Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях человека

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях человека"

На правах рукописи

КОРОБОВА Мария Владимировна

Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях >л

человека /,■

03.00.23 - Биотехнология 14.00.46 - Клиническая лабораторная диагностика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург-2006

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении Санкт-Петербургский государственный Технологический институт (Технический университет) и на базе ФГУЗ Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины МЧС России.

Научные руководители: доктор химических наук профессор

доктор биологических наук

Гарабаджиу Александр Васильевич Зыбина

Наталья Николаевна

Официальные оппоненты: доктор химических наук, профессор доктор биологических наук,

Шугалей Ирина Владимировна Великанова Людмила Иосифовна

Ведущая организация: Санкт-Петербургский университет им. И. П. Павлова

государственный медицинский

Защита диссертации состоится "$ " 200бг в /^-^асов на заседании

диссертационного совета Д 212.230.04 при Санкт-Петербургском государственном Технологическом институте (Техническом университете) (190013, Санкт-Петербург, Московский пр. 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургского государственного Технологического института (Технического университета). Замечания и отзывы по работе, заверенные печатью, в одном экземпляре просим направлять по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр. 26, Ученый Совет.

Автореферат разослан

2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

к.т.н. Т. Б. Лисицкая

¿LOG 61.

Актуальность проблемы.

Как известно, при всех патологических процессах, происходящих в организме человека на клеточном уровне, возникают процессы альтерации, с последующей репарацией. В связи с этим, в терапии заболеваний различной природы, большое значение имеют препараты, способствующие защите и репарации клеток (Коган А.Х., 1999; Das U.N., 2000; Guerra Е. I., 2001).

Среди подобных соединений особое внимание привлекают антиоксиданты, способные контролировать и модулировать окислительные процессы в клетке. Ключевым ферментом антиоксидантной защиты организма является супероксидцисмутаза (СОД). Данный фермент осуществляет дисмутацию

супероксидного радикала (Ог) - продукта одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, который образуется практически во всех клетках организма, контактирующих с кислородом, и играет ведущую роль в процессах

токсичности активных форм кислорода (АФК). Oí действует на все компоненты клеток (белки, липиды, нуклеиновые кислоты), на компоненты соединительных тканей (гиалуроновая кислота), а также является предшественником более токсичного щдроксильного радикала (*ОН).

Каталитический характер инактивации супероксидного радикала определяет преимущество СОД по сравнению с антиоксид антами неферментативной природы. К настоящему времени существует хорошо обоснованная сгратегия применения препаратов СОД при самых различных заболеваниях, где патогенетическую роль выполняют активированные фагоциты, а гакже отмечаются нарушения, связанные с накоплением активных форм кислорода (Трубников Г.А. и соавт., 1998; Скальный A.B. и соавт., 2000; Чурилова И.В. и соавт., 2002; Davis J.M. et. al., 2000).

Наиболее перспективными для широкого клинического применения являются препараты гомологичных белков, а именно, препараты на основе СОД человека (Черепак JI. Н. и соавт., 1998; Davis J.M. et al., 2000). Одним из них, является Рексод, новый отечественный ферментный лекарственный препарат, обладающий антиоксидантным, антицитолитическим и противовоспалительным действием. Основным действующим вещество^ Рр^д^Щгяета^рекомбинантная

I библиотека"' I

супероксиддисмутаза (СОД) человека, выделенная из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae. Доклинические исследования препарата Рексод показали, что он является нетоксичным при однократном (остром) пероральном, а также внутривенном и внутримышечном введении (Соловьева Л.Я. и соавт, 2002) Опыт применения зарубежными исследователями препаратов СОД человека показал, что экзогенная супероксиддисмутаза обладает широким терапевтическим действием (Akbulut G. et al, 2005; Yune T.Y. et al, 2004; Kamata H. et al., 2005).

Все вышесказанное подтверждает актуальность изучения действия экзогенной супероксиддисмутазы, выделенной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae и определило цель исследования: охарактеризовать воздействие экзогенной супероксиддисмутазы, выделенной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, на процессы свободнорадикального окисления in vitro и оценить влияние препарата Рексод на клинико-лабораторные показатели при острых и хронических патологических процессах. Задачи исследовання

1 Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах.

2 Модифицировать метод определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови

3. Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro.

4. Изучить влияние экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли - а (TNF-а) в системах in vitro с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы.

5. Охарактеризовать показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса, биохимические и иммунологические параметры у больных с острым гепатитом В до и после лечения препаратом Рексод.

6 Изучить показатели свободнорадикального и антиоксвдантного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия) до и после лечения препаратом Рексод. Научная новизна.

В результате проведенного научного исследования, получены новые данные о механизмах протсктивного действия экзогенной супероксидцисмутазы на процессы свободно-радикального окисления и вскрыты механизмы подавления продукции TNF- а, фактора цитотоксичности, непосредственно и необратимо инициирующего апоптоз клеток мишеней по TNF- а - TNF- R пути in vitro. Показано положительное влияние препарата Рексод, содержащего рекомбинантную C^Zn-супероксиддисмутазу, на состояние «окислительного стресса», при остром и хроническом патологических процессах. Обоснован метод определения активности супероксидцисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, который не только дополняет методы оценки антиоксидантной защиты у человека, а в некоторых случаях может быть более информативным клинико-лабораторным показателем. Научно-практическая значимость работы.

Разработаны подходы к оценке антиокенданшого действия экзогенной супероксидцисмутазы в модельных системах. Спектр методов оценки антиоксидантной защиты был расширен за счет разработки метода определения активности супероксидцисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови.

Доказана эффективность применения препарата супероксиддисмутазы Рексод при остром (гепатит В) и хроническрм (возрастная макулодистрофия) патологических процессах.

Апробация работы и публикации по материалам исследования

Результаты работы представлены на научной конференции «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию П.М.Альбицкого (9-10 октября 2003 года, Санкт-Петербург), и национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиокевданты и здоровье человека» (26-30сентября 2005г, Смоленск).

По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 91 странице, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы, содержащего 129 источников, из них 44 на русском языке. Работа иллюстрирована 11 рисунками и 15 таблицами. Материалы и методы исследования

В опытах in vitro использовали рекомбинантную супероксиддисмутазу, полученную в лабораторных условиях по схеме выделения и очистки' патент РФ № 2186848 (Соловьева Л.Я., 2002, ГосНИИ ОЧБ, г. Санкт-Петербург). Источником рекомбинантной СОД человека была биомасса клеток рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae (ООО „Трис", Москва). Биомасса поставлялась в замороженном виде. Разрушение клеточных стенок дрожжей S. cerevisiae проводили с помощью лабораторной установки "Дезинтегратор для микроорганизмов" (ГосНИИ особо чистых биопрепаратов). В процессе работы для лабораторной очистки фермента использовали следующие сорбенты: солоза, С8-целлюлоза. Для определения молекулярной массы фермента и проверки наличия примесей проводили гель - хроматографию (гель АСА 44, LKB, Швеция). Активность выделенной супероксиддисмутазы определяли спектрофотометрическим методом, основанном на торможении реакции окисления кверцетина (Костюк В.А. и соавт., 1990). Для клинических исследований использовался лекарственный препарат рекомбинантной супероксиддисмутазы Рексод (разрешение на проведение клинических исследований № 308 от 28 июня 2001 года Министерства Здравоохранения Российской Федерации).

Подготовка материала для проведения модельных опытов и исследований в группах пациентов.

В модельных системах для определения окислительной деструкции белков, в качестве субстрата, использовали бычий сывороточный альбумин (SIGMA).

Раствор белка готовили в концентрации 70 мг на 1 мл физиологического раствора. Для создания условий, обеспечивающих постоянную генерацию Oí"' использовали систему содержащую ксантин/ксантиноксидазу. Все пробы в модельных системах имели одинаковый объем. Исследуемым биологическим материалом были форменные элементы и сыворотка периферической крови человека. Исследования проводили в день забора материала. Все пациенты и волонтеры заполняли протокол информированного согласия.

Для проведения анализа в эритроцитах, кровь центрифугировали при 3000 об/мин. 15 минут, плазму отбрасывали и эритроциты промывали два-три раза изотоническим раствором. Эритроцитарную массу использовали для получения гемолизата, в соответствии с методами определения параметров. Нейтрофилы и мононуклеары выделяли из периферической крови на фиколл-верографиновом градиенте (Зыбина H.H., Лавинская H.H., 1994). Сыворотку для исследований получали общепринятым методом. Оценка клинике-лабораторных параметров.

Оценка свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы включала, определение конечных продуктов ПОЛ (ТБК-АП) (Gutteridge J.M. et al., 1978; Гаврилов В.Б. и соавт., 1987), определение окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах (Lee Кшп-Tatt et al., 1974), определение активности супероксвидисмутазы (СОД) набором "Randox" в эритроцитах, нейтрофилах и мононуклеарах, определение активности каталазы (Aebi Н., 1984), определение карбонильных групп белков (Дубинина Е.Е., 1993); для оценки продукции TNF- а использовали коммерческие тест-системы для твердофазного иммуноферментного анализа (ООО "Протеиновый контур"); из биохимических параметров в работе определяли: АЛТ, общий билирубин, ГТТП, щелочную фосфатазу, холинэстеразу на автоматическом анализаторе «Копе Specific» (Финляндия), наборами реактивов фирмы Randox (Англия).

Характеристика обследованных больных.

В ходе диссертационного исследования были обследованы пациенты с диагнозом острый гепатит В. Пациенты были разделены на две группы. Первую

группу составили 15 больных в возрасте от 17 до 68 лет (8 женщин и 7 мужчин). Больные получали базисную терапию - режим, диета, инфузионная терапия (5% раствор глюкозы, физ. раствор, солевые растворы, спазмолитики, витамины). Во вторую группу вошли 15 пациентов в возрасте от 17 до 60 лет (12 мужчин и 3 женщины). Эти пациенты (15 человек) кроме базисной терапии, прошли курс атиоксидантной терапии, препаратом Рексод (производство ГосНИИ ОЧБ) Препарат вводился внутривенно капельно по 32 мг ежедневно в течение 10 дней Исследование было проведено с соблюдением правил двойного слепого плацебо контролируемого рандомизированного метода. Клиническая часть данного раздела (объективные данные эпидемиологического анализа, оценка тяжести процесса, верификация диагноза) была выполнена совместно с врачом-инфекционистом Андреевой С Г., ординатором Городской инфекционной больницы №30. Вторую хруппу обследованных составили 30 пациентов в возрасте от 30 до 65 лет с диагнозом хроническая возрастная макулодистрофия. Среди сопутствующей патологии отмечались: атеросклероз сосудов головного мозга, гипертоническая болезнь, дисциркуляторная энцефалопатия. Всем обследованным был проведен курс терапии с применением рекомбинантного препарата СОД. Препарат вводился внутривенно капельно по 32 мг ежедневно в течение 10 дней Клиническое сопровождение данного раздела проводила доцент кафедры офтальмологии Военно-медицинской академии Журавлева JI.B

В опытах in vitro использовали периферическую кровь волонтеров (группа из 15 человек) Всероссийского центра экстренной и радиационной, медицины МЧС России.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Очистка рекомбинантной СОД включала в себя разрушение клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae, получение белкового дезинтеграта, очистку супернатанта на катионите I (солоза), гидрофобную хроматография на С8-целлюлозе, диализ очищенного элюата и дальнейшую лиофилизацию (Соловьева ЛЯ Патент РФ № 2186848,2002).

В результате проведенной очистки был получен фермент активностью 550000 Ед/мг, содержание примесей в котором, по данным гель - хроматографии, не превышало 1 %.

1. Действие экзогенной супероксиддисмутазы в модельных системах на окислительную деструкцию белков.

Белки наиболее чувствительны к свободнорадикальному окислению по сравнению с другими биомолекулами и их окисление является наиболее ранним показателем усиления продукции АФК (Berlett B.S., Stadman E.R., 1997). Влияние свободных радикалов на белки разного типа приводит к сложным модификациям в структуре белковых молекул и, соответственно, к изменению их физико-химических и биологических свойств. В связи с этим, была исследована динамика образования карбонильных групп белков в опытах in vitro в зависимости от уровня продукции активных форм кислорода в системах с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы, и, таким образом, оценено действие фермента В модельных системах на окислительную деструкцию белков, (таблица 1)

Таблица 1.

Действие супероксиддисмутазы в модельных системах на окислительную деструкцию белков, M(SD).____

Состав инкубируемой смеси и время инкубации Содержание карбонильных групп, нмоль/мг белка

Раствор белка 1,82 (0,22)

Раствор белка + система ксантиноксидаза-ксантин (30 минут) 2,99* (0,57)

Раствор белка + система ксантиноксидаза-ксантин (60 минут) 3,08* (0,43)

Раствор белка + система ксантиноксидаза-ксантин + раствор супероксиддисмутазы 30 минут 1,78* (0,32)

Раствор белка + система ксантиноксидаза-ксантин + раствор супероксиддисмутазы 60 минут 1,72* (0,35)

1° инкубации - 37° С

* - различия достоверны по сравнению с системой без супероксиддисмутазы (р<0,03)

' - различия достоверны по сравнению с контролем (р<0,05)

Доза фермента для обработки in vitro рассчитывалась исходя из доз, назначаемых в клинической практике при внутривенном введении препарата Рексод. В результате проведенных -экспериментов было отмечено, что использование супероксиддисмутазы в модельных системах, с повышенным уровнем супероксид-анион радикала, способствовало достоверному снижению содержания карбонильных групп, что подтверждает активность рекомбинантной супероксиддисмутазы.

2. Определение активности супероксиддисмутазы в иейтрофилах и мононуклеарах периферической крови.

Защита клеток от свободных радикалов представляет собой многоуровневую систему антиоксидантов. Так называемая, первичная защита ослабляет реакции инициации свободнорадикального окисления, за счет уменьшения концентрации свободных радикалов. К системе первичной защиты относится супероксиддисмутаза, имеющая вне- и внутриклеточную локализацию

Для получения максимальной информации о взаимоотношении прооксидантных и алтиоксидантных систем и увеличения числа информативных показателей антиоксидантного статуса, метод определения СОД в эритроцитах, был нами модифицирован для определения активности супероксиддисмутазы в иейтрофилах и мононуклеарах периферической крови. Разрушение клеток проводили методом последовательно! о замораживания-оттаивания Для создания условий, обеспечивающих постоянную генерацию 02'"' использовали систему содержащую ксантин/ксантиноксидазу. В систему добавлялся 2-(4-йодофенил)-3-(4-нитрофенол)-5-фенилтетразола хлорид, который в присутствии Ог' формирует красную формазановую окраску. По снижению окраски в присутствие СОД рассчитывалась активность фермента.

Так как до этого в специальной литературе отсутствовали сведения об этом методе, нами было проведено исследование по выявлению основных характеристик аналитической надежности метода определения активности супероксиддисмутазы в иейтрофилах и мононуклеарах периферической крови. Оценка воспроизводимости, правильности, чувствительности, условий хранения материала выполнялась в соответствии с рекомендациями, данными в справочнике

"Лабораторные методы исследования в клинике" под редакцией В.В. Меньшикова (1987). Результаты проведенного исследования позволили сделать вывод, что аналитическая надежность метода определения активности супероксидцисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, позволяет использовать его для оценки активности СОД и является дополнительным параметром оценки состояния "окислительного стресса".

3. Действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro.

Ввиду недостаточности научных данных о механизмах действия экзогенно введенной СОД на активность эндогенной супероксиддисмутазы были проведены модельные эксперименты in vitro. С этой целью определяли СОД внутршелеточно (эритроцита, мононуклеары и нейтрофилы) до и после инкубации с ферментом. В ходе экспериментов in vitro, гепаринизированная кровь, полученная от волонтеров, обрабатывалась раствором супероксиддисмутазы. Доза препарата для обработки in vitro рассчитывалась исходя из доз, назначаемых в клинической практике при внутривенном введении препарата Рексод. Эксперименты были проведены с двумя концентрациями фермента - со стандартной концентрацией, полученной в результате пересчета доз, используемых в клинической практике, и количества фермента в два раза выше исходного Также оценивалось влияние фермента при различной длительности инкубации с образцами крови in vitro (t° инкубации 37° С, 5 % СОг). Данные, полученные в результате проведенных экспериментов in vitro, показали, что активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах при культивировании с двумя дозами препарата -со стандартной дозой, полученной в результате пересчета на объем пробы, и последовательно введенной второй, а также при различной длительности инкубации с образцами крови in vitro достоверно не изменялась. Эти данные подтверждают действие фермента на межклеточном уровне и дает основания предположить опосредованный механизм действия супероксиддисмутазы на уровне макроорганизма.

4. Изучение влияния экзогенной СОД на продукцию TNF- а.

Синтез эндогенной СОД способствует снижению уровеня TNF- а в регуляции острого и хронического воспаления, а также в возникновении и развитии септического шока (Adachi Т. et al., 1994; Marikovsky М. et al., 2003). В связи с этим, с целью изучения влияния экзогенной СОД на параметры иммунитета и воспаления в опытах in vitro, оценивалась продукция TNF-a -провоспалительного цитокина, фактора, обладающего цитотоксичностью в отношении клеток - мишеней и участвующего в элиминации их путем апоптоза (Кетлинский С.Л. и соавт., 1998) Учитывая, что TNF-a, в свою очередь, запускает каскад активации других цитокинов, которые вызывают пролиферацию и активацию клеток иммунной системы, изменение концентрации TNF-a в крови во многом определяет состояние иммунной системы в каждый означенный период В ходе модельных опытов in vitro гепаринизированная кровь, полученная от волонтеров, обрабатывалась рекомбинантной супероксиддисмутазой. Доза фермента для обработки in vitro рассчитывалась исходя из доз, назначаемых в клинической практике при внутривенном введении препарата Рексод. Опыты были проведены с двумя концентрациями фермента: со стандартной концентрацией, полученной в результате пересчета, и концентрацией в два раза превысившей исходную. Для оценки влияния рекомбинантной СОД на синтез и продукцию TNF-a мононуклеарами периферической крови in vitro изучали спонтанную и индуцированную продукцию TNF-a клетками крови и оценивали уровень цитокина в плазме до и после инкубации с ферментом.

В результате проведенных исследований были выявлены достоверные изменения в синтезе и продукции провоспалительного цитокина TNF-a. Уровень продукции цитокина, оцененный в плазме периферической крови сразу после воздействия СОД, he отличался от такового в плазме крови без воздействия СОД.

При предварительной совместной инкубации с экзогенным ферментом спонтанная продукция TNF-a достоверно снижалась прямо пропорционально времени инкубации с ферментом. Аналогичные результаты были получены при изучении индуцированной продукции цитокина при воздействии индуктора, имитирующего воздействие чужеродного антигена (LPS содержащий препарат -продигиозан). Уровень индуцированной продукции TNF-a в условиях

эксперимента снижался с 568 пг/мл до 92 при инкубации с раствором супероксиддисмутазы 15 минут, а при условиях удлинения сроков обработки и увеличения дозы фермента - до 56 пг/мл (т.е. в 10 раз). Достоверных различий в снижении индуцированной продукции TNF-a в зависимости от условий воздействия супероксиддисмутазы выявлено не было. Можно предположить, что экзогенный фермент действует на синтез белка TNF-a также, как и эндогенный, блокирует его, в связи с чем уменьшается споптанная и индуцированная продукция провоспалительного цитокина.

Таким образом, в эксперименте in vitro с использованием экзогенной СОД нам удалось подтвердить описанные ранее в литературе взаимоотношения между эндогенной СОД и TNF-a (Wakai М. et al., 1994).

5. Оценка клинико-лабораторных параметров у больных с острым гепатитом В до я после лечения препаратом Рексод.

По данным литературы (Pavlak К et al.,2004; Sanches-Campos S, 2004; Akbulut G et al., 2005), 1епатит В характеризуется состоянием окислительного стресса и повышением в плазме крови уровня провоспалительных цитокинов. Продукты окислительного стресса (Kamata Н. et al., 2005) вызывают TNF-a индуцированную гибель клеток. Поэтому, использование в терапии препарата Рексод должно снижать продукцию супероксид анионов, индуцированную TNF-а, и предотвращать гибель клеток печени (Cuzzocrea S. et al., 2004). В ходе работы были изучены клинико-лабораторные показатели пациентов с острым гепатитом В до и после проведенного лечения. Пациенты были разделены на две группы сопоставимые по клиническому течению и клинико-лабораторным показателям: 1 - получавшие в качестве лечения стандартную базисную терапию (п=15); 2 - получавшие, кроме базисной, антиоксидантную терапию препаратом Рексод. При оценке изменения параметров окислительного стресса и антиоксидантного статуса до и после терапии (рис. 2) выявлено, что в обеих группах активность СОД в эритроцитах оставалась на постоянном уровне. СОД в мононуклеарах и нейтрофилах в ходе терапии возросла в обеих группах, причем в группе с антиоксидантной терапией достоверно (р<0,05) на 25% и 33% больше, чем в группе сравнения соответственно. Уровень каталазы в обеих группах и до и

после лечения, оставался на нижней границе нормы без изменения, и оказался неинформативным в описании динамики окислительного стресса.

В% ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ В ГРУППЕ С БАЗИСНОЙ ТЕРАПИЕЙ ■ % ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ В ГРУППЕ ПОЛУЧАВШЕЙ ПРЕПАРАТ РЕ*СОД

Рис. 2 Сравнительная характеристика влияния базисной терапии и терапии с включением препарата Рексод на параметры окислительного стресса и антиоксидантной защиты

Примечание' «О» уровень - исходные значения показателя; по оси Xr 1- карбонильные группы, 2- СОД эритроцитов, 3- СОД иейтрофилов, 4- СОД мононуклеаров, 5-каталаза эритроцитов, 6-гдутатион восстановленный, 7- глутатион окисленный, 8- ТЕК-АП иейтрофилов, 9- ТБК-АП мононуклеаров.

В процессе лечения показатель окислительного повреждения липидов -уровень продуктов ПОЛ (кол-во ТБК-АП в нейтрофилах и мононуклеарах), имел тенденцию к снижению у всех пациентов. Однако в группе, получавшей препарат Рексод, достоверное снижение количества ТБК-АП (р<0,05) иейтрофилов происходило в среднем на 15% больше, а достоверное снижение количества ТБК-АП (р<0,05) в мононуклеарах на 12% больше, чем в первой группе (с базисной терапией). Терапия препаратом Рексод позволила достоверно(р<0,05) снизить уровень карбонильных групп и приблизить его к норме. При сравнении биохимических параметров в обеих группах отмечалась тенденция к их нормализации. При этом ЩФ и ХЭСТЭР у всех пациентов изменялись одинаково равномерно. Однако, в группе пациентов, пролеченных препаратом Рексод, общий билирубин, АлАТ и I I "Ш достоверно (р<0,05) снизились в среднем на 10%-13% больше, чем в группе пациентов, получавших только базисную терапию.

И% ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ В ГРУППЕ С БАЗИСНОЙ ТЕРАПИЕЙ

■ % ИЗМЕНЕНИЯ ПАРАМЕТРОВ В ГРУППЕ ПОЛУЧАВШЕЙ ПРЕПАРАТ РЕКОРД I

1 2 3 4 5

Рис. 3 Сравнительная характеристика влияния базисной терапии и терапии с включением препарата Рексод на биохимические параметры обследованных пациентов.

Примечение: «0» уровень - исходные значения показателя, по оси Х- 1-ЩФ.2- ГТТП, З-общий билирубин,4-АлАТ, 5-ХЭСТЭР.

ТКТ-а - провоспалительный цитокин, фактор цитотоксичности в отношении клеток- мишеней, играет значительную роль в патогенезе острого гепатита В. Биологическими эффектами ЮТ-а, при этой патологии, является индукция апоптоза (программируемой гибели) гепатоцитов по ЮТ-а - ЮТ-аЯ пути, индукция белков острой фазы и других провоспалительных цитокинов. Кроме этого ЮТ-а является фактором повреждения клеток эндотелия мелких сосудов (капилляров), хемоаттрактантом нейтрофилов, которые в свою очередь реализуют свою цитотоксичность в отношении клеток-мишеней (гепатоцитов) за счет свободных форм кислорода. В связи с вышесказанным, была оценена продукция этого провоспалительного цитокина до и после лечения у пациентов, получавших стандартную базисную терапию, и пациентов, получавших в дополнение к базисной терапии препарат рекомбинантной СОД - Рексод. В момент поступления в стационар у пациентов ЮТ-а в сыворотке крови не был повышен. Продукция 'ПЧР'-а в периферической крови пациентов с острым гепатитом В повторно оценивалась после проведенного лечения - стандартного базисного и с включением препарата Рексод. Полученные данные выявили повышение уровня Т№-а в периферической крови по завершении курса

стандартной базисной терапии, что указывает на продолжение системного воспаления, на продолжающуюся генерацию свободных радикалов и оксидативного стресса, а также на продолжающееся повреждение клеток печени. В группе пациентов, получавших в схеме терапии Рексод, аналогичного повышения ЮТ-а не отмечалось.

Таблица 2.

Уровень TNF- а в сыворотке пациентов с острым гепатитом В до и после лечения в сравниваемых группах, X(SD).

Пациенты группы 1 Пациенты ipynnu 2

Наименова- Едини- Нормаль- ДО после до после

ние цы ные лечения лечения лечения лечения

параметра значения п=15 п=15 п=15 п=15

TNF-а (пг/мл) 13,4 (9,83) 21,4 (6,91) 93,8* (12,7) 23,6 (7,50) 28,8 (9,56)

*- различия по сравнению с нормой (р<0,05)

Таким образом, использование препарата Рексод в терапии пациентов с острым гепатитом В позволило значительно улучшить биохимические параметры и взаимоотношение показателей окислительного стресса и антиоксидантной защиты, а также уменьшить уровень провоспалительного цитокина Т№-а в периферической крови.

6. Влияние препарата Рексод на параметры свободнораднкального статуса и антиоксидантной защиты у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия).

В ходе диссертационного исследования была проведена оценка параметров свободнорадикальиого статуса и антиоксидантной защиты у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия) до и после лечения препаратом Рексод.

О возрастной (или атеросклеротической дегенеративной) макулодистрофии в специальной литературе не очень много данных. Тем не менее, большинство авторов сходится во мнении, что этот процесс связан с хроническим увеличением образования свободных радикалов в ретинальной оболочке глаз (Soldatova A.M., et al, 1994; Bosinski S N. et al., 1997; Fedorov A.A., 1998). Отсутствие ингибирования TNF-a, постоянная активация супероксиданионами NF-кр и, вследствие этого, повышенная экспрессия адгезионных молекул на клетках эндотелия сосудов ретинальной оболочки с последующим рекрутированием лейкоцитов являются критическими событиями в развитии атеросклеротической макулодистрофии (Lin S.J. et а1.2005).

В работе были изучены клинико-лабораторные показатели пациентов с диагнозом макулодистрофия (п=30) Анализ параметров процессов свободнорадикального окисления и ангиоксидантного статуса свидетельствовал об достоверном (р<0,05) увеличении маркеров свободнорадикального повреждения белков (СО-группы) и липвдов (ТБК-АП) на фоне сниженного содержания восстановленного глутатиона. После проведения курса терапии с применением рекомбинантного препарата СОД было проведено повторное обследование пациентов. Анализ полученных результатов показал, что после лечения препаратом Рексод активность СОД в эритроцитах пациентов достоверно (р<0,05) возросла с 100,5 до 132,5 отн. ед./мг белка. Содержание продуктов окислительной деструкции липидов и белков существенно уменьшилось: уровень карбонильных групп достоверно (р<0,05) снизился с 1,49 до 1,18 нмоль/мг белка, а уровень ТБК-АП с 4,67 до 3,54 мкмоль/л (р<0,05).

Рис.4 Супероксиддисмутаза эритроцитов Рис. 5 Карбонильные группы

(отн. ед./мг белка) (нмоль/мг белка)

Рис.б ТБК-АП (мкмоль/л)

Примечание: *- достоверные различия параметра по сравнению с данными до лечения (р<0,05) (рис. 4,5,6).

Полученные после проведенной терапии рекомбинантным препаратом СОД результаты отражают ингибирующее влияние СОД на интенсивность процессов свободнорадикального окисления в периферической крови пациентов с макулодистрофией и, прежде всего, на уровень окислительной модификации белка.

ВЫВОДЫ

1. Действие фермента супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах выражается в достоверном снижении содержания карбонильных групп, что подтверждает способность фермента эффективно снижать уровень супероксид-анион радикала.

2. Аналитическая надежность модифицированного метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, основанного на изменении формирования красной формазановой окраски в присутствии СОД в системе генерирующей Oj", позволяет использовать его для оценки активности СОД и состояния "окислительного стресса".

3. В эксперименте при различной по длительности совместной инкубации in vitro образцов крови волонтеров с различными концентрациями супероксиддисмутазы активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах достоверно не изменялась.

4. Инкубация крови в модельных системах с различными концентрациями раствора супероксиддисмутазы приводит к достоверному снижению продукции фактора некроза опухоли a (TNF-a) мононуклеарами периферической крови.

5. Эффекты терапии препаратом Рексод при остром гепатите В характеризовались достоверным снижением общего билирубина, АлАТ и ГГТП по сравнению с группой пациентов, получавших стандартную терапию. Отмечалось увеличение активности СОД в мононуклеарах и нсйтрофилах, снижение показателей окислительного повреждения липидов (количество ТБК-АП в нейтрофилах и мононуклеарах) и окислительной деструкции белков (карбонильные группы).

6. Изменения параметров окислительного стресса и антиоксидангного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса после лечения препаратом Рексод заключались в снижении окислительной деструкции белков и липидов.

Список работ по теме диссертации

1. Препарат рекомбинанггной супероксиддисмутазы в лечении больных макулодистрофией /Коробова М.В., Фролова М.Ю.. Чурилова И.В, Журавлева JI.B ,3ыбина H.H.// Материалы Всероссийской научн. конф «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию ПМ Альбицкого, 9-10 октября 2003 года, СПб Мед акад журн. -2003. -№3, прил.4 -С.161.

2. Оценка состояния окислительного стресса в диагностике хронических нарушений мозгового кровообращения у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС/ Зыбина H.H., Тихомирова О.В., Фролова М.Ю., Коробова М.В., Пашкевич А.И.// «Клинико-лабораторный консилиум». -2004. -№5. - С.27-31.

3. Патогенетическое значение окислительного стресса у ликвидаторов последствий аварии на Чернобыльской АЭС с соматической патологией/ Зыбина H.H., Фролова М.Ю., Коробова М.В.// Материалы Всероссийской науч -практич. конф. «Война и современная медицина. Проблемы организации и оказания медицинской помощи и подготовки населения, специалистов для ликвидации медицинских последствий чрезвычайных ситуаций мирного и военного времени» 12-13 апреля, 2005г, СПб

J0O6fl-

»-8270

«Вестник С-Пб Государственной Медицинской академии им ИИ.Мечникова» -2005 -Ш.-С.255-256.

4. Оценка влияния экзогенной супероксиддисмутазы на процессы свободно-радикального окисления у больных с острым гепатитом В / Андреева С.Г., Зыбина H.H., Коробова М.В., Фролова М.Ю, Чурилова И.В. //«Вестник новых медицинских технологий». -2005. - Т.ХП, №2. - С.56-58.

5 Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы при острых и хронических заболеваниях и в опытах in vitro/ Коробова М.В., Фролова, М.Ю, Зыбина, H.H., Чурилова И В.// Материалы 4-ой нац. науч.-практич. конф. «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» 26-30 сентября, 2005г, Смоленск. - С.105-106.

6. Патогенетическое значение окислительного стресса у ликвидаторов последствий аварии на ЧАЭС с соматической патологией/ Зыбина Н Н., Фролова М.Ю., Коробова MB// Материалы 4-ой нац. науч -практич. конф «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» 26-30 сентября, 2005г, Смоленск. - С.74-75.

12.04.06 г. Зак.64-70 РТП ИК «Синтез» Московский пр., 26

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Коробова, Мария Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОКСИДАТИВНЫЙ СТРЕСС. АНТИОКСИДАНТНАЯ ЗАЩИТА.

МЕТОДИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ К ПОЛУЧЕНИЮ РЕКОМБИНАНТНЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ АНТИОКСИДАНТНОГО

ДЕЙСТВИЯ

1.1. Свободные радикалы. Определение, классификация и механизмы образования

1.2. Физиологическое значение свободных радикалов

1.3. Патофизиологические эффекты свободных радикалов.Оксидативный стресс как типовой патологический процесс. Система антиоксидантной защиты организма

1.4. TNF-а и Си,гп-супероксиддисмутаза

1.5. Супероксиддисмутаза-структура, биохимия. Супероксиддисмутаза как антиоксидант

1.6. Возможности терапевтического применения препаратов супероксиддисмутазы

1.7. Принципы получения рекомбинантных препаратов

1.8. Принципы промышленного культивирования

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Лабораторный метод очистки рекомбинантной супроксиддисмутазы

2.1.1. Метод получения белкового дезинтеграта

2.1.2. Метод ионообменной хроматографии

2.1.3. Диализ (обессоливание)

2.1.4. Метод гель-хроматографии

2.1.5. Определение белка по методу Лоури

2.1.6. Количественный метод определения активности супроксиддисмутазы

2.2. Подготовка материала для проведения модельных опытов и исследований групп пациентов

2.3. Оценка параметров свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы

2.3.1. Определение конечных продуктов ПОЛ (ТБК-АП)

2.3.2. Определение окисленного и восстановленного глутатиона в эритроцитах периферической крови человека

2.3.3. Определение активности супероксиддисмутазы набором "Randox" в нейтрофилах и мононуклеарах

2.3.4. Определение активности каталазы

2.3.5. Определение окислительной деструкции белков

2.4. Методы оценки иммунного статуса

2.4.1. Индукция синтеза цитокинов. Определение фактора некроза опухоли - a (TNF - а)

2.4.2. ИФА метод определения TNF- а

2.5. Методы оценки биохимических параметров

2.5.1. Метод определения AJIT

2.5.2. Метод определения общего билирубина

2.5.3. Метод определения ГГТП

2.5.4. Метод определения щелочной фосфатазы

2.5.5. Метод определения холинэстеразы

2.6. Характеристика обследованных больных

2.7. Статистические методы

2.8. Характеристика используемых реактивов и оборудования

ГЛАВА 3. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1. Действие препарата рексод в модельных системах на окислительную деструкцию белков

3.2. Модифицирование метода определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови

3.3. Действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro

3.4. Изучение влияния экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли а (TNF-а), фактора воспаления обладающего цитотоксичностью в отношении клеток мишеней, в системах с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы

3.5. Оценка клинико-лабораторных параметров у больных с острым гепатитом

В до и после лечения препаратом Рексод.

3.6. Влияние препарата рексод на параметры свободнорадикального статуса и антиоксидантной защиты у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия или сенильная неэксудативная хориоретинальная дистрофия)

Введение Диссертация по биологии, на тему "Лабораторные методы оценки влияния экзогенной супероксиддисмутазы на параметры окислительного стресса в опытах in vitro и при острых и хронических заболеваниях человека"

Актуальность проблемы.

Как известно, при всех патологических процессах, происходящих в организме человека на клеточном уровне, возникают процессы альтерации с последующей репарацией. В связи с этим, в терапии заболеваний различной природы, большое значение имеют препараты, способствующие защите и репарации клеток (Коган А.Х., 1999; Das U.N., 2000; Guerra Е. I., 2001).

Среди подобных соединений особое внимание привлекают антиоксиданты, способные контролировать и модулировать окислительные процессы в клетке.

Ключевым ферментом антиоксидантной защиты организма является супероксиддисмутаза (СОД). Данный фермент осуществляет дисмутацию супероксидного радикала (Oi)- продукта одноэлектронного восстановления молекулярного кислорода, который образуется практически во всех клетках организма, контактирующих с кислородом и играет ведущую роль в процессах токсичности активных форм кислорода (АФК). Oi действует на все компоненты клеток (белки, липиды, нуклеиновые кислоты), на компоненты соединительных тканей (гиалуроновая кислота), а также является предшественником более токсичного гидроксильного радикала (*ОН).

Каталитический характер инактивации супероксидного радикала определяет преимущество СОД по сравнению с антиоксидантами неферментативной природы. К настоящему времени существует хорошо обоснованная стратегия применения препаратов СОД при самых различных заболеваниях, где патогенетическую роль выполняют активированные фагоциты, а также отмечаются нарушения, связанные с накоплением активных форм кислорода (Трубников Г.А. и соавт.,1998; Скальный А.В. и соавт.,2000; Чурилова И.В. и соавт., 2002; Davis J.M. et. al.,2000).

Наиболее перспективными для широкого клинического применения являются препараты гомологичных белков, а именно, препараты на основе СОД человека (Черепак JI. Н. и соавт., 1998; Davis J.M., et al., 2000). Одним из них, является Рексод - новый отечественный ферментный лекарственный препарат, обладающий антиоксидантным, антицитолитическим и противовоспалительным действием. Основным действующим веществом Рексода является рекомбинантная супероксиддисмутаза (СОД) человека, выделенная из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae. Доклинические исследования препарата Рексод показали, что он является нетоксичным при однократном (остром) пероральном, а также внутривенном и внутримышечном введении. Опыт применения зарубежными исследователями препаратов СОД человека показал, что экзогенная супероксиддисмутаза обладает широким терапевтическим действием (Yune T.Y.et al., 2004; Akbulut G. et al., 2005; Kamata H et al., 2005).

В связи с выше сказанным, можно сказать, что использование экзогенной супероксиддисмутазы, являющейся ключевым ферментом антиоксидантной системы, будет способствовать защите клеток макроорганизма от альтерации супероксидными радикалами и корректировать состояние оксидативного стресса.

Цель исследования:

Охарактеризовать воздействие экзогенной супероксиддисмутазы, выделенной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, на процессы свободнорадикального окисления in vitro и оценить влияние препарата Рексод на клинико-лабораторные показатели при острых и хронических патологических процессах in vivo.

Задачи исследования

1. Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах.

1. Модифицировать метод определения активности супероксиддисмутазы в эритроцитах для нейтрофилов и мононуклеаров периферической крови.

2. Оценить действие экзогенной супероксиддисмутазы на активность эндогенной супероксиддисмутазы в опытах in vitro

3. Изучить влияние экзогенной СОД на продукцию фактора некроза опухоли -а (TNF-а) в системах in vitro с добавлением экзогенной супероксиддисмутазы.

4. Охарактеризовать показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса, биохимические и иммунологические параметры у больных с острым гепатитом В до и после лечения препаратом Рексод.

5. Изучить показатели свободнорадикального и антиоксидантного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса (возрастная макулодистрофия) до и после лечения препаратом Рексод.

Научная новизна.

В результате проведенного научного исследования получены новые данные о механизмах протективного действия экзогенной супероксиддисмутазы на процессы свободно-радикального окисления и оценены механизмы подавления продукции TNF- а, фактора цитотоксичности, непосредственно и необратимо инициирующего апоптоз клеток мишеней по TNF- а - TNF- R пути in vitro. Показано положительное влияние препарата "Рексод", содержащего рекомбинантную Си^п-супероксиддисмутазу, на состояние «окислительного стресса», при остром и хроническом патологических процессах. Обоснован метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, который не только дополняет методы оценки антиоксидантной защиты у человека, а в некоторых случаях может быть более информативным клинико-лабораторным показателем. Научно-практическая значимость работы.

Разработаны подходы к оценке антиоксидантного действия экзогенной супероксиддисмутазы в модельных системах. Спектр методов оценки антиоксидантной защиты расширен за счет разработки метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови.

Доказана эффективность применения препарата супероксиддисмутазы Рексод при остром (гепатит В) и хроническом (возрастная макулодистрофия) патологических процессах.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

• Опыты in vitro достоверно доказывают действие экзогенной супероксиддисмутазы на снижение окислительной деструкции белков в системе с постоянной генерацией Ог.

• Метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови может быть использован, как дополнительный показатель при оценке антиоксидантного статуса организма.

• В эксперименте при различной по длительности совместной инкубации in vitro образцов крови волонтеров с различными концентрациями супероксиддисмутазы активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах достоверно не изменялась.

• Инкубация крови в модельных системах различными концентрациями раствора супероксиддисмутазы приводит к достоверному снижению продукции фактора некроза опухоли а (TNF-а) мононуклеарами периферической крови и подтверждает, что одним из опосредованных механизмов действия фермента является снижение продукции TNF- а.

• Применение препарата Рексод на фоне базисной терапии при остром патологическом процессе (гепатит В) оказывает положительное влияние на интенсивность процессов свободнорадикального окисления, что выражается в достоверном улучшении биохимических показателей.

• При хроническом процессе (возрастная макулодистрофия) проявляется ингибирующее влияние препарата Рексод на интенсивность процессов свободнорадикального окисления и, прежде всего, на уровень окислительной модификации белка.

Апробация работы и публикации по материалам исследования

Результаты работы были представлены на научной конф. «Молекулярные механизмы типовых патологических процессов», посвященной 150-летию П.МЛльбицкого (9-10 октября 2003 года, Санкт-Петербург), и национальной научно-практической конференции «Активные формы кислорода, оксид азота, антиоксиданты и здоровье человека» (26-30сентября 2005г, Смоленск). По теме диссертации опубликовано 6 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Коробова, Мария Владимировна

ВЫВОДЫ

1. Действие фермента супероксиддисмутазы на окислительную деструкцию белков в модельных системах выражается в достоверном снижении содержания карбонильных групп, что подтверждает способность фермента эффективно снижать уровень супероксид-анион радикала.

2. Аналитическая надежность модифицированного метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови, основанного на изменении формирования красной форма-зановой окраски в присутствии СОД в системе генерирующей 02", позволяет использовать его для оценки активности СОД и состояния "окислительного стресса".

3. В эксперименте при различной по длительности совместной инкубации in vitro образцов крови волонтеров с различными концентрациями супероксиддисмутазы активность эндогенной СОД в эритроцитах, мононуклеарах и нейтрофилах достоверно не изменялась.

4. Инкубация крови в модельных системах с различными концентрациями раствора супероксиддисмутазы приводит к достоверному снижению продукции фактора некроза опухоли а (TNF-а) мононуклеарами периферической крови.

5. Эффекты терапии препаратом Рексод при остром гепатите В характеризовались достоверным снижением общего билирубина, АлАТ и ГГТП по сравнению с группой пациентов, получавших стандартную терапию. Отмечалось увеличение активности СОД в мононуклеарах и нейтрофилах, снижение показателей окислительного повреждения липидов (количество ТБК-АП в нейтрофилах и мононуклеарах) и окислительной деструкции белков (карбонильные группы).

6. Изменения параметров окислительного стресса и антиоксидантного статуса у пациентов с хроническим течением патологического процесса после лечения препаратом Рексод заключались в снижении окислительной деструкции белков и липидов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Постановка цели и задач данного исследования были обусловлены тем, что в течение последнего десятилетия достоверно доказывается физиологическая и регу-ляторная роль свободных радикалов, а также их непосредственное участие в патогенезе многих заболеваний (Трубников ГА. и соавт., 1998; Davis J.M. et. al.,2000; Балаболкин, 2000).

Благодаря открытию механизмов вовлечения активных форм кислорода в развитие различного рода патологических процессов, у ученых мира появилась возможность в разработке новых подходов в антиоксидантной терапии (Скальный А.В. и соавт.,2000; Чурилова И.В. и соавт., 2002; Шанин Ю.Н, 2003). Несмотря на то, что характеристика антиоксидантного статуса дает дополнительную, более полную информацию о повреждения организма на клеточном уровне, данные методы диагностики используются в практике довольно редко. Это связано с тем, что в клинической практике, практически не возможно уловить образование свободнорадикальных форм в биологических системах, ввиду их чрезвычайно короткого времени жизни и сложности методов, которые могли бы эту задачу решить. Тем не менее, характеристика антиоксидантного статуса может дать дополнительную и важную информацию о состоянии патологических процессов.

Как известно, клеточная защита от свободных радикалов представляет собой многоуровневую систему биооксидантов. Так называемая первичная защита ослабляет реакции инициации свободнорадикального окисления, уменьшая концентрацию свободных радикалов. В проведенном исследовании была проведена оценка возможностей антиоксидантной защиты первой линии, так называемых "ловушек" свободных радикалов. К ним относятся: супероксиддисмутаза - дисмутирующая супероксидный радикал, каталаза - удаляющая перекись водорода и глутатион, участвующий в детоксикации перекисей. Параллельно с оценкой антиоксидантной защиты проводилось исследование маркеров свободнорадикального окисления, таких как ТБК-активные продукты, а также высокоспецифического маркера окислительного повреждения макромолекул- окислительной деструкции белков.

Для получения максимальной информации о взаимоотношении прооксидант-ных и антиоксидантных систем и увеличения числа информативных показателей антиоксидантного статуса, в ходе исследования был разработан метод определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах периферической крови. Результаты экспериментов с использованием предложеннного метода, обработанные методами статистического анализа, доказали аналитическую надежность разработанного метода определения активности супероксиддисмутазы в нейтрофилах и мононуклеарах. Результаты апробации метода показали, что он может быть использован не только в научных целях, но и как дополнительный клинико-лабораторный показатель до и после лечения антиоксидантами.

В диссертационном исследовании для коррекции про- и антиоксидантных систем была использована рекомбинантная супероксиддисмутаза. Перспективность использования лекарственных препаратов, содержащих гомологичную СОД, получаемую методами генной инженерии является неоспоримой ввиду безопасности использования, возможности наработки достаточных количеств препарата с известной активностью.

Проведенное нами исследование действия фермента на окислительную деструкцию белков в модельных системах, показало достоверное снижение содержания карбонильных групп. Это подтверждает способность фермента эффективно снижать уровень супероксид-анион радикала и действовать на наиболее важное звено патологического процесса.

Интересным результатом оказалось достоверное снижение продукции фактора некроза опухоли TNF-a в модельных системах при обработке проб раствором фермента. Данные экспериментов подтверждают данные литературы о взаимоотношениях между СОД и TNF- a (Akbulut G. et al., 2005, Yune T.Y.et al., 2004, Kamata H et al.,2005)

Оценивая клинико-лабораторные показатели пациентов прошедших на фоне базисной терапии, терапию антиоксидантным препаратом Рексод (рекомбинантная супероксиддисмутаза), можно сделать вывод о положительном терапевтическом эффекте. При оценке влияния рекомбинантной СОД на клинико-лабораторные показатели при остром гепатите В (30 человек) отмечалось, что общий билирубин, АлАТ и ГГТП были достоверно ниже в группе пациентов, в схему лечения которых был включен препарат Рексод, по сравнению с группой пациентов, получавших только базисную терапию.

Изменения параметров окислительного стресса и антиоксидантного статуса сопровождалось увеличением активности СОД в мононуклеарах и нейтрофилах, снижением показателей окислительного повреждения липидов (количество ТБК-АП в нейтрофилах и мононуклеарах) и окислительной деструкции белков (карбонильные группы). По сравнению с группой пациентов, получавших стандартную терапию (без препарата Рексод), в группе пациентов , в схему терапии которых был введен препарат экзогенной СОД, не отмечалось повышение уровня TNF-a , который в свою очередь поддерживает воспаление в печени, вызывает гибель гепатоци-тов и генерирует образование новых продуктов оксидативного стресса.

В группе пациентов с хроническим течением патологического процесса возрастная макулодистрофия) после лечения препаратом Рексод отмечалось снижение окислительной деструкции белков и липидов, вызывающих дегенеративные атеро-склеротические изменения в ретинальной оболочке глаза.

Таким образом, по совокупности проведенных экспериментальных и клинических наблюдений можно говорить об эффективности применения рекомбинантной супероксиддисмутазы, полученной из биомассы рекомбинантного штамма-продуцента Saccharomyces cerevisiae, для коррекции состояния острого и хронического оксидативного стресса при острых и хронических патологических процессах (Коробова М.В. и соавт., 2005).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Коробова, Мария Владимировна, Санкт-Петербург

1. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма: Методические рекомендации,- СПб., «Фолиант»,2000. 104 с.

2. Балаболкин М. И., Клебанова Е. М. Роль окислительного стресса в патогенезе сосудистых осложнений диабета. // Проблемы эндокринологии, 2000, т. 46, № 6, с. 29-34.

3. Бегдай И.В., Перцева М.Ю., Дацева Т.А., Воробьева Е.Г. Биотехнология восстановления первоначальных свойств питательных сред после культивирования микроорганизмов Ставрополь, Ставропольский гос. ун-т, 2005.

4. Бейли Дж, Оллис Д. Основы биохимической инженерии. М., «Мир», 1989, т.2, с.345-350.

5. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах // Соросовский образовательный журн., 2000, №4, с 71-78.

6. Гаврилов В.Б., Гаврилова А.Р., Мажуль JI.M. Анализ методов определения продуктов перекисного окисления липидов в сыворотке крови по тесту с тиобарбитуровой кислотой // Вопр. мед. химии, 1987, т.ЗЗ, № 1, с.118-122.

7. Дроздова Ю.И. Выделение и изучение свойств супероксиддисмутазы человека из рекомбинантного штамма дрожжей Saccharomyces cerevisiae -Автореф. дисс. канд. биол. наук. С-Пб., 1997,20с.

8. Ю.Дубинина Е.Е. Роль активных форм кислорода в качестве сигнальных молекул в метаболизме тканей при состоянии окислительного стресса // Вопр. мед.химии, 2001, т.47, №6, с.558-561.

9. П.Егоров Н.С. Промышленная микробиология. Учеб. пособие для вузов по спец. "Микробиология" и "Биология". М., Высш.шк., 1989, 688с.

10. Еремин А.Н. Соиммобилизация супероксиддисмутазы, каталазы. // Прикл.биохимия и микробиология, 2001, т.37, №1, с. 53-62

11. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. СПб, 1998, 156 с.

12. Клебанов Г. И., Теселкин Ю. О., Бабенкова И., Любицкий О. Б., Владимиров Ю. А. Антиоксидантная активность сыворотки крови // Вестник РАМН,1999, №2, с. 15-21

13. Коган А. X. Фагоцитзависимые кислородные-свободнорадикальные механизмы аутоагрессии в патогенезе внутренних болезней // Вестник РАМН, 1999, №2, с. 2-10.

14. Кожин С.А., Кожина Т.Н., Латыпов В.Ф., Королев В.Г. RAD29 и RAD31 -новые гены дрожжей Saccharomyces cerevisiae, участвующие в контроле репарации ДНК. Выяснение возможных функций этих генов. // Генетика,2000, №36, с. 1025-1032.

15. Кожина Т.Н., Кожин С.А., Латыпов В.Ф., Королев В.Г. RAD29 и RAD31 -новые гены дрожжей Saccharomyces cerevisiae, участвующие в контроле репарации ДНК. Изоляция и генетическое изучение мутантов. // Генетика, 2000, №36, с. 767-773.

16. Красильников И.В. Перспективы развития рынка рекомбинантных препаратов // Фармацевтический вестник, 2005, №16 (375), с.26.

17. Кулаев И.С. Бактериолитические ферменты микробного происхождения в биологии и медицине // Соросовский образовательный журн., 1997, № 3, с. 23-31.

18. Лебедев Л. Р., Сизов А. А., Масычева В. И., Карпенко Л. И., Рязанкин И. А. Молекулярный вектор для доставки генов в клетки-мишени // Биотехнология, 2001, №1, с. 3-12.

19. Морозов В.И. Участие активных форм кислорода в регуляторных процессах. В кн.: Фундаментальные и прикладные аспекты современной биохимии. Тр. науч. конф., посвященной 100-летию каф. биохимии СПбГМУ им. ак. И.П. Павлову.- СПб., 1998, с.398-400.

20. Нагоев Б. С., Иванова М. Р. Роль системы антиоксидантной защиты организма в патогенезе острых вирусных гепатитов // Терапевтический архив, Кабардино-Балкарский гос. ун-т им. X. М. Бербекова, 2003, №11, с. 37-41.

21. Пасечник И.Н., Азизов Ю.М., Никушин Е.В.и др. Роль окислительного стресса как компонента критических состояний в генезе нарушений гемостаза. // Анестезиология и реаниматология, 2001, №3, с. 41-43.

22. Скальный А. В., Кудрин А. В. Радиация, микроэлементы, антиоксиданты и иммунитет. М., 2000,427с.

23. Сойфер В.Н. Международный проект "Геном человека" // Соросовский образовательный журн, 1998, № 12, с. 4-11.

24. Соловьева Л.Я., Чурилова И.В., Княжев В.А., Калошин В.Г., Антипова Т.О., Федорова Н.М. Способ выделения супероксиддисмутазы. Патент РФ № 2186848, от 10 августа 2002 г.

25. Трубников Г.А., Журавлев Ю.И. Антиоксиданты в комплексной терапии больных хроническим бронхитом. // Росс. мед. журн., 1998, №2, с.38-41.

26. Чекнев С. Б. Активные метаболиты кислорода в обеспечении и контроле естественных цитотоксических реакций. // Вестник РАМН, 1999, № 2, с. 1015.

27. Черепак Л. Н., Деримедведь Л. В., Николенко В. В. Хронологическая зависимость противовоспалительного действия супероксиддисмутазы. // Провизор, 1998, №5, с. 41-43.

28. Шанин Ю.Н., Шанин В.Ю., Зиновьев Е.В. Антиоксидантная терапия в клинической практике. СПб., ЭЛБИ-СПб, 2003, 128 с.

29. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. 2-е изд., испр. и доп. -Новосибирск, 2004,496 с.

30. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы. СПб., «Игра», 2000,294 с.

31. Abachi Т., Nakamura М., Yamada Н., Futemna A. Quantitative and qualitative change of extracellular-superoxide dismutase in patients with various deseases. // Clinica Chimica Acta, 2004, №6, p.123-131.

32. Adams, D. O., HamiltonT.A. The cell biology of macrophage activation. // Annu. Rev. Immunol., 1984, №2, p.283-286.

33. Adler, К. В., Fischer B.M., Wright D.T., Cohn L.A., Becker S. Interactions between respiratory epithelial cells and cytokines: relationships to lung inflammation. // Ann. NY Acad. Sci., 1994, №725, p.128-130.

34. Aebi H. Catalase in vitro // Methods. Enzymol., 1984, Vol.2, №9, p.673 684.

35. Aggarwal, В. В., Natarajan K. Tumor necrosis factors: developments during the last decade. // Eur. Cytokine Network, 1996, №7, p.93-96.

36. Alekseev S.Y., Kovaltzova S. V., Fedorova I. V., Gracheva L.M., Evstuhina T.A., Peshehonov V.T., Korolev V.G. HSM2 (HMOl) gene participates in mutagenesis control in yeast Saccharomyces cerevisiae. // DNA Repair, 2002, №1, p.287-297.

37. Alvarez, S., Boveris A. Antioxidant adaptive response in human blood mononuclear cells exposed to UVB. // J. Photochem. Photobiol., 1997, № 38, p.152-156.

38. Bast A., Haenen G. Oxidants and antioxidants: State of the Art. Symposium on oxidants and antioxidants. // The Am. J. of Med., Vol.91, №3, p. 10.

39. Betteridge D. J. What is oxidative stress? // Metabolism, 2000, Vol. 49, №2, p.3-8.

40. Bogdan, C., Nathan C. Modulation of macrophage function by transforming growth factorp, interleukin-4, and interleukin-10. // Ann. NY Acad. Sci., 1993, №685, p.713-715.

41. Bosinski S.N., Krasnogorskaia V.N., Solomina E.V. Efficacy of direct revascularization of choroids in the treatment of atherosclerotic macular dystrophies // Vest Oftalmol., 1997, Vol.l 13, №4, p.35-37.

42. Chepurnaya O.V., Kozhina T.N., Peshekhonov V.T., Korolev V.G. The REC41 gene of Saccharomyces cerevisiae: isolation and genetic analysis. // Mutation Res., 2001, №486,41-52.

43. Collins, Т., Read M.A., Neish A.S., Whitley M.Z., Thanos D.A., Maniatis T. Transcriptional regulation of endothelial cell adhesion molecules: NF-кВ and cytokine-inducible enhancers. // FASEB J., 1995, №9, p.899-901.

44. Culotta V.C., Klomp L.W., Strain J.H., Casareno R.L., Krems B.I., Gitlin J.D. The copper chaperone for superoxide dismutase. // J. Biol. Chem., 1997, №272(38), p. 23469-23472.

45. Cuzzocrea S., Pisano В., Dugo L., Ianaro A., Ndengele M., Salvemini D. Superoxide- rel;ated Sigmnaling Cascade Mediates nuclear factor -kappa В activation in acute inflammation. // Antioxid. Redox. Signal., 2004, №6(4), p.699-704.

46. Das U.N. Beneficial effect(s) of n-3 fatty acids in cardiovascular diseases: but, why and how? // Prostaglandins Leukot. Essent. Fatty Acids., 2000, Vol. 63, №6, p. 351-621.

47. Fedorov A.A., Stoliarenko G.E. A pathological study of newly formed subpignent epithelial tissue in patients with senile macular dystrophy. // Vest. Oftalmol., 1998, Vol.114, №5, p.51-55.

48. Forman H. J., Torres M. Redox signaling in macrophages. // Mol. Aspects Med., 2001, №22, p.189-195.

49. Fridovich I. The biology of oxygen radicals. // Science, 1978, №201, p.875-878.

50. Fried R. Enzymatic and non-enzymatic assay of superoxide dismutase. // Biochemie., 1975, Vol. 57, p.657-660.

51. Froh M., Wheeler M.D., Smutney O., Zhong Z., Bradford B.U., Thurman R.G. New method of delivering gene-altered Kupffer cells to rat liver: studies in an ischemia-reperfusion model. // Gastroenterology, 2003, №124(1), p.172-83.

52. Gao В., Flores S.C., Leff J.A., Bose S.K., McCord J.M. Synthesis and antiinflammatory activity of a chimeric recombinant superoxide dismutase: SOD2/3. //Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol., 2003, №284(6), p.917-925.

53. Guerra E. J. I. Oxidative stress, diseases and antioxidant treatment. // An. Med. Interna., 2001, № 6, p.326 335.

54. Gui S.Y., Wei W., Wang H., Wu L., Sun W.Y., Chen W.B., Wu C.Y. Effects and mechanisms of crude astragalosides fraction on liver fibrosis in rats. // J. Ethnopharmacol., 2005, №27, p.46-49.

55. Gutteridge J.M.C., Tickner T.R. The characterization of thiobarbituric acid reactivity in human plasma and urine. // Anal. Biochem., 1978, Vol. 91, p.250-257.

56. Gutteridge J.M., Halliwell B. Free radicals and antioxidants in the year 2000. A historical look to the future. // Ann. NY Acad. Sci., 2000, №899, p.136-47.

57. Halliwell В. Reactive Oxygen Species in Living Systems Source, Biochemistry, and Role in Human Disease. // The Am. J. of Medicine, Vol.91, p.3-14.

58. Ibelgaufts H. Dictionary of cytokines. // VCH, 1995, №6, p.710-715.

59. Internotional conference on «Superoxide dismutases: Recent Advanses and Clinical Applications", May 14-15, 1998, Institut Pasteur. Paris, 1998, 125 p.

60. Fedorova I.V., KovaltzovaS.V., Korolev V.G. The Yeast HSM3 Gene Is Involved in DNA Mismatch Repair in Slowly Dividing Cells. // Genetics, 2000, №154, p. 495-496.

61. Jennings P. E. Vascular benefits of gliclazide beyond glycemic control // Metabolism, 2000, Vol.49, №10, p.17-20.

62. Kahl R., Kampkotter A., Watjen W., Chovolou Y. Antioxidant enzymes and apoptosis // Drug. Metab. Rev., 2004, Vol.36, №3-4, p.747-762.

63. Kamata H., Honda S., Maeda S., Chang L., Hirata H., Karin M. Reactive oxygem Species Promote TNF-alpha-induced death and sustained JNK activation by inhibiting MAP kinase phosphatases. // Cell., 2005, №120(5), p.649-661.

64. Knight J.A. Free radicals: their history and current status in aging and disease. // Ann. Clin. Lab. Sci., 1998, №28, p.331-346.

65. Landeghem G.F., Tabatabaie P., Beckman G., Beckman L., Andersen P. Manganese-containing superoxide dismutase signal sequence polymorphism associated with sporadic motor neuron disease. // Europ. J. of Neurol., 1999, №6, p.639-644.

66. Lee Kum-Tatt, Tan It-Koon. A new colorimetric method for the determination of glutathione in erythrocytes // Clinica Chimica Acta., 1974, Vol.53, p. 153-161.

67. Li Т., Huang X., Zhou R., Liu Y., Li В., Nomura C., Zhao J. Differential expression and localization of Mn and Fe superoxide dismutases in the heterocystous cyanobacterium Anabaena sp. strain PCC 7120. // J. Bacterid., 2002, №184(18), p.5096-50103.

68. Lindberg M.J., Normark J., Holmgren A., Oliveberg M. Folding of human superoxide dismutase: disulfide reduction prevents dimerization and produces marginally stable monomers. // Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 2004, №101(45), p.15893-15898.

69. Chen S., Wang H.T., Yang В., Fu Y.R., Ou Q.J. Protective effects of recombinant human growth hormone on cirrhotic rats. // World J. Gastroenterol., 2004, №10(19), p.2894-2897.

70. Liochev S.I., Fridovich I. Copper- and zinc-containing superoxide dismutase can act as a superoxide reductase and a superoxide oxidase. // J. Biol. Chem., 2000, №275(49), p.38482-28485.

71. Loguercio C., Federico A. Oxidative stress in viral and alcoholic hepatitis. // Free Radic. Biol. Med., 2003, №34 (1), p.1-10.

72. Luk E., Yang M., Jensrn L.T., Bourbonnais Y., Culotta V.C.Marganese activation of Superoxide dismutase 2 in mitochondria of Saccharomyces cerevisiae. // J.Biol.Chem., 2005, №25, p.38-41.

73. Malmstrom, B. G. Enzymology of oxygen. // Annu. Rev. Biochem., 1982, №51, p.21-25.

74. Marikovsky M., Ziv V., Nevo N., Harris-Cerruti C., Mahler O. Cu/Zn superoxide dismutase plays important role in immune response. // The J. of Immunology, 2003, №170, p. 2993-3001.

75. Mates J.M., Gomez C.P., Blanca M. Chemical and biological activity of free radical scavengers in allergic diseases. // Clin. Chim. Acta, 2000, №296, p.1-15.

76. Maytin M., Leopold J., Loscaizo J. Oxidant stress in the vasculature. // Curr. Atheroscler. Rep., 1999, Vol.2, №l,p.56-64.

77. Morrison, D. C., Ryan J.L. Endotoxins and disease mechanisms. // Annu. Rev. Med. 1987, №38, p.417-419.

78. Mruk D.D., Silvestrini В., Mo M.Y., Cheng C.Y. Antioxidant superoxide dismutase a review: its function, regulation in the testis, and role in male fertility. // Contraception., 2002, №65(4), p.305-11.

79. Ndengele M.M., Muscoli C., Wang Z.Q., Doyle T.M, Matuschak G.M., Salvemini D. Superoxide potentiates NF-kappa В activation and modulates endotoxin-induced cytokine production in alveolar mascrophages. // Shock, 2005, Vol.23, №2, p.186-193.

80. Ookawara Т., Eguchi H., Nishimura M., Kizaki Т., Takayama E., Saitoh D., Ohno H., Suzuki K. Effects of oxidative stress on the nuclear translocation ofextracellular superoxide dismutase. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, №303(3), p.914-924.

81. Pabst M. J., Johnston R.B. Increased production of superoxide anion by macrophages exposed in vitro to muramyl dipeptide or lipopolysaccharide. // J. Exp. Med., 1980, №151, p.101-104.

82. Paolisso G., Esposito R., DAlessio M.A., Barbieri M. Primary and secondary prevention of atherosclerosis: is there a role for antioxidants? // Diabetes Metab., 1999, №25(4), P.298-306.

83. Pawlak K., Pawlak D., Mysliwiec M. Hepatitis intensified Oxidative Stress, MIP-1 beta and RANTES plasma levels in uraemic patients. // Cytokine., 2004, №28(6), p. 197-204

84. Petrunia A.M., Iasid Abu Ebeid .Clinical and immunological characteristics of dystrophic diseases of the retina in cleaners up after Chernobyl AES accident. // Vest. Oftalmol., 2001, Vol.l 17, №2, p.25-27.

85. Rosen P., Xuellang Du, Guang-Zhi Sui. Antioxidants in diabetes managemen /Eds/ L. Parker et a. New York, 2000, p. 17-32.

86. Roversi F.M., Galdieri L.C., Grego B.H., Souza F.G., Micheletti C., Martins A.M., D'Almeida V. Blood oxidative stress markers in Gaucher disease patients. // Clin. Chim. Acta., 2005, № 23, p. 41-44.

87. Hernandez-Saavedra D., Zhou H., McCord J.M. Anti-inflammatory properties of a chimeric recombinant superoxide dismutase: SOD2/3 // Biomed. Pharmacother., 2005, № 59(4), p.204-208.

88. Ken C.F., Lin C.T., Shaw J.F., Wu J.L. Characterization of fish Cu/Zn-superoxide dismutase and its protection from oxidative stress. // Mar. Biotechnol. (NY), 2003, №5(2), p. 167-173.

89. Liu Y., Borchert G.L., Donald S.P., Surazynski А., Ни C.A., Weydert C.J., Oberley L.W., Phang J.M. MnSOD inhibits proline oxidase-induced apoptosis in colorectal cancer cells. // Carcinogenesis., 2005, №26(8), p.1335-1342.

90. Ryzhova L.S. The hemodynamics of the brain and eye in patients with presenile and senile nonexudative central chorioretinal dystrophy during health resort treatment. // Vest. Oftalmol., 1992, Vol.108, №4-6, p.21-23.

91. Sakashita A., Epstein C.J., Carlson E., Koeffler H.P. Hematopoietic progenitor cells of transgenic mice with increased copper/zinc-superoxide dismutase activity are resistant to tumor necrosis factor. // J. Cell. Physiol., 1994, №160, p.233-235.

92. Sanches-Campos S., Alvares M., Culebras J.M, Gonzales-Gallego J, Tunon M.J. Pathogenic molecular mechanisms in an animal model of fulminant hepatic failure: rabbit hemorrhagic viral disease. // J. Lab. Clin. Med., 2004, №144(4), p.215-222.

93. Saugstad O.D. Chronic lung disease: the role of oxidative stress. // Biol. Neonate., 1998, №74, p.21-28.

94. Shirshikov Iu.K., Eliseeva E.G., Perchikova O.I. Ultrasound in the diagnosis of macular pathology of the eye. //Vest. Oftalmol., 1991, Vol.107, №4, p.42-46.

95. Chung J., Yang H., De Beus M.D., Ryu C.Y., Cho K., Colon W. Cu/Zn superoxide dismutase can form pore-like structures. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, №312(4), p.873-876.

96. Sindhu R.K., Koo J.R., Roberts C.K., Vaziri N.D. Dysregulation of hepatic superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in diabetes: response to insulin and antioxidant therapies. //.Clin. Exp. Hypertens., 2004, №26(1), p.43-53.

97. Solas A.B., Kalous P., Davis J.M., Saugstad O.D. Effects of recombinant human superoxide dismutase during reoxygenation with 21% or 100% oxygen after cerebral asphyxia in newborn piglets. // Matern. Fetal. Neonatal. Med., 2003, №14(2)6 p.96-101.

98. Soldatova A.M., Voskresenckii O.N. Antioxidant vitamins and age-related retinal dystrophy. // Vopr. Med. Khim., 1994, №40(2), p.2-6.

99. Suzuki K. Effects of oxidative stress on the nuclear translocation of extracellular superoxide dismutase. // Biochem. Biophys. Res. Commun., 2003, №303(3), p.914-919.

100. Toyokuni S. Reactive oxygen species-induced molecular damage and its application in pathology. // Pathol. Int., 1999, №49(2), p.91-102

101. Wang Z., He Z., Shen Q., Gu Y., Li S., Yuan Q. Purification and partial characterization of recombinant Cu, Zn containing superoxide dismutase of Cordyceps militaris in E.coli. // J. Chromatogr. Analyt. Technol. Biomed. Life. Sci., 2005, № 5, p.826.

102. Zhang Y., Wang J.Z., Wu Y.J. Gene cloning, expression and purification of its production of recombinant human superoxide dismutase. // Sheng. Wu. Gong. Cheng. Xue Bao., 2000, №16(5), p.557-560.