплензктомия у овец спонтанно заражениях кровепаразитами показало четно выраженные температурную и-паразитарную реакции.

Гематологические исследования показали, что удаление се-, лезешш у овец-кровепаразитоносителей вызывает повышение па-разйтемии и усиление вирулентности кровепаразитов.

Для диагностики и определения неблагополучия хозяйств по кровепаразитозам овйц южно использовать метод сплензкто-мии животных. Данные опытов по спленэктомии могут иметь не только диагностическое значение, но и важный прогностический интерес в условиях нараотания факторов* способствующих увеличению числа животных с иммунодефицитом в связи с загрязнением окружающей среды пестицидами-, радиацией и т.п.

СЕРОДИАГНОСТИКА АНАПЛАЗМОЗА. ОВЕЦ О ПРИМЕНЕНИЕМ ОЩЕННОГО МЕТОДАМИ ИММУНОХтШ-АНТИША ИЗ А.отаа

Залогом успешного конструирования иммунодаагностикумов является получение очищенного антигена. Существующие метода получения антигенов несовершенны. В связи с этим ми ставили задачу получить аналлазмейные я нормальные антигены из крови зараженных а.оу1в, спленэктомированных, а такие здоровых овец.

Корпускулярные антигены готовили по общепринятой методике (Н.^Степанова, 1970). Из пяти Оерий антигенов, приготовленных из зараженной анаплазмами кровя в РСК наиболее ак-

тивными оказались антигены серий 2, II, титр их был 1:16 и 1:8.

Параллельно по той же методике (Н.И.Степанова, 1970) были приготовлены, антигены из крови, свободной от анаплазм (т.н, "нормальный" антиген).

При гель-фильтраций анаплазменного и нормального антигенов на хроматографической'колонке с сефадексом G-гоо было установлено совпадение пиков о II-ой до 15-ой фракции и с 17-оЙ до 23-еЙ.

Поэтому далее для иммунизации лабораторных животных и получения наибольшего количества специфических антител и наименьшего количества баллаотных антител, необходимо предварительно провести разделение антигенов на фракции и проводить имцуниэвцвю только определенными фракциями.

. СРАЩТЕЛШШ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЗЛИЧНЫХ • МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ АНАПЛАЗМЕННЫХ АНТИТЕЛ

Существующие способы получения аналлазменных антител упираются в получение сыворотка !фот от естественно переболевших анаплазмозом животных. Между тем общепринятых методов получения в большом количестве аналлазменных антител нет.

Повтору мы разработала несколько методов иммунизации лабораторных животных с целью получения максимального количества аналлазменных антител. .

Иммунизацию лабораторных животных анаПлазменным антигеном иэ крови проводили тремя схемами: по методу Fey et al. (1976), но методу А.М.Сафронова (1976) и по методу С.Фримеля (1987). Забор крови-от иммунизированных по различным схемам кроликов производили начиная с 3-его дня после последней инъекции с интервалом в 3 дня в течение одцо-го ме- ■

сяца. Динамику титра анаплазмэннах антител (идаотипов) изучали путем постановки реакции количественной преципитации (РКП) по методу M.Heidelberger (1938) в каждые' 3 дня. Сорбцию антител из гипвриммунных сывороток проводили из каждой порции антисывороток. Степень чистоты выделенных анаплазмен-ных антител постоянно контролировалась специальными методиками.

Наибольший титр анашгазменншс антител (264 мкг-мл) получен в результате иммунизации кроликов по методу Г.Фркмеля (1987) на 9-ый день после последней инъекции. На втором месте стоит метод иммунизации по Уеу et al. (1976), где такав • на 9-ый день было получено анаплазменных антител в количестве 250 мкг/мл. Наименьшее количество антител (125 мкг/мл) получено в результате иммунизации методом А.М.Сафронова.

Результаты опытов показали, что при всех трех схемах иммунизации наибольший титр антител получен на 9-ый день после пооледней инъекции антигена, а затем наблюдается постепенное снижение количества антител й на 24-ый-30-ый дни практически сводится к нулю.

Считаем, что из изученных нами схем иммунизации лучшей является методика иммунизации по Г.Фриыелю (1987), которая проводится сочетанием внутримышечных и внутривенных введений ' антигена. Вабор крови должен производиться начиная с 7-9-го дня после пооледней инъекции. Эта методика позволила в достаточном количестве наработать анапла&ыеняне антитела или идиотип для дальнейшей работы.

АШИИДИОТИПЫ К АНАПЛАЗМЕННЬЩ АНТИТЕЛАМ И ИХ АКТИВНОСТЬ & СЕРОИШШЮЛОгаЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

Следующим этапом,нашей работы было получение в достаток-

них количествах антиидиотипов к возбудителю а.оуХв и попытка сконструировать из них диагноотикум для серологических исследований при анаплазмозе рогатого скота.

По своей специфичности антийдиотипические антитела являются "зеркальным отражением" специфичности соответствующих антител и иммуноглобулинов«« рецепторов В-лшфзцито'в. По этой причине антиидиотипическое тело Может служить имитатором определенной антигенной детерминанты. Что касается бивалентных антиидиотипическйх антител или искусственно агрегированных . антиидйотипических антител, то они могут рассматриваться в принципе, как эквивалент соответствующих мультивалютных антигенов (А.Я.Кульберг, 1966)» Исходя из этих основных положений, можно заключить, что антийдиотипические антитела могут быть использованы в целях иммунодиагностики, а в поливалентной форме - в качестве вакцинных препаратов.

Ряд авторов использовали этот феномен. Например, м.Ргап-со1;%е и Х.игЪап' (1984). использовали кроличьи аитиидиотипи-чеокие антитела против антитёл к вирусу табачной мозаики для получения антител против этого вируса.

Е.СвИв и х.я.сьаау (1984) получали антитела против вируса гепатита. .

По общепринятой ныйе Технологии получение антигенов, используемых в диагностических целях, связано о большими методическими трудностями^ поучением и .содержанием животных с большой паразитемией, фракционированием Полученных антигенов, с адсорбцией антисывороток.- В свете сказанного становятся особенно впечатляющими перспективы для создания в производственных масштабах иммунодиагностичвских препаратов на основе штгадиотшшческих антител. Однажды полученный вы-

сокоочищекный антиген в количестве, достаточном для получения небольших количеств антител к нему молет, в принципе, обеспечить производство иммунодиагностических препаратов как для индикации антигена, так и для обнаружения антител у ре-нонвалесцентов и вакцинируемых. Полученные антитела послужат для индукции синтеза антиидиотипических антител. Пооледние с одной стороны могут выполнять функции антигена при определении антител^ с другой - использованы для получения новых 1 порции антител.

Анализ литературы показал, что "феномен антиидиотипии" используется очень мало, в отношении аналлаэманных антител не применялся.

Поэтому мы разработали и изучили несколько подходов при получении антиидиотипических анаплазменных антител, изучили динамику титра антител, отработали иммуносорбционные метода для счистки антител.

При иммунизации лабораторных животных идиотипами по методу Fey et al. (1976) с использованием полного адъюван-та Фрейнда (ПАФ), начиная с 6-го дня пооле последней инъекции получено наибольшее количество антиидиотипических антител (440-400 мкг/мл), с 12-го дня количество их резко уменьшалось примерно в 4 раза (около 100 мкг/мл) и сходило на нет.

При иммунизации лабораторных животных по Рву at ai. (1976) по схема идиотии + гидроокись аллшиния (ГА) получены антиидиотипические антитела сравнительно в небольших количествах - 82-80 мкг/ш, с. 9-12-го дня количество их снижается до 60 мкг/мл и сводится к нулю.

Таким образом, наилучшим вариантом наработки антиидиотипических анаплазменных. антител является иммунизация лабора-

торных животных по методу Fey et ai. <1976) по схеме идиотии + ЛАФ.

Лучшим сроком для сбора крови являются 6-9 дни после последней инъекции.

Иммунизация кроликов по схеме идиотил + ГА давала небольшие количества антиидаотипических антител, примерно втрое меньше, чем.иммунизация по схеме идиотип + ПАФ.

Наивысший титр антител (60-82 мкг/мл) таете наблюдали на 6-9 дни после последней инъекции.

В последующие дни количество антител резко снижалось.

Эту схему иммунизации можно использовать при невозможности применения по каким-либо причинам первой схемы.

Для сорбции антиидаотипических анаплазменных антител применим метод s.Avrameae et ai. (1969) с использованием яммуносорбента, приготовленного по методу А.Н.Маянского о соавт. (1976) с включением идиотила в матрицу яолиакриламид-ного геля.

Следующим этапом нашей работы было установление диагностической ценности приготовленных антиидаотипических антител в серологических реакциях для выявления анаплазмоза. Они были испытаны в'РСК, РИГА, ИФА о заведемо положительными и заведемо отрицательными сыворотками.

РСК о антиидиотипическими антителами оказалась непригодной дйя выявления анаплазмоза и аналлазмоносительства. Многократная поотановка и разные варианты титрования исследуемых сывороток и антиидаотипических антител убедили нас в невозможности использования нашего диагностйкума в этой реакции,

В процессе отработки постановки FfiTA с- антиидиотипи-

ческим даагностикумам испробованы две серии его, полученные в результате иммунизации о ПАФ и ГА, для насадки использованы эритроциты, приготовленные по Фили и.Вайнбаху.

Результаты опытов показали, что наш диагноотикум, полученный в результате иммунизации и с ПАФ и о ГА моаио использовать для диагностики анаплазмоза в РИГА с эритроцитами по ВаРнбаху. Оптимальное разведение его 1:160. После определения оптимальных условий постановки РНГА с использованием анти-• идиотипичаского даагноотикума мы приступили к оценке его диагностической значимости при спонтанном анаплазмозе овец.

Из анализа литературных данных, по мнению ВОЗ, в ближайшее время ИФА (иммуноферыентный анализ) должен заменить такие серологические тесты, как РОК, РНГА, РИФ, РИМ. Высокая чувотвительнооть, специфичность, простота постановки реакции, экономичность, возмогчос'ть автоматизировать почти все этапы позволяют в короткие сроки провести массовые обследования животных в целях определения распространенности болезни и иммунологического статуса животных.

Исходя из этого, мы ставили задачу адаптировать ИФА о использованием антиидиотипического антигена для диагностика анаплазмозов. Ранее Т.Т.Сулейыенов (1986) этот метод применял для диагностики анаплазмоза о анапдазменным антигеном Н.И.Степановой.

Для постановки ИФА использовали плашки из полистирола отечественного производства (опытного завода ЗШИ Медполи-мер, Москва).

В качестве антигена" использовали пул из- антиоывороток, полученных в результате иммунизации, а также гамма-глобулин, выделенный солевым методом из этих же антиоывороток, путем

высаливания оульфатом аммония при 50$ насыщении, Антиидиотип разводили карбонатным буфером pH 9,0. После внесения исследуемых сывороток плашки сенсибилизировали альбумином. Конъюгацию проводили с пероксидазой из хрена Олайнского производства { Rz - 2,7-3,2). Субстрат готовили из смеси ортофе-нилендиамина (0,4 мг/мл) и перекири Водорода (конечная концентрация 0,005$) .на цитратном буфере pH 5,0. Для промывания полистироловых планшетов использовали 0,01М фосфатный буфер (рИ 7,2) на физиологическом растворе, содержащий 0,5 г/л твин-80 (ТФБ). Выбор оптимальных концентрации анти-идиотида для сорбции проводили в сравнительных экспериментах в разведении от 1:10 до 1:10040.

•Полученные в процессе отработки постановки ИФА результаты опытов показали, что наиболее оптимальные условия для протекания реакций следующие: разведения антийдиотипичеоко-го аналлазменного антигена 1:200 и 1:400} исследуемых сывороток 1:80 и 1:160.

Таким образом, для диагностики анаплазмоза целесообразно применять антиидаотйпичеокий анаплазменный антиген в РИГА и в новом высокочувствительном и специфичном тесте - ИОД.

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ АНТИИДОТШИЧЕСКИХ ЛИАГНОСТИКУМОВ ДНЯ ВЫЯВЛЕНИЯ СПОНТАННОГО И ЭКС- ' • ПЕРШЕНТАЛЬНОГО АНАПЛАЗМОЗА

Установив пригодность антиидиотипического анаплазмен-ного диагиостикума для' выявления анаплазмоза мы попытались в сравнительном аспекте изучить диагностическую эффективность нашего диагиостикума в различных сероиммунологических тестах (PCК, ГИД, HITA, ИФА). Из испытанных нами серологи-

ческих' тестов наилучшими оказались РИГА н ИМ (таблица I).

Таблица I

Диагностическая эффективность различных саро-иммунологических тестов при анаплазмоае овец

Сероиммунологи- 1 Результаты реакции ! Титр антител

чвский тест ! 7 ¡ !

+ i <■»

РСК - — -

РИГА + - 1:320

ИД - - -

ИФА + ' - 1:640

РСК и РИД оказавшихся неприемлемыми о нашим даагаоота-кумом мы в дальнейшей работе не использовали.

Далее в сравнительном аспекте изучали диагностическую ценность нашего антигена в РИГА и ИФА на одних и тех хз сыворотках крови от экспериментально зараженных анаплазма-ми, спленэктсшрованяых и интактных овец. Контролем служили сыворотки крови от здоровых овец. Заболевание анаплазмозом подтверждали микроскопией мазков крови (таблица 2).

Опробирован нами также б положительным результатом Сэндвач-ыетЬд ИФА - одна из модификации метода ИФА. Он оказался очень чувствительным тестом, антиген в разведении 1:640 и сыворотки 1:3200 давали реакцию в четыре креота.

Таким образом, полученные нами антиидаотипы к A.ovia, приготовленный антиидиотипичеокий анаплазменный антиген, оказались активными в таких современных оероиммуналогичео-ких теотах как РИГА, ИФА и Сэндвич-метод ИФА и рекомендуются в. качестве дешевых и эффективных даагностикумов для выявления экспериментального и спонтйшого анаплазмоза рога-

Таблица 2

Диагностическая эффективность антиидиотипов в РИГА и ИФА при анаплазмозе овец

Л» !Пара!Титр антителIС плен-!М !Пара!Титр антител!Сплен-жив.!зите! ^ !экто- !жив.!зите! ~ j ~ !экто-

!мия 'ИЕГА J И ФА __! '««я ! И1ГА ! ИФА _

! ! I !Да!Нет! ! ! ! !Да!Нет ! ! I ! +t - f í ! • ! ! +! -

I + 1:160 + II + 1:80 1:100 +

2 + 1:80 1:200 + 12 - 1:40 1:100 -

3 + 1:160 1:400 - 13 1:40 1:200 -

4 - 1:20 1:200 - 14 - 1:80 - -

б - 1:160 1:100 - 16 - 1:40 - -

6 1:40 1:100 - 16 - _ -

7 - 1:40 - - 17 + 1:200 +

8 - - 18 - i: 40 - -

9 - — - 19 + 1:160 1:200 +

10 1:40 - 20 - 1:80 - -

того окота.

ВЫВОДЫ

1. Установлена зараженность овец на юго-востоке Казахстана кровепаразитами в чиотом виде и в виде смешанных инвазий. Общая зараженность овец кровепаразитами составила 33,4%. Анаплазмы из числа зарегистрированных кровепарази-тов в чистом виде встречаются у 39,1$, в ассоциации с бабе-зиями у 4,2$, с тейлериями у И,9, о пироплазмами у 2,25?.

2. Определены основные вида иксодовых клещей, паразитирующих на овцах. Общая заклещёванность составила 16%, Индекс обилия в среднем равен 11,16. В сборах преобладают клещи родов Оегтасег^ог и НаетарЬувпИв.

3. Сшюнэктомия у спонтанно и экспериментально аара-женных анаплазмозом овец показала четко выраженную температурную и паразитарную реакции, резкое снижение, количества эритроцитов и гемоглобина и усиление лейкоцитарной реакции.

4. Изучение физико-химических свойств корпускулярных и растворимых анаплазменных и нормальных антигенов выявило совпадение пиков с 11-ой до 15-ой и о 17-ой до 23-ей фракций.

• 5. Разработаны методы иммунизации лабораторных животных для наработки анаплазменных антител.

6. Из антисывороток иммунизированных кроликов получены активные по отношению к анаялазмам гамма-глобулины, из которых посредством иммуносорбцин получены чистые анаплаз-менные антитела.

7. Разработаны две схемы иммунизации лабораторных животных чистыми анаплазменными антителами, получены антисыворотки к ним, из которых выделены чистые антиидиотипичео-кие антитела.

8. Определена динамика антиидаотипов к А.оу1в при иммунизации кроликов. .

9. Приготовлены несколько серий эритроцитарных дааг-ностикумов для РИГА о использованием антиидаотипов в качестве сенситина.

10. Полученные антиидиотипы активны при использовании в современных высокочувствительных тестах (ШГА, ИФА). Они обладают активностью, сопоставимой о активностью паразитов и могут быть использованы для конструирования иммунодааг-ностических теотов-.

11. Впервые на модели анаплазмоз овец изучены анти-

идиотины, отработаны методы их получения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для получения антиидиотипов рекомендуем применять иммунизащш лабораторных животных в два этапа: анаплазмен-ным антигеном из крови по охеме Г.Фримеля (1987) и чистыми

■ анаплазменными антителами по методу Реу et а1. (1976).

2. Для получения препаратов чистых антиидиотипических антител оледует применять иммуносорбцию..

3. Для удешевления маосового исследования рогатого скота на анаплазмоз следует применять диагностикумы, приготовленные о использованием антиидиотипов к а.оу1о в РИГА и ИФА.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Жантуриев М.К., Шабдарбаева Г.С. Кровепаразиты овец юго-востока Кааахетана/Дивотний мир Казахстана и проблемы его <зхраны/Алма-Ата, 1982. С. 79.

2. Жантуриев М.К,, Шабдарбаева Г.С. Кровепаразиты и . их ассоциации у овец юго-востока Казахотана/УСовременные

проблемы протозоологии/- Вильнюс, 1982. С. 124.

3. Жантуриев М.К., Шабдарбаева Г.С. Борьба о крове-паразитами и вызываемыми ими болезнями овец на юго-востоке Казахстана//Информ. листок КааНИИНТИ, № 237, 1982, о. 5.

4. Шабдарбаева Г.С. К изучению распространения ана-плазм и тейлерий овец в условиях юго-воотока Казахстана// Материалы научно-практичеокой конференции молодых ученых и специалистов КазНИШ и АЗШ, Алма-Ата, 198.4, с. 45.

б. Шабдарбаева Г.С. Влияние спленэктомии на гематологические показатели Ьвец-кровепаразитоносителвй//Тезисы

Всесоюзн. н.-техн. конф, молодых ученых "Актуальные вопросы профилактики и лечения болезней о/х животных". У., 1985, с. 23?г

6. Шабдарбаева Г.С. Распространение пироллаамид овец и их переносчиков на юго-востоке Казахстана//0овремешше проблемы протозоологии/Тезисы докл. и оообщ, 1У оьезда ВОПР/ Л., 1987, о. 164.

7. Шабдарбаева Г.С, Изучение возможности получения антиидиотилов к аналлазмам мелкого рогатого окота//Тезисы докл. респ. н.-аракт. конф. молодых ученых в спецгалиотов. "Вклад молодых ученых и специалистов в интенсификацию агропромышленного комплекса". Длма-Ата, 1989, о. 7.

8. Способ получения анаплазменного антигена/Приоритет А 4848875/15 76020 от 09.07.1990 г.

Коопцит*» •«CП,, ««пинии •Иву»»'' Км,СО1

3