Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОХРАНЕНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИЙ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИИ ПРИ ВЫВЕДЕНИЙ ИЗ СОСТОЯНИЯ АНАБИОЗА

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СОХРАНЕНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИЙ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИИ ПРИ ВЫВЕДЕНИЙ ИЗ СОСТОЯНИЯ АНАБИОЗА"

Всесоюзная ордена Ленина академия сельскохозяйственных наук имени В. И. Ленина (ВАСХНИЛ) Всесоюзный ордена Ленина институт экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ)

На правах рукописи

Аспирант ДЖУБАНДЫКОВА Мансня Сагидуллаевна

СОХРАНЕНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ .АЭРОБНЫХ БАКТЕРИИ ПРИ ВЫВЕДЕНИИ ИЗ СОСТОЯНИЯ АНАБИОЗА

(03.00,07 —микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва— 1975

Всесоюзная ордена Ленина академия сельскохозяйственных наук имени В. И, Лепила (ВАСХНИЛ) Всесоюзный ордена Ленина институт экспериментальной ветеринарии (ВИЭВ)_

Аспирант ДЖУБАНДЫКОВА Мансия Сагидуллаевна

СОХРАНЕНИЕ ЧИСЛЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ АЭРОБНЫХ БАКТЕРИИ ПРИ ВЫВЕДЕНИИ ИЗ СОСТОЯНИЯ АНАБИОЗА

(03. 00.07 — микробиология)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук

На правах рукописи

л-г^пъ

. , ..-..л

М о с к в а — 1975

Работа выполнена в лаборатории микробиологии Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии {директор—заслуженный деятель науки РСФСР, доктор ветеринарных наук, академик ВАСХНИЛ .Я- Р. Коваленко).

Материалы диссертации изложены на 144 стр. машинописного текста, из них, 2 стр. введение, 25— обзор литературы, 64 — собственные исследования, 13 — обсуждения, 2 — выводы и практические , рекомендации, иллюстрированы 27 таблицами и 12 рисунками.

Список использованной литературы включает 290 источников, в том числе 140 иностранных авторов.

Научный руководитель — доктор ветеринарных наук М. А. Сидоров.

Официальные оппоненты:

1. Зав. отделом противобактериальных препаратов Всесоюзного научно-исследовательского и технологического института биологической промышленности МСХ СССР, доктор ветеринарных наук Никаноров Борис Андреевич.

2. Ст. научный сотрудник 43 курсов офицеров ветеринарной службы научно-исследовательской лабораторией, кандидат биологических наук Кузьмин Николай Афанасьевич.

Ведущее учреждение — Украинский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии.

Автореферат разослан « £ » А 1975 г

Защита диссертации состоится « » 1975 г.

в 14 часов на заседании специализированного Ученого совета Всесоюзного ордена Ленина института экспериментальной ветеринарии (109472, Москва, Ж-472, Кузьминки, ВИЭВ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Ученый секретарь ВИЭВ

кандидат бпол. паук В. В, Калугин.

ВВЕДЕНИЕ

Развитие микробиологии н практическое применение ее достижений вызвало необходимость разработки методов максимального сохранения жизнеспособности полезных мик-роогранизмов, а также присущих им генетических особенностей. Проведенными исследованиями была установлена возможность длительною сохранення биологических свойств бактерии на средах под слоем минерального масла, а также высушиванием из замороженного состояния, под вакуумом {лнофилнзацней).

Важнейшая задача лнофнлнзаини — сохранение неизменными не только жизнеспособности, но и основных биологических свойств микроорганизмов. Большинство авторов (П. И. Бахметьев, 1912; Н. Н. Титов, 1945; С. Г. Колесов, 1952; М. И. Соколов, 1960; Н. Н. Гннсбург с соавт., 1964 Р. А. Салтыков, 1965, 1966) полагают, что в процессе хранении биологические свойства лнофнлпзпрованных бактерий остаются неизменными. Другие авторы считают, что при хранении у л нофнл из кропанных культур возникают отклонения от первоначальных свойств (А. Д. Равнч-Бнргер, 1960; Е. Н. Коробкова, 1900 и др.) - Полагают, что если обезвоживание бактериальных клеток, имеющее место прн лнофнлизацин, не сопровождается существенными повреждениями генетического аппарата, мембран, ферментов и других структурных элементов клетки, то наступает состояние, при котором метаболптпческне процессы либо прекращаются, либо протекают очень медленно (П. Ю. Шмидт, 1955; Л. К. Лол пи а-Лозинский, 1966; М. Е. Бекер, 1968 и др.).

Значительное число исследований было проведено в на-' правлении изучения влияния состояния анабиоза или преда-набиоза на выживаемость бактериальных клеток. На основа-пин большого числа опубликованных данных (Б. И. Бланков, Д. Л. Клебанов, 1961; О. Смит, 1963; Е. В. Майстрах, 1904; М. Е. Бскер, 1907; Е. Е. Никитин, И. В. Знягпн, 1971 н др.) можно сделать заключение, что замораживание обеспечивает самую высокую выживаемость бактерий, однако этот метод в практических условиях неудобен. Сублимационная сушка без

защитных срсд действует губительно на биологические объекты, но при использовании защитных сред этот метод может обеспечить очень высокую выживаемость бактерий (Топпинг с соавт., 1940; Хорниброк, 1949; А. А. Аржелас, 1952; Л. П. Се-рышева, 1958; Б. И. Бланков, В. В. Литвак, Ю. Г. Казьмина, 1960; В. С.-Суслова, 1965; Е. М. Хрипунов, В. М. Котляров, И. А. Бакулов, 1972).

В последнее время выяснилось, что количество живых бактериальных клеток, полученных из лиофилизироваиных культур, зависит не только от процесса лиофнлнзацли it других факторов, связанных с ней, но и от методики выведения этих культур из состояния анабиоза. В сообщениях Б. И. Бланкова (1965), А. И. Рапопорта {1971) и других авторов приведены данные, которые свидетельствуют о том, что при выведении из анабиоза большую роль в сохранении- жизнеспособности бактерий играют также состав растворителя (ре-активатора) и метод реактивации сухих бактериальных клеток, поскольку повреждения клеточных структур возникают и на этой стадии. Однако данные относительно влияния тех или иных Факторов на выживаемость бактерий прн реактивации немногочисленны.

В-связи с этим представляют значительный интерес исследования, направленные на разработку оптимальных условий, которые бы способствовали лучшему восстановлению жизнеспособности лиофилизироваиных бактерий.

В соответствии с изложенным выше перед нами были поставлены. на разрешение следующие вопросы:

1. Изучить выживаемость и биологические свойства культур возбудителен рожи свиней и лнетерноза, выведенных из состояния анабиоза при помощи различных реактиваторов.

2. Разработать принципы и метод реактивации лиофилизироваиных в различных наполнителях бактериальных культур.

3. Изучнт[> возможность хранения указанных бактерий на питательных средах под слоем минерального масла без пересева.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

В экспериментах были использованы шесть штаммов микроорганизмов: дна штамма (вирулентный № 1329 и вакцинный ВР-2) Erysipclolhrix insidiosa н четыре штамма различного зоологического происхождения (№ 4—40, № 119, JvTe 272, Xj) Listeria monocytogenes, которые получены из музея жи-4

вых бактериальных культур лаборатории микробиологии ВИЭВ, где они хранились п поддерживались со временн их выделения путем периодических пересевов на соответствующие питательные среды.

У всех указанных штаммов аэробов предварительно изучили морфологические, культур ал ьные, тинкториальные, биохимические и вирулентные свойства общепринятыми в микробиологии методам». У штамма ВР-2 была изучена также им-муиогениость для белых мышей.

Указанные выше штаммы подвергнуты сублимационной сушке. С этой целью бактерии каждого штамма (селекционированные Э—формы) выращивали на мясо-пеитопном агаре (МПА) в матрах в течение 24 часов при температуре 37°. Выросшие колонии смывали небольшим количеством 0,85% раствора хлористого натрия (рН 7,2—7,4). Полученную густую суспензию бактерий разбавляли соответствующим наполнителем до концентрации 1 млрд. живых бактерий в 1 мл. Количество живых бактерий в 1 мл. суспензии определяли путем рассева различных разведении ее на агар в чашках Петри с последующим (через 48 часов выращивания) подсчетом колоний. Бактериальную суспензию, содержащую 1 млрд. живых бактерий в 1 мл., разливали по 1 мл. в ампулы из нейтрального стекла с внутренним диаметром 16 мм., закрывали тонким слоем стерильной ваты н помещали в сублимационный аппарат фирмы «Эдварде» (Англия),

В качестве наполнителей для каждого исследованного штамма бактерий использовали мясо-пептопньм! бульон (рН 7,2), 20[,/о-ную стерильную неинактнвнрованную сыворотку крови крупного рогатого скота (рН 7,2), молочпо-лактозо-са-харозную среду (рН 7,2) и стерильное обезжиренное сборное молоко коров (рН 6,9).

Лиофнлпзацию проводили следующим образом: бактериальную суспензию в ампулах предварительно замораживали при температуре минус 45° в течении З-х^часов и затем подвергали сублимационной сушке на установке «Эдварде» в течение 24 часов. Первые 4 часа лиофилизацню проводили при температуре плюс 23—24" С, затем включали подогрев и' доводили температуру до плюс 37° С В период сушки температура колебалась от плюс 36° С до плюс 40" С.

Величину остаточной влажности определяли по методу, предложенному К. Е. Долниовым (1957). В наших опытах она составила в среднем 2,5—З.ОТо.

Всего высушено с различными наполнителями 960 ампул с суспензиями изучаемых бактерий. Половину запаянных под вакуумом ампул с лнофнлпзпрованнымп культурами хранили

при температуре плюс 22° С б темпом месте, а другую часть при температуре плюс 4° С.

В' качестве реактиваторов использовали 0,85%-ный раствор хлористого натрия (рН 7,2), 5*/«1-ный раствор пептона (рН 7,2), мясо-пептоинын бульон (рН 7,2) и стерильное обезжиренное молоко коров (рН 6,9)

В охлажденные до +4С С ампулы с сухой массой бактерий медленно частыми каплями добавляли по 1 мл охлажденного до +4° С того или иного реактнватора и не перемешивая выдерживали 60 минут при комнатной температуре (20—23°). Затем содержимое ампулы взбалтывали, готовили серийные десятикратные разведения в 0,85%-ном растворе хлористого натрия, получая разведения от 10-1 до 10~9. Во всех опытах для каждого последующего разведения использовали отдельную пипегку. Из трех—четырех последних разведений микропипеткой брали по 0,3 мл микробной взвеси и высевали на 3 чашки Петри с пластинчатым мясо-пептонным агаром (МПА).-На каждую чашку таким образом высевали по 0,1 мл, распределяя бактериальную ¿взвесь по поверхности агара. Засеянные чашки Петри помещали в термостат при температуре 37° С. После 48-часовой инкубации производили подсчет выросших колоний. Число колоний, выросших на пластинчатом агаре в трех чашках Петри, складывали, выводили среднее арифметическое для одной чашки, умножали сначала на фактор.разведения, а затем на 10, получая таким образом количество живых бактериальных клеток в 1 мл. Процент выживаемости лнофнлпзпрованпых культур, восстановленных через определенные промежутки времени с помощью различных реактиваторов, вычисляли по Формуле

V А • 100 = В '

где: X — показатель выживаемости бактерий;

А — количество живых бактерий в 1 мл восстановленной культуры (выведенной из состояния анабиоза);

В — исходное количество живых бактерий в 1 мл этой же культуры до лиофилизацни.

Количество живых бактерий в 1 мл определяли до лиофи-лнзацни, сразу после лнофнлнзации, а также через б и 12 месяцев хранения запаянных ампул при температуре +4 и 4-22° С, используя для реактивации перечисленные растворы. По максимальному выходу жизнеспособных бактерий судили об эффективности того или иного реактнватора. 6

Непосредственно после лнофнлпзации, а затем через 6 II 12 месяцев хранения прн двух температурных режимах у изучаемых штаммов исследовали морфологические, культу-ральные, тинкториальные, биохимические свойства, а также вирулентность, нммуногенность (у штамма ВР-2) п степень диссоциации путем рассева 24 часовой культуры па мясо— пептошшй агар л подсчета 5, I? н переходных форм колоний.

Наряду с этим было изучено влияние хранения возбудителей рожи свиней и листерноза на мясо—пептоином агаре под слоем минерального масла. С этой целью культуры, образующие типичные гладкие колонии, засевали на мясо—пептонный агар с малым скосом и выращивали при температуре 37° в течение 2—3 суток. В пробирки с обильным ростом культуры вносили стерильное вазелиновое масло так, чтобы уровень последнего превышал па 1 см край скошенного агара. При заливке следили, чтобы весь воздух около культур был вытеснен минеральным маслом. Пробирки с залитыми минеральным маслом культурами закрывали ватпо-марлевымн пробками н хранили без пересева. Контролем служили культуры, не залитые маслом н пересеваемые через каждые 3 месяца.

Пробирки с опытными н контрольными культурами хранили прп комнатной температуре в темном месте к при температуре рефрижератора ( + 4° С).

Спустя 12, а затем 24 месяца хранения при двух температурных режимах, производили высевы культур возбудителен рожи свиней п лнстерноза на питательные среды. У бактерий, пересеянных на свежий мясо-пептоннын бульон, изучали степень диссоциации. С этой целью суточную бульонную культуру всех штаммов высевали па чашки Петри с пластинчатым агаром, никубировалн 48 часов при 37" и с помощью бинокулярной лупы подсчитывали количество Э-, К и переходных форм. Одновременно изучали морфологические, культураль-ные, тннкторнальные, Ферментативные, вирулентные н имму-ногенные свойства исследуемых штаммов бактерий, хранившихся под слоем минерального масла.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Реактивация бактерий, лиофилизированных в 20%-ной сыворотке крови крупного рогатого скота

При использовании в качестве реактиватора физиологического раствора выход живых бактерий штамма ВР-2 сразу после лнофнлпзации составил 0,9а/о, через 0 месяцев храпения— 0,3% (при +4° С), 0,2% (прп +22° С) и через 12 меся-

цев —0,2®/« {при +4° С) н 0,06% (при + 22" С) к исходной концентрации.

При применении в качестве реактнватора мясо-пептонного бульона выход жизнеспособных бактерий непосредственно после высушивания составил 49,5%, через 6 месяцев — 2,3й/» (при +4° С), 0,4% (при +22° С) и через 12 месяцев — 0,8л/о (при +4° С), 0,05% (при +22° С) к исходной концентрации. При использовании 5*/в-ного раствора пептона выхода живых бактериальных клеток составил 71% непосредственно" после лиофнлнзашш, через 6 месяцев — 7,1% (при +4° С) и 3,1е/» (при 4-22" С), через 12 месяцев— 0,5% (при +4° С) и 0,1°/» (при +22° С) к исходной концентрации. Выход жизнеспособных бактерий, реактивированных обезжиренным молоком, составил 65% сразу после лнофилнзации, а через 6 месяцев 30!% (при +4° С) и 10,0% (при +22° С) и через 12 месяцев —1% (при +4С С), 0,03% (при +22° С) к исходной концентрации.

Для вирулентного штамма № 1329, реактивированного физиологическим раствором, выход живых бактерий непосредственно после лиофплизашш составил по истечении 6 месяцев— 11,8% (при +4° С) и 0,6% (при +22' С), через 12 месяцев— 10»Лг (при + 4°С) и 0,1% (при +22° С) к исходной концентрации. При применении в качестве реактнватора мясо-пептонного бульона выход жизнеспособных бактерий составил 58,0% непосредственно после лиофилизации, 10% (при +4° С), 2,4®/о (при +22° С) через 6 месяцев и 7,7% (при +4° С), 1,2% (при +22° С) через 12 месяцев хранения. При использовании 5%-ного раствора пептона выход живых бактериальных клеток сразу после высушивания составил 94,2*1/й; через 6 месяцев хранения —32% (при 4-4° С) я 13% (при +22® С) к исходной концентрации. При выведении штамма № 1329 из состояния анабиоза обезжиренным молоком выход Ж71вых бактериальных клеток составил 71% непосредственно после лиофилизацин; 57% (прн + 4° С), 6,2% (при +22° С) через 6 месяцев и 8«/о (при +4° С), 6,2% (при + 22° С) через 12 месяцев хранения.

При оживлении штаммов листерий (№ 4—40, № 119, № 272, Хг) было установлено, что сразу после высушивания наибольший выход живых бактерий наблюдался при применении в качестве реактнватора обезжиренного молока, раствора пептона и затем МПБ. При использовании физиологического раствора выход живых бактерий был в 3—6 раз ниже по сравнению с другими реактпваторами. Аналогичная картина наблюдалась при исследовании через 6 и 12 месяцев хранения, причем в ампулах хранившихся при комнатной 8

температуре, выход живых бактерий был всегда Ниже в 2 и более раз.

Реактивация бактерий, лиофилизированных в молочно-лактозо'Сахарозмой среде

Показатели выживаемости штамма ВР-2, выведенного из анабиоза с помощью Физиологического раствора, были низкими независимо от продолжительности хранения (0,06—5,3®/а к исходнбй концентрации). При суспензнрованнн другими ре-активаторами (мясо-пелтонный бульон, 5%-ный раствор пептона и обезжиренное молоко) непосредственно после лиофи-лнзацни количество живых бактерий снижалось в 2—3 раза по сравнению с исходным количеством бактерий. Через 6— 12 месяцев хранения при +4° С число жизнеспособных бактерий уменьшилось в 20—80 раз. Тем не менее использование этих реактиваторов обеспечивало выживаемость большего количества клеток, чем при применении физиологического раствора. Так, через 12 месяцев хранения при +4" С физиологическим раствором восстанавливалось 0,2% бактерий, а 5%-ным раствором пептона — 5%, т. е. в 25 раз больше. При температуре хранения -г 22° С количество выживших клеток снижалось в 90—95 раз.

При использовании физиологического раствора количество живых бактерий штамма N8 1329 было в 90—95'раз ниже, чем до лиофилнзацнн и составляло 0,6% к исходному числу бактерий. Применение мясо-пептонного бульона, 5в/о-ного раствора пептона и обезжиренного молока сразу после высушивания обеспечивало выживаемость 47—70% бактерий. Через 6—12 месяцев хранения при температуре +4° С количество живых бактерий уменьшилось в 2—3 раза, а при +22° С — в И—25 раз.

Результаты опытов показывают, что выживаемость лпсте-рнй (штаммы № 4—40, № 119, № 272, Ха), выведенных из анабиоза с помощью реактиваторов, содержащих белки, составляет непосредственно после высушивания 75—99% к исходной концентрации бактерий. При хранении выживаемость бактерий снижалась незначительно (в 1—2 раза) при температуре + 4° С и в 2—2,5 раза при температуре +22 С. Если в качестве реактиватора применяли физиологический раствор, то выход живых бактерий через 12 месяцев хранения во всех случаях не превышал 4,5% (при +4° С) и 2**/® (при 22° С).

Реактивация бактерий, лкофилизированных в обезжиренном

молоке

Отнмалыгым реактнватором для бактерий штамма ВР-2, лиофнлнзнрованиых в обезжиренном молоке, является обезжиренное молоко. При использовании последнего количество t живых бактерий через 12 месяцев хранения при температуре + 4° С было в 2—8 раз больше, чем при реактивации другими реактпваторамн. Наименьшая выживаемость бактериальных клеток наблюдалась при восстановлении культур с помощью физиологического раствора: даже непосредственно после лнофнлизацин выход живых бактерий составлял 1,9% относительно исходного количества бактерий.

При изучении влняния различных реактпваторов на выживаемость бактерий штамма Л'а 1329, лнофилнзнрованного в обезжиренном молоке оказалось, что влияние реактпваторов наиболее существенно сказывается при выведении из анабиоза непосредственно после лнофнлизацнп н через 6 месяцев хранения.

При использовании в качестве реактиватора ' обезжиренного молока выход живых бактерий составлял 60,0—57,0% после лнофнлизацин и через 6 месяцев (при +4° С), а применение физиологического раствора обеспечивало выживаемость только 7,0—4,0% бактерий после лнофнлизацин н через 6 месяцев. Через 12 месяцев хранения при температуре +4ЛС выход жизнеспособных клеток был приблизительно одинаков (3,5—5,3%) независима от вида реактиватора. Необходимо подчеркнуть, что ¡1 в этом случае лучшей температурой хранения является температура рефрижератора (+4° С).

Лнстернн (штаммы № 4—40, Кг 119, № 272, Хг), высушенные в обезжиренном молоке, весьма удовлетворительно переносят процесс лнофнлизацин. При использовании реактивато-ров, содержащих белок, выживаемость (в зависимости от штамма) непосредственно после лнофнлизацин составляла 60—95%, через бмесяцев — 54—969/о и через 12 месяцев хранения— 35—80% (при +4° С). В данном случае наилучшими реактпваторамн являются мясо-пептонный бульон и обезжиренное молоко, которые обеспечивают оживление не менее 50% бактерий. Оптимальной температурой хранения является температура рефрижератора, так как выход жизнеспособных' бактерий при таком режиме хранения был в 2—4 раза выше, чем при хранении при комнатной температуре.

Иная картина наблюдается при использовании в качестве реактиватора физиологического раствора. Выход живых бактерии непосредственно после лнофнлизацин составлял всего 6,8% по сравнению с 95% клеток при использовании обезжи-10

ренного молока. Через 12 месяцев хранения при температуре -.¡-4° С можно было вывести из состояния анабиоза только 1,1% бактериальных клеток, т. е, в 40—60 раз меньше, чем это может быть обеспечено применением обезжиренного молока и мясо-пептонного бульона.

Реактивация бактерий, лиофилмзированмых в мясо-пептон ном бульоне

Выживаемость бактерий рожи свиней штамма ВР-2, выведенных из анабиоза с помощью физиологического раствора, составила: сразу после лиоФнлнзацнн 0,3% (к исходной концентрации), через 6 месяцев хранения при +4°С и +22° С— 0,055/о и 0,03%, а через 12 месяцев хранения при тех же температурах— 0,03% и 0,01% соответственно. При использовании в качестве реактиватора мясо-пептонного бульона выход живых бактерий сразу после высушивания был равен 50% (к исходной концентрации), через 6 месяцев при -|-40 С и + 22° С — 0,7р/о и 0,5%, а через 12 месяцев хранения при тех же температурах — 0,5% и 0,1% соответственно. Выход жизнеспособных бактерий, реактивированных 5%-ным раствором пептона, составил 31,5®/о (сразу после лиофилизацин), 12,1 и 1.5% —через 6 месяцев хранения при +4° С и +22° С соответственно и 1,2 — 0,02% через 12 месяцев хранения при тех же температурах.

Прй суспекзнрованип в обезжиренном молоке выход живых бактерий этого штамма составил: сразу после высушивания— Эб^/с, через 6 месяцев хранения при +4° С и +22° С — 86% и 60% соответственно; через 12 месяцев хранения при тех же температурах—1,3% и 1,1;% соответственно.

Выживаемость штамма № 1329, выведенного из анабиоза с помощью физиологического раствора, составила сразу после высушивания 1,8%, через 6 месяцев хранения при +4" С и + 22" С 0,99/о и 0,8% соответственно, а через 12 месяцев хранения при тех же температурах 0,1% и 0,01%. Выход жизуе-способных бактерий, реактивированных мясо-пептонным ¿фМ"

составил 87,59/о непосредственно после лиофилизацин, 20% — через 6'месяцев и 2% через 12 месяцев хранения при + 4° С. При температуре хранения +22° С выживало 16% и 0,3°/о соответственно срока хранения. При реактивации 5%-ным раствором пептона выход жизнеспособных бактерий этого штамма составил 44,5% непосредственно после лиофилизацин, 12,5% —через 6 месяцев и 0,9% —через 12 месяцев храпения при +4° С; при температуре +22° С выжило 10°/& и 0,2% бактерий соответственно. При суспензировании обезжиренным молоком восстанавливали жизнеспособность 99% бак-

тернй сразу лосле высушивания, 90% — через 6 месяцев й 12% —через 12 месяцев хранения при +4° С; при температуре +22° С выживало 72% и 10% соответственно срокам хранения.

Все штаммы лпстернй весьма удовлетворительно переносили процесс лиофплнзацнн в мясо-пептонном бульоне и при восстановлен!»! белковыми реактпваторами непосредственно после лиофплпзации выживало до 99% бактерий. Культуры, выведенные из состояния анабиоза с помощью физиологического раствора, содержали 6—21% жизнеспособных клеток. Прн хранении в течение 12 месяцев с помощью физиологического раствора восстанавливали жизнеспособность только 1,5— 10% бактерий, тогда как прн использовании других реактпва-торов восстанавливали способность к росту до 80% бактерий.

Изучение биологических свойств бактерий рожи свиней к л истерий, лиофилизированных в различных наполнителях.

С целью изучения биологических свойств лиофнлизированных культур бактериальную массу после реактивации высевали на мясо-пептониый бульон и мясо-пептоиный агар и помещали в термостат при температуре +37° С на 24 часа.

Восстановленные культуры возбудителя рожи свиней и лпстернй на поверхности агара образовывали колонии только Э-формьг с гладкой поверхностью. Шероховатые формы колоний посла лнофнлнзашш и реактивации не были обнаружены. Морфологические, тникторнальные и культуральные свойства изучаемых бактерий лосле выведения из анабиоза были типичными. Биохимическую активность реактивированных культур возбудителен рожи свиней и листерий изучали после трехкратного пассажа на свежих питательных средах. Независимо от температуры и длительности хранения, а также применяемого реактнватора биохимическая активность у изучаемых культур сохранилась,

С целью изучения нммуногеипых свойств вакцинного штамма ВР-2 были взяты ампулы с сухой массой бактерий, высушенных в различных наполнителях н хранившихся при температурах +4° С и +22°. Каждая из культур была выведена из состояния анабиоза по методике описанной ранее, и засеяна в мясо-пептонный бульон. Суточной бульонной культурой вакцинировали белых мышей весом 17 г (доза 0,5 мл подкожно) и через 20 дней заразили заранее подтитрованной культурой вирулентного штамма № 1329. Вакцинированные мышц ие заболели, что свидетельствует о том, что оставшиеся живыми бактерии вакцинного штамма ВР-2, независимо от наполнителя и реактнватора и давшие рост в бульоне, сохраняют иммуногенные свойства. 12

Пргг изучении вирулентных свойств культур возбудителей рожи свиней н л истерий, выведенных из состояния анабиоза, оказалось, что вирулентность штаммов также существе/то ле изменилась.

Хранение культур под слоем минерального масла

В результате изучения культур, хранившихся в пробирках на мясо-пептопном агаре под слоем минерального масла без пересева в течение двух лет (срок наблюдения), было установлено, что морфологические, культуральные и тинкториаль-ные свойства не изменились. При первом пассаже на свежую питательную среду наблюдали удлинение лаг-фазы, К третьему пассажу скорость роста бактериальной популяции восстанавливалась. На пластинчатом агаре бактерии формировали колонии только гладкого типа; колонии шероховатого типа не были обнаружены. Установлено, что биохимическая активность, вирулентность, а также иммуногенность вышеуказанных культур оставались неизменными.

Таким образом, культуры возбудителей рожи свиней и ли-стерноза сельскохозяйственных животных, хранившихся 2 гола без пересева на агаре под слоем минерального масла, сохраняют жизнеспособность и присущие им основные биологические свойства. Этот метод может с успехом использоваться при поддержании коллекции культур 'в условиях любой бактериологической лаборатории.

ВЫВОДЫ

1. Жизнеспособность возбудителей рожи свиней и лпсте-рпоза сельскохозяйственных животных в лиофнлнзнровапном состоянии зависит не только от применяемой при лпофилиза-цнн защитной среды, но п от температуры хранения и применяемых для выведения из состояния анабиоза реактиваторов.

2. В связи с тем, что некоторые белковые реактиваторы (молоко, пептонный раствор) позволяют сразу после лиофн-лизации восстанавливать способность к росту у абсолютного большинства л истерий, можно полагать, что сам по себе процесс лнофилизации в защитных средах повреждает бактериальные клетки, однако они сохраняют потенциальную способность к оживлению.

Эта потенциальная способность может реализоваться ггрп применении оптимального белконого реактниатора, который должен подбираться опытным путем для каждого вида микроорганизма.

3 При реактивации лнофнлизированных бактерии с целью

максимального сохранения численности популяций необходимо использовать для регндратацип реактивирующие жидкости, содержащие белок. Удовлетворительный выход живых бактерий наблюдается при использовании одного и того же вещества в качестве реактнватора и защитной среды, используемой при лноФнлнзацни.

4, Бактерии рожи свиней н лпстернн, лнофнлнзнрованные в различных наполнителях к хранившиеся в течение 12 месяцев в запаянных ампулах при температуре +4" С и +22" С, и затем восстановленные из состояния анабиоза по разработанной нами методике с использованием различных реактнвато-ров, включая и физиологический раствор поваренной соли„ в субкультурах полностью сохраняют свон исходные Аежгерпо-логические свойства л не диссоциируют.

5. Возбудители рожи свиней и листерноза, выращенные на МПЛ н хранившиеся под слоем минерального масла в течение двух лет (срок наблюдения) без пересева, сохраняют жизнеспособность н исходные биологические свойства. В соответствии с этим можно использовать метод хранения бактерий на МПЛ под слоем минерального масла как в производственных лабораториях, так и в музее живых бактериальных культур.

Практические рекомендации

1, Для реактивации лнофплизнрованных в различных наполнителях культур возбудителя рожи свиней (включая вакцинный штамм рожи ВР-2), а также лпетерпй необходимо использовать растворители (реактнваторы), содержащие белок, что обеспечивает более высокий выход живых бактерий.

Наиболее постоянные и удовлетворительные результаты получаются при использовании в качестве реактнватора среды, в которой бактерии были лнофплизнровапы.

2, В производственных условиях бактериальные культуры возбудителей рожи свиней н листерноза можно хранить без пересева па мясо-нептонном агаре под слоем минерального масла в течение 2-х лет (срок наблюдения). При таких условиях хранения культуры не диссоциируют и не изменяют биологические свойства.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Реактивация лиофплизпрованных культур возбудителя рожи свиней. Ж. «Ветеринария», 1974, № 2, 46—47.

2. Выведение бактериальных культур из анабиоза. Ж. «Ветеринария», 1975, № 3, 48—49.

Ответственный за выпуск автореферата — доктор ветеринарных наук М. А. Сидоров.

Зак. 822 Тир. 150

Типография Мое козе кон ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академик имени К. И. Скрябина