Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Выделение и изучение свойств супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение свойств супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae"

< о №

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ И МЕДИЦИНСКОЙ ПРОМЫШЛЕННОСТИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ

АКАДЕМИЯ

На правах рукописи

ДРОЗДОВА ЮЛИЯ ИГОРЕВНА

Выделение и изучение свойств супероксидцисмугазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей БассЬагошусез

сегеу1з1ае.

03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена на кафедре биотехнологии Санхт-Петсрбургской Государственной Химкко-Фармацезтической Академии и в лаборатории биохимии ГосНИИ Особо Чистых Биопрепаратов.

Научные руководители:

доктор биологических наук, Е.П. Яковлева профессор

кандидат химических наук, И.В.Чурилова старший научный сотрудник

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор С.Н. Лызлова доктор химических наук, профессор АЛ. Селезнева

Ведущее учреждение: Институт Экспериментальной Медицины Российской Академии Медицинских Наук

Защита состоится " Л/Д^ргиС^ 1997 года в часов на заседании специализированного совета К 084.63.01 при СПХФА (197376, Санкт-Петербург, ул. Профессора Попова, 14)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке СПХФА

Автореферат разослан _1997 года.

Ученый секретарь спей кандидат биологических наук

Ученый секретарь специализированнргр совета.

Н.В. Кириллова.

Общая характеристика работы.

Актуальность проблемы:

В настоящее время проводятся интенсивные исследования по разработке и созданию лекарственных препаратов на основе супероксиддисмутазы (СОД)- ферментного препарата, обладающего широким спектром терапевтического действия (артриты, циститы, заболевания легких, печени, ишемия миокарда, лучевые поражения и т.д.).

Биологическая функция СОД связана с детокснкацией организма от потенциально опасных супероксндных радикалов, образующихся в норме и при различных патологических процессах. В состав лекарственных препаратов входит СОД из различных источников: эритроцитов печени быка, СОД, выделенная из бактерий, а также растительная СОД. Наиболее известым препаратом является Пероксинорм (Германия), содержащий СОД из печени быка. Применение его в клинике показало, на фоне несомненного терапевтического эффекта, наличие побочных аллергических реакций, что в нескольких случаях привело к анафилактическому шоку. Поэтому применение СОД, выделенной из эритроцитов человека, а также рекомбинантной СОД человека позволит существенно расширить терапевтическое применение лекарственных препаратов на их основе.

Противовоспалительная активность различных препаратов СОД отличается друг от друга и причины этих различий не ясны. Возможно, это связано с повреждающим действием активных форм кислорода, таких как гидроксильный радикал, гипохлорит, присутствующих в области воспаления. Эти молекулы могут атаковать и разрушать структуру экзогенной СОД, изменять ее активность и, соответственно, фармакологическую эффективность. Поэтому представляет несомненный интерес оценить причины различной окислительной устойчивости СОД, выделенных из разных источников.

Задачи исследования. Целью настоящей работы является разработка технологии выделения и очистки рекомбинантной СОД человека из дрожжей 8.сегет1ае и изучение свойств полученной СОД. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработка препаративного метода выделения и очистки супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей БассЬагоп^сев сегетаае У2134.

2. Изучение ее физико- химических свойств.

3. Изучение окислительной инактивации СОД из различных источн иков под действием гипохлорита.

4. Обоснование возможности использования выделенной СОД

для повышения лечебной ценности кисломолочных продуктов.

Научная новизна. Предложена схема выделения и очистки Си^п-СОД человека из биомассы рехомбинантного штамма дрожжей БассЬа-гошусев сеге\таае {разработан в институте Генетики микроорганизмов) на отечественных сорбентах (производство ГосНИИ ОЧБ), позволяющая достичь не только эффективного фракционирования и высокой степени очистки, но и обеспечить высокие выходы целевого продукта.

Изучен механизм инактивации рекомбинантной и эригроцитарной СОД человека гипохлоригом. Показано, что относительная устойчивость СОД к действию гипохлорита, по сравнению с другими ферментами антиокислительной системы клеток, связана с тем, что окислению подвергаются аминокислоты, не входящие в состав активного центра, а лишь опосредованно влияющие на активность СОД. Определены причины различий окислительной инактивации СОД человека и быка гипохлоритом. Установлена взаимосвязь между количеством цистеиновых остатков в молекуле СОД и ее устойчивостью к действию физиологических концентраций гипохлорита.

Практически значки?,

1. В работе экспериментально показано, что выход высокоочищенной рекомбинантной СОД человека с единицы биомассы дрожжей З.сеге^ае штамм У2134 более, чем на порядок превышает выход СОД с единицы эрнтромассы крови человека, что позволяет рассматривать указанный микроорганизм, как подходящий объект для создания на его основе технологического штамма СОД человека.

2. Указан подход к оценке терапевтической эффективности СОД из различных источников, основанный на сравнительном изучении инактивирующего действия физиологических концентраций гипохлорита на препараты СОД.

3. На примере разработанной рецептуры кисломолочного напитка, включающей рекомбинантную СОД человека, показана возможность использования СОД в молочной промышленности.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на международной конференции по свободным радикалам (Турция, Стамбул, 1995г.); на 8-й конференции международного общества по изучению свободных радикалов (Испания, Барселона, 1996г.); на международном конгрессе по охислительному стрессу и восстановительной регуляции (Франция, Париж, 1996г.); на мемориальной научно-практической конференции памяти проф. Р.И .Лившица (Челябинск, 1996г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 работ.

Структура и объем днбсертапии. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание

объектов исследования и методики экспериментов, изложение результатоз исследований и их обсуждение, выводов, списка цитируемой литературы, включающего /^ссылки, из них работ зарубежных авторов и приложения.

Работа изложена на страницах машинописного текста, содержит <Jp таблиц, рисунков.

Материалы и методы исследований.

Объекты исследования и материалы. В качестве объектов исследования использовали супероксиддисмутазу человека, выделенную из рекомбинактного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae Y2134 (рСОД), СОД из бычьих эритроцитов (6СОД) производства фирмы "Serva" (ФРГ); СОД из эритроцитов человека (чСОД) производства ГосНИИ ОЧБ (Санкт-Петербург).

В процессе работы использовали следующие сорбенты: солоза, Q-целлюлоза, сефароза-4р, С8-целлюлоза (октил-сфероцелл) (производства ГосНИИ ОЧБ); TSK G2000 SW (TOJO SODA, Япония).

Определение активности. Для определения активности СОД использовали спектрофотометрический метод, основанный на торможении реакции окисления кверцетина (Костюк В.А. и др., 1990). За единицу активности принимали такое количество СОД, которое ингибирует окисление кверцетина на 50%.

Для определения активности СОД использовали также люминесцентный метод, основанный на измерении ингибирования ферментом хемилюминесцентной реакции окисления люминола супероксидным радикалом, генерируемым в системе гипоксантин-ксантиноксидаза. За единицу активности принимали такое количество СОД, которое уменьшало интегральную интенсивность свечения контрольной реакции на 50%.

Аналитические методы. Для определения физико-химических и спектральных характеристик полученного фермента использовали ряд аналитических методов. Реакцию по определению активности спектрофотометрическим методом проводили в ячейках планшета для иммунологических исследований, показания оптической плотности снимали с помощью прибора Mikroplate Reader 3550 производства фирмы "Bio-Rad" (Австрия). Хемилюминесценцию измеряли на люминометре LKB 1251 фирмы LKB (Швеция). Для определения молекулярной массы белка проводили электрофорез с SDS в полиакрилимидном геле (Остерман Л А., 1981), а также ВЖХ на хроматографе Hewlett Packard НР1050, в качестве маркерных белков использовали овальбумин (45000), химотрипсиноген (25000), миоглобнн (17800), цитохром (12300). Для определения изоэлектрической точки использовали метод изоэлектрофокусировання, которое проводили на приборе Vagophor 11

(Эстония).

Разрушение клеточных стенок дрожжей Б.сеге^ае проводили с помощью лабораторной установки "Дезинтегратор для микроорганизмов" (ГосНИИ Особо Чистых Биопрепаратов).

Дсйсгрте гипрхдарита_на_СцДп-СОД. Концентрацию

гипохлорита измеряли спектрофотометрически (Е290=350 М-1см-1). Типичный эксперимент проводили следующим образом. В термостатированную при 37°С пробирку помещали определенный обьем запасного раствора фермента и буфера Хэнкса рН 7,4. Через несколько минут, когда температура смеси достигла 37°С, в раствор добавляли определенное количество гипохлорита. Сразу после добавления гипохлорита из пробирки отбирали нулевую пробу (0,1 мл). Реакцию останавливали немедленным разведением пробы дистилированной водой в 1000-20000 раз. Полученные разведения использовали для определения активности СОД. В дальнейшем, через определенные промежутки времени по ходу реакции отбирали 3-4 пробы и анализировали их на остаточную активность.

Модификацию остатков лизина с помощью ухсусного ангидрида и модификацию остатков аргинина с помощью фенилглиоксаля проводили по методике ОисМ А.(()ис!<1 А. е* а1., 1982).

О появлении модифицированных форм фермента судили по изменению заряда молекулы беяха, выявленное с помощью изоэлектрофокусирования (ИЭФ).

Модификацию иистеиновых групп иодацетамидом (1АА) проводили по методике (У/ахс1а1 МЛ. й а1., 1968; Сиге! F-R.NL, 1972).

Для определения числа ЗН-групп использовали методику (1апа1оуа I« а1., 1968), основанную на реакции с реагентом Эллмана.

Результаты и обсуждение.

1. Выделение и очистка Си^п-80Р человека из биомассы рекомбинантного штамма дрржжей 5ассЬагошусез сегеу»51ае.

Известно, что дрожжи являются подходящим, если не наилучшим реципиентом для экспрессии гена человеческой СОД, так как дрожжевая клетка обеспечивает Ы-концевое ацетилирование целевого белкового продукта. Рекомбинантную СОД человека выделяли из биомассы дрожжей Б.сегегагае, штамм У2134.

Методы выделения и очистки СОД микроорганизмов достаточно хорошо разработаны. От выбора метода разрушения клеггочной стенки дрожжей, в конечном итоге, зависит выход фермента. Наиболее распространенными методами является разрушение ультразвуком, гидравлический сдвиг, механическое разрушение в дезинтеграторе, лизис под действием щелочи или обработка ферментативными средствами. Для дальнейшей очистки широко применяют методы гель-фильтрации, ионообменной и аффинной

хроматографии и др.

Данные методические подходы и были положены нами в основу схемы очистки рекомбинантной СОД человека из биомассы дрожжей Б. сегеу!з1ае У2134.

Для разрушения клеточной стенки дрожжей нами выбран метод механического разрушения в дезинтеграторе, поскольку это один из наиболее доступных и экономичных способов. Так, применение этого метода позволяет с высокой эффективностью (90-95% разрушения клеточной стенки) обработать 1кг биомассы за 40 минут. Клеточные стенки удаляли центрифугированием при 10000 об/мин. Надосадочную жидкость использовали для дальнейшего выделения СОД. Известно, что Си.2п-СОД обладает такими уникальными свойствами, как высокая термоустойчивость, устойчивость к действию денатурирующих агентов, широкий рН-оптимум каталитической активности. Это позволило нам провести как термоинактивацию (50°, 120 мин.), так и рН-инактивацию части примесей. Эффективность этих двух независимых стадий обработки клеточного экстракта была примерно одинаковой (удельная активность возросла в 2 раза). Но поскольку следующим этапом очистки является ионообменная хроматография на кагионите солоза, рН сорбции на котором выбрано 4.2±0.1, то нами предложена следующая последовательность обработки после разрушения клеточных стенок: подкисление лизата до рН4.2 с целью отделения части примесных белков и подготовки клеточного экстракта к нанесению на катионит и отделение осадка центрифугированием при 10000 об/мин.

Следующий этап очистки- ионообменная хроматография на катионите солоза. Выбор данного носителя обусловлен его механическими характеристиками, позволяющими проводить разделение в колонках большого размера, а также сорбционными характеристиками. Профиль элюции СОД на катионите солоза представлен на рис. 1. РН

0 * ю 15 А/фракции

Рис.1. Профиль элюции СОД на катионите солоза. Элюэнт: 0.1М ^НР04. 1 - белок (Джо), 2- активность СОД, 3- рН.

Следует отметить, что эта стадия позволила отделить основную массу пигмента, содержащегося в экстракте дрожжевых клеток, а также значительно сконцентрировать СОД. С помощью этой стадии нам удалось повысить активность до 200000 Ед/мг, однако содержание примесных белков было еще высоким.

В качестве следующей стадии очистки нами предложена стадия ионообменной хроматографии на анионите О-целлюлоза. С помощью этой стадии нам удалось повысить активность до 420000 Ед/мг, количество примесей, по данным ВЖХ, составляет около 7%. Однако, нами поставлена задача, как можно более полно избавиться от примесей и получить высокоочищенный препарат. Для достижения этой цепи достаточно проведения аффинной или гидрофобной хроматографии.

Аффинную хроматографию проводили на металл-хелатном сорбенте сефароза-4{5. Выбор этого метода обусловлен наличием на поверхности белковой молекулы гистидиновых групп, которые обладают сродством с хелатными ионами металлов, в данном случае Си2* в результате чего и встраиваются в гель. С помощью этой стадии нами получен фермент с активностью 500000 Ед/мг и со степенью чистоты около 95-96% (по данным ВЖХ). Однако, при явных приемуществах, данный сорбент не является идеальным для промышленного получения высокоочищенного препарата рекомбинантнон СОД человека, поскольку процесс протекает при слишком низкой скорости и используется дорогой импортный сорбент. Поэтому, в качестве альтернативного пути, нами предложена стадия гидрофобной хроматографии.

Гидрофобную хроматографию проводили на отечественном сорбенте С8-целлюлозе (октил-сфероцелл). В результате этой стадии нам удалось повысить активность фермента до 550000 Ед/мг и довести степень чистоты препарата (по данным ВЖХ) до 98-99%. Фермент, полученный после конечной стадии очистки диализовали против воды при температуре 4° до проводимости 0.05-0.1 и лиофильно высушивали.

Выход СОД после конечной стадии очистки составляет 64% (табл.1). В результате нами получен высокоочищенный препарат, содержание примесей в котором по данным электрофореза и ВЖХ, не превышает 1% (рис.2,3).

Т.о. разработанная нами схема выделения рСОД позволяет получить препаративные количества высокоочищенного фермента, по своим характеристикам не уступающего лучшим отечественным и зарубежным аналогам. Кроме того, показано, что рекомбинантный штамм Б.сегел^ае У2134 является весьма перспективным продуцентом СОД человека, поскольку выход фермента с единицы биомассы более чем на порядок превышает количество СОД, получаемой с 1л эритромассы (табл.2). Разработанный применительно к СиДп-СОД человека из рекомбинантного штамма дрожжей Б. Сегеу15!ае У2134

Рис.2 Электрофоретическое разделение человеческой (1) и рекомбинантной (2) СОД в ПААГ с ЗОБ и р- меркаптоэтанолом; (3)-исходный раствор фермента.

Рис.3 Определение степени гомогенности супероксиддисмутазы с помощью ВЖХ.

Таблица !.

Очистка супероксиддисмутазы из рекомбннантного штамма дрожжей

Стадия счиспси Белок, мг ОСиря активность, Едх10-3 Удмькзя активность, Ед/мг Степень очистки Выход активности, %

Исходный раствор ({юрменте 295 19760 67000 1 100

рН-имактммция 110 15950 145000 2.2 81

Ионообменная хроматография накатионит» 78 15000 200000 3 76

Ионообменная хроматография наанионите 30 12600 420000 6.3 64

Аффинная хроматографии 23 11500 500000 7.5 58

Гидрофобная хроматография 23 12600 550000 8.2 64

методический подход, может оказаться эффективным и для выделения СОД человека из других рекомбинантных штаммов микроорганизмов.

2, Биохимические и физико-химические характеристики Си^п-БОР человека из рекомбинантного штамма дрожжей ЗассЬаготусев сегеутаае.

Биохимические свойства рекомбинантной и эритроцитарной СОД человека представлены в табл.2

Таблица 2.

Основные физико-химические характеристики чСОД и рСОД.

Уд. Активность, Ед/мг (слосгроф. метод) Молекулярная масса, Да Р1 Выход, г (с кг биомассыисл эритромассы)

рСОД 480000£20000 39000 4.9 3.5

чСОД 460000±20000 39000 4.9 0.05

Провели сравнительное изучение для чСОД н рСОД удельной активности (табл.2), изозлектрической точки (рис.4) и молекулярной массы (табл.2, рис.2,3). Показано, что активность составляет 480000±20000 Ед/мг (что соответствует 3800±200Ед/мг по методу восстановления цитохрома с), молекулярная масса равна 39000Да и изоэлектрическая точка- 4.9. Была изучена также термостабильнось (рис. 5), рН-стабильность (рис. 6) и спектр поглощения СОД в УФ и видимой областях (рис. 7). Как следует из приведенных данных, препараты СОД человека выдерживают высокие температуры (до 60°С), имеют широкий рН оптимум действия, спектр поглощения имеет 2

максимума: в области 2б0нм и широкий шах, обусловленный содержанием меди в молекуле СОД в области 620-680нм.

Т.о. нами показано, что физико-химические характеристики: молекулярная масса, температура. ИЭТ, удельная активность и рН-зависнмость, а также спектральные характеристики для рСОД и чСОД полностью совпадают.

I

Щ

.5 »9

Рис.4

Изоэлектрофокусирование раствора человеческой (1) и рекомбинантной (2) СОД.

1 2 "

-5,34 .4,7.

-4,4 -3,5

Р*

vf 120% х

i 100% о

80%

ё X 60% --

а 40% • 20% -

< 0% -

40 45 50 55 60 65 70 75 Э0 85 90 Температура, *С

Рис.5 Влияние температуры на активность рекомбинантной и человеческой СОД. Концентрация ферментов 1 Омг/мл, т=30 минут, 50шМ ФБ, рН7.6.

140% т ; 120%

£ 20%

0% I | ! I I |-| I- I -! 1Н-Н

5

8

11

рк

Рис.6 Влияние рН на активность человеческой и рекомбинантной СОД. Конц. СОД=Юмг/мл, 1=25сС, т=1час, 50тМ буферные растворы (цитратный, цитрато-фосфатный, фосфатный, 2-амино-2-метил-1-пропанол НС1 и др.).

Рис.7 Спектр поглощения 1% водного раствора чСОД и рСОД в УФ и видимой областях.

3. Изучение действия гипохлорита на Си.2п-С0Д.

При определении возможных причин различной терапевтической эффективности препаратов СОД из разных источников, мы исходили из того, что одним из главных показателей противовоспалительной эффективности является способность СОД сохранять каталитическую активность в очаге воспаления. Была изучена окислительная инактивация и структурная дезорганизация рекомбинантнон СОД человека, эритроцитарной СОД человека и быка под действием НОС1, генерируемого ферментативной системой полиморфноядерных

¿&0 320 нт

600

Ш длина Ва/мь/, /■

лейкоцитов: мислоперсжсидаза- перекись Еодорода- хлорид. Гипохлорит считается одним из наиболее токсичных физиологических оксидантов, концентрация которого в очаге воспаления достигает -ЮОмкМ.

Инкубация ч.р и 6СОД с ImM гипохлорита (рис.8) приводит к значительной потере активности и в одном и в другом случае, причем для ч и рСОД остаточная активность после 5 минут инкубации составила -50%, а для рСОД только 10%. Очевидно, что и ч и р СОД более устойчивы к инактивирующему действию НОС!, чем 6СОД. Это подтверждается также результатами по инактивации СОД различными концентрациями ИОС1 (рис.9). Небольшие концентрации гипохлорита (до 200мкМ) приводят к значительной потере активности 6СОД, и в гораздо меньшей мере к инактивации ч и рСОД. Увеличение количества гипохлорита уменьшает разницу в остаточной активности.

Потеря активности СОД, несомненно, связана с модификацией ее структуры. Одним из проявлений окислительной модификации СОД является уменьшение числа аминогрупп, доступных титрованию трннитробензосульфоновой кислотой (ТНБС). Чнсло титруемых аминогрупп уменьшается с увеличением концентрации гипохлорита, хотя следовало ожидать увеличения, поскольку в молекуле СОД имеется 20 лизиновых и 8 аргининовых остатков, а доступно титрованию в нативной молекуле всего 4-5 аминогрупп. Видимо, это связано с окислением аминогрупп гнпохлоритом, которое протекает в белках весьма активно и приводит к образованию альдегидов (Clark R.A. et al., 1986). При увеличении концентрации НОС1 до 400мкМ и выше количество титруемых аминогрупп достигает минимума и остается постоянным. Вероятно, происходит разворачивание белковой глобулы, экспонирование ранее недоступных для титрования ТНБС аминогрупп, часть которых не окисляется. Изменение конформации белка и разворачивание глобулы могут происходить не только за счет прямого действия НОС1, но и вследствие вторичных реакций образовавшихся альдегидов с ближайшими аминогруппами. Продукты подобных реакций, шиффовы основания, однозначно идентифицируются по флуоресценции белка в длинноволновой области спектра (400нм). При окислении СОД гнпохлоритом наблюдается появление длинноволновой флуоресценции, интенсивность которой возрастает с увеличением степени окисления.

Наблюдаемое уменьшение доступных аминогрупп должно быть сопряжено с уменьшением заряда белка. Изоэлектрофокусирование нативного и окисленного ферментов показывает, что у окисленного белка заряд становится более отрицательным и появляются отдельные модифицированные формы СОД, обладающие иными изоточками. Сдвиг рК. для модифицированных форм чСОД и рСОД по сравнению с натнвной молекулой составляет 0,3-0,4 единицы рН, а для 6СОД 1,0 -1,1. При изоэлектрофокусировании продуктов окислительной инактивации

мы наблюдали следующую картину: 6СОД в большей степени подвергалась структурной дезорганизации, чем Ь и гСОД. Одним из возможных объяснений различной устойчивости 6СОД и чСОД к действию НОС1 является различие в количестве положительно заряженных аминокислот (лизин, аргинин), окисленных НОС1. Число лизиновых остатков в молекулах 6СОД и чСОД одинаково и равно 20-22 (Баууаёа У. е! а1., 1972), однако их пространственная доступность различна, и если для ССОД число аминогрупп, доступных титрованию ТНБС равно 8, то для чСОД их только 4. Структурные модификации проявляются как в деградации полипептидной цепи, так и в образовании высокомолекулярных агрегатов. Все модифицированные формы при этом, проявляют каталитическую активность.

а? 120% - 100% £ ео%

5 40% - ■ 4

-ч.рСОД 6СОД

20% X t

-S-J-—i

I •• T 1 -I Tf

0 2,5 5

10 15 20 Время, мин

25 30

Рис.8. Кинетические кривые инактивации чСОД, рСОД и 6СОД при действии гипохлорита.

О 50 100 200 300 [НОСЦдвкМ

Рис.9. Инактивация чСОД, рСОД и 6СОД при действии гипохлорита. Концентрация чСОД и .рСОД- 2.7мхМ(1), 6СОД- З.ЗмкМ(2). Доверительный интервал определен при 5% уровне значимости.

4. Влияние поверхностных SH-групп на чувствительность фермента к действию окислителя.

Одним из возможных объяснений различной устойчивости чСОД и рСОД по сравнению с 6СОД к действию КОС! является наличие дополнительного цистёинового остатка (Cyslll) у чСОД. Известно, что Cys и Met окисляются гипохлоритом со скоростью в 100 раз большей, чем остальные аминокислоты. Нами показано, что при инкубации чСОД и рСОД с небольшими концентрациями НОС1 (50мкМ), не приводящими к изменению активности, наблюдается значительное уменьшение содержания доступных SH-групп (рис.10). При дальнейшем увеличении количества HOCI уменьшение содержания SH-групп не столь велико, как в начальный момент, что, по видимому, связано с изменением конформации молекулы СОД и определению "замаскированных" SH-групп Cys6. Кроме того, модификация чСОД и рСОД IAA по SH-группам приводит к уменьшению окислительной стабильности ч,рСОД в отношении НОС! (рис.11). Очевидно, Cysl 11 в ч и рСОД выполняет роль ложной мишени или ловушки для гипохлорнта и, тем самым, способствует сохранению каталитической активности ч и рСОД.

Исходя из приведенных данных можно сделать предположение о первой стадии окислительной инактивации ч и рСОД. Гипохлорит, прежде всего, действует на поверхностные SH-группы, что приводит к уменьшению количества HOCI, достигающего активного центра ч и рСОД и, соответственно, большей устойчивости фермента по сравнению с СОД из других источников, в молекулах которых не содержатся дополнительные остатки цистеина.

Т.о. свободные цистеиновые остатки играют значительную роль в процессе инактивации СОД гипохлоритом и содержание или отсутствие этих групп является одной из причин различной окислительной устойчивости СОД, выделенных из разных источников.

120% г

0% —|—|—I—|—I—I—|—I—|—I—I—I—(—I—I—(

О 100 200 300 400 500 600 700 800 [НОСЦ, мкМ

Рис.10. Изменение содержания SH-групп (1) и активности (2) чСОД и рСОД [50 мкМ] под действием гипохлорита.

О 50 100 200

[НОСЦ, мкМ

400

-Наивная ч,рСОД

А - -Модифицированная по вн-фуппам ЧрСОД

Рис.11. Инактивация нативной и модифицированной по БН-группам чСОД и рСОД при действии гипохлорита.

5, Роль ?лшррстатичеш« шнмадгейсгеий р прочтем окищгши>нрй модификации СОД гашыгоритом,

Среди ферментов антиокислительмой системы клеток (СОД, ' каталаза, глутатионпероксидаза) СОД обладает наибольшей устойчивостью к действию гипохлорита. Нами показано, что отличительной чертой окисления СОД (и бычьей и СОД человека) гипохлоритом, является сохранение каталитической активности у окислительно модифицированных структур СОД, что свидетельствует о недоступности активного центра для СЮ", несмотря на значительные изменения белка в целом. При рассмотрении причин инактивации СОД гипохлоритом необходимо исключить окисление аминокислот в активном центре, а наблюдаемые изменения, вероятно, связаны с окислительной модификацией других аминокислотных остатков, не менее важных для катализа.

Наиболее вероятными кандидатами являются остатки Ьуз120,134 и Агд143 (для аминокислотной последовательности 6СОД) и Ьуз122,136 и А^141 (для чСОД), т.к. имеено эти остатки образуют положительно заряженный пространственный кластер, ориентирующий 02" относительно активного центра. Благодаря такой конформации обеспечивается усхорение прохождения 02'" к активному центру, что способствует протеканию реакции дисмутации в диффузионном режиме.

При увеличении ионной силы каталитическая активность бычьей, а также человеческой и рекомбинантной СОД падает, что связано с экранированием зарядов лизинов и, соответственно, уменьшением

степени пространственной координации 02" относительно активного центра. При повышении ионной силы активность окисленного фермента возрастает (рис.12) и при больших концентрациях солей приближается к активности нативного фермента. Можно предположить, что при окислении СОД модифицируются остатки, контролирующие электростатический этап реакции дисмутации 02~, т.е. лизины 122 и 136.

Для выяснения роли аминокислот, определяющих электростатический этап катализа, т.е. остатков лизина и аргинина, исследовали модифицированные по этим остаткам образцы. Следует отметить, что модификация СОД вызывает снижение активности, в частности, ацетилирование лизинов уксусным ангидридом уменьшает активность до 15%, а обработка фенилглиоксалем до 10%. Кроме того, модификация приводит к различной чувствительности фермента к инактивирующему действию НОС! (рис.13). СОД, модифицированная по остаткам лизина, слабо инактивируется при действии гипохлорита. Дополнительным подтверждением основной роли Lys в окислительной инактивации СОД гипохлоритом служит заметная потеря активности фермента, модифицированного фенилглиоксалем по Argl43, т.е. оставшиеся незакрытыми остатки Lys взаимодействуют с НОС1, что и приводит к потере активности.

0,1 0.2 0,3 0,4 Молярность фосфата, M

-Ф— Натавная ч,рСОД ■it - - Окисленная ч.рСОД

Рис.12. Влияние ионной силы на нативную (1) и окисленную (2) чСОД и рСОД (2,7 мхМ).

Таким образом, при действии гипохлорита на СОД остатки лизина, в том числе остатки 122 и 136, являются наиболее вероятными мишенями, и окисление аргинина является маловероятным событием, то есть меняется структура начального участка канала, формирующего направленный поток 02~ к активному центру фермента.

При подобном механизме действия гипохлорита активный центр

50 100 [НОС1], мкМ

—-Ф-ч.рСОД

модифицированная уксусным ангидридом

-ч.рСОД

модифицированная фвнилглиокгалэм

—в — Нативная ч,рСОД

200

Рис.13. Влияние гипохлорита на нативную СОД (1), на СОД, модифицированную уксусным ангидридом (3), и на СОД, модифицированную фенилглиоксалем (2). Данные для чСОД и рСОД совпадают.

не затрагивается, а окислению подвергаются аминокислоты, опосредованно влияющие на активность (в частности, определяющие дальний порядок электростатических взаимодействий). Окисление аминокислот, удаленных от активного центра, изменяет физико-химические параметры, в частности, электрофорез ическую подвижность, что приводит к появлению форм белка со свойствами, отличными от нативной молекулы, но обладающих активностью.

6. Обоснование возможности использования выделенной рекомбинантной СОД человека для повышения лечебной ценности кисломолочных продуктов.

Медицина не является единственной областью, в которой СОД находит применение, это и пищевая и косметическая промышленность. В своей работе мы показали, что СОД, включенная в состав кисломолочного продукта может выступать в качестве антиоксиданта: установлено стимулирующее влияние супероксиддисмутазы на развитие лактобактернй. Определена оптимальная концентрация фермента, равная 0.012% от объема смеси, при которой сокращается длительность лаг-фазы и увеличивается число клеток в среде, что повышает лечебные свойства кисломолочного продукта. Показано, что СОД способствует увеличению сроков хранения и вязкости, а также стабилизирует кислотность продукта (рис. 14,15,16; табл.3).

Установлено также, что СОД выступает и в качестве

противовоспалительного средства, используемового для лечения желудочно-кишечных заболеваний. Активность фермента на всех стадиях приготовления напитка не изменяется. Клинические испытания проводились на кафедре гастроэнтерологии и диетологии в Александровской больнице. Под наблюдением находилась группа из 45 больных, страдающих хроническим гастритом, язвенной болезнью желудка, дисбактернозом кишечника и алиментарной дистрофией.

О 0,004 0,008 0,012 0,016 0,02 Концентрация СОД, •/•

-Количество кпвтск ласгобаетврий

- Продолжительность лаг-фазы

Рис.14. Влияние супероксиддисмутазы на продолжительность лаг-фазы и количество клеток лактобактерий (Хтах)

-0,020% СОД

- 0,012% СОД

---- 0,006%

] сод

I---ста, сод

Рис. 15. Влияние СОД на динамику роста лактобактерий закваски.

8000

У 7000 я

6000

£

£ 5000 ж

& 4000 с

¡5 3000 | 2000

,1"

—-в—Молодо без СОД I

-■■&•■ Молота с 0,012% | СОД !

Врзмя, час

Рис.16. Влияние СОД на вязкость продукта. Влияние СОД на длительность хранения готового продукта.

Таблица 3.

Показатели в кисломолочном продукте Продолжмтштьиссть хранения, час

5 часов 72 часа 148 часов

баз сод с 0012% СОД без СОД С 0.012% СОД без СОД с 0.012% СОД

1. Колтество молочнокислых-палочек -стептоиитов, ко.е./ см5 6x10" 3x10 2x10' 2x10" 6x10* 8x10*

2x10" 5х10у 7x10" 5x10* 5x10' 7x10°

2. Кислотность, иТ 85 80 95 87 112 93

3. Синвреэис (количество отделившейся сыворотки, %), и*»*=15минут 50 45 56 52 60 60

4. рН 4.30 4.35 4.15 4.10 4.10 4.10

Напиток назначался 2 раза в день до еды по 150-200мл на прием в течение 14 дней. На фоне лечения биологические препараты и ферменты не применялись. Проведенные исследования показали, что в 100% случаев был убедительный терапевтический эффект: улучшение самочувствия, восстановление аппетита, прибавка в массе, купирование болей в животе, затухание аллергических процессов, восстановление бифидо- и лактофлоры и др. Клинические испытания молочнокислого

напитка показали целесообразность его использования в рационе больных, страдающих различными заболеваниями желудочно-кишечного тракта.

Выводы.

1. Выделена в высокоочищенном состоянии, по данным высокоэффективной жидкостной хроматографии, изоэлектрофокуснрования и электрофореза в полиакриламндном геле Са^п-СОД человека из биомассы рекомбинантного штамма дрожжей БассЬаготусеэ сегеч^ае.

2. Определены биохимические (молекулярная масса, изоэлектрическая точка) и физико-химические (удельная активность, спектры поглощения в ультрафиолетевой и видимой области длинн волн, температурная и рН- стабильности) характеристики рекомбинантной СОД человека. Показано, что они совпадают с аналогичными характеристиками для СОД человека из эритроцитов крови.

3. Детально изучены закономерности инактивации Си^п-СОД человека гипохлоритом, наиболее сильным окислителем, образующимся в очаге воспаления. Полученные данные свидетельствуют о недоступности активного центра для гипохлорита и позволяют сделать вывод о механизме ииактивирующего действия СОД гипохлоритом, связанном с окислением аминокислот, не входящих в состав активного центра, но опосредованно влияющих на активность, з частности аминокислот, контролирующих этап электростатического взаимодействия субстрата с ферментом.

Изучена сравнительная инактивация СОД человека и быка гипохлоритом. Обнаружено, что большая устойчивость человеческой и рекомбинантной СОД к действию окислителя, связана с наличием дополнительного остатка цистенна в молекуле чСОД и рСОД, способного окисляться гипохлоритом в 100 раз активнее, чем другие аминокислоты.

4. Предложена оригинальная рецептура кисломолочного напитка с закваской из лакто- и бифидобакгерий, включающая СОД, для лечебного питания. Установлено стимулирующее влияние супероксиддисмутазы на развитие лактобактернй. Определена оптимальная концентрация фермента в продукте, равная 0.012%, при которой сокращается длительность лаг-фазы развития лактобактернй и время образования сгустка, активность же фермента при этом не изменяется. Показано, что СОД увеличивает продукцию микроорганизмов, сроки хранения и стабилизирует кислотность.

Список онублмкованиых работ.

L Cliurilova i.V., Drozdova Ju.I., Arbipova A.N., Yakovleva E.P. Production of therapeutic iactic-acid drinks countaining superoxide dismutase (SOD)./ Internationale congress on free radicals in health and disease, Istanbul-Turkey,

1995, p. 123.

2. Красникова JI.B., Архипова A.H., Чурклова И.В., Дроздова Ю.И./ "Способ получения кисломолочного продукта с супероксиддисмутазой", положительное решение о выдаче патента на изобретение. N95 104578/13(008735), 1995.

3. I.V.Churilova, B.P.Sharonov, N.V.Leonova, Yu.I.Drozdova Electrostatic interaction between O, " and hypochlorite-oxidation modified supeфxide dismutase./ Oxidative stress and redox regulation: Cellular Signaling, Aids, Cancer and other Diseases. International congress, Institut Pasteur, Paris,

1996, p. 149.

4. Paramonov В., Drozdova Yu., Zinoviev E. Blood chemyluminescence in burn shock stage./ VIII Biennial meeting international society for free radical research, Barcelona-Spain, 1996, p.41.3.

5. Парамонов Б.А., Зиновьев E.B., Дроздова Ю.И. Хемилюминесценция крови у тяжелобольных в период ожогового шока./ "Актуальные проблемы реаниматологии и экстремальной медицины", Мемориальная научно-практическая конференция памяти проф. Р.ИЛившица, Челябинск, 1996.