Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная оценка серологических тестов (РДСК, РНГА и ИФА) для диагностики анаплазмоза рогатого скота и нутталлиоза лошадей"

ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ

ВЕТЕРИНАРИИ ИМЕНИ Я.Р.КОВАЛЕНКО (ВИЭВ)

РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК (РАСХН)

о г с; л ■ На правах рукописи

з ¡ О Vil

- э та

ГЕОРГИУ ХРИСТОФИС

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ (РДСК, РНГА И ИМ) ДЛЯ'ДИАГНОСТИКИ АНАПЛАЗМОЗА РОГАТОГО СКОТА И НУТТАЛЛИОЗА ЛОШАДЕЙ

03.00.19 - Паразитология, гельминтология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических

наук

Москва - 1997

¡ I

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко.

Научные консультанты: Доктор биологических наук, профессор

Н.И.Степанова, доктор биологических наук, профессор В.Т.Заблоцкий

Официальные оппоненты:

1. Доктор биологических наук, профессор О.Ф.Гробов (ВИЭВ)

2. Доктор медицинских наук, Э.Е.Шуйкина (ИЩИГМ)

3. Доктор биологических Hayif, профессор Э.Б.Кербабаев (ВИГИС)

Ведущая организация: МВА - Московская Государственная Академия Ветеринарной Медицины и Биотехнологии имени К.И.Скрябина

Зашита состоится --ШШ-------1997 г. в

часов на заседании специализированного Совета Д 020.20.02 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийской научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко по адресу: 109472, г. Москва, Кузьминки, ВИЭВ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан "-^А." ьШЬР--------1997 г.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

кандидат биологических наук Г.А.Трондина

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.Разведение овец и крупного рогатого СКОЖЭ является одной из наиболее выгодных в экономическом отношении отраслей животноводства во многих странах мира, призванное обеспечить потребность человека в продуктах питания и сырья для легкой промышленности.

К сожалению, болезни овец и крупного рогатого скота инфекционной, паразитарной и незаразной этиологии до сих пор наносят большой экономический ущерб.

Значительный вред рогатому скоту причиняют кровепарази-тарные болезни, среди которых особое место занимает анаплазмоз -трансмиссивное, природно-очаговсэ заболевание, характеризующееся лихорадкой непостоянного типа, глубокой анемией, истощением. Многочисленность переносчиков, включающих клещей надсе-мейства £хойохаеа и кровососущих насекомых, широко распространенных на земном шаре, в значительной мере обуславливает широкий ареал анаплазм (И.В.Абрамов и др., 1955). Ведущим фактором поддержания эпизоотических очаЕов является длительное, практически пожизненное носительство анаплазм в организме однократно переболевших животных: у крупного рогатого скота - 13 -15 лет, у овец - до 5 лет (срок наблвдения), во время которого возможны рецидивы - от. Зх до 5 раз (М.П.Конюхов, 1957; В.П.Пе-тишев, 1964; И.В.Абрамов, 1965; В.В.Калягин, 1966). К возбудителю анаплазмоза крупного рогатого скота восприимчивы - буйвол, зебу, лось, олень, антилопа, косуля, а к возбудителю анаплазмоза овец - коза, архар, муфлон, сайгак, козерог, антилопа в?.пе.и-сиа а!Ы£гепд косуля, лось, олень. Возможен механический перенос возбудителя от анаплазмоносителей или больных животных здоровым при несоблвдении правил асептики и антисептики во время хирургических вмешательств. Поэтому хотя анаплазмозу присуща определенная сезонность - весенне - летне - осенний период, отдельные вспышки заболевания отмечены и зимой. К настоящему времени анаплазмоз рогатого скота зарегистрирован во многих странах Европы и Азии, во всех государствах Африки, Америки и в Австралии. В странах СНГ это заболевание регистрируется по-

всеместно (Армения, Азербайджан, Грузия, Молдавия, Таджикистан, Узбекистан, Казахстан, Туркмения, Украина, Беларуссия и Российская федерация).

В странах СНГ гибеяь крупного рогатого скота и овец от анаплазмоза колеблется от 25% и выше. За рубежом гибель крупного рогатого скота от анаплазмоза значительная и достигает 50-80% (H.Seifert, i960), а иногда и 96-100% (A.Lubrini, 1960). b.Valiejci, s.Uani, (i960) сообщают о гибели 5

тыс. голов крупного рогатого скота во время вспышки анаплазмоза в департаменте Гуалегия (Аргентина).

Специальных исследований по определению экономического ущерба от анаплазмоза в нашей стране проведено очень мало. В связи с этим представляют интерес данные, полученные зарубежными исслец оватеяями. Так, например, в странах Центральной Америки потери от анаплазмоза составляют ежегодно 850 млн. долларов, (R.Aloniliardo, 1976) а в Вшой Америке - 1365-1638 млн. (Anon, (1937). Только США ежегодно теряет от этого заболевания 100 млн. долларов (B.R.UcCallon,1973). молока у больных анаплазмозом коров резко снижается, потеря продуктивности за лактацию составляет 400-1000 л., у пораженных быков-производителей наблюдается импотенция, полный стерилитет. В СССР общие потери от анаплазмоза не поцсчитываяись, . хотя имеются некоторые данные по отдельным областям. Так, Л.П.Артеменко (1977) установила, что прямые убытки от анаплазмоза, нанесенные за четыре года в хозяйствах Ровенской и Житомирской областей Украины (1969-1972), выразились в су.чме I4I9I3 руб., или в среднем за год они составляли 35478 руб., не меньший ущерб животноводству наносит и анаплазмоз овец.

Снижение упитанности, количества и качества шерсти, значительный падеж (30% и более) особенно характерны при анаплазмозе овец (М.А.Ахвертиев, 1968; А.М.Ганиев, 1973; Н.И.Степанова, Л.П. Дьяконов, 1973 и др.).

Несмотря на проводимые мероприятия против переносчиков анаплазмоза и применения имеющихся терапевтических средств, экономический ушерб, наносимый этой болезнью скотоводству страны, остается значительным. Это обусловлено, превде всего, отсутствием в распоряжении практических работников надежных диагностических методов, приемлемых для массового обследования животных с целью выявления больных и паразитоносителей - источников инвазии в природе.

Диагностика анаплазмоза рогатого скота основана на учете эпизоотического состояния, сезона года, клинических признаков, патоморфологических изменений и результатов микроскопического исследования мазков крови. Из клинических признаков принимают во внимание прежде всего выраженную анемию видимых слизистых оболочек (цвет белого фарфора) и истощение животного. Решающим в диагнозе является положительные результаты микроскопического исследования мазков крови.

Анаплазмы окрашиваются краской Гимза по Романовскому в темно-красный цвет, расположены преимущественно по периферии эритроцита. Нередко в одном эритроците содержится несколько ана-плазм. Однако своеобразная форма возбудителя в виде точки и наличие иногда в крови здоровых животных включений (тельца Жолли и др.), трудно отличимых от анаплазм, затрудняет микроскопическую диагностику анаплазмоза и тем более анаплазмоносительства. Правда, при сомнительных результатах микроскопии можно использовать метод биопробы на восприимчивых животных или спленэктомию подозреваемого в анаплазмоносительстве животного, хотя они не всегда и не во всех условиях осуществимы из-за сложности и дороговизны.

Ограниченные возможности микроскопической диагностики сдерживали своевременное проведение лечебных и других мер борьбы с болезнью.

Именно эти трудности в идентификации анаплазм, особенно в начале болезни и при паразитоносительстве, вызвали необходимость изыскивать специфические и более эффективные средства диагностики, такие, как серологические.

Для предотвращения этих убытков нужна своевременная диагностика. В США и России при развертывании исследований по изучению иммунологического состояния больных анаплазмозом животных отрабатывались методы получения биомассы возбудителя с целью использования её в качестве антигена. В 1952 г. K.E.Price, l.i.ioelne.

первые получили анаплазменный антиген для РСК путем отмыва-- • ния эритроцитов инвазированной крови от плазмы и лизиса их в дистиллированной воде. Освобождение анаплазм осуществляли при длительном и многократном центрифугировании на суперцентрифуге.

В России с 1959 года изучаются серологические методы

диагностики кровепаразитарных болезней животных в лаборатории протозоологии ЕКЭВ, в частности Н.И.Степановой была разработана РСК при анаплазмозе. Применение этой ре-

акции не вышло за пределы лабораторных испытаний. Однако, было отмечено, что в ряде случаев эта реакция не выявляет комплемент-связывающие антитела у носителей возбудителя. Поэтому возникла необходимость в усовершенствовании ранее существующих лабораторных методов диагностики (РСК) и разработке и внедрении новых, специфичных и более чувствительных, основанных на шшунофер-ментном анализе и других.

Все вышеизложенное свидетельствует об актуальносдьисследо-ваний по серологической диагностике анаплазмоза крупного рогатого скота и овец.

Заболевание лошадей нутталлиозом зарегистрировано во многих странах Африки, Европы, Азии, Центральной и йеной Америки, а также в Австралии.

Нутталлиоз имеет широкое распространение в Екных и в ряде Центральных областей Российской федерации. В настоящее время в большинстве ранее неблагополучных зон регистрируется, в основном, как нутталлионосительство.

Нутталлиозом болеют лошади, ослы, мулы и зебу. Перенос возбудителя на территории СНГ осуществляется иксодовыми клещами В половозрелой фазе:нЗ'а1опа р1ишЪеищ, Н.scoupense, Dermaceii-

tor marsine.tus, D.imttalli, D. silvarum, Rhipicephalus turanicus Eli. bursa. .

Тип передачи - трансфазный, в пределах одной генерации или

при прерывистом питании. Поэтому, в отличие от пироплазмоза основным резервентом возбудителя в природе являются больные и переболевшие животные-нутталлионосители. Поскольку диагностика нутталлиоза на основе эпизоотологических данных, симптомоком-плекса 'болезни, микроскопии мазков крови, особенно при нуттал-лионосительстве, затруднена, серологические исследования приобретают особое значение. Паразитоносительство стало препятствием в продаже в зарубежные страны, а также спортивному и культурному обмену, т.к. во многих странах мира введены ограничения на ввоз лошадей-паразитоносителей. Так в 1970 г. в США введено официальное требование о том, что все лошади, ввозимые в страну подлежат обязательному исследованию на пироплазмидозы. Животные положительно реагирующие в РСК ввозу не допускаются. В последующие годы это требование введено также в Канаде, Авста-лии, франции, Финляндии-и других странах Европы.

В соответствие с Ветеринарным законодательством в Правилах

отбора, ветеринарной обработки животных и птиц, отправляемых на экспорт, предусмотрено обязательное исследование племенных и спортивных лошадей на пироплазмидозы.

Исследования по серологической диагностике нутталлиоза лошадей проводятся в лаборатории протозоологии ШЭВ с 1976 г. с помощью реакции длительного связывания комплемента (РДСК) (Н.И. Степанова, В.В.Петровский).

Однако, долголетний период исследований показал, что в ряде случаев эта реакция не выявляет комплементсвяэывакщие антитела у явных носителей возбудителя, а также у нутталлионосите-лей после применения им курса лечения с целью дезинвазии. В связи с этим возникла необходимость иэыскивания более чувствительного метода серологической диагностики, для чего остановились на методике иммуноферментного анализа.

Метод иммуноферментного анализа испытан рядом зарубежных исследователей при цутталлиозе лошадей ( с.Soûle et al., 1984; Я.Weiland, 1986).

Цель и.задачи, исследования. Основная цель работы - усовершенствовать существующие методы диагностики и разработать и освоить производство новых, более чувствительных тест - систем.

Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи;

- отработать оптимальные режимы получения высокой парази-темии анаплазм у восприимчивых животных с целью приготовления антигена;

- разработать промышленную технологию изготовления анаплаз-менного антигена, а также нормативно-техническую документацию

на нее;

- освоить производство наборов компонентов для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) с использованием единого антигена из A.ovis

- отработать постановку реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) для диагностики анаплазмоза;

- разработали освоить производство иммуноферментного диа-гностикума анаплазмоза крупного рогатого скота ч овец;

- выявить период появления и исчезновения противоанаплаз-менных антител у экспериментально зараженных овец и телят с по-

мощью различных тест - систем (РДСК, ИФА и РИГА);

- сравнительна:иэучитьчувствительность 3-х реакций (РДСК, ИФА и РИГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец;

- провести выборочное серологическое исследование на анаплазмоз крупного рогатого скота и овец в хозяйствах разных природно-климатических зон России и других стран СНГ.

- отработать оптимальный режим получения высокой парази-темии у спленэктомированных нутталлионосителей и высокоактивных антигенов для серологических реакций - РДСК и ИФА;

- отработать реакцию иммуноферментного анализа (ИМ) для выявления нутталлийных антител;

- выявить период появления и исчезновения антител у экспериментально зараженных нутталлиозом лошадей;

- уточнить эпизоотическую ситуацию по нутталлиозу лошадей в России, странах СНГ и Прибалтики.

Цаучная_новизна. Разработан метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец, включающий: получение высокой (до 60-98%) прразитемии у животных - доноров посредством введения им после спленэктомии I6.I07 - 14.10 анаплазм или спленэкто-мии животных - анаплаэмоносителей спустя 120 дней после их заражения.

Впервые установлено существование общих антигенов в структуре A.Ovis и А. marginale < что позволяет использовать антиген из А.о via для серологической диагностики анаплазмоза как овец, так и крупного рогатого скота в ИФА, РДСК и РИГА.

Впервые разработана и внедрена РДСК с единым антигаом из A.Ovis для серологической диагностики анаплазмоза у всех видов парнокопытных.

Впервые изучена динамика антителообразования у экспериментально зараженных анаплазмозом животных с помощью трех серологических реакций (ИФА, РИГА и РДСК) показано, что ИФА выявляет антитела у зараженных овец спустя 12-13 дней после введения возбудителя, в то время как в РИГА они обнаруживались на 13-18-й, а в РДСК - 18-23 день. У экспериментально зараженных анаплазмозом телят ИФА также оказался наиболее чувствительным методом. С помощью его антитела у зараженных телят выявляли на 10 дней раньше, чем в РДСК, и на 5 дней раньше, чем в РИГА.

Показано, что нет различий в серологической активности ан-

тигенов приготовленных из различных штаммов А.mar ginal§ выделенных в Узбекистане, Калининградской области или Ставропольском крае.

Установлено, что ИФА выявляет на 26,7% больше больных и переболевших животных,чем в РДСК и на 15,2$ больше, чем РИГА. Длительное (около) года анаплазмоносительство у крупного рогатого скота выявляется с помощью ИФА на 83,4% больше, чем в реакции длительного связывания комплемента и гемагглютинации.

Установлена широта распространения инвазии в различных регионах России. Наибольший процент анаплазмоносительства у овец выявлен*, в Ставропольском крае - 35,655 положительных проб из 645 исследованных, в Саратовской области - 35,6% из 1802 и в Дагестане - 31,1% из 899; у крупного рогатого скота - в Рязанской области - 20,2% из 468, в Новосибирской - 19,4% из 72, в Калининградской - 15,8% из-5831.

Впервые разработаны методы иммуноферментнойодиагностики (ИФА) и реакции непрямой гемагглютинаДий (РИГА) при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец.

Впервые показано, что для получения высокой паразитемии и высокоактивных нутталлийных антигенов, лошадей необходимо спленэктомировать спустя 90 дней после заражения нутталлиозом.

Впервые разработан высокочувствительный метод иммунофер-ментной диагностики нутталлиоза лошадей. С помощью ИФА выявляют на 22,1% больше нутталлионосителей, чем РДСК. С помощью РДСК и ИФА изучена динамика антителогенеза у экспериментально зараженных нутталлиозом лошадей, уточнена эпизоотическая ситуация по нутталлиозу лошадей в России, странах СНГ и Прибалтики. Наибольшее паразитоносительство выявлено в Узбекистане,- 83,8% положительных проб из 36 исследованных, в Туркменистане - 80,8% из 89 и РФ - 42,9% из 9493 соответственно. Наибольший уровень нут-таллионосительства у лошадей в России выявлен в ростовской области - 44,4% положительных проб из 3776 исследованных, в Москве и Московской области - 42,9% из 3393, в Ставропольском крае - 42,8% из 1523, в Краснодарском крае - 40,1% из 292, в Рязанской области - 25,0% из 40, Воронежской области - 34,2% из 345, в Калмыкии - 41,6% из 48, в Татарстане - 42,8% из 56.

DE§£2!!HS£!i2§_эначение_работы. Предложена единая методика получения анаплазменных антигенов A.Ovis и A.marginale для серологических реакций: РДСК, РИГА и. ИФА и предложена комплексная

схема получения позитивной и негативной сыворотки рогатого скота и их высушивания. Приготовлена нормативно - техническая документация (НТД) на технологию изготовления, контроля и применен • ния набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента, включающая: I) Временную инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК (на опытную партию), утвержденную ГУБ Госвгропрома СССР 27 июля 1987 г.; 2) Технические условия (10-07-88) на набор компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого ско'га в РДСК, утвержденные ГУБ Го-сагропрома СССР 6 апреля 1988 г.; 3) Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), угверж-денное ГУБ Госагропрома СССР б мая 1988 г.

Оптимизирована иммуноферментная реакция определения антител в сыворотке крови при анаплазмозе рогатого скота и подготовлена нормативно-техническая документация (НТД) на технологию изготовления, ксйтроля и применения набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в ИМ, которая одобрена ГосвеЗ'бие-комиссией 20.10.95 г. Разработано Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции иммуноферментного анализа (ИФА) (в порядке производственного опыта), которое утверждено ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам I декабря 1989 г.

Разработана методика получения высокоактивного нутталлийного антигена для серологических реакций - РДСК и ИФА. Оптимизирован режим постановки реакции иммуноферментного анализа для определения антител в сыворотке крови при нутталлиозе лошадей, разработана нормативно-техническая документация (НТД), включающая Вре^. менную инструкцию по изготовлению и контролю набора компонентов . для иммуноферментной диагностики нутталлиоза лошадей и Техни--ческие условия. Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики нутталлиоза лошадей в реакции иммуноферментного анализа (РИА) (в порядке производственного опыта) которое утверждено ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам I декабря 1989 г.

¿ПЕОбация_Еаботы. Результаты диссертационной работы доложены на научных конференциях и симпозиумах: конференция молодых

ученых, посвященных 60-й годовщине образрвания СССР» Москва, 1982 г.; конференция молодых ученых, посвященная реализации Продовольственной программы СССР, Москва 1983; Всесоюзный семинар-совещание "Опыт выращивания, нагула, откорма и профилактики болезней крупного рогатого скота в хозяйствах республик Средней Азии, Закавказья и Казахстана", Самарканд, 1983 г.; конференция молодых ученых, посвященная усилению роли науки в реализации , Продовольственной программ СССР на период до 1990 г., Москва 1984 г.; научно-методический семинар "Применение иммуноферментного анализа в ветеринарии", Москва, 1'984 г.; на IУ сьезде Всесоюзного общества протозоологов", Лен^рад, 1987 г.; на Всесоюзной конференции по природно-очаговым болезням, Новосибирск, 1989 г.; на заседании секции ВАСХНЙЛ, Москва 1990 г.; на заседании Московского отдела ВОПР, 1993 г.; на международной научной конференции "Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии", Витебск, 1993 г.; на заседаний секции "Ветеринарная биотехнология", Москва 1996 г.

0^бликации_р2^льтатов_иссл^ований. По теме диссертации опубликован«) 26 научных работ в сборниках и научных трудах ВИЭВ, журналах "Ветеринария", Антибиотики и химиотерапия", изданиях ВДНХ, материалах Всесоюзных и республиканских научно-производственных конференций и совещаний.

На_защиту_выносятся:

1. Метод получения высокой паразитемии анаплазм у животных-доноров и активных антигенов для серологических-;реакций.

2. Освоения производства и внедрение наборов компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК.

3. Разработка и освоение производства набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в Й8А'.'.

4. Разработка реакции непрямой гемагглютинации при анаплазмозе рогатого скота.

5.Сравнительное изучение динамики появления и исчезновения анаплазменных антител у экспериментально зараженных овец и крупного рогатого скота и анаплазмоносителей с помощью разных серологических реакций.

6. Сравнительное изучение диагностической ценности трех серологических реакций при анаплазмозе рогатого скота.

7. Материалы по изучению антигенных свойств А.О^а и д.шаг-гапа1е и использование единого антигена из А.о^±з для исследо-

вания сывороток крови овец и крупного рогатого скота, зараженных анаплазмозом в серологических реакциях (РДСК, РИГА и ИФА).

8. Результаты серологических исследований на анаплазмоз крупного рогатого скота и овец в различных природно-климатических зонах в РФ и странах СНГ.

9. Отработка оптимального режима получения высокой парази-темии у спленэктомированных нутталлионосителей и чистой массы нутталлий с целью приготовления антигена для РДСК и ИФА.

10. Разработка реакции иммунЬферментного анализа для диагностики нутталлиоза лошадей.

11. Освоение производства наборов компонентов для диагностики нутталлиоза лошадей в ИФА.

12. Материалы по изучению периода появления и исчесновения антител у экспериментально зараженных нутталлиозом лошадей.

13. Материалы по уточнению эпизоотической ситуации по нут-таллиозу лошадей в РФ, странах СНГ и Прибалтики.

Мьем.и_стшша-Дис£ещаиан. Диссертация изложена на 203 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, список литературы и приложение. Работа иллюстрирована 26 таблицами и 12 рисунками. Список использованной литературы включает 385 источников, из них 189 иностранных. В приложении предложено 8 документов, подтверждающих наиболее важные результаты этапов исследований и их практическую ценность.

ЧАСТЬ I. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ (РДСК, РНГА И ИФА) ДЯЯ ДИАГНОСТИКИ АНАПЛАЗМОЗА РОГАТОГО СКОТА

2. СОБСТВЕННЫЙ ИССЛЕДОВАНИЯ

ЕЛ. Материалы и методы

Настоящая работа выполнялась с 1981 по 1994 г. в лаборатории протозоологии Всероссийского НИИ экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко и на базе Вышне-Волоцкого отдела ВИЭВ. :

В опытах использовали 59 овец 6-24 месячного возраста и 32 теленка 10-18 - месячного возраста.

Для заражения животных использовали: тюменский штамм А .оVIв и ставропольский, узбекский и калининградский штаммы А.та^з.па1е.

Для изучения эпизоотической ситуации по анаплазмозу рогатого скота необходимый материал был доставлен из хозяйств различных областей и республик Российской Федерации и стран СНГ. Всего исследовали 9159 проб сыворотки крови крупного рогатого скота и 4832 пробы сыворотки крови овец.

Заражение животных проводили подкожным введением крови от больных или переболевших анаплазмозом доноров. Спленэктомию животных осуществляли согласно методическим • указаниям, рекомендованным ГУВ МСХ СССР от 24 сентября 1975 г.

У всех животных до опытов исключали бруцеллез (исследования проводили в лаборатории по изучению бруцеллеза ВИЭВ) и анаплазмоз путем исследования мазков и сыворотки крови в РДСК с анаплазменным антигеном. Опыты выполняли во все сезоны года. Всех подопытных животных двукратно до'заражения анаплазмами и один раз в пять дней в инкубационный период и в течение всей болезни, вплоть до полного выздоровления, подвергали паразитоло-гическим, гематологическим и иммунологическим исследованиям.

В клинические исследования, проводимые ежедневно, входили наблюдения за общим состоянием животных и наличием аппетита, измерение температуры тела, частоты пульса и дыхания, определение длительности паузы мевду руминациями в секундах, цвета видимых слизистых оболочек и непигментированных участков кожи, состояние сердечной деятельности и желудочно-кишечного тракта.

Паразигологические исследования заключались в приготовлении мазков из периферической крови, фиксации их в метиловом спирте, окраске по Романовскому-Гимза и микроскопировании. Уровень пара-

зитемии при наличии единичных анаплазм выводили путем просмотра 100 полей зрения микроскопа, а при наличии большого количества анаплазм- путем подсчета и процентного соотношения общего •■ количества эритроцитов с количеством эритроцитов пораженных а-наплазмами. Во время острого течения болезни паразитемию учитывали ежедневно.

В гематологические исследования входили: определение содержания гемоглобина в грам-процентах, подсчет эритроцитов и лейкоцитов в I мкл крови с помощью■счетной камеры Горяева, определение лейкоцитарной формулы. '

Для изучения иммунологических реакций организма животного на введение анаплазм, сыворотку их крови исследовали на наличие анаплаэменных антител в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), реакции непрямой гемагглютинации (РИГА) и иммуно-ферментного анализа (ИФА). В т^х же реакциях"Йе стно активность антигенов ИЗ A.Ovis и А.marginale.

Реакцию длительного связывания комплемента ставили согласно Временного наставления по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента, утвержденного ГУВ Госагропрома СССР 6 мая 1980 г. (Н.И.Степанова, Н.А.Казаков, X. Георгиу).

Реакцию непрямой гемагглютинации (РИГА) ставили по общепринятой методике в нашей модификации.

Иммун оферме нтный анализ (ИФА) ставили по разработанному нами Временному наставлению по применению набора каш оноктов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции иммунофермен-тного анализа (ИФА) (в порядке производственного опыта), утвержденному ГУВ ГоскомиссииСовмина СССР по продовольствию и закупкам I декабря 1989 г.

При отработке твердофазного метода ИФА для выявления антител в сыворотке крови рогатого скота использовали лиофилизированный анаплазменный антиген.

Иммуноферментный конъюгат получали по методу М.В.Wilson, Р.К.Hakane et al.,(197Э)ковалентным связыванием пероксидазы, модифицированной периодатом натрия, с иммуноглобулинами кроличьей сыворотки, полученной против глобулинов рогатого скота. Имму-:. ноглобулиновую фракцию из коммерческой сыворотки кролика выделяли осаждением в 20^-ном растворе полиэтиленгликоля - 6000 по стандартной методике и коньюгировали с пероксидазой из хрена (Ш =3,0)

отечественного производства..

Рабочее разведение коньюгата определяли непосредственно в иммуноферментной реакции. 'В разных сериях коньюгатов оно составляло от 1:160 до 1:12000. Полученные коньюгаты сохраняли в глицероле или лиофилизировали.

Субстратную смесь готовили по D.S.Ellens et A<,T„Giellceiis(1980) с использованием Б-аминосалициловой кислоты в концентрации 0,8 м мг/мл и перекиси водорода в виде 0,5 М раствора, которые смешивали перед внесением в лунки в соотношении 10:1.

Реакцию ИМ ставили на отечественных полистироловых плашках путем последовательного внесения в лунки по 0,2 мл антигена, исследуемой сыворотки, коньюгата и субстрата.

Для приготовления анаплазменного антигена тотальное обескровливание животных проводили в период максимальной паразитемии -40-60$ и более. Кровь собирали в стерильные колбы с лимоннокислым натрием из расчета 50 мл 20^-ного раствора цитрата натрия на I литр крови. Обработку крови проводили в день ее взятия или не позднее следующих суток.

Отделение плазмы осуществляли центрифугированием на рефрижераторной центрифуге К-70 при 6000 об/мин, а эритроциты отмывали физиологическим раствором (pH 7,2-7,4) также при 6000 об/мин в течение 30 мин., трехкратно.

Полученный осадок эритроцитов помещали во флаконы и лизиро-вали попеременным замораживанием-оттаиванием до полного их лизиса с целью высвоболздения анаплазм. Как правило, достаточно 2-3 '

- кратного замораживания-оттаивания эритроцитов при температуре

- 25-35°С. Лизат эритроцитов смешивали с пятью объемами физиологического раствора (pH 7,2) и центрифугировали в течение 45 мин при 6000 об/мин 2-3 раза. Полученные осадки, содержащие массу анаплазм и небольшое количество ядер лейкоцитов, объединяли, разбавляли в 2 раза физиологическим раствором и гомогенизировали в шуттель-аппарате или вручную во флаконах с бусами не менее часа.

Полученный антиген консервировали тиомерсаном (1:10000) и, после определения его титра в РДСК, лиофилизировали.

Сублимационное высушивание приготовленных серий анаплазменного антигена, позитивных и негативных сывороток проводили в лаборатории биофизики на приборе Edwards.

Перед лиофилизацией приготовленные серии анаплазменного

•: г-14-

антигена смешивали с защитной средой в соотношении 1:1. Последняя состоит из равных частей 0,5%-ного раствора сахарозы и 0,5%-го раствора карбоцил-метил-целлюлозы (КМЦ), (Н.И.Степанова, В.А.Горбатов, В.В.Петровский). Полученную смесь разливали в ампулы по 2 мл, позитивную и негативную сыворотки разливали также по 2 мл, но без защитной среды. Затем ампулы помещали в морозильную камеру с температурой минус 40-50°С и выдерживали в ней не более двух чьсов. После этого материал переносили в сушильную камеру аппарата и включали вакуум-насос. Включение вакуум-насоса считали началом сушки. ;

Продолжительность цикла сушки препарата в ампулах с фасовкой 2 мл ие более 48 часов, причем сублимация должна быть в пределах 50-60% общего времени.

Величина вакуума в период сублимации должна быть не более 0,3 мм рт. ст. (13.3Па).

Примерный режим сушки антигена и сыворотки в ампулах с фасовкой 2,0 мл: общая продолжительность сушки - 32-40 часов, в том числе продолжительность сушки при изменении температуры препарата от - 40° до 0° С (сублимация) - 20-24 часа; от 0° до +23° С - 5-6 часов; при +23°С - 7-10 часов. Определение массовой доли влаги проводили по ГОСТ 24061-80. Она должна быть в пределах от 1-3%. Вакуум в ампулах устанавливали аппаратом типа Д.Арсонваль. Фиолетово-синее свечение в ампулах и характерное потрескивание указывает на наличие вакуума. Лиофилизированный антиген хранили в бытовом холодильнике (при +4° С).

2.2. Результаты исследования

2.2.1. Определение условий, влияющих на степень переболева-вания и выраженность параэитемии у зараженных анаплазмами животных.

Для приготовления анаплазменного антигена, применяемого в серологических реакциях, используют кровь от больного животного, из которой после разрушения эритроцитов выделяют чистые анаплазмы. На активность такого антигена большое влияние оказывает уровень пораженности эритроцитов крови донора анаплазмами - чем выше па-разитемия, тем активнее антиген. В связи с этим перед нами была поставлена задача - отработать технологию получения высокой параэитемии у зараженных анаплазмозом животных.

Учитывая литературные данные о различной длительности инку-

бационного периода у зараженных анаплазмозом животных в зависимости от дозы введенного возбудителя и способа заражения, мы обратили внимание на факторы, способствующие сокращению инкубационного периода и появлению максимальной паразитемии.

Обычно паразитемия у овец и крупного рогатого скота при анаплазмозе сравнительно невысока и-в наших опытах у отдельных животных не превышала 10-15#, у большинства животных процент поражен-ности эритроцитов анаплазмами составлял 0,5-3, Кровь с подобной паразитемией не могла быть использована в качестве исходного материала для приготовления активного Антигена. В связи с этим для получения большой паразитемии мы использовали, как правило, спле-нэктомированных животных. Однако не было известно, когда лучше ее проводить - до заражения животных или после переболевания их анаплазмозом. Для решения этого вопроса провели 8 опытов с использованием 37 овец и телят, у 18 из которых вначале удалили селезенку, а затемзаразили их анаплазмозом. У оставшихся 19 животных селезенка была удалена в различные сроки после переболевания их анаплазмозом.

Спленэктомию и обескровливание животных проводили со ст.науч. сотр. В.В.Петровским, в.н.с. Н.А.Казаковым, С.Д.Родиным, Г.Л.Бур-бой, ст.науч.сотр. С.Н.Малышевым и аспирантом П.Э.Кердзая.

Опыт № I: У баранов № I и № 2, 12 и 24-месячного возраста (помесь мериносовой породы с романовской) и 5 овец №№ 3-7 была удалена селезенка. На 2-ой день после спяенэктомии каждому животному ввели'.' подкожно по 40 мл цитратной крови от переболевших анаплазмозом доноров, содержащей 5 Л О7 анап. лазм/животное. За животными вели ежедневные наблюдения и проводили все указанные исследования.

Спустя 25-30 дней после спленэктомии, на высоте паразитемии (25-60^), животных обескровили. Для достижения высокой пара*-' зитемии у животных в первом опыте потребовалось 25-30 дней (табл. I). От 2-х животных (№ I и № 4), у которых паразитемия не превышала 25-4СЙ, соответственно и антигены были получены слабоактивные (рабочие титры 1:4 и ниже). Все антигены (кроме двух, которые были антикомплементарными), приготовленные из инвазирован-ной пнаплазмпми крови (паразитемия 50-60$), оказались активными в титре 1:8 - 1:16. Антикомплементарные антигены получены от овец (№ б и № 7), у которых паразитемия развивалась медленно, и обесг*;'. кровлены они были в период, когда п их крови выявлены высокие титры антител - от 1:40 до 1:80.

Таблица I

Влияние дозы анаилазм, введенных спленэктомированным овцам, на интенсивность инвазии и титры приготовленных антигенов

! Воз- ,Коли-'Ч0СТВО Сроки Шаразитемия! Рабочие

живот-! раст !введен-1 ной •крови ! (мл) обескровливания !при обес- ! титры

пых !(мес.1 I после ¡кровливании! спленэктомии ■ <г- 1 (в.дней) ! п /0 ! антигенов

1-ый_опыт „(ввели 5*10^ анаплазм/животное)

I 13 40 26 40 1:4

2 24 40 30 60 1:16

3 16 40 25 50-60 1:8

4 18 40 28 25-30 Ниже 1:4

5 18 40 30 50 1:16

6 18 40 27 40 антикомплементарный

7 18 40 25 60

2~ой_опыт _ (ввели 14^10^ анаплазм/живогное)

8 18 120 15 80-90 1:32

9 18 120 15 80-90 1:16

3-й опыт_ Хввели_16"10^ анаплазм/животное)

10 8 120 23 80-85 1:32

II 8 120 23 70-75 1:32

12 8 120 24 80-85 1:64

13 8 120 22 65-70 1:32

14 8 120 23 75-80 1:64

Опыт № 2: двум овцам ДО 8-9), 8-9-месячного возраста была удалена селезенка. На второй день после сплензктомии животным подкожно ввели по 120 мл нитратной крови, содержащей 14.10^ аналазм/животное. Па 15-й день после заражения на высоте пэра-зитомии (80-90%) овцы были обескровлены. Антигены, приготовленные из этой крови, оказались активными в титрах от 1:16 до 1:32 (табл. I).

Опыт № 3: Пяти овцам ДО 10-14) 8-месячного возраста удалили селезенку. Через 24 часа после сплензктомии каждому животному ввели подкожно циттатную кровь от носителя в количестве 120 мл, содержащую 16.10 анаплаэ»0швотное. На 22-24 день после . заражения при паразитомии 65-85% овцы были обескровлены. В этом опыте наблюдали сокращение сроков развития максимальной паразите-мчи до 22-24 дней. Все антигены, приготовленные из инвазирован-ной анаплаэмами крови, оказались активными в титрах - 1:32-1:64 (табл. I)'.

Таким образом, проведенные опыты показали, что уровень па-рязитемии у зараженных животных и сроки, необходимые для достижения ее максимальной величины, находятся в прямой зависимости от дозы введенных анаплазм. Так, если в 1-ом опыте, где заражающая доза составила 5.10^ анаплазм, максимальная паразитемия на уровне 25-60% была достигнута к 25-30 дню, то во 2-ом опыте, где для заражения овец применили дозу в 14.10 анаплазм, гораздо большая паразитемия (80-90%) была достигнута на 10-15 дней быстрее. Антигены с высокими титрами 1:32-1:64 получили только от тех овец, которым ввели большое количество анаплазм и обескровили при высокой паразитемия - 65-90%.

Во второй серии опытов использовали овец-анаплазмоносите-лой, которых спленэктомировали в различные сроки после переболе-ваиия с целью получит! у них высокую параэитемию.

Опыт № 4: 1-я группа. Овец №№ 15, 18, 20 спленэктомировали через 557, 326 и 210 дней соответственно, овец Ш 16, 17, 19, 21-23 спустя 120-180 дней после переболепания.

2-я группа. Четырех овец Ш 24-27 спленоктомировали спустя 90 дней после переболевания (табл. 2). Животным первой группы потребовалось 16-26 дней для достижения максимальной паразитемии 60-98% после их сплензктомии. До сплензктомии все овцы были паразитоносителями в течение 120-557 дней, все показатели крови (гемоглобин, гематокрит, количество- эритроцитов) у анаплазмоно-

носителей за указанный период восстановились . полностью и вто-

Таблица 2

Влияние сроков паразитоносительства, предшествовавших спленэктомии, на интенсивность инвазии и титры антигенов

№ ! Воз- ¡Сроки спленэ-¡Сроки обескров-!Паразитемия!Рабочие живот-! раст ¡ктомии после ¡ливания после ! при обес- ! титры ных !(мое.)¡переболевания!спленэктомии ¡кровливании! анти! !. (дней) ! (дней) ! в % ! генов

Опыт & 4. 1-ая группа

15 27 557 20 60-70 1:8

16 16 175 20 90-98 1:32

17 16 175 18 90-98 1:32

18 1С 326 17 95-98 1:32

19 14 180 16 90-95 1:32

20 8 210 20 65-70 1:16

21 14 180 26 65-70 1:16

22 18 150 25 65-70 1:16

23 18 120 20 70-75 1:32

2-ая группа

24 16 90 24 35-40 1:8

25 16 90 17 35-40 1:8

26 16 90 17 35-40 1:8

27 16 90 20 65-70 1:16

Опыт № 5

28 24 180 22 70-75 1:16

29 24 180 22 80-85 1:64

ричная анемия наступила после того, как у животного развилась высокая паразитемия в результате удаления селезенки.

У тех анаплазмоносителей, которых спленэктомировали после 90 дней носительства (2-я группа животных), результаты оказались иные. При получения невысокой паразитемии (35-40$) развивалась анемия (табл. 2).

Таким образом, этот опыт показал, что для получения высокой паразитемии 60-98% анаплазмоносителей необходимо сплсноктомиро-вать спустя 120 и более дней носительства.

Активность анаплазменных антигенов, полученных из крови опытных овец, показала, что она находится в прямой зависимости от паразитемии у обескровленных животных. Так от овец 1-ой группы, которых обескровили при высокой паразитемии 60-98$, получили антигены в титрах - от 1:16 до 1:32 и только от одной овцы, которую спленэктомировали спустя 557 дней носительства, получили антиген ó невысокими титрами - 1:8.

Опыт № 5. Две овцы-анаплазмоносительницы спленэктомировали спустя 180 дней после переболевания. На 2-й день после спленэкто-мии ввели дополнительно цитратную кровь от носителя, содержащую 16.10'' анаплазм/животное с целью повлиять на сроки обострения заболевания (табл. 2). Для обострения заболевания потребовалось 22 дня, и животных обескровили при паразитемии 70-85$. Опыт показал, что дополнительное введение инвазированной крови анаплаз-моносителям после их спленэктомии не влияет на сроки развития и уровень паразитемии. Антигены, приготовленные из инвазированной анаплазмами крови (паразитемия 70-85$), оказались активными в титрах от 1:16 до 1:64.

Опыт № 6. Четырех телят (№№ 1-4), 12-мясячного возраста чернопестрой породы, спленэктомировали. На второй день после операции им ввели кровь по 150 мл при паразитемии 16.I07 анаплазм/животное от паразитоносителей (табл. 3).. На 21-32 день после спленэктомии телята были обескровлены при паразитемии анаплазм 40-50$. Антигены, приготовленные из инвазированной крови, оказались активными в титрах 1:32-1:64. Как и в предцдущих опытах на ощах, наиболее активные антигены получили иг тех животных, которых спленэктомировали, а затем ввели большое количество ант- ■ пладм.

Опыт № 7. Четырех телят (№№ 5-8) спленэктомировали п различные сроки (300-360 дней) после переболевания их анаплазмозом.

-20- Таблица 3

Интенсивность инвазии и титры антигенов, приготовленных из крови зараженных анаплазмами телят после их спленэктомии'

№ ! Воз- !Код-во вве- '.Сроки обескров-! Паразите-! Рабочие живот-! раст !ливания после ! мия при ! титры

ных !(мое.)¡паразитемии !спленэктомии ! обескров-!антигенов

!

116.10' ана-,плазм/жив.

(дней)

ливаюш, в %

1

2

3

4

12 12 12 12

150 150 150 150

:21 21 32 21

55-60 55 40-45 55-60

1:64 1:32 1:64 1:32

Таблица 4

Интенсивность инвазии и титры антигенов, приготовленных из крови телят-анаплазмоносителей, спленэктомированных в различные сроки после шреболеванкя

Время Сроки 11с1Т1„ Ш ! Воз- '.спленэктомии ¡обескровли- ¡„„ПК»™.! Рабочие

живот-' ласт 'после заРа~ 'вашш посло 'ливании. ' тип» ЖИВ01 . раы .жения • спленэктомии' л*Шс1ШШ • ■ пиры

ных ! (мае.)!, (дней) ! (дней) '. в % ¡антигенов

5 14 360 26 65-70 1:16

6 14 360 27 65-70 1:16

7 14 • 300 28 40-50 1:8

8 14 300 28 70-75 Г: 32

trifft 26-28-й день после спленэктомии телят обескровили при паразитемии 40-75% (таб. 4). Антигены, приготовленные из инвазиро-ванной энаплязмами (А.marginale) крови, оказались активными в титрах от 1:8 до 1:32.

Таким образом, поставленные нами опыты показали, что активные антигены с высокими титрами - от 1:16 до 1:64, можно получить от тех телят и овец, которым после спленэктомии вводили большое количество крови, содержащей не меньше 14.10^ анаплазм/ животное. Аналогичные результаты отмечены у животных, сплензкто-мированных спустя 120 дней посл^ их переболевания анаплазмозом. Однако недостаток последнего метода заключается в том, что необходимо животных сначала заразить для развития первичного заболевания, этщать, пока переболеют и только через 4 месяца спленэкто-мировать.

2.2.2. Серологическая.общность антигенов из A.marginale . выделенных в Узбекистане, Ставропольском крае и Калининградской области.

Сотрудниками лаборатории протозоологии ВИЭВ (Н.А.Казаковым, С.Т.Родином, Х.Георгиу и аспирантом П.Э.Кердэая) были проведены исследования по изучению иммунологических свойств анаплазм из различных природно-географических зон. Результаты проведенных исследований показали, что анаплазмы, ввделенные от крупного рогатого скота в хозяйствах Узбекистана, Ставропольского края и Калининградской области не отличаются по вирулентности и имму-ногенности.

Перед нами была поставлена задача-изучить антигенные свойства перечисленных выше штаммов A.marginale- в РДСК.

Эти исследования были предприняты с целью выяснения возможности диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота в Узбеи кистане, Ставрополье и Калининградской области с иезаяьэопанием антигена, приготовленного из одного штамма возбудителя. Для этого предстояло определить наличие или отсутствие антигенных различий у анаплазм, выделенных в Средней Алии (Узбекистане), Юге '(Ставрополье) и западе России (Калининградская область).

В опыте находились 12 телят черно-пестрой породы в возрасте 10-12 месяцев, которых разбили на три группы по 4 животных в каждой. Телят первой группы заразили анаплазмами, выделенными к Ставрополье, второй группы - Калининградской области и третьей - Узбекистане.

Перед этим опытом взяли трех телят, каэдого из которых за-

разили одним из перечисленных штаммов анаплазм. На высоте пара-эитемии животных обескровили и приготовили три серии анаплаэмен-нык антигенов.

Пробы сыворотки крови от подопытных телят исследовали с го-мо- и гетчрологичными янаплпяменными антигенами в РДСК (табл. 5, б и 7).

Результаты исследований показали, что в пробах сывороток крови животных, зараженных анаплазмами из Ставропольского края, максимальныый титр антител (Ii 160) установлен с антигеном, приготовленным из Узбекского штамма 'анаплазм. Следующие по активности были антигены, приготовленные из Ставропольского (1:140) и Калининградского (1:80) штаммов анаплазм.

Исследования сывороток крови животных, зараженных анаплазмами Калининградского штамма, показали, что в наиболее высоких титрах (1:140) выявлял антитела антиген, приготовленный из анаплазм Узбекского происхождения. Более низкие титры антител (1:120) были выявлены с помощью антигенов возбудителей Ставропольского и Калининградского штаммов.

У животных, зараженных анаплазмами Узбекского штамма, наивысший титр антител в РДСК выявлен с помощью антигена, приготовленного из гомологичного штамма и равнялся 1:120. Далее по активности были антигены, приготовленные из анаплазм Калининградского и Ставропольского штаммов (1:80).

Учитывая, что все антигены были приготовлены по единой методике, можно сделать заключение, что наиболее активным в РДСК является антиген, приготовленный из анаплазм, вьщеленных из Узбекистана. Далее по активности стоят антигены, приготовленные из анаплазм, выделенных из Ставропольского края и из Калининградской области.

Однако антигенная активность испытанных штаммов анаплазм не настолько отличается мезвду собой, чтобы для каждого региона (Юг и Запад России, Средная Азия) готовить диагностикум из местного штамма. В результате мы считаем, что любой из этих штаммов можно использовать с диагностической целью во всех трех регионах, что . и было подтверждено в дальнейших исследованиях.

2.2.3. Серологическая общность антигенов из А.Ояз и A. margínalo .

После установления серологической общности антигенов, при-

Табл. 5

Титры антител в сыворотке крови телят, зараженных пнаплаямами из Ставропольского края, выявленные с помощью гомо - и гетчро-____________________логичных_антигаов_________________________

Дни после заражения ! Антигены, приготовленные из ана-' ' плазм

1

!Калининград-!Узбякско-!Ставропольского штамма!го штамма'ского штамма

I 35 днеП после заражения 1:40 1:40 1:40

2 40 " 1:80 1:160 1:140

3 45 1:60 1:80 1:80

4 50 1:40 1:40 1:60

Табл. 6

Титры антител в сыворотке кропи у толят, зараженных анаплпзмоми

из Калининградской области, выявленные с : помощью гомо - и гете-

рологичных антигенов

,'ЯЧ Дни после заражения !Антигены, приготовленные из ана-

; I плазм

I (Калининград-'Упбекско-!Ставрополь-

ского штамма!го штамма!ского штамма

I 35 дней после заражения 1:40 1:40 1:10

2 40 1:120 1:140 1:120

3 45 1:80 1:80 1:80

4 50 1:40 1:80 1:80

Табл. 7

Титры антител в сыворотке крови телят, зараженных анаплазмями

Узбекского штамма, выявленные с помощью гомо - и гетерологичных

антигенов

№№' Дни после заражения !Антигены, приготовленные из ана-

1 ,__________ ,_плазм________

? Калининград-!Узбекско- !Ставрополь-

1 ! ского штамма!го штамма ского штамма

I 35 дней после заражения 1:20 1:40 1:20

2 40 1:С0 1:120 1:60

3 15 1:60 1:60 1:00

4 50 " 1:30 1:40 1:60

родно-климатических зонах страны, перед нами была поставлена задача - установить наличие или отсутствие общих детерминант в антигенной структуре А. Ovis и A.marginale . Для этого после . получения антигенов из А.Ovis и А.marginale и определения рабо-: чих титров их испытывали с сыворотками крови животных, зараженных возбудителем гетерологичного вида. Антигены из A.(Víb титровали с сыворотками крови крупного рогатого скота, зараженного A-marginale и в качестве контроля с сыворотками овец, заражена ' ных A. Ovig . Активность антигенов А.Оу^ титрованных в РДСК с ■. позитивными сыворотками крови о^ец и крупного рогатого скота, зараженных анаплазмозом, полностью совпадает.

Антигены, приготовленные из А.marginale » титровали с сыворотками овец, зараженных A.Ovis и сыворотками крупного рогатого скота, зараженного A.marginale • Активность антигенов А.шаг-ginale » титрованных с позитивными сыворотками крупного рогатого скота и овец, полностью совпадает.

В дальнейшем сыворотки крови крупного рогатого скота, переболевшего анаплазмозом (A.marginale)) исследовали в РДСК с антигенами А.Оу^а и A.marginale* Сыворотки овец, переболевших анаплазмозом (A.Ovia ], исследовали в РДСК с антигенами из A.marginale" A.Ovis (табл. О).

Кроме нативных, исследовали и лиофилизированные сыворотки овец и крупного рогатого скота.

Как видно из таблицы 8, результаты исследования сывороток крови крупного рогатого скота, зараженного A.marginale , с антигеном из A.Ovis в РДСК и, наоборот, сывороток крови овец, зараженных A.Ovia с антигеном из A.marginale . полностью совпали.

Эты опыты показали существование общих антигенов в антигенной структуре A.Ovís и A.marginale и позволили в дальнейшем готовить антиген для серологической диагностики анаплазмоза овец и крупного рогатого скота из А. Ovis , как наиболее доступного и дешевого сырья.

По материалам проведенной работы Главное управление ветеринарии Госагропрома СССР утвердило НТД на изготовление, контроль и применение наборов компонентов для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец в РДСК с единым антигеном из A.ovis . материалы экспонировались в 19ГС г. на ВДНХ и по ним вьщана серебряная медаль.

2.2V4. Динамика пэразитечиг и анаплазменных антител, выявля-

Таблица 8

Титры антител в сыворотках крови овец и крупного рогатого скота, переболевших анаплазмозом, выявляемые с помощью гомологичных и гетерологичних антигенов анаплазм

Ш п/п

га ¡Титры антител л ! № сывороток!сыворотках овец, ! п/п овец ¡выявляемых с ! ¡антигенами: !:

! А.ог1а ! А.таг^ппЦе

гёй

сывороток КРС

Титры антител в сыворотках КРС, выявляемых с антигенами: А.ОУ1Э !А.шагй1па1е

I.

о

3.

3,4,8,25

1,13,15, 17,24,27 и 30

1:10

1:20

2,5-7,9-12, 14,16,18-21, 26,28 я 29 1:40

4. 22 и 23

1:80

1:10

1:20

1:40 1:80

1.

2.

4.

5,7,13

6,8 II 29

9,15,21 и 30

1:5 1:10

1-4,10-12, 14,16-20, 22-20 1:40

1.

2. 3.

6

1,2,3

4 и 5

1:5 1:10

1:20 1:20

Серии позитивных высушенных сывороток

1:40 1:40 I. 5 . 1:20

1:80 1:80 2. 2,3,4 и 6 1:40 1:160 1:160 3, I 1:160

1:40

1:20 1:40 1:160

емых с помощью РДСК у экспериментально наряженных анаплазмозом овец разных пород овец и крупного рогатого скота.

Динамику антителообразования у животных после введения им возбудителя изучали на овцах 18-24-мес. возраста (один опыт) и телят 10-18-месячного возраста (один опыт).

Опыт поставлен с целью выяснения влияния породы на антителообразования у овец. Использовали 23 животных. Всех овец разделили на три группы по 7-8 животных в каждой. В первую группу включили овец романовской породы, во вторую - мериносовой и в третью - калининградской. Кроме т*ого, поставили I опыт по изучению динамики образования комплементсвязывающих антител в сыворотке крови телят черно-пестрой породы, зараженных онаплозмами. С этой целью использовали 12 телят. Заражение животных проводили путем подкожного введения в нижнюю треть шей инфицированной крови в дозе 6.10® анэплаэм на каадое восприимчивое животное (опыты проводились совместно с аспирантом П.Э.Кердзая и старшим науч. сотр. С.Д.Родиным).

Начало выявления комплементсвязывающихантител у овец 1-ой группы пришлось на 21 день после заражения, 2-ой группы - 23-й день и 3 -й группы - 18 день. Титры антител составили в начале опыта - 1:5, затем их уровень повышался, достигая максимума -1:80-1:160'(в первой группе) к 35 -ому дню. Затем на 40-й день уровень антител снизился до 1:40, а спустя 7 дней вновь повы'-. сился до прежнего уровня - 1:160. Во 2-ой группе животных это повышений наблюдали к 46-ому, а 3-ей к 40-ому дню. Затем содержание антител снижалось до 1:20-1:40 и на таком уровне удерживалось в течение 300 дней после заражения у овец 1-ой группы, 71 день - 2-ой группы и 75 дней - 3-ей группы (сроки наблюдения). Процесс антителообразования не зависел, от породы овец, У всех овец Зх групп антитела стали выявлятьез на 18-23 день после заражения .

Параллельно с исследованием сыворотки крови с целью выявления комплементсвязывающих антител проводили микроскопирование мазков крови для установления сроков появления анаплазм в периферии«?: ской крови. Обнаружение паразитов не совпадало с появлением комплементсвязывающих антител у животных. У овец 1-ой, 2-ой и 3-ей групп анаплазмыв периферической крови стали появляться раньше, чем компягементсвязывающие антитела. Более того, очень часто пик комплементсвязывающих антител наблюдали после угасания паразитемии и начала восстановления показателей крови (гемо-

глобин, количество эритроцитов И др. )

Сравнивая все полученные в РДСК результаты следует отметить, что начало выявления комплементсвязыпамцих антител у телят в сроднен приходмлось на 20-25 день после заряжения, когда титры антител составляли - 1:5. Затем уровень антител повышался и к 30-45 дню достигал своего максимума - от 1:40 до 1:320. После этого отмечалось постепенное снижение уровня антител и к 65-75 дню после заражения они выявлялись, в среднем, в разведении сыворотки -1:10 до 1:20, а у некоторых телят результаты реакции были отрицательными.

Параллельно с исследованием сыворотки крови с целью выявления комплементевязнвающих антител проводили микроскопирование мазков крови у телят для установления сроков появления анаплазм в периферической крови. Обнаружение паразитов как и у телят не согшало с появлением комплементсвязьтамцих антител у телят. А-наплазмн в мазках периферической крови стали появляться на 10 дней раньше, чем комплементсвязывающие антитела в сыворотках крови у телят. Как и при анаплазмозе овец, очень часто пик комплементевязнвающих антител наблюдали после угасания паралитемии и начала восстановления крови (рис. 4).

2.2.5. Реакция непрямой гемагглютинации (РИГА.).

Для совершенствования серологической диагностики анаплазмоза рогатого скота в направлении повышения ся чувствительности была применена новая при этом заболевания тест-система - реакция непрямой гемагглютинации (РИГА).

При проведении исследований по определению возможности применения РИГА для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец использовали работы, посвященные изготовлению стойких, специфических и чувствительных диагностикумов. В качестве носителей антигенов при разных инфекционных заболеваниях использовали эритроциты барана, которые имеют определенные преимущества перед небиологическими частицами (Б.НЛСаральный, 1970; С.X.Садиков, 1975). Эритроциты данного вида животных, достаточно однородны по размеру и в растворах солей образуют довольно стойкую, гомогенную суспензию, не оседающую за короткое время.

В результате проведенных исследований был разработан стойкий (срок годности не менее 24 мес.), специфичный диагностикум,

представляющий собой 2,5$-ную взвесь эритроцитов барана, фиксированных формалином, обработанных танином и сенсибилизированных антигеном A.Ovis.

Отработан оптимальный режим изготовления диагностикума, включающий:

1. Подбор метода получения активного антигена, способного адсорбироваться на эритроцитах. Установки«), что только антиген с высокими титрами (1:32 и выше по РДСК) отвечает атому требованию;

2. Определение оптимального времени обработки раствором танина (15), обеспечивающего стабильность взвеси эритроцитов в фосфатио-буферном 0,85д~ном растворе хлорида натрия при pH 7,27,4 и высокую адсорбционную способность (в отношении антигена) формзлинпзированных эритроцитов барана;

3. Определение концентрации формалина (5«) и экспозиции обработки (16-18 ч.), в термостате при 37° С, обеспечивающие длительную сохранность эритроцитов (более 6 лет) без признаков лизиса и аггломерации;

Л. Определение концентрации антигена (1:4), продолжительность (12-14 ч) и температуры (+37° С) сенсибилизации, а также концентрации эритроцитов в диагностикуме (2,5%).

Контроль активности жидкого эритроцитарного диагностикума осуществляли путем постановки реакции непрямой гемагглютинации с позитивной анаплазменной сывороткой с заведомо известным титром, в РИГА не ниже 1:3200, 2+. Специфичность диагностикума определяли на сыворотке крови рогатого скота, не зараженного'анаплазмозом, №.животных, переболевших тейлериозом и бабезиозом. РИГА ставили в лунках полистироловой пластины с круглым дном.

Реакцию проводили в обьеме 0,125 мл. Для получения нужных разведений испытуемых и контрольных сывороток (I положительная и I отрицательная), не инактивируя, их разводили до 1:50, 1:100, 1:200, 1:400, 1:600, 1:1600, 1:3200 и 1:6400 в физиологическом растворе с кроличьей сыворотки. Затем по 0,1 мл каждого разведения сыворотки сливали в лунки.

После этого в те же лунки вносили специально откалиброван-ной капельницей по I капле (0,025 мл) эритроцитарного диагностикума .

Сыворотки и эритроцитарный диагиостикум тщательно перемешивали путец осторожного встряхивания пластин и оставляли их при

комнатной температуре на 2-3 часа. Затем, проводили ухает реакции

по четнрех-бпльной систпме:

++4+ - агглютинированные эритроциты ровным слоем покрапают всю поверхность дна лунки; края агглютинина иногда загибаются по внутрь;

-м + - агглютинированные эритроцит),i равномерно прикрывают всю поверхность дна лунки; заметны границы агглютинина;

4-1 - по краю агглютинированных эритроцитов образуется кольцо из несклеенных эритроцитов;

+ - агглютинированные притроцитм оседают на дно лупки в виде небольшого кольца с ровными ^краями;

- эритроциты оседают на дно лунки п виде "пуговки" или компактного колечка с ровными кроями.

Реакцию считали положительной при агглютинации сенсибилизированных эритроцитов испытуемыми сыворотками в разведении 1:100 и выше с оценкой не менее 3+.

За сомнительную реакцию принимали агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов сывороткой в разведении 1:50 с оценкой не ниже 2+ и 1:100 с оценкой I+»

Нами приготовлено Ю серий оритроцитарного диагностикума (8 серий из А.о-ай и 2 серии из Amargiimle ). При титрации с заведомо положительными и отрицательными сыворотками опец и крупного рогатого скота и сыворотками животных, переболевших други« ми протояойными заболеваниями, установлено, что РИГА является специфичным тестом для диагностики анаплазмоза.

2.2.5.1. Динамика накопления гемагглготинирующих антител у зараженных анаплазмозом овец и телят.

При выполнении этой работы использовали тех же овец и телят, которые ранее упоминались при изложении данных о динамике компле-ментсвязывающих антител при анаплазмозе.

Сроки выявления гчмагггттинирующих антител у ове.ц колебались в небольших пределах. Так у животных 1-ой и 2-ой групп ини появились на 13-14-й день после заражения, а в 3-ей группе - на 18 день. Гемагглютинируицие антитела в начале опыта выявляли в разведении сыворотки крбпи 1:100, затем уровень гемагглютиниру-ющих антител повышался, достигая титров 1:3200 на 35-46 день после заражения (I и 2-ая группы). Затем уровень ггамагглютинируг щих антител снижался до 1:1600 - 1-ая и 2-ая группы и 1:800 -

I

о го

I

И£А РИГА РДСК 1:3200 I:540С 1:32С

1:1600 1:3200 1:150

к 1:600 1:1600 1:80

§ 1:400 1:800 1:40 §

3 1:200 1:400 1:20 в

р 1:100 1:200 1:10

1:50 1:100 1:5

о — О-

14 21 28 35 49 56 300 Дни после заражения 1-ый опыт 1-я группа Рис. I.

/

/

13 18 23 36 45 71 Дни после заражения

1-ый опыт

2-я группа Рис. 2.

ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ АНТИТЕЛ И ПАРАЗИТЕМИЯ У ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНО ЗАРАЖЕННЫХ

АКАПШМАЖ ОВПЦ 3 РДСК, РИГА И И5А РДСК_ РИГА-------И5А -о-о-о-о-о- Паразитекия++++++++-н-

¡5

£

ИМ РИГА РДСК

1:6400 1:12800 1:640

1:3200 1:6400 1:320

1:1600 1:3200 1:160

1:800 1:1600 1:80

1:4СХГ< 1:800 1:40

1:200 1:400 1:20

1:100 1:200 1:10

1:50 1:100 1:5

¿7-0—1

С?

12 18 29 35 40 45 55 Дни после заражения 1-ый опыт 3-я группа

Рис. 3. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ АНТИТЕЛ И ПАРАЗЖМИЯ У ЭКСПЕРИуЕНТАЛЬНО ЗАРАЖЕННЫХ АНАПЛАЗМАМИ ОВПЦ В РДСК, РИГА К И ФА

10 15 20 25 30 35 40 45 65 Дни после заражения 1-ый опыт

РДСК

РИГА

Рис. 4. ДИНАМИКА НАКОПЛЕНИЯ АНТИТЕЛ И ПАРАЗИТЯШЯ У ЭКСПЕРИМЗНг-ТАЛЬНО ЗАРАККННЫХ АНАПЛАЗМАМИ ТЕЛЯТ В РДСК, РИГА И ИФА КФА -о-о-о-о-о- Паразитемия ++++++++++++

о

- •-323-я группаЧ в день окончания опыта).

Онаружение паразитов в малках периферической крови не всегда совпадало с выявлением гемагглютинирующие антител. У животных: 3-ей группы анаплазмыв мазках периферической крови появлялись раньше, чем гемагглютинирующие антитела, а в I и 2-ой группах -одновременно (рис. 1-3).

Начало выявления гемагглютинирующих антител в сыворотке крови экспериментально зараженных телят приходилось на 15/ый день после заражения. Титры гемагглютинирующих антител в начале опыта не превышали уровня - I:iOO - 1:200. В дальнейшем наблюдали увеличение титров антител - от 1:1600 до 1:3200 к 30-45 -ому дню. Затем отмечалось снижение титров гемагглютинирующих антител до 1:200, и на таком уровне они сохранялись до конца опыта (75 дней - срок наблюдения).

Что касается анаплазм в периферической крови, то у телят они обнаруживались на 5 дней раньше, чем гемагглютинирующие антитела (рис. 4).

Из проведенных опытов видно, что гемагглютинирующие антитела выявляли в среднем на 5 дней раньше, чем комплементсвязывающие и почти одновременно с появлением анаплазм в мазках периферической кршви овец. Таким образом подтверждено, что РИГА является чувствительным тестом для диагностики анаплазмоза и выявляет его в более ранние сроки в сравнении с РДСК. РИГА, как и РДСК подтврждает наличие общих антигенов в структуре A.Ovis и А.marginale .

2.2.6. Реакция иммуноферментного аналчза (ИФА).

В последнеедесятилетие в диагностике вирусных инфекций большое значение приобретает иммуноферментный метод, обеспечивающий .возможность своевременного обнаружения возбудителя и пф-¿ективпости проведения мер борьбы и профилактики.

Успех этого метода обьясняется его высокой производительностью, чувствительностью и специфичностью, достигаемым благодаря применению в качестве маркеров ферментов, которые позволяют современными физическими методами регистрировать образование комплекса антиген-антитело (E.Bngvall, P.Perlman, 1971-1972$ Vollär and Bidvell, 1975).

При разработке реакции иммунофериентного анализа применяли лизированный анаплазменный антиген. Готовые серии антигена проверяли на активность, специфичность и определяли их рабочие титры в ИМ в объеме 0,2 мл с положительными и отрицательными сыворотками животных, переболевших тейлериозом, ба-безиозом, инфекционным метритом и бруцеллезом.

В основном все процедуры проводили вручную или с помощью полуавтоматов. Для адсорбции белков на полимерных носителях использовали разные объемы реагентов, наиболее приемлемым объемом оказался - 0,2 мл.

Реакцию проводили либо при комнатной температуре либо при 37° С. Связь между антигеном и сывороткой лучше проходит при 37° е. При сравнительном испытании разных режимов постановки ИМ (табл 10), наилучший результат был получен в варианте 7, потому что при адсорбции антигена меньше, чем 4 часа происходит недовыявление зараженных животных, и наоборот, при инкубации г' более 4 часов наблюдали ложноположительные реакции.

После предварительной промывки и внесения антигена, платы высушивали на воздухе и хранили при комнатной температуре в течение 3 месяцев.

Для отмывки ппашек использовали мягкий прессурный плунжер, в котором в лунки подается обильная струя. В качестве отмыво-чной жидкости использовали 0,1 М калий фосфатный буфер с включением 0,05$ твином - 20.

Из ферментов взяли пероксидазу. Синтез пероксидазных конью-гатов осуществляли по методике (м.влШвоп, Р.кладете, 1978).

Методика постановки ИМ сводится к следующему: в лунки полистироловых плашек вносили по 0,2 мл анаплазменного антигена в рабочем титре. Разведение антигена до рабочего титра осуществляли 0,01 М калий фосфатным буфером с 0,1 М хлористым натрием (рН 7,4). Время инкубирования в термостате при 37° С - 4 ч. Лунки плашек промывали тем же буферным раствором, содержащим 0,05% детергента твина - 20. Этот раствор готовили в день постановки реакции добавлением 0,5 мл твина к I л фосфатно-буферного раствора.

Испытуемые сыворотки, а также контрольные (одна позитивная и одна негативная), не инактивируя, разводили до 1:50 и 1:100 фосфатным буфером в пробирках и исследовали в этих разведениях, внося по 0,2 мл в лунки с иммобилизованным антигеном. При не-

Табл.9

Определение оптимального режима постановки ША

№ вари- Температура Адсорбция Инкубация Инкубация Реакция фермент- Примечание анта С° /сенсиби- сыворотки кояьюгата субстрат

лизация/ в ч в ч в ч

антигена в ч

I

го

I

I. Комнатная 2 2 3 0,5-1

2. 37° " I I I I

3. Комнатная 6 6 12 0,5-1

4. Комнатная 4 4 12 I

5. 37° 1,5 1,5 1,5 0,5

6. 37° 0,5 0,5 0,5 I

7. 37° 4 1,25 1,25 0,5

(7о11ег е1: а1;, 1979)

ОИвЗ-пе ег а1., 19В0}

(Еп^а11 et а1., 1975)

(Розс-Е-оп, 1979)

СЬеп1п155;к1 et а1., 1978)

(Йи11:1;епЪеЕ2 е1г а1., 1975) СобстЕенше данные.

обходимости положительные сыворотки титровали, используя двухкратное из разведение.

Плашии с антигеном и сывороткой инкубировали в термостате при 37° в течение 1,25 ч,после чего два - три раза лунки отмывали буфером с твином, затем в них вносили по 0,2 мл коньюгата в рабочем разведении и инкубировали в течение 1,25 ч в термостате при 37° С. После окончания этого срока лунки отмывали тем же буфером с твином Три-четыре раза с 3-5-минутным интервалом.

В подсушенные лунки-плашек добавляли по 0,2 мл субстрата. Реакцию оценивали визуально спустя 30-50 минут после внесения субстрата. Считали ее положительной в случае изменения окраски от коричневого до темно-коричневого цвета. Отрицательная реакция характеризуется отсутствием изменения цвета субстрата или появлением слабо-желтого окрашивания. Степень окрашивания субстрата определяли в крестах и оценивали:

++++ - темно-коричневый цвет - реакция положительная +++ - коричневый цвет - реакция положительная ++ - светло-коричневый цвет - реакция сомнительная

- отсутствие изменения цвета субстрата или появление сл&бо-жеятого окрашивания - реакция отрицательная. При получении1'сомнительного результата (светло-коричневый цвет) проводили повторное исследование сыворотки крови, взятой от животного спустя 15-30 дней. При повторном получении сомнительного результата животное считали положительным. Для постановки реакций иммуноферментного анализа было приготовлено 12 серий коньюгатов, из которых 5 серий против глобулинов овец и 7 - против глобулинов крупного рогатого скота в титрах от 1:160 до 1:1280 (табл. 10). Титрацию коньюгатов проводили с позитивными и негативными сыворотками в разведении 1:50 или 1:50, 1:100 и 1:200. Установлено, что можно использовать оба метода для титрации коньюгата.

2.2.6.1. Динамика накопления анагтазменных антител, выявляемых с помощью ИФА, у экспериментально зараженных овец и крупного рогатого скота.

При выполнении этой работы использовали те..шо сыворотки о--вец и телят', которые ранее упоминались при изучении динамики комплементсвязывающих и гемагглютинирующих антител при анаплаз-

'мозе.

Табл. 10

Активность коньюгатов против глобулинов овец и крупного рога-го скота, титрованных с аналлазменными антигенами

Серии Антигены из А. о vis Титры Антигены из Aparginale Титры

К2йьюс§™_р8тйв_глоб£линов ЛЕС

1. 1:160 1:160

2. 1:240 1:240

3. ' 1:1280 1:1280

4. 1:640 1:640

5. 1:160 1:160

6. 1:240 1:240

7. 1:400 1:400 Цоньюгаты_против_гло^линов_овец

1. 1:200 1:200

2. 1.200 1:200

3. 1:320 1:320

4. 1:320 1:320

5. 1:160 1:160

Антитела в ИФА у овец во всех группах выявляли в среднем на 12-14-й день после заражения в титрах - от 1:100 до 1:200.

В дальнейшем уровень антител повышался, достигая максимальных титров - от 1:1600 до 1:3200 к 35-56-му дням. После этого срока наступило их незначительное снижение, которое и сохранилось до конца опыта ( в 1-й группе - до 300 дней, во 2-й - до 71 дня и в 3-й - до 90 дней - срок наблюдения).

Антитела в ИФА у экспериментально зараженных тэдят выявля-.ли в среднем на Ю-й день после заражения. В дальнейшем уровень антител повышался, достигая максимальных титров - от 1:1600 до 1:6400 на 30-45 день. В после,-дующем титр антител снижался до 1:400 и на таком уровне сохранился до 75 дней (срок наблюдения), (рис. 4).

У овец и телят аналлазмы в периферической крови обнаружены одновременно с появлением анаплазменных антител в ИФА (рис. 1-4).

■ '-37-

Таким образом, сравнительное изучение чувствительности трех серологических реакций (ИФА, РДСК и РНГЛ) при экспериментальном анаплазмозе овец показало, что ИМ выявляет анаплазменные антитела на 5-10 дней раньше, чем РДСК и РИГА, причем одновременно с появлением анаплазм в мазках периферической крови.

Анаплазменные антитела у экспериментально зараженных телят также выявляются в И5А на 5-10 дней раньше, чем РДСК и РИГА и одновременно с появлением паразитов в мазках периферической :: крови. Спустя 145 дней после заражения все телята продолжали положительно реагировать в-МА, ;в то время как в РДСК и РИГА положительно реагировали только 41,0? зтапстннх (табл. II).

Табл. II

Результаты серологических исследований в РДСК, РИГА и ИФА телят-анаплазмоносителей спустя 145 дней после их заражения

№ живо- РДСК РИГА ИФА Микроскопия

тного

I. отрицательно отрицательно 1:200 +

2. 1:10 2+ 1:100 1:200 +

3. отрицательно отрицательно 1:100 +

4. м ff 1:100 +

5. fi п 1:100 +

6. 1:5 3i 1:100 1:200 +

7. 1:20 3+ 1:200 1:400 +

8. отрицательно отрицательно 1:100 +

9. п п 1:100 +

10. п п 1:100 +

II. 1:40 2+ 1:400 1:800 +

12. 1:20 3+ 1:200 1:400 +

2.2.7. Динамика паразитемии и антител у зараженных анаплазмозом спленэктомированных овец.

С целью выяснить период появления анаплазменных антител у спленэктомированных и потом зараженных животных поставлен один опыт. Семь овец сплензктомировали а затеи зарааили инфицированной A.ovi0 кровью.

В сыворотке крови овец до опыта не выявляли анаплязменных

антител ни в одной из используемых реакций. В после,т^кхцие 5-10 дней после спленэктомии и заражения также не обнаруживали антитела, в то время как в мазках периферической крови уже появились энаплазмы. Антитела у сплпнэктомированных овец в ИФА стали выявлять на 13-й день в титрах от 1:50 до 1:100 (табл. 12).

Табл. 12

Результаты серологических исследований в РДСК, РИГА и И<М зараженных анаплазмозом спленэктомированных овец

Количе- Сроки взятия крови РДСК РИГА ИФА Микроскопия

ство после спленэктомии

живо- (в дней)

тных

7 0 _ _ _ -

5 _ +

10 - - +

13 1:50-1:100 +

18 - 1:100-1:200 +

Как видно из табл. 12, на 18-й день титры антител в ИФА продолжали расти и достигали уровня от 1:100 до 1:200, а компле-ментсвязывающих и гемагглютинирующих антител не обнаруживал», несмотря на то, что паразитов в мазках периферической крови находили в пределах 40-60%. В день обескровливания при паразите-мии 65-75% анаплазменные антитела выявляли только в И$А в титрах 1:100.

2.2.0. Динамика паразитпмии и анаплазменных антител у телят при длительном паразитоносительстве.

О целью выяснить наличие анаплазменных антител у телят рез 300 дней после заражения был поставлен следующий опыт. Спустя 300 дней после заражения 12 телят-анаплазмоносителей иссле.'-довали в РДСК, РИГА и ИФА при параллельном проведении микроскопии мазков периферической крови. Результаты исследований приведены в табл. 13.

,^абл. 13

Результаты серологических исследований в' РДСК, РИГА и ИФА телят-энаплазмоносителей спустя 300 дней после заражения

№ живо-• тного РДСК РНГА ИФА Микроскопия

I. отрицательно отрицательно 1:100 +

2. И « 1:200 +

3. И п 1:100 +

4. П tt 1:100 +

5. п п 1:200 +

б. п п 1:200 +

7. п п 1:200 +

8. и tt 1:200 +

9. и « 1:100 +

10. и 11 1:100 +

II. 1:100 1:200 +

12. 1:5 3+ 1:100 1:200 +

Как видно из табл. 13 комплементсвязнвающие и гемагглюти-нирующие антитела выявляли в сыворотке крови только у двух телят (16,6%).

В то время как в ИМ положительно реагировало 100% телят в титрах - 1:100 (№ I, 3, 4, и 10) и 1:200 (№ 2, 5-8, 11-12). В мазках периферической крови были обнаружены единичные анаплазмы у всех телят. В дальнейшем Зх телят спленэктомировали и через 20-25 дней наблюдали обострение паразитемии. В день обескровливания, при паразитемии 35-50%, выявляли анаплазменные антитела только в ИФА.

Таким образом при длительном параэитоносительстве (300.дней) ИФА выявляет на 83,4% больше зараженных животных, чем РДСК и РИГА.

2.2.9. Результаты серологических исследований на анаплазмоз крупного рогатого скота и овец из разных регионов России и стран СНГ.

Анаплазмоз крупного рогатого скота и овец зарегистрирован

■ Табл. 14

Результаты серологических исследований на анаплаз;:оз в Р"СК сыворотки крови крупного рогатого скота иг газлкчных регионов России и стран СКГ

| Вид КИЕОТНЫХ

' Свцк ' Крупный рогатый скот

I-------------------------------------------------------------

.р'сл-во 'Положительные'В мазках !?!ол-во ! Положите ль- 'Б мазках

' МЫ&

!проб ' н ' кровч ' проб 1 в'р£СК ' крови • "всего)'-----------------------'(всего !---------------------

' 'К-во ! в " 'К-во'В « ' 'Кол-ео'Е % 'К-во!Е ? ' !проб ' ! ' ' ' проб ' ' 1

3 1 4 ! 5 ' 6 ' 7 ! 8 ! 9 ? 1С ' II ! 12 ! 13

1. Марийская республика 1991-1982

2. Ставропольский ку.ей "

3. Горьковская обл. "

Крым

5. Марийская республика 1983-1964

6. Ставропольский край "

7. Дагестан "

8. Туркменистан "

9. Саратовская область "

1'0. Калининградская область 1961-1983

11. Чечено-Ингушская рес. "

12. Рязанская область "

13. уАновская область 1984-19Е5

!Республика край ! область

ата исследования (год)

I

48" 57 13,7 - - - - - -

5е5 Т07 ОС! А 89 тс; 1 - - -

145 7 4,8 - - - - - -

30 б 20,0 - - - - - -

215 4 1,8 - - - - - -

60 33 55,0 - - - - - -

597 145 24,2 - - - - - -

427 219 51,2 - - 23 • 10 ■. . 43,4 _

1802 •343 35,5 - - - - - _

- - - - - 1534 333 ОГ <*! ►.А, ■ -

- - - - - 5С2 35 . 6,9 _

- - - - - 413 88 от ?

- - - - - 390 35 6,9 ' _ -

14. Башкирская республика 1964-1985

15. Рязанская область "

15. Таджикистан "

17. Опытная база ВИЗВ 1982-1985

16. Червленные Еуруны

Дагестан 1988

19. Калининградская область "

20. Минская область "

21. Брянская область 1992

22. Новосибирская область "

ВСЕГО:

Табл. 14 (продолжение)

5 ! 6 ? 7 т е Т 9 ! 10 ! II 1

_ 70 7 10,0

- 55 7 12,7

- 192 13 6,7

70 36,2 - 582 265 ис с О

135 44,7 - - -

- 4297 594 13,8

- 1091 276 25,2

- 130 17 13,0

- 72 14 19,4

1526 31,5 9351 1694 18,1

Табл. 15

Сравнительная оценка диагностических тестов (РДСК, РИГА и Шк при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец

Ш Республика, край, область Кол-во Положительные в

проб РДСК РИГА И'ЗД

ЭДзупцого рогатого скота

I. Рязанская область 120 170 248

2. Кировская область . 58 26 35 50

3. Калининградская область 500 80 210 250

4. Дагестан 188 35 58 90

5. Киевская область Украины 478 112 180 250

6. Минская область Белоруссии 1476 409 494 750

ВСЕГО: 3200 782 1147 1638

В % 24,4 35,8 51,1

ОБЩ

1. Ставропольский край 60 33 40 48

2. Саратовская область 350 но 137 180

3. Дагестан 375 86 133 189

4. Туркменистан 427 219 280 350

ВСЕГО: 1212 448 590 767 В % 36,9 48,6 63,2

ВСГСГО: 4412 1230 1737 2405 В % 27,8 39,3 54,5

на многих территорияхРоссийской федерации и странах СНГ. К настоящему времени установлен в 24 областях, краях и автономных республиках России, в восьми областях Украины, в четырех - Белоруссии, в Азербайджане, Армении, Грузии, Казахстане, Киргизии, Таджикистане, Туркмении и Узбекистане.

Начиная с 1981 г. мы проводили серологические исследования по изучению эпизоотической ситуации по а^шлазиозу рогатого скота в республиках бывшего СССР. Необходимый кэтериая был доставлен из хозяйств различных областей и .республик России и стран СНГ. Исследовали 9351 проб сыворотки крови крупного рогатого скота и 4833 пробы овец. Среди крупного рогатого скота зараженность анаплазмами составила в среднем 18,1 (1694 проб) и овец - 31,5 (1526 пробМтабл. 14). При параллельном исследовании 4412 проб сыворотки крови крупного рогатого скота и овец в разных серологических реакциях комплементсвязывающие антитела выявлены в 1230 пробах (27,8%), в то время как методом РИГА антитела к анаплазменному антигену обнаружены в 1737 пробах (39,3%) в ИМ - в 2405 пробах (54,5%), в том числе у крупного рогатого скота положительными в РДСК были 782 пробы (24,4%) в РНГА - 1147 пробы (35,8%), в ИФА - 1638 пробы (51,1%), у овец в РДСК - 448 проб (36,9%), в РНГА - 590 проб (48,6%), в ИМ - 767 пробы (63,2%) табл. 15.

Таким образом, при сравнительной оценке трех серологических методов с сыворотками, привезенными из неблагополучных по анаплавмозу хозяйств, установлено, что методом ИМ выявляется на 26,7% носителей больше, чем в РДСК и на 15,2% больше, чем РНГА.

Анализ эпизоотической ситуации показывает, что анаплазмоз распространен во многих областях, краях и республиках России, поэтому необходимо при перемещении животных, а также плем продаже проводить серологические исследования. Известно, что ввду-щим фактором поддержания эпизоотических очагов является длительное, практически пожизненное носительство анаплазм в организме однократно переболевших животных: у крупного рогатого скота -13-15 лет, у овец - до 5 лет (срок наблюдения) (И.В.Абрамов и др. 1965).

ЧАСТЬ II. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ТЕСТОВ (РДСК, И ИФА) ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ НУТГАЛЛИОЗА ЛОШАДЕЙ

-443. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

¡J.I. Материалы и методы

Исходным материалом для получения нутталлийного антигена служила кровь от остро больных нутталлиозом животных с поражен-ностью. эритроцитов от 40 до 70%. Для получения такой паразитемии жеребят-нутталлионосителей спленэктомировали согласно методичег ским указаниям, утвержденным ГУВ МСХ СССР от 24 сентября 1975 г., а затем через 5-8 дней тотально обескровливали. Приготовление антигена, лиофилизацию его и титрацию проводили также, как при анаплазмозе. Лиофилизированные антигены хранили в бытовом холодильнике (при +4° С).

Этот антиген был использован нами при отработке твердофазного метода ШгА для выявления антител в сыворотке крови лошадей для установления нутталлионосительства.

ИФА ставили по разработанному нами наставлению, утвержденному ГУВ Госкомиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам I декабря 1989 г.

Э.2. Определение условий, влияющих на степень пероболевания и выраженность паразитемии у зараженных нуттпллиозом лошадей.

В опыте использовали 8 лошадей, каждой из которых ввели по 50-100 мл крови от цутталлионосителей. При этом в сыворотке крови : носителей обнаруживали комплементсвязывающие антитела в разведений 1:5 и единичные нутталлии в мазках периферической крови. Удаление селезенки у опытных животных проводили в разные периоды - с 35 по 270 дней после заражения. Обычно на 5-8-ой день после спленэктомии лошадей обескровливали при высокой паразитемии (табл. 16).

Как видно из таблицы, лошадь, которую спленэктомировали на 35-й день после заражения пала при невысокой паразитемии (10-12$).

Лошади, которых спленэктомировали спустя 94-180 дней после заражения, дали хорошую паразитемиго - 55-70$ (2, 3, 4, 5 и б). Лршяди, сптенэктомированныг» на 270-й день после заражения, дали невысокую парвзитемию - в пределах 10-15$. Из крови 5 лошадей (2-6), которых обескровили при высокой паразитемии, получены активные антигены с титрами - от 1:32 до 1:64 в РДСК. Активность антигенов приготовленных из крови лошадей, давших низкую паразитемии, (7 и 8) была слабой и не превышала тмтрп 1:4.

Табл. 16

Влияние сроков носительства нутталлий, предшествовавших спленэ-ктомии лошадей, на интенсивность инвазии и титры антигенов в

РДСК и ИМ

№ жи- Сроки пара- Сроки обес- Парази- Титры антигонов вотных зитоноси- кровливания темия в в РДСК В ИМ тельства до после спле- день обе-

спленэкто-мии ( (в дн.) нэктомин (в дн.) скровли-вания (в %)

I. 35 14 10-12 пала

2. 94 5 55-60 1:32 1:64

3. 109 6 55-60 1:64 1:128

4. 150 Н 1 55-60 1:32 1:64

5. 158 п 1 65-70 1:64 1:128

6. 180 8 55-60 1:32

г» 270 15 10-15 ниже 1:4

8. 270 15 10-12 ниже 1:4

Таким образом, поставленный нами опыт показал, что для получения высокой паразитемии (55-7С#) и высоких титров нутталлчйннх антигенов (1:32-1:64) лошадей необходимо сплензктомировать после 3-б-меся«ного нутталлионосительствп.

3.3. Способ приготовления позитивной и негативной сыворотки..

Для титрования антигенов и постановки реакции были необходимы позитивная и негативная сыворотки. Для этого на 15-25 дни после заражения лошадей нутталлиозом, когда титры антител в сыворотке крови достигали 1:40 и выше, у животных брали кровь для приготовления г< ПОЗИТИВНОЙ сыворотки. Титры сывороток, характеризующие их активность, и антикомплементарные.свойства определяли в РДСК с использованием стандартизированной серии нутталл-ийного антигена. Приготовленные серии положительных сывороток крови лошадей были высокоактивными и неантикомплементарными ' (№1 и 4 - 1:40 до 1:80, 2 и 5 - 1:20 до 1:40, 3 - 1:20). Негативные сыворотки крови лошадей также не обладали антикомпле-

ментарными свойствами.

С целью длительного сохранения нутталлийный антиген, о также необходимые для реакции сыворотки высушивали таким же образом, как и при анаплазмозе. Высушенные антиган и сыворотки заново титровали в РДСК. Положительные сыворотки сохраняют свою активность в течение 3-х лет, а антигены - до 10 лет при хранении их в холодильнике при температуре +4° С (срок наблюдения).

3.4. Разработка метода иммуноферментного анализа при нут-таллиозе лошадей. - !

Режим,постановки ИФА был аналогичен.. тому, который разработан нами при диагностике анаплазмоза рогатого скота. Приготовлено 6 серий коньюгатов. Титрацию коныогатов проводили с нут-таллийным антигеном, положительными и отрицательными сыворотками лошадей, а также в качестве контроля использовали сыворотки крупного рогатого скота и кроликов. Титры коныогатов колебались от 1:160 до 1:2560 (I и 6 серии - 1:160, 2 - 1:320, 4 - 1:640, 3 - 1:120 и 5 - 1:2560) и были специфичны т.к. не давали положительных результатов с отрицательными сыворотками крупного рогатого скота и кроликов.

Специфичность метода ИФА подтверждена при исследовании сыворотки крови лошадей больных случной болезнью или ринопневмо-нией. Ни в одном случае эти сыворотки не реэгировали с нуттал-лийным антигеном в ИФА.

Опыты проводились совместно со ст. науч. сотр. В.В.Петровским и С.Н. Малышевым.

Отработку режима постановки ИФА, а также определение диагностического титра проводили на сыворотках крови от экспериментально зараженных нутталлиями лошадей, а также на сыворотках крови, поступивших из различных хозяйств страны. Установлено, что диагностическим титром в ИФА является разведение сыворотки 1:50 и 1:100.

Активность антигенов изучали в РДСК и ИФА. В РДСК титры нутталлийных антигенов были 1:32 и 1:64, в ИФА 1:64 и 1:128. Таким образом показатели, полученные в ИМ в два раза выше, чем в РДСК (табл.; 16).

3.5. Динамика антителогенеза и паразитемии при нутталлиозй лошадей.

При исследовании сыворотки крови от экспериментально зараженных нутталлиозом лошадей комплементсвязывающие антителе выявляли в период мевду 15-20 днями после заражения, в то время как иммуноферментным методом антитела обнаруживали на 10-15 дней раньше в титрах от 1:100 до 1:400. В последующем, когда титры антител в РДСК были от 1:40 до 1:160, в ША они выявлялись в титрах от 1:1600 до 1:3200 ( на 65-й и 60-й день после заражения). Затем пик антител снизился и на 105 день их уровень в РДСК был от 1:10 до 1:20, в IKA от 1:_200 до 1:400 (табл. 17).

Табл. 17

Динамика накопления антител выявляемых с помощью ИФА и РДСК и паразитемия у экспериментально яаравенных лошадей

Дни после заражения

пп

Титры антител

В РДСК

'Паразитемия

--------1

В ИМ !

I. До заражения

2. 15 дней после заражения - I 100 4

3. 20 п п IS. I 400 4

4. 41 11 ft 1:20 I 400 +

5. 55 ff t! I МО I 800 +

6. 60 И Н 1:160 I 3200 +

п 65 И Ч 1:80 I 1600 a.

о и. 105 t» »f 1:20 I 200 +

Параллельно с исследованием сыворотки крови в ИМ и РДСК проводили микроскопирование мазков крови для установления сроков появления нутталлий в периферической крови. Обнаружение паразитов не совпало с появлением антител. Путталлиив мазках периферической крови стали появлялся на 5-й день после заражения, а антитела на 10-15 дней позже.

Л.б. Сравнительное изучение чувствительности двух серологических реакций - ИМ и РДСК при нутталлиозе лошадей.

Еысокая чувствительность и диагностическая ценность метода . ИЗА вытекает из экспериментальных данвдх, полуденных при исследовании лошадей - нутталлионосителей, находящихся в опытах по

их санации от возбудителя различными химиотерапевтическими препаратами (проводили на 8 естественно переболевших лошадях и 3-х носителях возбудителя после заражения кровью). Для санации использовали: диамодин, его липосомную форму (ВПМИ), буталекс (английской фирмы "Купере") и полимерный комплекс азидина (ИНХС АН СССР).

Под обработкой диамидином находились б лошадей, принадлежащих Московскому Центральному ипподрому (2) и Московскому госцирку (4). НУ'таллионосительство у них установлено серологически с помощью РДСК и ИМ.-

Лппосомным диамидином обработано 2 лошади из Московского Центрального ипподрома. Диэмидин вводили 4-кратно с интервалом 72 часа внутримышечно в области шей, в 10%-ном растворе, в дозе 5 мг/кг.

После введения диамидина почти у всех лошадей имело место появление симптомов колик, особенно выраженное у цирковых лошадей, снятие которых осуществляли введением 2 мл 1% сернокислого атропина.

Последующий серологический контроль (РДСК и ИМ) показал, что у некоторых лошадей вдет снижение титров комплементсвязыва-ющих антител, вплоть до полного их исчезновения. Однако ИМ в этих случаях всегда давал положительные результаты.

Под обработкой буталексом находились 2 лошади, нутталлионо-сительство у которых после экспериментального заражения составля-я ло 5 месяцев. Буталекс вводили внутримышечно в область шеи 4-кратно с интервалом 72 часа, в дозе 5 мг/кг, т.е. в два раза больше, чем рекомендуется для лечения тейлериоза«.

Последующий серологический контроль показал, что у одной лошади отмечалась отрицательная реакция в РДСК через 1-3 месяца после курса инъекций; у другой - комплементсвязывающие антитела снизились до минимума (сомнительная реакция). Однако через 5 месяцев обе лошади были серопозитивными в РДСК. В то же время на протяжении всего периода наблюдения после окончания курса иньекций бутолекса обе лошади были серопозитивными в ИМ, что также как и в опыте с диамидином, указывает на отрицательный результат при применений для санации буталекса.

Отрицательный результат санаций. от нутталлий был также получен и при применении полимерной формы азидина. Препарат применялся двукратно с интервалом б суток в дозе 5 мг/кг (табл. 18).

'Каждая инъекция сопровождалась угнетением, отказом от корма,

Таблица "18

Результаты исследования лошадей-нутталишоносктелей в РДСК и ИФА до и после лечения их разными протквопротозойными препаратами

Шетшод ,нуттал-'лионо-ша-!ситель-

ди 'СТБа Аа -перед

¡лечением

Результатычисслед0ваний!лечебный '• серологический контроль

лечена* , ,-'Биологический

микроскопия ^япарат ! р^'сс^ж

7®А мяяйя ттоии -еаняпки ' чеРез иес- ' ! чеРез иес-' ! ицд, биопро-

- ба) или

^^¡^з з 45! МКФ0СК0П11Я

РДСК ИФА мазка крози•санации 1*5 1"Ю0 ка КУ?- !

нутталлий ,таллий

! I 2

I 4 - . 4+ + Диамидин - - - - 4+ 4+ 4+ 4+ спленэктомия положительная паразитемия 12 %

2 4 - 4+ + Липосомный диамвдин - - - - 3+ 3+ 2+ 2+ биопроба полояительн.

3 4 + 2+ - - - + - 1+ 3+ 3+ 4+ биоцроба полсжительн.

4 неизв. 4+ 4+ + Диамидин 3+ - - + 3+ 3+ 3+ 2+ не обнаружены

5 4+ ' 4+ + Диамидин 3+ - + ± 3+ 2+ 4+ 3+ не обнаружены

5 19 — 2+ + Тршафла- бин — — — 0 4+ 0 2+ 0 в мазках нутталлии

? 5 3+ 4+ + Буталекс — + — 2+ 4+ 3+ 0 4+ в мазках нут таллзш

Обозначения: 4+, 3+, 2+ - положительная реакция; 1+, + сомнительная; 0 - не исследовали

-50-

болезненностьюв области введения.

Таким образом, ни один из четырех препаратов, использованных для дезинвазии лошадей от нутталлий."| не дал положительных • результатов. Использованные для дезинвазии нутталлионосителей от возбудителя химиопрепараты (полимерный комплекс азидина, ди-амидин, липосомный диамидин и буталекс) не дали положительных результатов. Поставленной биопробой было подтверждено, что лошади являются носителями.

37. Результаты выборочных'серологических исследований на нутталлиоз .лошадей в Российской федераций, странах СНГ и Прибалтики .

Начиная с 1989 г. необходимый материал был доставлен из! хозяйств различных областей и республик РФ, стран СНГ, Прибалти.Ч. ки (табл. 19 и 20).

Табл. 19

Результаты серологических исследований на нутталлионосительство лошадей в Российской федерации

№ Наименование областей, Кол-во Положительные

краев, республик проб РДСК % ИМ

I. Москва и Московская

область 3393 580 17,0 1456 42,9

2. Ростовская область 3776 650 17,2 1678 44,4

3. Ставропольский край 1523 264 17,3 653 42,8

4. Краснодарский край 292 50 17,1 117 40,0

5. Рязанская область .40 6 15,0 10 25,0'

6. Воронежская область 345 59 17,1 118 34,2

п Калининградская область 74 - - - -

е. Ка лмнкия 48 8 16,6 20 41,6

о. Татарстан 56 9 16,0 24 42,8

9493 1636 17,2 4076 42,9

Как видно из табл. 19 исследования проводили двумя методами - РДСК и ИМ. Всего в Российской Федерации исследовано 9498 пробы сыворотки крови лошадей. При этом комплемчнтсвяэывающие

антитела выявлены в 1636 пробах (17,2^), в то время как в ИМ положительно реагировали 4076 проб - (42,9%). Наибольший уровень нутталлионосительства выявлен в Ростовской области (44,4%), в Мбскве и Московской области (42,9%)I в Ставропольском крае (42,0%) и Татарстане (42,7%).

В Российской федерации, странах СНГ и Прибалтики всего исследовано 12489 проб сыворотки крови лошадей (табл. 20).

Табл. 20

Результаты серологических исследований на нутталлионоситольство лошадей в Российской Федерации, С1Г и Прибалтики

те Наименования стран Кол-во Положительные

проб РДСК г* ША %

I. Российская Федерация 9493 1636 17,2 4076 42,9

2. Украина 1392 83 6,9 245 17,6

3. Белоруссия 169 25 14,7 52 30,7

4. Казахстан 34 2 5,8 4 П,7

5. Узбекистан 36 22 61,1 30 83,3

6. Туркменистан 89 52 58,4 72 80,8

7. Азербайджан 25 I 4,0 3 12,0

8. Киргизия 13 - - - -

9. Грузия 53 6 11,3 13 24,5

10. Латвия 371 24 5,4 63 16,9

II. Литва 83 0 9,6 II 13,2

12. Эстония 673 29 4,3 68 10,1

13. Молдова 0 I 12,5 2 25,0

12439 1889 15,1 4639 37,2

Как видно из табл. 20, в сыворотке крови лошадей комплемент-связывающие антитела выявлены в 1889 пробах (15,1%)., в то время как в И5А положительно реагировали 4639 проб (37,2%). Наибольший процент нутталлионосительства выявлен в Узбекистане (03,3' ), в Туркменистане (80,8) и Российской федерации (42,9).

Таким образом, сравнительной оценкой двух серологических методов диагностики нутталлиоза лошадей установлено, что метод ИФА выявляет на 22,1% больше нутталлионосителей, чем РДСК.

По материалам проведенной работы Главным управлением ветеринарии МСХ утверждено "Временное наставление по применению на-

бора компонентов для диагностики нутталлиоза лошадей в реакции иммуноферментного анализа (ИМ) в порядке производственного * опыта).

В настоящее время, согласно инструкции ГУВ Министерства сельского хозяйства, весь экспорт лошадей осуществляется под серологическим контролем^пироплазмидозы в лаборатории протозоологии ВИЭВ автором,

выводи

1. Разработан метод приготовления высокоактивных антигенов для серологической диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец, состоящий из получения высокой (до 60-98%) паразитемии анаплазм у животных-доноров посредством введении им после спле-нэктомии 15.10^-14.10^ анаплазм/животное • или спленэктомии животных - анаплазмоносителей спустя 120 дней после их заражения. Получение высокой паразитемии первым способом является более технологичным, т.к. требует меньше времени.

2. A.ovts и д,marginale имеют общие антигены, что позволяет использовать антиген из возбудителя анаплазмоза овец для серологической диагностики анаплазмоза как крупного рогатого скота, так и овец. На основании этих донных разработан и внедрён набор компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК с одним антигеном из A.ovis

3. В экспериментах и широких производственных испытаниях установлена специфичность U высокая диагностическая эффективность РИГА при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец,(выявляет на 11,7?- больше больных и переболевших живитных чем в РДСК).

4. Разработаны оптимальные параметры постановки имчунофер-ментного анализа (ИФА) для диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота и овец.

5. Сравнительное изучение диагностической ценности трёх серологических реакций (ИМ, РИГА и РДСК) при экспериментальном анаплазмозе овец показало, что ИМ выявляет антитела у животных спустя 12-13 дней после введения возбудителя,- в то время как РИГА - 13-18,'а РДСК - 18-23 дня.

6. Наиболее чувствительным методом серологической диагностики анаплазмоза крупного рогатого скота является ИМ. С помощью этого метода антитела у экспериментально зараженных телят выявляют на 10 дней раньше, чемвРДСК и на 5 дней раньше, чем в .

РНГА.

7. Штаммы АРаг81-Г1а1е , ввделенные в Узбекистане, Калининградской области и Ставрополье не различаются по серологической активности приготовленных из них антигенов, что,Позволяет использовать любой из них для серологической диагностики анаплазмоза на Юге и Западе России.

е. Найвысиий уровень анапяазмоноситеяьства у овец в России выявлен в Ставропольском крае - 35,6% положительных проб из 645 исследованных, в Саратовской области - 35,6? из 1802 и в Дагестане - 31,из 899; у крупного1, рогатого скота - в Рязанской области - 20,2$ из 413, в Новосибирской - 19,4!? из 72, в Калининградской - 15,8$ из 5831.

9. Реакция иммуноферментного анализа является более чувствительным серологическим методом диагностики анаплазмоза рогатого скота, выявляя на 26,7$ больше больных и недавно переболевших животных, чем в РДСК и на 15,больше чечвРНГА.

10. Длительное (около года) анаплазмпносительство у крупного рогатого скота выявляется с помощью реакции иммуноферментного анализа на 83% больше, чем в реакции длительного связывания комплемента и гемагглютинации.

11. Нутталлионосительство встречается в России, Украине, Белоруссии, Казахстане, Туркменистане, Узбекистане, Грузии, Молдове, Латвии, Литве и Эстонии. Наибольшее количество лошадей-нут-таллионосителей выявлено в Узбекистане - 83,3^ положительных проб из 36 исследованных, в Туркменистане - 80, из 89 и Р5 -42,9^ из 9493 соответственно. Наибольший уровень нуттпллионоси-тельства у лошадей в России выявлен в Ростовской области - 44,4^ положительных проб из 3776 исследованных, в Москве и Московской области - 42,9$ из 3393, в Ставропольском крае - 42,8? из 1523,

в Краснодарском крае - 40,1? из 292, в Рязанской области - 25, СЙ из 40, Воронежской области - 34,из 345, в Калмыкии - 41,из 48, в Татарстане - 42,8?* из 56.

12. С помощью реакции иммуноферментншианализа выявляют на 22,1? больше нутталлионосителей, чем реакцией длительного связывания кииплемерта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По результатам проведенных исследований" разработаны норма'-

типно-техническая документация и рекомендации, отраженные в следующих документах:

I. Технические условия на набор компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в РДСК, утвержденные Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР, 6 апреля 1988 г.

Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции длительного связывания комплемента (РДСК), утвержденное Главным управлением ветеринарии Госагропрома СССР б мая 1988 г.

3.; Временная инструкция по изготовлению и контролю набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогятого скота в РДСК (на опытную партию)»утвержденное директором Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветпрепаратов Госагропрома СССР 27 июля 1987 г.

4. Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики анаплазмоза рогатого скота в реакции иммунофер-ментного анализа (ИМ) (в порядке производственного опыта), утвержденное Главным управлением ветеринарии Государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам I декабря 1989 г.

5. Временное наставление по применению набора компонентов для диагностики нуттаялиоза лошадей в реакции иммуноферментного анализа (ИМ) (в порядке производственного опыта), утвержденное Главным управлением ветеринарии Государственной комиссии Совмина СССР по продовольствию и закупкам I декабря 1989 г.

6. Материалы диссертации включены в "Методические рекомендации по изучению и разработке мер борьбы с протоэойными болезнями животных", утвержденные секцией "Паразитологии и инвазиозных бо-' лезней" отделения ВАСХНИЛ, Москва, 1984 г. и в информационный лист №32-87 об эффективности диагностики анаплазмоза овец.

П П И С О К

основных работ, опубликованных по материалам диссертации.

1. Георгиу X. Серологическая диагностика анаплазмоза у овец //МВА. Сборник научных трудов. Т. 116, 1980, С. 72-76.

2. Георгиу X., Кердзая П.?. Антигенная специфичность ана-плазм в серологических реакциях //Бюллетень ЕЙЭВ, М., 1982, 48 С.

3. Георгиу X. Комплементсвязывающие антитела и паразитемия у овец при анаплазмозе //Труды ГИ?В, М., 1982, 55. С. 95-98.

-554. Георгиу X., Казаков H.A., Родин С.Д., Кердзая П.Э. Серологическая диагностика анаплазмоза рогатого скота //Труды ВИЭВ, М., 1983, 57. С. 77-81.

5. Георгиу X. Динамика антител и лечебние свойства сыворотки крови овец при экспериментальном анаплазмозе (Д.Ovis ) //Труды'ВИЭВ, М., 1983, 57. С. 35-42.

6. Георгиу X« Изучение динамики комплементсвязывающих антител у интактных и спленоктомированных овец. Патология органов дыхания и пищеварения сельскохозяйственных животных /ДША, М., 1983.С. 77-78. - >-

7. Артшин С.К., Забережный А.Д., Георгиу X., Родин С.Д., Кердзая П.Э. Нуклеотидный состав и гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК А.marginale //Тезисы докладов Всесоюзного семинара -совещания, Самарканд, 1983. С.72-75.

8. Георгиу X. Серологические реакции при экспериментальном анаплазмозе кроликов.//Бюллетень ВИЭВ, И., 1983, 50. С. 82-83.

9. СтепановаН.И., Георгиу X. Иммуноферментный анализ (ELISA) при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец /Дезисы докл. Всесоюзного семинара-совещания, Самарканд, 1983. С. 71-73.

10. Георгиу X. РИГА и РПГА при анаплазмозе крупного рогатого скота и овец // Тезисы докл. Всесоюзного семинара-совещания, Самарканц, 1983. С. 68-69.

11. Казаков H.A., Георгиу X. Приготовление анаплазменннх антигенов и факторы,•влияющие на их серологическую активность //Тезисы докл. Всесоюзного семинара-совещания, Самарканд, 1983. С. 67-68.

12. Сахимов М.Р., Георгиу X. Видовой состав и диагностика кровйпаразитов крупного рогатого скота Вахшской долины // Душанбе, 1984. С. 32-36.

13. Георгиу X., Зиневич JI.A. Дисперсный анализ эритроцитов с помощью электронного счетчика при анаплазмозе овец // Труды ШЭВ, М., 1984. С. 96-98.

14. Георгиу X. РДСК, РДП и РИГА (РИГА) при окспериментальг1 ном анаплазмозе кроликов //Труды ВИЭВ., М., 1984, т. 60. С. II7-I20.

15. Степанова Н.И., Петровский ' .В., Заблоцкий В.Т. Казаков H.A., Мутузкина З.П., Родин С.Т., Георгиу X., Малышев С.Н., Бур-ба Г.Л. Методические реком^ции по изучению и разработке мер борьбы с протозойным болезнями животных. Москва, 1984, 59 с.

-5616. Георгиу X. Сравнительная оценка ИМ и РДСК при анаплазмозе рогатого скота //Бюллетень ВИ?В М., 1985, 58. С. 52-54.

IV. Георгиу X. Сравнительное изучение антигенной специфи- • чности A.oviÄ-- и А .marginale //Бюллетень ШОВ, М., 1985 , 57. С. 25-26.

1С. Георгиу X. Диагностикческая ценность ШВА и РИГА при анаплазмозе //Тезисы докл. и сообщений 1У сьезда ВОПР, 1987. С. 125-126.

19. Бычкова Л.В., Синев В.П., Георгиу X. Эффективность диагностики анаплазмоза овец -//Информационный листок f*i?32-87, 1987. С. 2.

20. Георгиу X., Степанова H.H. Серологические реакции для диагностики анаплазмоза // I. "Ветеринария", М., 1987, № 5 С. 43-45.

21. Соколов М.Н., Рахматов H.A., Казаков H.A., Георгиу X. Особенности течения респираторных болезней овец, выэывающихаас-социацией вирусов, риккетсий и бактерий //Пленум секции научного совещания по проблеме охраны природы Отделения общей биологии АН СССР, Витебск, 26-28 сентября 1988 г.

22. Родин С.Т.., Георгиу X. Экологическая взаимосвязь анаплазмоза диких и домашних животных //Тезисы докладов XII Всесоюзной конференции по природной очаговости болезней, Новосибирск , 1989. С. 170.

23. Георгиу X., Петровский В.В., Малышев С.Н. (ELISA - -тест)- чувствительный и специфичный метод диагностики нутталли-оносительства у лошадей //JK. "Ветеринария" М., 1990, С. 36-38.

24. Тимофеев Б.А., болотин И.М., Степанова Л.П., Богданов A.A., Георгиу X., Малышев С.Н., Петровский В.В., Клибанов А.Л.,, Торчилин В.П. Липосомняя форма диамидина: снижение токсичности //К. "Антибиотики и химиотерапия", М., 1991, № 9 т. 36. С. 34-36.

25. Георгиу X. Метод иммуноферментного анализа (И'М) для диагностики нутталлиоза //Витебск, Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии, 1993. С. 85-86.

26. Малышев С.Н. Георгиу X. Попытка освобождения организма лошадей от нутгаллий с помощью буталекса // Актуальные проблемы медицинской и ветеринарной паразитологии, Витебск, 1993. С. 92-93.