Выделение и изучение белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2

Барыкова, Юлия Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Выделение и изучение белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Выделение и изучение белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2"

Барыкова Юлия Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИЙ РОЖИ СВИНЕЙ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВР-2.

03.00.23.- биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Барыкова Юлия Александровна

ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ БЕЛКОВЫХ КОМПОНЕНТОВ БАКТЕРИЙ РОЖИ СВИНЕЙ ВАКЦИННОГО ШТАММА ВР-2.

03.00.23.- биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Работа выполнена в отделе иммунологии Всероссийского научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности (ВНИТИБП) РАСХН.

Научные руководители: доктор биологических наук

Клюкина Валентина Ивановна

доктор ветеринарных наук Апалькин Виктор Александрович

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Белоусов Василий Иванович

кандидат ветеринарных наук, Тихонов Леонид Иванович

Ведущая организация: ГНУ« Всероссийский научно-

исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р.Коваленко».

Защита диссертации состоится 23 декабря 2005 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01. во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП.

Автореферат разослан «21» ноября 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Ю.Д.Фролов

рос. национал н библиотек . С-ПетеЛург 01Г9\ 08 Ш3 кт/УУ ,

¿¿39SVJ,

1. Общая характеристика работы

1.1. Актуальность темы. Рожа свиней, вызываемая бактерией Егу-sipelothrix rhusiopathiae - септическое антропозоонозное инфекционное заболевание, поражающее преимущественно свиней в возрасте от 3 до 12 месяцев, реже животных других видов, а также человека (Панин А.Н., 2000г., Малахов Ю.А., Душук Р.В., 2001г.). Болезнь широко распространена и наносит значительный экономический ущерб вследствие гибели, абортов, мертворо-ждаемости (Воронин Е.С., Романова М.В., 1987г.).

Эффективность противорожистых биопрепаратов во многом зависит от иммуногенных и антигенных свойств штаммов, используемых для их изготовления. Многие ученые приложили немало труда для изыскания биопрепаратов для диагностики и профилактики рожи свиней (Горбунова Н.В., 1988г., Душук Р.В., Подлесных Л.А., Тихонов Л.И., 1999г., Олейник А. В., 2002г., Клкжина В.И, Моисеева Н.А., 1998., Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., 2000г. и др.).

Однако, несмотря на наличие в РФ высокоэффективных средств профилактики ежегодное количество вновь регистрируемых неблагополучных хозяйств уменьшается незначительно. По материалам официальных отчетов ветеринарных служб РФ показано, что по наличию выявленных неблагополучных пунктов и уровню летальности рожа свиней занимает 7 место среди 14 наиболее распространенных инфекционных болезней свиней. По проценту к общему количеству прививок рожа свиней занимает второе место (после чумы свиней) (Рахманов A.M., Яременко Н.А. 2003).

Многочисленные исследования посвящены изучению белков эризи-пелотриксов и направлены на поиск иммунизирующих антигенов, обеспечивающих иммуногенные свойства противорожистых вакцин.

Так, имеются несколько сообщений Kobayashi S. et al., 1991г., Sato Н., Yamazaki Y. et al., 1998г., посвященных выделению и изучению антигеноак-тивных белков Е. rhusiopathiae, способных защитить от рожи свиней. Оказалось, что многие вакцинные штаммы, например, Marienfelde, AN-4, SE-9, 2179, Agata, Koganei и др. отнесенные к различным сероварам (1а, 2, 5, 10, 20), продуцируют в культуральную жидкость в больших концентрациях белки с молекулярной массой 64-65 кДа, которые и являются, по мнению иссле-

дователей, иммунодоминантными белками, играющими значительную роль в защите от инфекции.

В настоящее время среди средств специфической профилактики рожи свиней самым распространенным препаратом является сухая живая вакцина из штамма ВР-2, обладающая наиболее высокими иммуногенньгми свойствами и слабой реактогенностью (Скичко Н.Д., Мельник Н.В, Зенов Н.И., 1996 г., Ярцев М.Я., 1993 г. и др.).

Однако в доступных нам литературных источниках обнаруживаются лишь незначительные сведения о антигенноактивных белках штамма ВР-2 бактерий рожи свиней, их иммунобиологических особенностях и участии в выработки антител. Поэтому более детальное исследование белков бактерий рожи свиней штамма ВР-2 является актуальным.

1.2. Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось выделение и изучение фракционного состава и серологической активности белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать методы получения белковых экстрактов и отдельных белков бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2;

- изучить серологическую активность полученных белковых экстрактов и отдельных белков;

- получить гипериммунные сыворотки на мышах на белковые компоненты и выделенные белки и изучить их активность и специфичность в РА, РДП, ИФА;

- разработать тест-систему ИФА для определения уровня антител в гипериммунных антиэризипелотриксных сыворотках.

1.3.Научная новизна. Впервые выделены белки с м.м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа бактерий рожи свиней штамма ВР-2 и изучена их серологическая активность и иммунизирующие свойства.

Впервые установлено, что белок с м.м. 25 кДа, выделенный из бактериальной клетки вакцинного штамма ВР-2 является видоспецифическим и может быть использован для определения антиэризипелотриксных антител.

Установлено, что белок с м.м. 12 кДа является типоспецифическим и может быть использован для оценки поствакцинального иммунитета.

Разработана тест-система ИФА на основе белков с м. м. 12 кДа и 25 кДа для определения уровня антител в противорожистых сыворотках.

1.4. Практическая значимость исследований. На основании результатов проведенных исследований:

1. Разработаны технология получения компонентов и тест-система ИФА на основе белков м. м. 12 кДа и м. м. 25 кДа, которые могут быть использованы для выявления антиэризипелотриксных антител в сыворотках крови животных.

2. Разработаны проект нормативно-технической документации на тест-систему ИФА и методика определения антиэризипелотриксных антител к роже свиней, которые рассмотрены на методической комиссии ВНИТИБП и утверждены директором института.

1.5. Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 29-ой научной студенческой конференции МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва (19-20 мая 2003 г.); на международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», г. Щелково (5-6 октября 2004 г.); на международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 35-летию ВНИТИБП, г. Щелково (26-27 мая 2005 г.).

1.6. Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 10 научных статей.

1.7. Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 124 страницах машинописного текста, и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения, список литературы, включающий 247 наименований, из которых 173 отечественных и 74 зарубежных источников, и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 16 рисунками.

2. Собственные исследования

2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в отделе иммунологии ВНИТИБП РАСХН в рамках программы фундаментальных и прикладных исследований по научному обеспечению развития агропромышленного комплекса Российской Федерации на 2001-2005 гг., в соответствии с плановой научно-исследовательской тематикой.

В работе использовали готовые серии сухой противорожистой вакцины штамма ВР-2 и баккультуру бактерий рожи, типичную по морфологии, культуральным свойствам, полноценной по антигенным свойствам, полученные со Щелковского биокомбината.

Ультразвуковой гомогенат получали обработкой 30 мл отмытой бактериальной суспензии с концентрацией клеток 4 млрд/мл ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т при частоте 22 кГц с использованием четырех режимов: импульсно 5,10,15 и 20 раз по 10 сек.

Щелочной гидролизат получали обработкой 10 мл суспензии бактериальных клеток с концентрацией 40 млрд/мл экстракцией 0,1 Н раствором NaOH в течение 16 часов при 14°С. Надосадок, полученный после центрифугирования при 10000 об/мин в течение 20 мин, нормализовали добавлением 1 Н НС1 до рН 7,2-7,4.

Автолизат получали из 40 мл бактериальной суспензии клеток с концентрацией 30 млрд/мл в забуференном физиологическом растворе (ЗФР, рН 7,2-7,4) выдерживанием в течение двух месяцев при 4°С. Пробы отбирали на 20,40 и 60 сутки и центрифугировали при 10000 об/мин в течение 20 мин.

Термоэкстракт получали из 10 мл бактериальной суспензии клеток с концентрацией 10 млрд/мл в ЗФР с рН 7,2-7,4 автоклавированием в течение 1 часа при t 121°С (1 атм), с последующим центрифугированием при 4000 об/мин в течение 40 мин.

Полученные после центрифугирования осадки исследовали на полноту разрушения клеток микроскопически с окраской по Граму.

Фракционный состав выделенных белковых экстрактов изучали гель-фильтрацией на колонке размером 2x60 см фирмы Pharmacia (Швеция), за-

полненной сефадексом G-200 в 50 мМ трис-HCl буфере рН 8,0 с 2 мМ ЭДТА, или ЗФР рН 7,2.

Фракции собирались на автоматическом коллекторе в количестве 2-3 мл. Измерение ОП полученных фракций проводили на ФЭК-60 при 1=600 нм. Общий белок определяли по методу Лоури (1956 г.).

Серологическую активность белковых компонентов и выделенных белков контролировали в РДП и ИФА.

В исследованиях применяли гипериммунные сыворотки, которые получали иммунизацией мышей сухой противорожистой вакциной с концентрацией клеток 3-4 млрд./мл; белковыми экстрактами и белками м.м. 300, 250,65,25 и 12кДа, которые доводили до содержания белка 200 мкг/см3.

Сыворотку на цельные бактериальные клетки получали иммунизацией мышей сухой противорожистой вакциной, которую вводили 4 раза с недельным интервалом 50-и мышам массой 17-18 гр. подкожно в область спины по 0,5 см3. Через 7 дней после последней инъекции брали кровь и получали сыворотки.

Сыворотки на белковые экстракты и выделенные белки получали иммунизацией мышей, которым вводили белковые препараты с адъювантом Фрейда („Sigma") дважды подкожно в область спины по 0,5 см3. Через три недели после последней иммунизации брали кровь и получали сыворотки.

В исследованиях также применяли 125 сывороток от свиней из СПК «Новое Литвиново», взятые до и после вакцинации сухой противорожистой вакциной штамма ВР-2.

В качестве контрольных свиных антиэризипелотриксных сывороток использовали: референс-сыворотку к штамму ВР-2 (ВГНКИ); интернациональный стандарт к серотипу N (International Standart for swine erysipelas serum, anti-N, Великобритания); производственную противорожистую сыворотку на штаммы (1329, 1689-серотип 1, 1933-9/2-серотип 2), производства Армавирской биофабрики; отрицательные и специфические к другим инфекциям сыворотки.

Реакцию агглютинации (РА) проводили по общепринятой методике. В качестве антигена использовали суспензию клеток бактерий рожи штамма ВР-2 с концентрацией 2-3 млрд/мл.

Реакцию имму но диффузии по Ухтерлони (РДП) ставили по общепринятой методике (1967 г).

Для разработки тест-системы ИФА использовали непрямой твердфаз-ный метод ИФА на 96-луночных микроплатах по Engvall.

Для проведения непрямого твердофазного ИФА, в лунки микроплат сорбировали антигены, в рабочей концентрации и выдерживали в течение 18 часов при 4 °С. Затем планшеты отмывали и инкубировали с контрольными и исследуемыми сыворотками в разведениях от 1:128 до 1:32768 в течение 1,5 часов при 37 °С. После инкубации и промывки к образовавшемуся Аг-Ат комплексу добавляли анти-IgG (H+L) коньюгат свиньи или мыши в рабочем разведении.

Реакцию учитывали фотометрически по показаниям ОП492 на считывающем устройстве «Sigma» и выражали в единицах иммуноферментного анализа (ЕД ИФА).

Цифровые данные подвергали статистической обработке величин и их ошибок по методикам Рокицкий П.Ф., 1967; Автандилов Г.Г., 1973.

2.2. Результаты исследований

Выделение и изучение фракционного состава белковых экстрактов клеток бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2.

Получение и изучение фракционного состава ультразвукового гомогената бактерий рожи свиней.

УЗ-гомогенат получали обработкой бактериальных клеток ультразвуком на дезинтеграторе УЗДН-2Т и частоте 22 кГц. В процессе работы подбирали режим УЗ-дезинтеграции, приводящей к полному разрушению микробных клеток: I режим - импульсно 5 раз по 10 сек; II режим -10 раз по 10 сек; III режим -15 раз по 10 сек; IV режим -20 раз по 10 сек.

Установлено, что полное разрушение микробных клеток (100%) отмечено после УЗ-дезинтеграции по IV режиму. Полученный УЗ-гомогенат был использован для выделения белков на колонке, заполненной сефадексом G-200.

Для определения молекулярных масс выделенных белков колонку предварительно калибровали с использованием белков известной молекулярной массы (белки-метчики). В качестве белков-метчиков использовали IgG

свиньи м. м.160 кДа и сывороточный альбумин человека м. м. 65 кДа. Калибровка колонки белками с известной молекулярной массой позволила получить линейную зависимость ^М от доступной константы Ка„ позволяющей определять молекулярную массу исследуемых белков.

Результаты фракционирования УЗ-гомогената представлены на рис. 1.

штт^яттттятжшв'

тш№гяттж.&№шшт шттггттшштшятя mmmms и >я тшш&шшшш шмттттгжшшшлт шттш ш тттшшшш ттт т:ш»шшлт»

:«ws# ■ ■ . - -i *г А

£ Ш

I а

Рис 1. Фракционирование УЗ-гомогената клеток бактерий рожи свиней и определение молекулярных масс белков.

Результаты фракционирования УЗ-гомогената на колонке с сефадек-сом G-200 свидетельствуют, что экстракт разделился на пять отдельных пиков. Основная масса белков выходила в I и II пиках (17,4% и 16%), представляющих собой крупномолекулярные фракции, имеющие м. м. 300 и 250 кДа.

До 15% белка м. м. 25 кДа выходило в IV пике, 5% белка м. м. 65 кДа выходило в III пике и всего 3% белка м. м. 12 кДа - в V пике.

В последующих опыта УЗ-гомогенат был использован при иммунизации мышей и в качестве антигена для постановки серологических реакций.

Получение и изучение фракционного состава щелочного гидролизата бактерий рожи свиней.

За основу получения щелочного гидролизата была взята методика Н. Sato, Y. Yamazaki (1998 г.) обработки клеток бактериальной суспензии сероваров 1а, 2, 5 и 20 Е. rhusiopathiae щелочью.

В нашей модификации стадия осаждения белков сульфатом аммония была опущена и гидролизат перед фракционированием на колонке нормализовали до pH 7,2-7,4 с помощью 1Н HCl.

Результаты фракционирования щелочного гидролизата представлены на рис. 2.

Рис. 2. Фракционирование щелочного гидролизата клеток бактерий рожи свиней и определение молекулярных масс белков.

Из рис. 2 видно, что в результате фракционирования щелочного гидролизата было получено два пика. Один, слабовыраженный пик состоял из крупномолекулярных белков м. м. 300 и 250 кДа. Другой, острый и высокий был представлен низкомолекулярным белком м.м. 12 кДа. Выход белков в I пике составил 7,2%, во II пике - 58%.

Получение и изучение фракционного состава автолизата бактерий рожи свиней.

Автолизат получали выдерживанием клеток бактерий рожи в ЗФР рН 7,2-7,4 в течение 2-х месяцев при 4°С с отбором проб на 20,40 и 60 сутки. Максимальный выход белковых компонентов был установлен у автолизного материала, полученного после 2-х месячной выдержки.

Результаты фракционирования автолизата представлены на рис. 3.

Рис. 3. Фракционирование автолизата клеток бактерий рожи свиней и определение молекулярных масс белков.

Результаты фракционирования автолизата на колонке с сефадексом в-200 показали, что было получено 5 пиков, содержащих белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа. Максимальный выход белка м. м. 25 кДа (52,5%) наблюдали в 4 пике.

При микроскопическом исследовании целостности клеток бактерий подверженных автолизу, обнаружены как целые микробные клетки, так и разрушенные.

Получение и изучение фракционного состава термоэкстракта бактерий рожи свиней.

Термоэкстракт получали авто «лавированием бактериальных клеток в течение 1 часа при X 121°С (1 атм.). Результаты фракционирования полученного препарата представлены на рис. 4.

Рис. 4. Фракционирование термоэкстракта клеток бактерий рожи свиней и определение молекулярных масс белков.

Из рис. 4 видно, что материал термоэкстракта выходил с колонки в виде широкого, «размазанного» пика, содержащего 54% м.м. менее 12 кДа и всего 8% белка м.м. 12 кДа.

Анализ результатов получения и изучения фракционного состава белковых экстрактов и белков бактерий рожи свиней.

В результате проведенных исследований установлено, что предложенные методы позволяли получать белковые экстракты, из которых были выделены отдельные белки с различной молекулярной массой.

Фракционирование УЗ-гомогената позволило получить максимальное количество белков м.м. 300 кДа (17,4%), 250 кДа (16%) и 25 кДа (15%). Белок м.м. 65 кДа, известный как иммунодоминантный для других серова-ров, из клеток штамма ВР-2 извлекался в незначительной концентрации -

5%. белок м.м. 12 кДа - 3%. Фракционирование щелочного гидролизата позволило получить значительное количество белка м.м. 12 кДа (58%), автоли-зата - м.м. 25 кДа (52,5%), а термоэкстракта - с м.м. менее 12 кДа (54%).

Таким образом, в результате исследований разработаны методы и подобраны необходимые условия, позволяющие избирательно экстрагировать из клеюк бактерий рожи свиней штамма ВР-2 белки разной молекулярной массы. Исключение составил белок м. м. 65 кДа, который был извлечен из клеток бактерий в минимальном количестве.

Изучение серологической активности белковых экстрактов и выделенных белков в РА, РДП и ИФА.

Исследование контрольных антиэризипелотриксных сывороток в реакции агглютинации.

В предварительных опытах все контрольные антиэризипелотриксных сыворотки были исследованы в РА, начиная с разведения 1:32. В качестве антигена для РА использовали суспензию клеток бактерий рожи штамма ВР-2 с концентрацией 2-3 млрд/мл. Специфичность в РА подтверждали исследованием сывороток от клинически здоровых невакцинированных животных и специфических сывороток к другим инфекциям (бруцеллезной, сальмонел-лезной, пастереллезной и лептоспирозной) сывороток.

Результаты постановки РА представлены в табл. 1.

Таблица 1

Результаты исследования сывороток в РА

Сыворотки Титры антител в сыворотках (1оя2) Средний титр (М±ш)

1 2 3 4 5 6 7

Гипериммунная к серовариантам 1 и 2 12а 13 12 12 13 13 12 12,4±0,15

Референс к Штамму ВР-2 13 13 13 13 14 14 13 13,3±0,17

Стандартная к Серотипу N 14 13 13 14 14 14 14 13,7±0,16

Отрицательные 0 0 0 0 0 0 0 0

Специфические к другим инфекциям 0 0 0 0 0 0 0 0

Примечание. А - величина соответствует разведению сыворотки 1 4096; 131о& -1:8192; 141о£2 ~ 1:16384.

Из представленных результатов в табл. 1 видно, что гипериммунная сыворотка к серовариантам 1 и 2 в РА имела титр 1:4096 - 1:8192 (12,4±0,15 1с^2). Референс-сыворотка к штамму ВР-2 и стандартная сыворотка к сероти-пу N. имели более высокие титры - 1:8192-1:16384 (13,3±0,17, 13,7±0,16 Исследование в РА сывороток здоровых животных и гетерологичных сывороток показало отрицательный результат. В дальнейших исследованиях РА была использована в качестве базовой реакции для выявления антител в сыворотках иммунизированных мышей и вакцинированных свиней из СПК «Новое Литвиново».

Изучение серологической активности белковых экстрактов и белков в реакции диффузионной преципитации

Серологическую активность белковых экстрактов и белков устанавливали в РДП с гомологичными и гетерологичными сыворотками.

Установлено, что УЗ-гомогенат и автолизат активно реагировали в РДП со всеми антиэризипелотриксными сыворотками в титрах 1:8-1:64. Щелочной гидролизат реагировал только с референс-сывороткой к штамму ВР-2 в тирах 1:16-1:32. Термоэкстракт не обладал нреципитирующей активностью. Гетерологичные сыворотки не реагировали ни с одним из экстрактов. Результаты исследования в РДП белков штамма ВР-2 представлены в табл. 2.

Таблица 2

Серологическая активность в РДП белков разной _молекулярной массы_

БелкиА (м.м. в «Да) Обратный титр антигенов с сыворотками антител

Референс к штамму ВР-2 Междунар. Стандарт к серотипу N Гипериммунная к сероварам 1 и 2 Отрицательные Гетерологичные

300 0 0 0 0 0

250 0 0 0 0 0

65 0 0 0 0 0

25 32-64 64-128 (9,4 мкг/мл)в 16-32 0 0

12 32 0 0 0 0

Примечание: А - исходная концентрация белка » 1200 мкг/мл; В - концентрация белка, еще дающая видимую полосу преципитата в геле.

Анализируя результаты РДП, можно сделать заключение, что активно реагирующими в РДП являются только белки с м. м. 25 и 12 кДа. Белок с м. м. 25 кДа может быть отнесен к видоспецифическому, так как проявил высокую активность в РДП со всеми сыворотками, образуя преципитаты даже при минимальной концентрации - 9,4 мкг/мл. Белок с м. м. 12 кДа является, по-видимому, типоспецифическим для штамма ВР-2, поскольку реагировал только с референс-сывороткой, полученной на данный штамм. Белки с м. м. 300,250 и 65 кДа в реакции РДП были неактивны со всеми сыворотками.

На рис. 5 представлены результаты РДП по определению антигенной идентичности белков с м.м. 12 и 25 кДа.

Рис. 5. РДП на идентичность белков с м.м. 12 и 25 кДа.

В результате выявлены две самостоятельные пересекающиеся линии преципитации, указывающие на различие исследуемых белков с м.м. 12 кДа и 25 к Да.

Изучение серологической активности выделенных белков в иммуноферментном анализе.

Серологическую активность выделенных белков исследовали в непрямом твердофазном ИФА на 96-ти луночных микроплатах по методу Eng-уа11.

Результатами подбора оптимальной сенсибилизирующей дозы на лунку микроплат установлено, что максимальная интенсивность ИФА регистрировалась при концентрации белков 5-10 мкг/мл, которая формировала высокий уровень оптической плотности и достоверное различие результатов с положительной ( ОП492 1,34-1,62), отрицательной (ОП492 0,04+0,01) и специфическими к другим инфекциям (ОП492 0,063+0,03) сыворотками.

Определение антител в антиэризнпелотриксных сыворотках в ИФА с использованием выделенных белков.

Определение антител в антиэризнпелотриксных сыворотках методом ИФА проводили по следующей схеме:

1) сорбция белков известной молекулярной массой на твердой фазе в концентрации 5-10 мкг/мл;

2) внесение в лунки микроплат с адсорбированными белками антиэризнпелотриксных, отрицательных и специфических к другим видам инфекции сывороток в двукратных разведениях от 1:128 до 1:32768;

3) инкубация с антивидовым иммунопероксидазным коньюгатом ан-ти-^О свиньи в рабочем разведении 1:2000 или анти-^С мыши 1:1 ООО;

4) внесение субстратного раствора и учет результатов ИФА.

Результаты определения антител в ИФА представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты определения антиэризипелотриксных антител в сыворотках свиней методом ИФА_____

Сыворотки Титр антител в сыворотках (1о£г) с белкамиА

300 кДа" 250 кДа 65 кДа 25 кДа 12 кДа <12 кДа

Гипериммунная к сероварам 1 и 2 12,6е 13,3 12,6 13,6 0 0

Референс к штамму ВР-2 13,3 13,7 7,6 14,3 10,5 0

Международный стандарт к серотипу N 13,3 13,6 8,7 14,6 0 0

Специфические сыворотки к другим инфекциям 0 0 0 0 0 0

Отрицательные 0 0 0 0 0 0

Примечание' А - цифровые данные представляют среднее значение арифметической величины (М) с ошибкой (ш) в пределах 3-5%, В - рабочая концентрация сорбируемых антигенов 5-10 мкг/мл; С - величина 71о& соответствует разведению 1.128; 8^2 соответст-вуег разведению 1:256; 9^2 соответствует разведению 1-512; 12^2 соответствует разведению ) 4096; 13^2 соответствует разведению 1:8192; !41о^ соответствует разведению 1:16384.

Установлено, что максимальную активность в ИФА проявили все сыворотки к белку с м.м. 25 кДа в титрах 13,6-14,6 1о§2. С белками с м.м. 250 кДа и 300 кДа они реагировали со средней активностью в титрах 12,6-13,7

\og2- Наименьшая активность выявлена у референс и стандартной сывороток к белку с м.м. 65 кДа в титрах 7,6 и 8,7 log2. Более активно с данным белком реагировала только гипериммунная сыворотка к серовариантам 1 и 2 в титре 12,61олг.

Что касается белка с м.м. 12 кДа, то с ним прореагировала только ре-ференс-сыворотка на штамм ВР-2.

Изучение серологической активности выделенных белков в РДП и ИФА показало, что из пяти белков в РДП реагировали только два белка с м. м. 12 и 25 кДа, а в ИФА - пять белков с м. м. 300,250,65,25, 12 кДа.

Белок с м.м. 25 кДа реагировал в РДП и в ИФА как с референс-сывороткой к штамму ВР-2, так и с сывороткой на сероварианты 1, 2 и сывороткой на серотип N. В отличие от белка с м. м. 12 кДа, который реагировал в обеих реакциях только с сывороткой к штамму ВР-2.

Следовательно, с большой долей вероятности можно утверждать, что белок с м.м. 12 кДа является основным дифференцирующим (типоспецифи-ческим) белком штамма ВР-2, который не был обнаружен исследователями ранее, а белок с м.м. 25 кДа является видоспецифическим белком, активно реагирующим как в ИФА, так и в РДП со всеми антиэризипелотриксными сыворотками.

Получение гипериммунных сывороток на мышах и изучение их активности и специфичности в серологических реакциях.

В результате иммунизации мышей цельными микробными клетками, УЗ-гомогенатом и белками с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа были получены гипериммунные сыворотки активность и специфичность которых исследовали в РА, РДП, ИФА.

Изучение активности и специфичности гипериммунных сывороток мышей в РА и РДП.

В данном разделе мы предприняли попытку выяснить какие белки бактерий штамма ВР-2 наиболее активно индуцируют выработку антител в организме иммунизированных мышей. Для этого полученные сыворотки мышей исследовали в РА.

Результаты изучения сывороток в РА представлены в табл. 4.

Таблица 4

Результаты исследования сывороток иммунизированных мышей в РА

Антиген для РА Сыворотка мышей на (обратные титры) Сыворотка мышей к белкам м.м. (кДа) (обратные титры)

цельные клетки УЗ-гомогенат 300 250 65 25 12

Бактер. клетки штамма ВР-2 Ю24-2048А Ю,71о&в 32-64 5,31о& 32-64 5,31о& 32-64 5,51og2 8-16 3,31og2 32-64 5,251og2 64-128 6,71ofe

Примечание. А - цифровые данные представляют среднюю арифметическую величину (М) для п=3 с ошибкой (т) в пределах 3-5%.

Анализ результатов, представленных в табл. 4 свидетельствует о том, что наиболее активной в РА оказалась сыворотка, полученная на введение цельных микробных клеток. В 32-64 раза менее активно реагировали сыворотки, полученные на УЗ-гомогенат и белки с м.м. 300,250 и 25 кДа.

Минимальную активность проявила сыворотка, полученная на белок с м.м. 65 кДа (обратные значения титров 8-16). Достаточно высокую активность проявила сыворотка, полученная на типоспецифический белок штамма ВР-2 с м.м. 12 кДа (64- 128).

Для выяснения вопроса, какие белки ответственны за выработку пре-ципитирующих антител, полученные сыворотки исследовали в РДП.

Результаты исследования сывороток иммунизированных мышей в РДП представлены в табл. 5.

Таблица 5

Результаты исследования сывороток иммунизированных мышей в РДП

Белковый антиген с м.м. (кДа) Сыворотка мышей, получ. на цельные клетки (обратные титры) Сыворотка мышей к белкам м.м., кДа (обратные титры)

300 250 65 25 12

300 0 0 0 0 0 0

250 0 0 0 0 0 0

65 0 0 0 0 0 0

25 8-16 0 0 0 4-8 0

12 8-16 0 0 0 0 4-8

Из табл. 5 видно, что сыворотка, полученная иммунизацией мышей цельными бактериальными клетками, реагировала в РДП только с белками с м.м. 12 кДаи 25 кДа.

Исследование сывороток мышей, полученных на белки с м. м. 300, 250 и 65 кДа показали в РДП отрицательный результат. В то же время сыворотки мышей к белкам с м. м. 12 кДа и 25 кДа реагировали только с гомологичными белками.

Анализируя представленные результаты можно сделать заключение о том, что наряду с цельными микробными клетками только два белка с м.м. 12 кДа и 25 кДа способны индуцировать выработку преципитирующих антител в организме иммунизированных мышей.

Изучение активности и специфичности сывороток мышей в ИФА.

Для исследования сывороток от иммунизированных мышей, полученных на цельные микробные клетки и на отдельные белки, использовали, кроме методов РА, РДП, метод непрямого твердофазного ИФА. Результаты титрования сывороток мышей в ИФА представлены в табл. 6.

Таблица 6

Результаты исследования в ИФА сывороток мышей

Белковый антиген м.м. (кДа) Сыворотка мышей, получ. на цельные клетки (обратные титры 1о&)А Сыворотка мышей к белкам м.м., кДа (обратные титры 1оя2)

300 250 65 25 12

300" 11,3е 10,7 5,7 0 0 0

250 11,7 6,2 11,3 0 0 0

65 3,7 0 0 3,7 0 0

25 12,0 0 0 0 11,7 0

12 10,7 0 0 0 0 10,7

Примечание: А - цифровые данные представляют среднюю арифметическую величину (М) для п=3 с ошибкой (т) в пределах 3-5%; В - рабочая концентрация сорбируемых антигенов 5-10 мкг/мл; С - величина 3,7к^г соответствует разведению 1:13; 5,71оф соответствует разведению 1.52; 6,21о|й соответствует разведению 1:74; 10,71с^2 соответствует разведению 1:1663; 11,31о)»2 соответствует разведению 12521; 11,7^2 соответствует разведению 1:3327; 12,0^2 соответствует разведению 1:4096.

Из табл. 6 видно, что максимальную активность сыворотка мышей, полученная на цельные бактериальные клетки, проявляла с белками с м. м. 25 кДа (титры 12^), 250 кДа (титр 11,71о&), 300 кДа (титр 11,31од2), 12 кДа (титр 1 0,71о£2). Наименьшая активность выявлена у данной сыворотки с белком с м.м. 65 кДа (титр 3,71о&).

Что же касается сывороток мышей, полученных на белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа, то они активно реагировали только с гомологичными белками. Так, сыворотка мышей, полученная на белок с м. м. 12 кДа, реагировала только с белком с м. м. 12 кДа в титрах 10,71о&, сыворотка мышей к белку м. м. 25 кДа реагировала только с белком с м. м. 25 кДа в титрах 11,71о£г, а сыворотка мышей к белку с м. м. 65 кДа реагировала только с белком с м. м. 65 кДа в титрах Ъ,1\о%г-

Установлено также, что небольшие перекрестные реакции были отмечены при исследовании сывороток мышей, полученных на белки с м. м. 300 и 250 кДа.

Таким образом, при иммунизации мышей цельными микробными клетками, УЗ-гомогенатом и белками с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа были получены специфические сыворотки, активно реагирующие в РА, РДП и ИФА.

Разработка тест-системы ИФА для определения антиэризипелотриксных антител.

Выделенные белки м.м. 12 кДа и 25 кДа были использованы при разработке тест-системы ИФА для выявления антиэризипелотриксных антител. Были исследованы 12 сывороток от клинически здоровых невакцинирован-ных свиней , 125 сывороток крови вакцинированных свиней из СПК «Новое Литвинове». Также были исследованы 4 сыворотки от людей, с установленным диагнозом -рожистое заболевание. Предварительно все сыворотки были исследованы в РА. Чувствительность и специфичность тест-системы ИФА была подтверждена исследованием специфических сывороток к другим инфекциям. Результаты сравнительного анализа антител в сыворотках вакцини-

рованных и невакцинированных против рожи свиней, проведенного в ИФА и РА представлены в таблице 7.

Таблица 7

Результаты исследования свиных сывороток в РА и ИФА

№ п/п Сыворотки Титр антител в сыворотках (1о&) Количество сывороток

РА ИФА

Белок м.м. 12кДа Белок м.м. 25кДа

1 Клинически Здоровых Невакцинированных 0 2,2 0 12

2 Клинически Здоровых Вакцинированных 5,0 10,6 9,6 13

6,0 11,6 10.6 74

7,0 13,6 11,6 26

- 8,6 6.6 12

3 Гипериммунная к сероварам 1 и 2 12,4 13,6 0 1

4 Референс к штамму ВР-2 13,3 14,3 10,5 1

5 Международный стандарт к серотипу N 13,7 14.6 0 1

6 Сыв-ки человека 0 0 4,6 4

7 Отриц./специф. к другим инфекциям 0 0 0 4

Из представленных в таблице 7 данных можно заключить, что тиры вакцинированных свиней колебались в широких пределах, но во всех случаях достоверно отличались от таковых у невакцинированных животных. Установлено, что исследованием 125сывороток методом ИФА были выявлены антитела как к белку с м.м. 12 кДа, так и с м.м. 25кДа. Титры антител к бел-кус м. м. 12 кДа были в 2-4 раза выше, в сравнении с титрами к белку с м.м. 25 кДа.

Установлено также, что из 125 исследованных сывороток в РА положительными были 113, в ИФА все -125.

Анализ в тест-системе ИФА сывороток крови человека с установленным рожистым заболеванием показал присутствие рожистых антител, которые не были выявлены в РА. Специфические антитела в сыворотках крови человека методом ИФА были выявлены только к белку с м.м. 25 кДа, и не были обнаружены в тест-системе с использованием в качестве антигена белка с м.м. 12 кДа.

Таким образом, анализируя полученные данные можно заключить, что разработанная нами тест-система ИФА на основе белков м.м. 12 кДа и 25 кДа может быть использована для выявления антиэризипелотриксных антител с большей чувствительностью, чем РА. Белок м.м. 25 кДа может служить маркером рожистой инфекции при исследовании антиэризипелотриксных сывороток человека и животных.

3. Выводы

1. Комбинацией методов препаративной биохимии выделены белки с м.м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа вакцинного штамма ВР-2. Максимальный выход белка м.м. 25 кДа (52,5%) был установлен при использовании энзимати-ческого метода, белка с м.м. 12 кДа (58%) - модифицированный метод щелочного гидролиза.

2. Впервые установлено, что белок с м.м. 25 кДа является видоспе-цифическим, вследствие чего может быть использован для выявления антиэризипелотриксных антител в РДП и ИФА.

3. Установлено, что белок с м.м. 12 кДа является типоспецифическим для вакцинного штамма ВР-2, вследствие чего может быть использован для оценки поствакцинального иммунитета у животных в ИФА.

4. Разработана тест-система ИФА на основе белков с м.м. 12 и 25 кДа вакцинного штамма ВР-2 для определения уровня антиэризипелотриксных антител.

5. Установлено, что для серотипирования вакцинного штамма ВР-2 пригоден модифицированный метод щелочного гидролиза, с помощью кото-

рого был получен типоспецифический белок с м.м. 12 кДа, выявляемый в РДП.

6. Предполагаем, что наличие типоспецифического белка с м.м. 12 кДа, выделенного из вакцинного штамма ВР-2, может служить основанием считать штамм ВР-2 одним из серотипов рожи свиней.

4. Практические предложения

Результаты научных исследований были использованы:

- при составлении проекта нормативной-технической документации на тест-систему ИФА для определения антиэризипелотриксных антител к рожи свиней на основе белков м. м. 12 кДа и м. м. 25 кДа;

- при написании методики ИФА для выявления антиэризипелотрис-ных антител в сыворотках крови животных.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Клюкина В.И., Кочетова Ю. А. Изучение субклассов в свиных противорожистых сыворотках методом иммуноблотинга и ИФА. // На-учн. основы техн. пр-ва вет. биол. пр-тов. Сборник докл. Междун. конф. молодых ученых, 2002, Щелково, -С. 111-113.

2. Юпокина В.И., Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. Субклассы свиных противорожистых сывороток. // Современные вопросы патологии с/х животных. // Мат. Междун. научно-практ. конф., Минск, 2003, -С. 129-130.

3. Клюкина В.И., Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. Выделение и изучение структурных белков Erysipelothrix гЬивюраЙиае вакцинного штамма ВР-2. // Современные вопросы патологии с/х животных. Мат. Междун. научно-практ. конф., Минск, 2003, -С. 131-132.

4. Клюкина В.И., Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. Протективные антигены бактерий рожи свиней: очистка и изучение иммунобиологических свойств. И Научн. основы техн. пр-ва вет. биол. пр-тов. Мат. Междун. науч-но-практ. конф., 2003, Щелково, -С. 108-111.

5. Клюкина В.И., Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. ИФА на основе структурных белков Егу81ре1оЙтх ЛцвюраИнае и изучение его диагностиче-

ской ценности. // Научн. основы техн. пр-ва вет. биол. пр-тов. Мат. Междун. научно-практ. конф., 2003, Щелково, -С. 111-113.

6. Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. Выделение и изучение белковых компонентов Егуз1ре1оЛпх НшвюраМае вакцинного штамма ВР-2 в различных серологических тестах. // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных. Сборник докл. Междун. конф. молодых ученых, 2004, Владимир, -С. 110-113.

7. Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. Фракционирование белков ультразвукового лизата (шт. ВР-2) гель фильтрацией на колонке сефадекса в-200. (сообщение первое) / Научн. основы техн. пр-ва вет. биол. пр-тов. // Сборник докл. Междун. конф. молодых ученых, 2004, Щелково, -С. 37-42.

8. Кочетова Ю. А, Моисеева Н. А. Антигенная активность и специфичность белков бактерий рожи свиней (шт. ВР-2), выделенных гель-фильтрацией на колонке сефадекса С-200. // Научн. основы техн. пр-ва вет. биол. пр-тов. Сб. докл. Междун. конф. молодых ученых, 2004, Щелково, -С. 42-44.

9. Барыкова Ю. А., Клюкина В.И. Рожа свиней: профилактика, диагностика и меры борьбы. // Научн. основы пр-ва вет. биол. пр-тов. Мат. Междун. научно-практ. конф., посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005, Щелково,-С. 113-115.

10. Клюкина В.И., Барыкова Ю. А., Грибов Ю.А. Серологический мониторинг напряженности иммунитета у свиней, вакцинированных с учетом эпизоотического состояния хозяйства. // Научн. основы пр-ва вет. биол. пр-тов. Мат. Междун. научно-практ. конф., посвященной 35-летию ВНИТИБП, 2005, Щелково, -С. 110-112.

Отпечатано в ООО "Мещера" Московская область, г Щелково, ул Свирская д 8а, тир 100 экз, зак №550

»237 Ai

РНБ Русский фонд

2006-4 24961

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Барыкова, Юлия Александровна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Открытие Erysipelothrix rhusiopathiae

2.2. Распространение рожи свиней

2.3. Систематическое положение

2.4. Строение микробных клеток Erysipelothrix rhusiopathiae 11 (•' 2.5. Характеристика возбудителя

2.5.1. Морфологические и тинкториальные свойства 2.5.2. Культуральные свойства

2.5.3. Биохимические свойства

2.5.4. Антигенная структура

2.5.5. Устойчивость 16 Ф 2.6. Активность и специфичность шаммов возбудителя рожи свиней

2.7. Серологическая классификация бактерий Erysipelothrix rhusiopathiae

2.8. Эпизоотические данные

2.9. Клинические признаки 27 А 2.10. Диагностики

2.10.1 Прижизненная диагностика

2.10.2 Посмертная диагностика

2.11. Иммунитет

2.11.1. Вакцины

2.11.2. Гипериммуная противорожистая сыворотка

Введение Диссертация по биологии, на тему "Выделение и изучение белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2"

Актуальность темы. Рожа свиней, вызываемая бактерией Егу-sipelothrix rhusiopathiae - септическое антропозоонозиое инфекционное заболевание, поражающее преимущественно свиней в возрасте от 3 до 12 месяцев , реже животных других видов, а также человека (Панин А.Н., 2000г., Малахов Ю.А., Душук Р.В., 2001г.). Болезнь широко распространена и наносит значительный экономический ущерб вследствие гибели, абортов, мертворо-ждаемости (Воронин Е.С., Романова М.В., 1987г.).

Эффективность противорожистых биопрепаратов во многом зависит от иммуногенных и антигенных свойств штаммов, используемых для их изготовления. Многие ученые приложили немало труда для изыскания биопрепаратов для диагностики и профилактики рожи свиней (Горбунова Н.В., 1988г., Душук Р.В., Подлесных Л.А., Тихонов Л.И., 1999г., Олейник А. В., 2002г., Клюкина В.И, Моисеева Н.А., 1998., Школьников Е.Э., Коломнина Г.Ф., 2000г. и др.).

Однако, несмотря на наличие высокоэффективных средств профилактики в РФ, ежегодное количество вновь регистрируемых неблагополучных по роже свиней хозяйств уменьшается незначительно. По материалам официальных отчетов ветеринарных служб РФ показано, что по наличию выявленных неблагополучных пунктов и уровню летальности рожа свиней занимает 7 место среди 14 наиболее распространенных инфекционных болезней свиней. По проценту к общему количеству прививок рожа свиней занимает второе место (после чумы свиней) (Рахманов A.M., Яременко Н.А. 2003).

Так, имеются несколько сообщений Kobayashi S. et al., 1991г., Sato Н., Yamazaki Y. et al., 1998г., посвященных выделению и изучению антигеноак-тивных белков Е. rhusiopathiae, способных защитить от рожи свиней. Оказалось, что многие вакцинные штаммы, например, Marienfelde, AN-4, SE-9, 2179, Agata, Koganei и др. отнесенные к различным серовариантам (1а, 2, 5, 10, 20), продуцируют в культуральную жидкость в больших концентрациях белки с молекулярной массой 64-65 кДа, которые и являются, по мнению исследователей, иммунодоминантными белками, играющими значительную роль в защите от инфекции.

В настоящее время среди средств специфической профилактики рожи свиней самым распространенным препаратом является сухая живая вакцина из штамма ВР-2, обладающая наиболее высокими иммуногенными свойствами и слабой реактогенностью (Скичко Н.Д., Мельник Н.В, Зенов Н.И., 1996г., Ярцев М.Я., 1993 г. и др.).

Цели и задачи исследования. Целью наших исследований являлось выделение и изучение фракционного состава и серологической активности белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

- изучить серологическую активность полученных белковых экстрактов и отдельных белков;

Научная новизна. Впервые выделены белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа бактерий рожи свиней штамма ВР-2 и изучена их серологическая активность и иммунизирующие свойства.

Впервые установлено, что белок с м. м. 25 кДа, выделенный из бактериальной клетки вакцинного штамма ВР-2 является видоспецифическим и может быть использован для определения антиэризипелотриксных антител.

Установлено, что белок с м. м. 12 кДа является типоспецифическим и может быть использован для оценки поствакцинального иммунитета.

Практическая значимость исследований. На основании результатов проведенных исследований:

Апробация работы. Материалы диссертационной работы докладывались на 29-ой научной студенческой конференции МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, г. Москва (19-20 мая 2003 г.); на международной конференции молодых ученых «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», г. Щелково (5-6 октября 2004 г.); на международной конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 35-летию ВНИТИБП, г. Щелково (26-27 мая 2005 г.).

Публикации результатов исследований. По материалам диссертации опубликованы 10 научных статей.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 124 страницах компьютерного текста, и состоят из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы и практические предложения, список литературы, включающий 247 наименований, из которых 173 отечественных и 74 зарубежных источников, и приложение. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты отдельных этапов работы, их научную и практическую ценность. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами, 16 рисунками.

2.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Барыкова, Юлия Александровна

Результаты исследования свиных сывороток в РА и ИФА п/п Сыворотки от свиней Титр антител в сыворотках (log2) Количество сывороток

РА ИФА

Белок м.м. 12кДа Белок м.м. 25кДа

1 Клинически здоровых невакцинированных 0 0 0 12

2 Клинически здоровых вакцинированных 5,0 10,6 9,6 13

6,0 11,6 10.6 74

7,0 13,6 11,6 26

- 8,6 6.6 12

3 Гипер иммунная к серовариантам 1 и 2 12,4 i 1 0 I 13,6 1

4 Референс к штамму ВР-2 13,3 14,3 10,5 1

5 Международный стандарт к серотипу N 13,7 0 1 ■ j 14,6 | 1

6 Сыворотки человека 0 0 4.6 4

7 Специфические к другим инфекциям 0 0 0 4

8 Отрицательные 0 0 0 4

••.-. Из.представленных.в табл. 15 даннь1х .можно заключить,.что титры антител в сыворотках крови вакцинированных свртпей колебались в.широких пределах, но во всех случаях'дострверно'отличались от таковых у не вакцинированных животных. ■ : / . . : "

Исследованием 125 сывороток методом ЙФА были выявлены антите- • лак белку с м. м. 12 к Да, так и к белку с м. м. 25 кДа. Титры антител к белку с м. м. 12 кДа были в 2-4 раза выше, в сравнение с титрами к белку с м. м. 25 кДа. ■'. ■•■ .

Установлено также, что из 125 исследованных сывороток в РА положительными были 113^ в ИФА все - 125.

Анализ в тест-системе ИФА сывороток крови человека с установленным рожистым заболеванием показал присутствие рожистых антител, которые не были выявлены в РА. Специфические антитела в сыворотках крови человека методом ИФА были выявлены только к белку с м. м. 25 кДа, и не были обнаружены в тест-системе с использованием в качестве антигена белка с м. м. 12 к Да.

Таким образом, анализируя полученные данные можно заключить, что разработанная нами тест-система ИФА на основе белков с м. м. 12 кДа и 25 кДа может быть использована для выявления антиэризипелотриксных ан-. тител с большей чувствительностью, чем в РА. Белок с. м. м. 25 кДа может служить маркером рожистой инфекции при исследовании антиэризипелотриксных сывороток человека и животных.

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

Многочисленные исследования, посвященные изучению белков эри-зипелотриксов, в последние годы направлены в основном на поиск иммунизирующих антигенов [119], обеспечивающих иммуногенные свойства противорожистых вакцин.

Оказалось, что многие вакцинные штаммы, например, Marienfelde, AN-4, SE-9, 2179, Agata, Koganei и др., отнесенные к различным серовариан-там (1а, 2, 5, 10, 20), продуцируют в культуральную жидкость в больших концентрациях белки с м. м. 64-65 кДа, которые и являются, по мнению исследователей, иммунодоминантными белками [230,231,237].

Такие микробные тела, отделенные от культуральной жидкости, им-муногенными свойствами не обладают. Разрушение микробных тел не повышает их иммуногенной активности, хотя незначительная концентрация белка м. м. 64-65 кДа в дезинтегрированном препарате обнаруживается [110,115]. Иммунизирующие антигены бактерий рожи свиней термолабильны и не соответствуют преципитирующим антигенам, которые являются термостабильными.

Приведенные данные, отнесенные ко многим серовариантам эризепе-лотриксов, значительно повышают интерес к изучению белков вакцинного штамма ВР-2.

Как известно, штамм ВР-2 индивидуален по следующим показателям: во-первых, бактерии не индуцируют в бульонные культуры иммунизирующие антигены, во-вторых, микробные тела, отделенные от культуральной жидкости, обладают высокой иммуногенной активностью, в-третьих, концентрированные и лиофилизированные микробные тела также обладают высокой иммуногенной активностью, в-четвертых, до настоящего времени не удалось извлечь из микробных клеток термостабильного преципитирующего антигена, в-пятых, микробные клетки серотипа N, куда относят и штамм ВР-2, содержат общий ^видо^пецифический антиген [110,115,121].

Комбинацией методов , препаративной биохимии: '.'физико-механическим (ультразвуковым), химическим (щелочной гидролизом), энзи-матическим (автолизом), термическим (автоклавированием) были получены белковые экстракты, из которых методом гель-фильтрации на колонке с се-фадексом G-200 выделены белки с м. м. 300, 250, 656, 25 и 12 кДа.

Так, с помощью ультразвука преимущественно выделились белки с м. м. 300 кДа (17,4%), 250 кДа (16%) и 25 кДа (15%). Белок с м. м. 65 кДа, известный как иммунодоминантный для других серовариантов, из штамма ВР-2' извлекался ультразвуком в незначительной концентрации - всего 5%. Еще меньше выявлено белка с м. м. 12 кДа (3%).

Щелочным гидролизом, напротив, удалось экстрагировать из клеток значительное количество белка с м. м. 12 кДа (58%>). С помощью автолиза преимущественно выделен белок с м. м. 25 кДа (52,5%), а термообработка позволила получить белки с м. м. менее 4 2 кДа (54%), которые не обнаружились в УЗ-гомогенате.

Таким образом, в результате проведенной работы разработаны методы и подобраны необходимые условия, позволяющие избирательно экстрагировать из бактериальных клеток штамма ВР-2 белки различной молекулярной массы в значительных концентрациях.

Исключение составил белок 65 кДа, который был извлечен из клеток методами УЗ-дезинтеграции и автолиза в минимальном количестве. Вероятно, такая прочная ассоциация белка с м. м. 65 кДа со структурными компонентами клеток не позволяет ему выходить в питательную среду и накапливаться в ней, как это отмечено для других серовариантов[237].

В следующей серии опытов была изучена серологическая активность белковых экстрактов и выделенных белков с м. м. 300, 250, 656, 25 и 12 кДа в серологических реакциях.

В результате изучения серологической активности белковых экстрактов в РДП удалось установить, что:

- УЗ-гомогенат реагирует со всеми антиэризипелотриксными сыворотками в разведениях от 1:8 до 1:32;

- щелочной гидролизат реагирует только с референс-сывороткой к штамма ВР-2 в разведения 1:16-1:324

- автолизат активнее других препаратов формировал четкие линии преципитации со всеми сыворотками в разведениях 1:32-1:64;

- термоэкстракт и УЗ-гомогенат автоклавированных клеток были инертны в РДП;

- отрицательные и специфические сыворотки к другим инфекциям (бруцеллезная, сальмонеллезная, пастереллезная и лептоспирозная) не реагировали ни с одним из экстрактов.

Анализ результатов серологической активности белков штамма ВР-2 свидетельствуют о том, что активно реагирующими в РДП являются только два белки с м. м. 12 и 25 кДа.

Белок с м. м. 25 кДа может быть отнесен к видоспецифическому, так как проявил высокую активность в РДП со всеми сыворотками. А доминирующий в щелочном гидролизате белок с м. м. 12 кДа является преципити-рующим типоспецифическим для штамма ВР-2, поскольку реагировал только с референс-сывороткой, полученной на данный штамм.

Белки с м. м. 300, 250 и 65 кДа не обладают преципитирующей активностью, белки термоэкстракта инертны в РДП.

Можно предположить, что неэффективность традиционного метода автоклавирования для выделения видового антигена из клеток штамма ВР-2 связана с особенностями его антигенной структуры, для которой такой режим термообработки является экстремальным, приводящим к активной пеп-тизации белков типового антигена, и как следствие к инертности в РДП.

При изучении антигенной идентичности белков с м. м. 12 и 25 кДа выявлены две самостоятельные пересекающиеся линии преципитации, указывающие на полную неидентичность антигенных детерминант, следовательно, на различие исследуемых антигенов.

На следующем этапе работы была изучена серологическая активность белков в ИФА. Установлено, что максимальную активность сыворотки в ИФА проявили к белку с м. м. 25 кДа в титрах 13,6-14,6 log2. С белками с м. м. 250 кДа и 300 кДа они реагировали со средней активностью в титрах 12,613,7 log2.

Наименьшая активность выявлена у референс и стандартной сывороток к белку с м. м. 65 кДа в титрах 7,6 log2 и 8,7 log2. Более активно с данным белком реагировала только гипериммунная сыворотка к серовариантам 1 и 2 в титре 12,6 log2.

Что касается белка с м. м. 12 кДа, то с ним прореагировала только ре-ференс-сыворотка, полученная на штамм ВР-2, в котором данный белок присутствует в высоких концентрациях.

Сравнительный анализ результатов серологической активности выделенных белков в РДП и ИФА показал, что из пяти белков в РДП прореагировали только два белка с м. м. 12 и 25 кДа, а в ИФА — пять белков с м. м. 300, 250, 65,25, 12 кДа.

Белок с м. м. 25 кДа реагировал в РДП и в ИФА как с референс-сывороткой к штамму ВР-2, так и с сыворотками к серовариантам 1, 2 и серотипу N. В отличие от белка с м. м. 12 кДа, который реагировал в обеих реакциях только с сывороткой к штамму ВР-2.

Следовательно, белок с м. м. 12 кДа является основным дифференцирующим (типоспецифическим) белком штамма ВР-2, который не был обнаружен исследователями ранее, а белок с м. м. 25 кДа является видоспецифи-ческим белком, активно реагирующим как в ИФА, так и в РДП со всеми ан-тиэризипелотриксными сыворотками.

В результате иммунизации мышей цельными микробными клетками, УЗ-гомогенатом и белками с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 кДа получены специфические сыворотки, активно реагирующие РА, РДП и ИФА.

Анализ серологической активности сывороток мышей в РА позволил установить, что наиболее активной в РА оказалась сыворотка, полученная на введение цельных микробных клеток. В 32-64 раза менее активно реагировали в РА сыворотки, полученные на УЗ-гомогенат и на белки с м. м. 300, 250 и 25 кДа.

Минимальную активность проявила сыворотка, полученная на белок с м. м. 65 кДа. Достаточно высокую агглютинирующую активность проявила сыворотка, полученная на типоспецифический белок штамма ВР-2 с м. м. 12 кДа.

На основании представленных данных предполагаем, что активное продуцирование агглютинирующих антител в организме животных обеспечивают не отдельные белки, а набор белков и полисахаридов, организованных в сложную молекулу пептидогликанового слоя и тейхоевых кислот клеточной стенки [14,16].

Выделенные же из сложной клеточной структуры отдельные белки способны индуцировать выработку агглютинирующих антител в минимальных количествах, что подтверждается данными исследований по отношению к белку с м. м. 65 кДа.

Анализ серологической активности сывороток мышей в РДП позволил установить, что из выделенных белков только два белка с м. м. 12 и

25 кДа способны индуцировать преципитирующие антитела в организме иммунизированных мышей.

Анализ серологической активности сывороток мышей в ИФА позволил выявить высокую активность сыворотки мышей, полученной на цельные клетки по отношению ко всем изучаемым белкам, что свидетельствует о наличии индивидуальных специфических антител к каждому из перечисленных белковых антигенов в данной сыворотке.

Что же касается сывороток мышей, полученных к белкам различной молекулярной массы, то они реагировали только с гомологичными антигенами. Небольшие перекрестные реакции выявлены у крупномолекулярных белков.

Выделенные белки с м. м. 12 и 25 кДа были использованы при разработке тест-системы ИФА для выявления антиэризипелотриксных антител. Были исследованы 12 сывороток от клинически здоровых не вакцинированных свиней и 125 сывороток крови вакцинированных свиней. Предварительно все сыворотки были исследованы в РА. Чувствительность и специфичность ИФА была подтверждена исследованием других специфических сывороток крови свиней (бруцеллезной, сальмонеллезной, пастереллезной и леп-тоспирозной).

Исследованием 125 сывороток методом ИФА были выявлены антитела к белку с м. м. 12 кДа, так и к белку с м. м. 25 к Да. Титры антител к белку с м. м. 12 кДа были в 2-4 раза выше, в сравнение с титрами к белку с м. м. 25 кДа.

Установлено также, что из 125 исследованных сывороток в РА положительными были 113, в ИФА все - 125.

Анализ в тест-системе ИФА сывороток крови человека с установленным рожистым заболеванием показал присутствие рожистых антител, которые не были выявлены в РА. Специфические антитела в сыворотках крови человека методом ИФА были выявлены только к белку с м. м. 25 кДа, и не были обнаружены в тест-системе с использованием в качестве антигена белка см. м. 12 кДа.

Анализируя полученные данные можно заключить, что разработанная нами тест-система ИФА на основе бешсов с м. м. 12 кДа и 25 кДа может быть использована для выявления антиэризипелотриксных антител с большей чувствительностью, чем в РА. Белок с м. м. 25 кДа может служить маркером рожистой инфекции при исследовании антиэризипелотриксных сывороток человека и животных.

••:■•;'■ v.':.--'-' : \■■•6.

V л.,. J. Комбинацией методов препаративной биохимии выделены белки с м. м. 300, 250, 65, 25 и 12 к Да,- вакцинного штамма J3F-2. Макси.мальный выход белка с м. м. 25 кДа (52,5%) был установлен при использовании энзи-матичёского метода, белка с м. м. 12 к Да (58%) - модифицированньш метод щелочного гидролиза. V

2. Впервые установлено, что белок с м. м. 25 кДа является видоспе-цифическим, вследствие чего может быть использован для выявления анти-эризипелотриксных антител в РДП и ИФА. - . ;

3. Установлено, что белок с м. м. 12 кДа является тшюспецифиче-ским для вакцинного штамма ВР-2, вследствие чего может быть использован для оценки поствакцинального иммунитета у животных в ИФА.

4. Разработана тест-система ИФА на основе белков с м. м. 12 и 25 к Да вакцинного штамма ВР-2 для определения уровня антиэризип ел отри ксных антител.

5. Установлено, что для серотипирования вакцинного штамма ВР-2 пригоден модифицированный метод щелочного гидролиза, с помощью которого был получен типоспецифический белок с м. м. 12 кДа, выявляемый в РДП.

6. Предполагаем, что наличие типоспецифического белка с м. м. 12 кДа, выделенного из вакцинного штамма ВР-2, может служить основанием считать штамм ВР-2 одним из серотшюв ролей свиней.

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Результаты научных исследований были использованы: при составлении проекта нормативно-технической документации на тест-систему ИФА для определения антиэризипелотриксных антител к роже свиней на основе белков с м. м. 12 и 25 кДа;

- при написании методики ИФА для выявления антиэризипелот-риксных антител в сыворотках крови животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Барыкова, Юлия Александровна, Щёлково

1. Авакян Б.Г. Особенности течения и способов борьбы с рожей свиней в Узбекистане: Автореф. дис. канд. вет. наук. Самарканд, 1991. 20 с.55

2. Авдиенко В.А. Рожа свиней. Лекция. М.: МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, 2000, 13с.

3. Андросов Ф.З. и др. Рожа // Справочник ветеринарного лаборанта. -М., 1981.-с. 83-84.

4. Анисим И.А. и др. Рожа // Патологическая диагностика инфекционных болезней свиней. Минск, 1980, 67с.

5. Антитела 1. Методы. Под ред. Кетти. -М.: "Мир", 1991, 350с.

6. Антитела 2. Методы. Под ред. Кетти. М.: "Мир", 1991, 382с.

7. Артемов Б.Т., Ефанова Л.И., Дынин В.И., Ковырялова С.В. Нит-ратредуцирующие свойства Erysipelothrix insidiosa. // Ветеринария. — 1995. № 6. с. 34-37.

8. Асонов Н.Р. Микробиология. М.: Колос, 2001. - 351 с.54.

9. Астафьева Н.В. Эризипелоид // Руководство по зоонозам. Л., 1983, с. 234-237.

10. Ю.Байрак В.А. и др. Возбудитель рожи свиней. // Практикум по ветеринарной микробиологии. М., 1980.-с. 146-150.11 .Беклемешев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция. М.: Медицина, 1987,304с.

11. Беличенко И.А. Бактерионосительсво рожи свиней // Пр. УзниВИ. 1986, вып.8, с 4-6.

12. Беличенко И.А. и др. Вопросы возрастной восприимчивости поро-сят-отъемышей к роже, выживаемость возбудителя. // Материалы науч.-практ. конф. по вопросам к интенсификации сельского хозяйства. 1985. — с. 14-17.

13. Билетова Н.А., Корнелаева Р.П., Кострикина Л.Г. Возбудитель рожи свиней. // Справочная микробиология. М., 1980. - с. 40-44.

14. Братюха В.В. Безалкогольный метод внутрикожной вакцинации свиней против рожи. Автореф. дис. канд. вет. наук. Витебск. 1988.-19 с.

15. Бухвальдер Р. и др. Иммунопрофилактика болезней животных. -М., 1981.-415 с.

16. Ветеринарные мероприятия в свиноводстве. Пособие. — Новочеркасск: 2003, с. 228.

17. Ветеринарная микробиология и иммунология. / Под ред. Н.А. Рад-чука. М.: Агропромиздат, 1991-3 82 с.

18. Ветеринарная микробиология. //П.А. Емельяненко, Г.В. Дунаев, Д.Г. Кудлай и др./ Под ред. П.А. Емельяненко, 1982. — 304 с.

19. Ветеринарные препараты. / Под ред. Д. Ф. Осидзе М.: "Колос", 1981,300с.

20. Власова Н.П. и др. Исследование по оптимизации состава питательной среды на основе ФКДГ для культивирования бактерий рожи свиней. // Передовой научно-производственный опыт в биологической промышленности. 1984. № 11.- с. 7-10.

21. Власова Н.П., Емельянов Н.И. Сравнительная характеристика роста бактерий рожи свиней в питательных средах различного состава // Передовой научно-производственный опыт биологической промышленности, 1984, №12 с. 9-11.

22. Воробьева З.Г. Экспресс-методы серологической диагностики инфекционных заболевании: Дис. доктора биол. наук. Новгород, 2002.-20 с.

23. Воронин Е.С. Рожа свиней: профилактика и меры борьбы. -М.:ННИИТЭагропром, 1987. 44 с.

24. Вышелесский С.Н., Андреев П.Н. Рожа. // Избранные труды. М.,1977.

25. Геведзе В.И., Андросюк Н.Н., Леиысова В.А. Рожа. // Профилактика болезней свиней на комплексах. Минск, 1982. - с. 30-34.

26. Геладзе В.Ш., Тутов И.К. Выживаемость аттенуированного штамма ВР-2 возбудителя ролей в процессе лиофильной сушки. // Тез. докл. науч.-произ. конф. -Курс, 1996.С.91-92

27. Глуховцев Г.Д, Дьяконов О.Б., Подлесных JI. А., Лукьянченко А. В. Проверка иммуногенных свойств вакцинных штаммов рожи свиней. // Труды ГНКИВП. М.,1966.Том XII - с. 212-217.

28. Глуховцев Г.Д. Принципы изготовления сухих вакцин против рожи свиней. // Труды ВГНКЙ ветпрепаратов. 1962. Т. 10. - с. 207-213.

29. Глуховцев Г.Д. Серологическая типизация штаммов рожи свиней. // Тр. ВГНКИ ветпрепаратов, 1967, т.VII, с.230-236.

30. Гобзем М.П. и др. Распределение рожистого антигена в организме свиней при аэрогенной иммунизации. // Достижения ветеринарной науки и передового опыта животноводству. - Минск, 1980. Вып. 5.-е. 62-65.

31. Гомкус А., Лошакевич Ф., Бартиинкас И.И. Изучение аллергического состояния организма свиней при аэрозольной иммунизации против рожи и сальмонеллеза. // Сб. науч. тр. / Литовский НИИ ветеринарии. — 1981. Т. VIII.-с. 115-141.

32. Горбунова И.В. Об антигенном родстве производственных штаммов рожистых бактерий. // Сб. науч. тр. ВГНКИ-1983, с. 96-97.

33. Горбунова И.В. Совершенствование технологии производства и метода контроля сыворотки против ролей свиней. // Диссертация, к.в.н., М., 1988,с.41-71.

34. Горский Б.В. и др. Возрастание изменения иммунологического фона у животных в условиях промышленного свиноводства. // Сб. науч. тр. / Казанский ГВИ. 1981. Т. 138. - с.82-85.

35. Горский Б.В. и др. Оценка результатов профилактической вакцинации свиней в условиях свинокомплекса. // Сб. науч. тр. «Оздоровительные мероприятия в промышленных животноводческих комплексах при инфекционных заболеваниях». — Казань, 1983. — с. 21-31.

36. Гусев М.В., Минаева JI.A. Микробиология. М.: Изд. МГУ, 1985,306с.

37. Гуславский И.И., Фабер В.В. Эпизоотология инфекционных болезней свиней на Алтае // Эпизоотология и меры борьбы с инфекционными болезнями животных. Новосибирск, 1985, с. 8-12.

38. Денскевич А.С. Инфекционные болезни свиней. Алма-Ата, 1977.-с. 21-25.

39. Дерябин П.Н., Каральник Б.В. Биологические свойства и использование тейхоевых кислот микроорганизмов. // ЖМЭИ №1,1983, с.15-21.

40. Душук Р.В. и др. Производственное испытание пероральной иммунизации свиней против рожи. // Актуальные проблемы эпизоотологии. — Казань, 1983.-е. 117-118.

41. Душук Р.В., Подлесных JT.A. Дифференциация вакцинных и полевых штаммов Erysipelothrix rhusiopathiae. // Ветеринария. 1991. №10. -с. 34-35.

42. Душук Р.В., Подлесных JI.A. Профилактика рожи свиней. Достижения науки и техники. 1988, №11. стр. 35.

43. Душук Р.В., Подлесных JI.A. Специфическая профилактика рожи свиней. // Ветеринария. 1999. Т. 3. — с. 33-35.

44. Душук Р.В., Подлесных JI.A. и др. Иммуногенность новой вакцины против рожи свиней. // Актуальные вопросы ветеринарии. Новосибирск, 1997.-е. 43-44.

45. Душук Р.В., Подлесных JI.A., Тихонов Л.И. Определение сроков формирования иммунитета у животных, иммунизированных эмульгированной вакциной против рожи свиней. // Сб. науч. Тр. ВГНКИ-1995,т.52 -С.21-26.

46. Душук Р. В., Подлесыых JI. А., Тихонов Л.И Причины слабого иммунитета у свиней вакцинированных против ролей. // Ветеринария. 1992, №4. - С.24-26.

47. Душу к Р.В., Подлесных Л.А., Тихонов Л.И, Шаталова Н.А. Профилактика и борьба с рожей свиней. // Ветеринарные советы фермерам. 1999.С.52-56.

48. Дынин В.И. Влияние предельно допустимых доз нитрата калия на иммунологическую реактивность животных, вакцинированных против ролей свиней. Автореф. дис. канд. Веет. Наук. Воронеж,1992. с. 12.

49. Дынин В.И. Применение иммуномодуляторов при вакцинопрофи-лактике рожи свиней на фоне иммунодефицитных состояний. // Пути повышения продуктивности воспроизводит, способности, профиоактики и лечения с.-х. животных. Курск, 1999, с. 108-109.

50. Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Изучение биологических свойств депонированной вакцины против ролей свиней в процессе ее хранения. // Труды ВГНКИ. М.,1964. Том XII. - с.218-225.

51. Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Определение типовой принад-лелености штаммов рожи свиней при помощи РДП в агаровом геле (микромодификация). // Труды ВГНКИ, т. 15, 1968, с. 155-160.

52. Дьяконов О.Б. Биологические свойства и применение живой слабовирулентной вакцины из штамма ВР-2 против ролей свиней. // Сборник трудов Эстонской сельскохозяйственной академии. — Тарту, 1888, Т. 57. — с. 114-117.

53. Еровиченков А.А. Клиншео-патогенетическое значение нарушений гемостаза и их коррекция у больных геморрагической рожей: Автореф. дис. мед. наук. Москва,2003.

54. Жаков М.С. Рожа // Патологическая диагностика болезней свиней. -М.; 1984, с. 128-132.

55. Иванов И.В. Рожа // Вскрытие и патологоанатомическая диагностика болезней свиней с/х животных. -М.; 1983, с. 181-184.

56. Изотова Н.А. и др. Аэрозольная вакцинация свиней против рожи, классической чумы и болезни Ауески. // Тезисы III Всесоюзной конференции по аэрозолям. -М., 1977, Т. 3. с. 51-51.

57. Иммунология. / Под ред. У. Тола. М.: Мир, 1988, Т 1-3.

58. Иммуноферментный анализ. Под ред. Т.Т. Нго, Г. Ленгофора. -М.: Мир, 1990, с. 445.

59. Инфекционные болезни животных. / Под ред. Д.Ф. Осидзе М.: Агропромиздат, 1977, с. 272.

60. Инфекционные и протозойные болезни сельскохозяйственных животных. -М.: 2003, с. 228.

61. Карелин А.И. Программа борьбы с инфекционными болезнями в промышленном свиноводстве. // Бюллетень ВИЭВ. 1982. Вып. 46. - с. 3-6.

62. Кирюткин Р.В. Справочник ветеринарно-биологических препаратов. Волгоград. 2000, 208с.

63. Кирюхин И.Ф. и др. Протективная активность противорожистого препарата иммуноглобулина (опыты на белых мышах). // Соврем, пробл. профилактики зооноз. болезней и пути их решения. — Минск, 1988. с. 145.

64. Коваленко Я.Р., Сидоров М.А., Татаринцев Н.Г. Антитела сывороток крови и напряженность иммунитета против рожи у свиней. Доклады ВАСХНИЛ. 1970, № 8. - с. 25.

65. Ковалев JI.B., Загороднов М.В., Евдокимов С.М. Профилактика инфекционных болезней животных. // Профилактика болезней в промышленном животноводстве. М., 1977. - с. 208-222.

66. Ковалев Г.К. Некоторые вопросы биологии Erysipelotrix rhu-sopathiae. // ЖМЭИ. 1982, № 3. - с. 11-18.

67. Колючев Н.М., Госманов Р.Т. Ветеринарная микробиология и иммунология. — М.: Колос, 2003, 432с.

68. Коляшко О.И. Мшсробиология. Минск. Высшая школа, 1987,с. 300.

69. Конопаткин А.А. Рожа свиней. // Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных. М., 1984. - с. 358-363.

70. Конопаткин А.А. Материалы многолетних исследований по комплексной иммунизации свиней и её эффективность. // Комплексная вакцинация в интенсивном животноводстве и её экономическая эффективность. -Кировобад, 1984. с. 84-104.

71. Коняев М.Т., Щербина В.К. Сравнительная эффективность вакцин против рожи. // Ветеринария. 1980. № 3. - с. 33-34.

72. Костенко Т.С., Пительсон С.С. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. — М.: Агропромиздат, 1989, с. 270.

73. Костенко Т.С., Радионова В.Б., Скородумов Д.И. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. М.: Колос, 2001, 340 с.

74. Кулеско И.И. и др. Изучение групповой иммунизации поросят против рожи. // Республиканский межведомственный тематический научный сборник. 1977. Вып. 46. - с. 7-11.

75. Лабораторные инфекции в ветеринарии. Бактериальные инфекции. Справочник. // Агропромиздат. — 1986. с. 280.

76. Лебедев В.В. Клиника и лечение ролей: Пособие для врачей. — Краснодар: Качество, 2003.

77. Малахов Ю.А., Душук Р.В. Специфическая профилактика и диагностика бактериальных болезней животных. // Ветеринария. 2000. № 1. — с. 35-38.

78. Медицинская микробиология. Под ред. академика РАМН В.И. Покровского и профессора O.K. Поздеева. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999, с. 1182.

79. Мельник Н.В., Моисеева Н.А. Создание референс-биопрепарата с использованием биопромышленной базы производства противорожистой вакцины из штамма ВР-2. // Тезисы докладов Всероссийской конференции к 100-летнему юбилею ВИЭВ. Москва, 1998. - с. 19-20.

80. Меркулов В.П., Эпштейн А.Б. Сухая вакцина против рожи свиней из второго матрикса Д.Ф. Конева. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. 1962. Т. 11.-с. 103-107.

81. Месробяну Л.Э., Пэунеску В.А. Физиология бактерии. Меридиане, 1975, с. 148.

82. Митин С.С. И др. Сравнительная оценка различных схем гипериммунизации лошадей при получении сыворотки против рожи свиней: Тез. докл. науч.-произв. конф. — Курс, 1996. с.210-211.

83. Мишустин Е.Н., Емуев В.Т. Микробиология. М.: Агропромиздат, 1987, с. 270.

84. Моисеева Н.А. Референс-противорожистая вакцина и ее использование для изучения гуморального иммунитета у трансгенных свиней. // Автореф. дис. канд. вет. наук. Москва, 1999. с. 20.

85. Монизиоз, диктеокаулез ягнят и коз и рожа свиней: диагностика и лечение. //Приусадебноехозяйство, 1991, № 1, с. 36-37.

86. Мусаев М.А., Абушев Ф.А., Юдицкая С.З. Материалы по природной очаговости эризипелоида в Нахичеванской АССР. // Вопросы природно-очаговых болезней. Алма-Ата, 1970, Вып. 3. - с. 14-20.

87. Мясников Ю.А. Эризипелоид. // Общая и частная эпидемиология. М., 1973. Т. 2. - с. 423-436.

88. Напряженность поствакцинального иммунитета против болезни Ауески, КЧС и ролей. / Шишков А.Т., Гришак Л.П., Пищик П.П. // Тезисы докладов III Всероссийской конференции по эпизоотологии. 1991, с. 313-315.

89. Никаноров Б.А. Рожа свиней. // Краевая эпизоотология Нечерноземной зоны РСФСР. М., 1980. - с. 95-105.

90. Никифорова И.М., Дьяконов О.Б., Подлесных Л.А. Биологические свойства штаммов ролей свиней, используемых для изготовления лсивых про-тиворожистых вакцин. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. -М., 1967. Т. 13.с. 218-221.

91. Никифорова Н.М. Научные достижения лаборатории по вопросам борьбы с пастереллезом сельскохозяйственных животных и рожей свиней. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. М.,1972. Т.ХШ. - с.216-222.

92. Никифорова Н.М., Подлесных А.А. Рожа. // Ветеринарные препараты. М., 1981, с. 266-274.

93. Олейншс А.В. Серовариантная принадлежность бактерий вида Erysipelothrix rhusiopathiae. // Дис. канд. биол. наук. Москва, 2002.102.0стерман Л.Д. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. -М.: Наука, 1985.-536 с.

94. Панин А.Н., Душук Р.В. Рожа: итоги работы и задачи исследования. // Сб. науч. трудов ВГНКИ // 2000, с. 44-52.

95. Панин А., Душук Р. Рожистая инфекция. // Вет. изд. -1998 -№ 15с. 4.

96. Панин А.Н., Душук Р.В. Состояние и перспективы профилактики рожистой инфекции. // Состояние, проб, и перспективы развития вет. наук в России.-М.1999. Т. 1.

97. Панин А.Н., Душук Р.В., Собко А.И. XII Международный конгресс по болезням свиней конгресс состоялся в августе 1992г.. // Ветеринария.-1993. Т. 4.-с. 57-59.

98. Панкратов А.Я. Микробиология и иммунология. М.: Медицина, 1987, с.304.

99. Подлесных Л.А. Изучение иммунобиологических свойств штаммов возбудителя рожи свиней с целью совершенствования биопрепаратов. // Автореф. дис. на соискание степени к.в.н. Витебск, 1978, с. 25.

100. Подлесных JI.A. Разработка методики получения типоспецифи-ческих сывороток для изучения антигенной структуры производственных и эпизоотических штаммов рожи свиней. // Тезисы докладов научно-производственной конференции ВГНКИ, 1972.

101. Подлесных JI.A. и др. Сухая живая вакцина против рожи свиней. Ветеринария. 1988, № 3, с. 31-33.

102. Подлесных JI.A., Душук Р.В. Рожистая септицемия у индеек. // Тез. докл. к научно-произв. конф. — 1985. — с. 75-76.

103. Подлесных JI.A., Душук Р.В. Усовершенствование метода изготовления и контроля инактивированной противорожистой вакцины. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. М.,1994. Т.55. - С.68- 75

104. Подлесных JI.A., Тихонов Л.И., Шаповалова Н.А. Вакцины против рожи свиней из штамма ВР-2. // Состояние, проб, и перспективы развития вет. наук в России. -М. 1999. Т. 1.

105. Подлесных Л.А., Дьяконов О.Б. Изучение некоторых маркеров вакцинных и эпизоотических штаммов возбудителя ролей свиней. // Труды ГНКИВП МСХ СССР. -М., 1974.Том хх. С. 179-183.

106. Полушин Г.В. Ролса свиней: практические рекомендации. СПб.: Гиорд. 2000, 21 с.

107. Померанцев А.П. и др. Плазмиды Erysipelothrix rhusiopathiae, их связь с антибиотической устойчивостью и вирулентностью. // Сб. науч. тр. ВГНКИ. М.,1996. Т.57. - С. 135-147.

108. Померанцев А.П. и др. Плазмиды Erysipelothrix rhusiopathiae -возбудителя рожи свиней. // Генетика. 1994. Т. 30. - с. 123.

109. Похил А.И. Культуральные, биохимические и биологические свойства бацилл рожи свиней. // Ветеринарна справа №3-6, 1939, с.58-64.

110. Притулин П.И. Диагностика болезней свиней на комплексах. -М., 1977.-е. 68-71.

111. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М.: Медицина, 1987,512 с.

112. Рахманов A.M., Яременко Н.А. Профилактика инфекционных болезней свиней в России. Сб. «Международная научно-практическая конференция». Минск: 2003. С.243.

113. Рево М.В. Материалы по изучению антигенной структуры ролей свиней. // Ученые записки КВИ, т.53, 1941, с.60-68.

114. Рогожин П.С. и др. Аэрозольная иммунизация подсвинков против рожи жидкой живой вакциной из штамма ВР-2. // Мат. конф. «Профилактика инфекционных болезней животных в Узбекистане». 1984. - с. 65-69.

115. Рогожин П.С. Биологические свойства эпизоотических и эталонных штаммов рожи. // Сб. науч. тр. / УзНИИ. 1973. Вып. 21.-е. 176-177.

116. Рогожин П.С. Изучение патогенных свойств эпизоотических и эталонных штаммов рожи. // Сб. науч. тр. / УзНИИ. — 1973. Вып. 21. — с. 178-181.

117. Рогожин П.С. Рожа. // Инфекционные и инвазионные болезни свиней в Узбекистане. — Ташкент, 1985. — с. 44-51.

118. Рожко Г.К. Рожа. Киев, 1981, с. 63-67.

119. Рягузов B.C. Эризипелоиды. // Ветеринарная микробиология. -М., 1982.-е. 198-203.

120. Самуйленко А.Я., Рубан Е.А. Основы биотехнологии производства биологических препаратов.2000. 376 с.

121. Сальдан A.JI. Хитрая рожа. Практик, 2001, № 8, с. 8.

122. Селиванов А.В., Хасанов Ч.Г. Групповая профилактика инфекционных болезней. М., 1983.-е. 147-150, 187-201.

123. Сидоров М.А. Вирулентность и иммуногенность вакцинного штамма ВР-2 рожи свиней. // Бюл. Всерос. института экспериментальной ветеринарии. 1991. т. 42. - с. 72-74.

124. Сидоров М.А. и др. Определитель зоопатогенных микроорганизмов. //М. 1995, с.102-104.

125. Скалинский Е. И., Шахбанов А.А. Ультраструктура возбудителя рожи свиней.// Доклады ВАСХЫИЛ, №8, 1970, с.36-37.

126. Смирнова Н.И. Возбудитель рожи. // Ветеринарная микробиология. Минск, 1979. - с. 144-146.

127. Справочник по болезням свиней. / Под ред. проф. А. И. Собко и проф. И. НТладенко. -Киев: Урожай, 1981.232 с.

128. Сорокин Д. Ю. Микробиология.- М.:Инфра, 1991.-320 с.

129. Тарасенок Н.И. Изменчивость возбудителя рожи свиней. // Доклады ВАСХНИЛ. 1979, № 10. - с. 39-40.

130. Тимофеева А.А. и др. Об эризипелоиде на островах Охотского моря (сообщение 1). // Источники и переносчики возбудителя эризипелоида. / ЖМЭИ. 1975, № 9. - с. 119-125.

131. Тимофеева А.А. и др. Об эризипелоиде на островах Охотского моря (сообщение 2). // Ландшафтные типы природных очагов эризипелоида. / ЖМЭИ.-1978,№ 1.-с. 41-51.

132. Томеску В., Гаврилэ Д. Рожа свиней. // Зоонозы. М., 1982. -с. 109-113.

133. Усаткин А. В. Клинико-патогенетическая оценка лечебной эффективности гемолиза аутокрови у больных рожей: Автореф. дис. канд. мед. наук.Ростов, 2002. 20 с.

134. Федоров Ю.Н., Лихотина Н.А. Иммунитет у подсвишсов после введения иммунной сыворотки против рожи. // Сб. науч. тр./ ВИЭВ. 1977. Т. 45.-с. 78-81.

135. Филоненко А., Чирков В. Рожа свиней. //Фермер, 1992, №6, с. 26-28.

136. Фролов А.П. Этиопатогенетические особенности развития некра-тической формы рожи, ее прогнозирование и принципы комплексного лечения: Автореф. дис. канд. мед. наук. Иркутск. 2003. 20 с.

137. Фролова М.А. и др. Испытание различных методов очистки про-тиворожистой сыворотки свиней. // Мат. конф. «Основы производства ветеринарных препаратов». Щелково,1989. - с. 107-113.

138. Хасанов Ч.Г. Аэрозольная иммунизация свиней против классической чумы свиней, болезни Ауески и рожи. // Мат. конф. «Актуальные проблемы эпизоотолонгии». Казань, 1983. - с. 11.

139. Хасанов Ч.Г. Аэрозольная вакцинация свиней против чумы, болезни Ауески и рожи. // Особенности возникновения и появления заразных заболеваний в условиях промышленной технологии. — Казань, 1983. — с. 66-69.

140. Чайковский В.Г. и др. К вопросу о серодиагностике эризипелои-да. // ЖМЭИ, 1981, № 9, с. 109-112.

141. Черкасов B.JI, Рожа (Диагностика, лечение, профилактика) М.: Моск. мед. акад., 1991.

142. Черкасов В.А. Патогенез и диагностика рожистой инфекции. -Воронеж, 1986. 158 с.

143. Шаповалов В.Ф. Определение иммнунных свойств культур бактерий рожи свиней на морских свинках. // Состояние, пробл. и перспективы развития вет. наук в России. -М., 1999, т. 1.

144. Шаталов В.Ф., Шаталов B.C. Восприимчивость морских свинок к возбудителю ролей свиней. // Сб. конф. «Диагностика и лечебно-профилактические мероприятия при инфекции инвазионных заболеваниях сельскохозяйственных животных». 1998. с.23-29.

145. Шесточенко М.А., Кузьмин Н.А. Ролеа свиней. // Люминесцентный анализ в ветеринарии. — М., 1979. с. 117-119.

146. Школьников Е.Э., Коломнина П.Ф. и др. К вопросу получения концентрированных лечебных сывороток: Тез. докл. Всерос. науч. конф. Курс. 1996.

147. Школьников Е.Э., Самуйленко А.Я., Еремец В.И. Усовершенствование питательной среды и условий культивирования бактерий рожи свиней. /Междунар. науч.-практ. конф. Покров, 2000.- С. 251-252

148. Шур И.В., Бутко М.П. Рожа свиней. // Руководство по ветеринар-но-санитарной экспертизе и гигиене производства мяся и мясных продуктов. -М., 1983.-с. 155-158.

149. Эрнст. JI.K., Моисеева Н.А. Уровень гуморального иммунитета у трансгенных свиней, вакцинированных противорожистой вакциной из штамма ВР-2. // Тезисы докладов Всероссийской конференции к 100-летнему юбилею ВИЭВ. Москва, 1998. - с. 21-22.

150. Юрков Г.Г. Рожа свиней. // Эпизоотология с микробиологией. -М, 1981.-с. 271-275.

151. Ярцев М.Я. и др. Разработка технологии производства живых сухих вакцин против пастереллеза птиц и рожи свиней. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 1993, №3.- С. 63-70

152. Ярцев М.Я., Шишов В.П., Душук Р.В., Подлесных JX.A., Зубец Н.А. Иммуногенные свойства сухой живой вакцины из штамма ВР-2 против рожи свиней. // Науч. основы вет. препаратов. М., 1999. — с. 74-77.

153. Aagaard М. Rodsjgeinfektioner hossvin // Dansk veterinaertidsskkift. -1982. №1, Vol. 65.-P. 2-8

154. Akutes Rotlaufgeschehen bei Saugferkeln in einem Schweinezuchtbe-trieb. / Von V. Kucken, H. Meisel und Ludwig. // Veter. Med. 1986. Vol.41 (5) №5

155. Aymal M. Experimental erysipelotrix arthritis. // Res. Vet. Sci. -1971. №2.-p. 403-411.

156. Barbary J.K. Swine erysipelas common pig disease. // Adelaida, South Australia. Dep. of agriculture. 1973, № 31. p. 4.

157. Binder J.P. Wertigkeit vjm Rotlauf-Hjperimmunseren vjn Pferden. // Wen. Tierarztl. Mischr. 1985. Vol. 72 №1. - S.l-7.

158. Binder J.P., Matbois H. Zur Bestimmung der Wertigkeit von Rjtlauf. // Veter. Med. -1990.№3. S. 5-9.

159. В ohm K., Suphasindhu V. Investigation en Phagocytosis of Erysipelas Bacteria by neutiophile Leucocytes with spectral reference to virulence IPVS proceeding. // Kobenhaun. 1980. - p. 197.

160. Bohm K.H. Zum Methodik der Rotlaufserologie-Zugleichein Beitrag zur Firage der Reproduzierborkeit Serologischer Ergebnisse. // Deutsche Tierarz-tliche Wochenschrift 1974. Vol. 81 №7.

161. Chin J.C., Eamens G.J. Immunoreactivity of fractionated antigens obtained from an arthritogenic isolate of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Australian Vet. Journal. 1988, № 65. - p. 345-349.

162. Cross G. Serological classification of Australian Strains of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Australian Vet. Journal. 1979, № 55. - p. 77-81.

163. Cysewski S.J., Wood R.I. Effecting of aflatonin on the development of acquired Immuning to Swine Erysipelas. // Am. J. Vet. 1979, № 39. -p. 445-454.

164. Dahms H., F. Schilow. Nachweis von E. r. Spezifischen Antikorpern in Seren expenimenfell infizuierter schweine mit ELISA und Immunobloting. // Veter. Med. 1990. Vol. 43 №6. - s. 907-916.

165. Dedie K. Die Saureloslichen Antigene von Erysipelothrix rhusiopathiae. // Monatsschr Veterinaermed, 1949, 4:7-10.

166. Denecke R., Wein G. Lolcale Antigenpersisters und chronizitat der experimtntellen Rotlauf-Poliarthritis. // Veter. Med. -1986. Vol. 99 №6.

167. Dingeldein W. Rotlaufzootie in einen Schweinemastbestang. // Tier-arzt. 1978. Vol. 82. № 2. S. 66-67.

168. Dinter Z. Der Hamagglutionshemmugetest bei der Bestimmung immu-nogenen Rotlaufstamme. // Berl. Munch. Tierarztl. Wschr., 1949, H 62, S.177-179.

169. Dremach G.E. Immunigenesis of piglets inoculated by deposit vaccination against erjsipelas of Swine in combination wiht BST-1. // Procecdingsof Acagemj of Agrarion Sciences of the Republic of Belarus. 2000. № 3. -P. 69-72.

170. Eamens GJ., Chin J.C. Comparision of inoculation regimes for the experimental production of swine erysipelas airthrites. // Austral, veter. j. 1990. Vol. 66 № 7.

171. Erler W. Serologisehe, chemisch und immunchemisch Untersuchun-gen an Rotlaufbakterien (Mitteilung I, II, III). // Veter. Med. 1973. Vol. 22 № 6. - S. 1125-1163.

172. Galan J.E. and Timoney J.E. Cloning and expression in E. coli of a protective antigen of E. rhusiopathiae. Aust. Vet. J. 1990; 63, 355-358.

173. Ganiere J.P., Yonger M.O., Brocas J., Chantal J. Le aviaire en France: Etude epidemiologique.// Rev. Med.veter., t. 133, N 11, 1982, p. 701-704.

174. Gerlach G. F. Radioaktive Markierung von Rotlaufbacturien zur An-vendung als bakterielles Adjuvans in Respirationstrakt des Schweines. // Dis. Hannover, 1985.-112 s.

175. Githkopoulos P.R. Erysipelas in quallis. // Yeter. 1984. Vol. 35. № l.P. 53-58.

176. Groschup M.H. et al. Characterization of protective protein antigen of Erysipelothrix rhusiopathiae. 1991. Vet. Microbiol., 30 p. 73-85.

177. Goertler V., Hubrig Th. Vergleichencle Untersuchungen mit der Wachstumprobe und dem Opsonozitophagentest zur Rotlaufimmunital der Schweine. // Arch, for Exper. Vet. Med. 1960, № 6. - s. 1087-1095.

178. Harrington K. Erysipelothrix infection in Swine. // Am. J. Vet. -1972, №33.-p. 853-854.

179. Hashimote K.Y. Erysipelothrix insidosa isolated from Swine. // Nat. Inst. Anim. Healtk. Tokyo. 1978, № 120. - p. 539-543.

180. Idem. Proposal for standardization of the Designations used for serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae (Migula). // Buchanan Intemat. J. Systematic Bact., 23, 1973, 184.

181. Kaden X., Heller P. Aerogene Immunisirung von Schweinen gegen Shweinepest und Rotlauf in einer Tierimmunisierungsscheuse Tierzucht. // Veter. Med. 1985. Vol. 39. № 10.

182. Kaden X., Heller P., Dubberke W. Zur Effektivitat der Verfahrens der Synchronen aerogenen Immunisierung und Ritlauf in einer Tierimmunisierangss-chleuse Analyse der wissenschaftlich - Technichen Nieveasis. // Tierzucht. -1995. Vol. 40 №20.

183. Kalf G.F. The antigenic components of Erysipelothrix rhusiopathiae. //Nature. 1970. Vol. 102, p. 39-47.

184. Klein N., Coddard R. und Pugh C. Zuvereassiger Schutz von Schweinen vor Parvairose und Rotlauf. // Veter. Med. 1996. Vol. 77 №9.

185. Kobayashi S. et al. Immunological characterization of protective antigens of Erysipelothrix rhusiopathiae. 1991. Epidemiol. Infect., 35, p. 73-87.

186. Kubo K., Yoshimoto M. Isolation of Erysipelothrix rhusiopathiae from apparenty healthy slaughter pigs. // Japan J. Veter. Med. 1993. Vol. 46 № 8.-p. 687-690.

187. Kubo К., Takahashi Т., Sawada Т. Serotypes and antimicrobial sus-ceptbility of Erysipelothrix rhusiopatliiae isolated from apparenty healthy slaughter pigs. // Japan J. Veter. Med. 1993. Vol. 46 № 8.

188. Kurosaki Y. Distribution of Erysipelothrix rhusiopathiae in artric swine and serovars of isolates. // J. Japan Veter. Med. 1984. Vol. 37 № 5.

189. Kucsera G. Erysipelothrix rhusiopathiae stamme eines neuen Sero-typs und ihre Bedentung in der serodiagnostik der Rotlaufbacterien. // Acta. Vet. Acad. Sci. Hung. 14:293-298,1964.

190. Kuscera G. Proposal for standardization of the designations used for serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Int. J. Syst. Bacterial. 1973, № 23. -p. 184-188.

191. Kucsera G. Uber einen aus Fischen isolierten Schweinerotlauf Bak-terienstamm von neuern serotypus. // Acta. Vet. Acad. Sci. Hung, 13:61-63, 1963.

192. Laemmli U.K. (1970) Nature (London), 277, 680.

193. Losano E.A., Jones L.D., Parker W.D. An Erysipelos Serumculture Agglutination (ESCA) test. // Amer. J. Vet. Res. 1959. Vol. 20, № 75. -p. 394-397.

194. Lusky K., Bache K., Rimke H. Infektionversuche an Labormausen mit Rotlauf. // Veter. Med. 1989. Vol. 43. № 1.

195. M6hlmann H. et al. Zur Moglichkeit und zum verlauf einer experi-mentellen aerogenen Rotlaufinfektion des Schweines. // Arch. Exper. Vet. Med. -1972. Bd. 26, № l.-s.9.

196. Muller B. Rotlauf bien Ferkel. // Prakt. Tierarzt. 1995. Vol 76. № 8. - s. 682.

197. Murase N., Suzuki K„ Nakahara T. et all. Studies on the typing of Erysipelothrix rhusiopathiae 1. Serological behaviors of Erysipelothrix rhusiopathiae isolated from pigs. // Jap. J. Vet. Sci., 21:113-121, 1959.

198. Nikolov P. Untersuchungen uber die Antigenstrustruktur von E.rhusiopathiae. // Доклад Болг. АН, 15, 17, 1962, 757-769.

199. Noguchi M. Detection of plasmid DNA in Erysipelothrix rhusiopathiae from pigs with chronic swine eiysipelas. // Japan J. Veter. Med. 1993. Vol. 55 №2. -p. 349-350.

200. Norrung V. Two new Serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Nord. Vet. Med. 1979, № 31. - p. 462.

201. Poole G.M., Counter F.T. Flosk Immunisation. // Biul. Inst. wet. Pu-law. 1969, № 113.-p. 11-13.

202. Sato H. et al. Protective activity and antigens analyses of fractions of culture filtrates of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Vet. Microbiol. 1995. № 45, p. 163-172.

203. Sawada T. Antiserum against culture filtrate is cross-protective for varions serovars of Erysipelothrix rhusiopathiae. // Veter. Microbiol. 1987. Vol. 14 № 1.

204. Sawada T. Cross protection of mice and swine given live-organism vaccine against challenge exposure with strain of Erysipelothrix rhusiopathiae representing ten serovars. // Am. J. Veter. Res. 1987. Vol. 48 № 1. - p. 81-84.

205. Sawada T. Effect of cyclophasphamide and cairageenan on resistance of mice to Erysipelothrix rhusiopathiae. // Veter. Microbiol. 1987. Vol. 15 № 4. — p. 341-346.

206. Sawada T. Immunogenicity of different fraction from broth culture of an attenuated strain of Erysipelothrix rhusiopathiae in mice and swine. // Japan J. Veter. Sc. 1987. Vol 49 № 1.

207. Sawada T. Mechanism of protection induced in mice against Erysipelothrix rhusiopathiae infection by treatment with porcine antiserum to the culture filtrate of an attenuated strain. // Veter. Microbiol. 1988. Vol. 17 № 1. -p. 65-74.

208. Sawada Т. Protective effect of sera from broth culture of an attenuated strain of Erysipelothrix rhusiopathiae. Japan J. Veter. Sc. 1987. Vol. 49 № 1. -p. 37-42.

209. Sawada T. Response of growth agglutinating antibody and protection of pigs inoculated with swine erysipelas live vaccine. // Anal. Biochem. 1979, 47, p. 503-620.

210. Schalz V. Aerogene Immunisierung gegen Rotlauf in Anlagen der in-dustrimazigen Tierproduktion. // Mh. Veter.-Med. 1972. B. 27, № 21. -s. 818-820.

211. Schecker L. Eignung elektromikroskopischer Immunoperoxydase -Techniken zum Nachweis von Erysipelothrix Antigen in Knorpel und Synoxi-alis. // Dis., 1985.-112 s.

212. Shilow W.F., Hagemann G., Dahms H. Praktische Bedcutung des ELISA ber Wertbemessurg Rotlaufummunseren. // Veter. Med. 1993. S. 15-18.

213. Shulz L.G. Rotlauf als Faktorenkrankrank heit. // Tierarzt. 1989. Vol. 102. № 10.-S. 325-330.

214. Sondermann R., Urbaneclc D. Die aerogene rotlaufimmunisierung von Schweinen in des Kafighaltung. // Monatsh. Vet.-Med. 1983. B. 38, № 12. -s. 444-448.

215. Stoll L. und Kast A. Serotypen von Erysipelothrix rhusiopathiae. // Veter. Med. 1970. Vol. 83. № 24. - S. 84-85.

216. Suphasindhu V. Untersuchungen zur Phagozytoze von Rotlaufbak-terien unter besonderen Reruchsichtigung der Virulenz. // Dis., Hannover, 1972.

217. Takahashi T. Enzymatic profiles of Erysipelothrix rhusiopathiae and Erysipelothrix tansillae. // Veter. 1989. Vol. 47 № 2.

218. Takahashi T. Pathogenicity of Erysipelothrix rhusiopathiae strains of seroxars la,3,5,6,8,11,21 and type N isolated trom slaughter pigs affected with chronis eryusipelas. // Japan J. Veter. Sc. 1985. Vol. 47 № 1. - p. 1-8.

219. Takahashi Т., Sawada Т. Serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae strains isolated from slaughter pigs affected with chronic erysipelas. // Japan J. Veter. Sc. 1984. Vol. 46 № 2.

220. Takahashi Т., Takigi M. Gross protection in mice and swine immunized with strains of Erysipelothrix rhusiopathiae of xarious serotypes. // Amer. J. Veter. Res. 1984. Vol 15 № Ю. -p. 2115-2118.

221. Watarai M. Comparison of etiological and immunological characteristic of two attenuated Erysipelothrix rhusiopathiae two strains of serotypes la and 2. // Japan J. Veter. Sc. 1993. Vol. 55 № 2.

222. Welmann G., Heuner F. Bedentung von serologischen Untersuchun-gen in der Schweinerotlaufforschund. // Centralblatt fuic Bacteriologie, Para-sitenlcunde, Infectionskrankheiten und Hygiene. 1957. B. 170, № 1/5. - s. 91-97.

223. Wood R.L., Harrington R. Serotypes of Erysipelothrix rhusiopathiae isolated from Swine and soiland manure of swine Pens in the United States. // Am. J. Vet. Res. 1979, № 39. - p. 1833-1840.

224. Wood R.L. Specificity in Response of vaccinated Swine and Mice to Challenge Exposure with Straing of Erysipelothrix rhusiopathiae of various Serotypes. // Am. J. Vet. Res. 1979, № 40. - p. 795-801.

225. Wood R.L. Swine erysipelas — a reviw of prevalence and research. // Amer. Vet. Med. Assoc. 1984. Vol. 184, № 8. - p. 944-949.

Информация о работе

Барыкова, Юлия Александровна
кандидата биологических наук
Щёлково, 2005
ВАК 03.00.23

Диссертация

Выделение и изучение белковых компонентов бактерий рожи свиней вакцинного штамма ВР-2 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы