Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Устойчивость микроводорослей к сухой и низкотемпературной консервации и физикохимический аспект проблемы анабиоза

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Устойчивость микроводорослей к сухой и низкотемпературной консервации и физикохимический аспект проблемы анабиоза"



На правах рукописи

КУЗЬМИНА Рузольда Ивановна

УДК 539.2+541.64+577.32

УСТОЙЧИВОСТЬ ШРОВОДОРОСЛЕЙ К СУХОЙ И >ШЗК0-ТШПЕРАТУР1ЮЙ ¡1 «¡ШКО-ЖШЧБСЮЙ

АСПЕКТ ПРОБЛИШ АНАШОЙ

03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕШИ СИШРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ БИОФИЗИКИ

КРАСНОЯРСК • 1990

Гобота внлолнопа в Красноярском государственном университете.

- Официальные оппоненты:

Лектор флзпко-математпческих наук, профессор С.П.Габуда доктор физико-математических паук А.В.Лнпспмов доктор биологических паук Е.А.Ваганов

Ведущая организация - Институт микробиологии им.А.Кирхенштейна

ЛН Латв.ССР

Зашита состоится _"_1990 г. в __час.

«а заседании Специалпзироваппого совета Д 003.45.01 по биофизике при Институте биофизики СО АН СССР

по адресу: 660036.Красноярск, Академгородок, Институт биофизики

диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биофизики.

Автореферат разослан "____"__ 1990 г.

Учений секретарь Пнеплалиэированиого совета Л.Г.Косолапова

ко пл. физ. -нот. наук

ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТ!

Постановка проблемы, ее актуальность. Общебиологическая проблема клеточного анабиоза включает широкий круг вопросов практического и теоретического характера. С ее реоюлием связано построение фундаментальной теории физиологической устойчир-юти клетки. Углубленное изучение анабиоза способствует речению практических задач биотехнологии, криомедицщщ, космической биологии и сельского хозяйства. В состоянии анабиоза биосистеш приобретает значительную устойчивость к действию мутагашшх факторов, что важно для создания фонда генотипов организмов с нужными свойствами.

Несмотря па поразительные успехи, достигнутые в окспершен-тальнем агабпозе (Филатов, 1961; Зш1«1,1961; т'тоград-£ш1келъ,1%'7; Бекер, Дамберг, Рапопорт,1981; Голдовский,1986; Пушкарь, Гордиен-ко и др.,1985; и др.), теоретические вопроси проолеми считать окончательно ршецнши еще нельзя. До сих пор неизвестно, какие изменения претерпевает гротоплазма при обезвоживании, какой при этом образуется продукт, почему одни клетки лучше сушить, а лру-гие - морозить. Данное обстоятельство обусловлено преобладанием в теории феноменологического подхода (например, Голдовский,1977, 1981; Ло~;та-Лозинсклй,1984). В рамках флзи химических прогнозов, полученн!.х на молекулярном г субклеточном уровнях организации биосистем, трудно сделать заключение о механизмах устойчипо-сти клетки к анабиотическим факторам среди, а следовательно, обосновать выбор оптшального способа конаервнг ованля клеток и хранения биомассы. Существует мнение, что следует "пересмотреть направление биофизических исследований, обратив внимание на изучение биополимеров в твердом, сухш состоянии (соответствутадем анабиозу" (Голдовский,1981,с.109). Однако, поскольку состояние анабиоза присуще организму (клетке), физико-химический аспект проблемы должен включать изучение ответных реакций протоплаз:,ш как целостной системы. В данном отношении рассмотрение агрегатного состояния про-тошшзии при обезвоживании монет дать необходимую информации. Хотя го:эфпкащш лротоплазмы при сухом анабиозе (Генкель,1975; Голдовский,Г981; Гекер Дамберг, Рапопорт, 1981) и замора кипа им (Туманов, 1979). предполагается, физиологическая уст ойчивость клеток с этих позиций почти не исследована, Создание полной картины анабиоза нсвоз!.кш з без широкого охвата разнообразных организмов. Боль-

шов знзчение имеют водоросли, являющиеся незаменимым объекта для исследования вогпикновения ж. зни но Земле и зволоционных связей в природе (Масюк,1965).

Актуальность темы диссертации состоит в следующем:

- создание предпосылок для развития фундаментальной теории физиологической устойчивости анабиотических систем и систем искусственного анабиоза;

- развитие единых представлений о сухом и холодов»- анабиозе через состояние воды;

- выявление закономерностей реакции микроводорослей па действие сушки и низкотемпературной консервации в голях оптимизации режимов консервирования и хранения.

Цель и задачи исследования. В настоящей работе предпринята попытка описания состояния клеточного анабиоза на физико-химическом уровне организация протоплазмы. За основу вязто положение, что состояние анабиоза предполагает обратимый переход золевой компоненты (тиксотропный гель) и органоидов в ксерогель.

При выполнении работы были поставлены следующие задачи:

1. Разработать физическую модель, адекватно описывающую связь состояний организмов с агрегатными свойствами протоплазм"т.

2. Экспериментально изучить состояния меза- и анабиоза про- и эукариотичсских водорослей.

3. Найти способ определения оптимального метода ког. нервации ' клеток по состоянию воды и структурной организации ксерогелей.

Для выполнения поставленных задач решались следующие вопроси.

- обоснование устойчивости анабиотических систем про- и эукариотических клеток с привлечением теории гелес 'разованкя и перко-ляции;

- начете состояния воды неподготовленных, подготовленных к обезвоживанию клеток и модельных систем;

- исследование устойчивости микроводорослей к сухой и низкотем-* ператдшой консервации как объектов, обладающих фотосинтетическим аппаратом.

Научная новизна работы. Б рамках теории гелообр^зования (Р1огу. 1953; Тагилу979,1981; Де Жен, 1982) с использованием идей перколяции (Эфрос,1982) показано, что в процессе обезвоживания протоплазмы формируются различные по устойчивости и свойствам ге-леподобные или гелевые системы. Модельный подход и применение

комплекса методов при изучении состояния водг в структурной орга-ниоащш ксерогелей позволили определить природу "белкового" тела (Бекер с соавт.,1981) подготовленных и неподготовленных к анабиозу систем. Выявлена связь ус-ойчивости клеток к обезвоживанию с типом ксерогеля. Предложен способ установления оптимального метода консервировслия клеток (суска, заморакивзние) по состоянию воды в гидратной оболочке (уровень остаточной влажности состояния мезабиоза). В качестве модели исследования анабиоз использованы ■микроводоросли прс- и эунариотической организации. Покамно, что состояние фотосинтетического аппарата может .служить критериеи жизнеспособности организма и ориен-лгрсм при установлении состояния мезабиоза. Впервые дается физико-химическое определение состояний организмов и прогнозируется, эволюция анабиот,-ческих систем.

Практическое значение работа. Полученные результаты способствуют пониманию механизме клеточного анабиоза, ориентируют на изучение .физико-химических свойств протоплг. при обезвозшваиии и действии низких теше!, .тур, устанавливают связь состоя!!ия води с устойчивостью организма, позволяют объяснить ранее неясш:е явление при конезрвировании микроорганизмов. Выводы работы необходим-учитывать при совершенствоЕзнии способов консервирования и хранения микроорганизмов и _ астителышх тканей, ь разработках научно-обоснованных приемов консервации -дологической продукции.

Результаты работа могут найти практическое пршенение в лабораториях биофизического, экологического и физиологи' эсь -го профилей, гае изучаются процессы физико-хшическ^й организации протоплазмы и устойчивость клеток и тканей к обезвогиванию и действию •низких температур.

. Материалы диссертации использовались в курсах лекций "Физика биополимеров", "Физиология микроорганизмов", читаемых для студентов кафедры биофизики Красноярского государственного ушшерситета. Методическая разработка экспресс-метода определения гидратной воды посредством поглощения энергии СВЧ-поля входит в болыяой биофи-зичеекпй практикум.-Разработанный способ определения температурной устойчивости микроорганизмов защищен авторским свидетельством и рекомендован для микробиологической, пищевой промышленности, сельского хозяйства при реиении вопросов, связанных с хранением сельскохозяйственной и другой продукции. Найденный решил консервирования и хранения хлореллы может быть применен в замкнутых систе-

мах жизнеобеспечения с целью восполнения жизнеспособной бясгюсы, а также в биотех-.-ологичоских лроцессах с участием водорослей.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференциях по анабиозу (Рига,1971,1984), на Всесоюзных совещаниях по управляемому биосинтезу и биофизике популяций (Красноярск, 1969,197а), не Всесоюзных рабочих совещаниях по воросу круговорота веществ в замкнутых системах на основе жизнедеятельности низших организмов (Киев,1972,1974,1976), на Всесоюзном симпозиума "Клетка и абиотические факторы среды" (1с шнград,1974), на Всесоюзном совещании по управляемому биосинтезу водородных бактерий и других хемоавтотрофов (Красноярск,1976), на Всесоюзном симпозиуме "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Черноголовка,197?), на Международном симпозиуме,"Рост микроорганизмов на ^-соединениях" (Пущино,19г'7), на Международном симпозиуме стран С®. "Биотехнология и биоинженерия" (Рига,1978), на I Всесоюзном, съезде биофизиков (Москва,1982), на Всесоюзном симпозиуме "Биологические проблемы Севера" (Магадан,1983), на I Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы современной альгологии" (Черкассы,1987), на Всесоюзной школе "Биофизические и биотехнические аспекты гомеостаза на различных уровнях организации биосистем" (Красноярск,198"), на семинарах Института физики СО АН СССР (Красноярск,1986,1987), в Институте микробиологии ш.А.Кирхенште!:ла АН Латв.ССР (Рига,1989),

Публикации. Результаты диссертации опубликованы в 40 работах в отечественных научных журналах ("Физиология растоний", "Биологические науки", "Известия СО АН СССР"), научных сборниках, препринтах ИФ СО АН СССР, в монографии "Вопросы биосинтеза" (У глава).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, семл глав, заключения, выводов, изложена на 320 страницах машинописного текста. Иллюстрирована 73 рисунками и 30 таблицами. Список цитируемой литературы (832 ссылки на работы отечественных и зарубежных авторов) и приложение (13 таблиц) занимает 103 страницы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

оВо введении обосновывается актуальность физико-Гчтаческого изучения протоплазмы при обезвоживании. Отмечается значение голой

в устойчивости организмов к с ушко и замораяиг шин.

Первая глава носит,обзорный характор. В ной проанализированы вопросы, относящиеся к проблеме анабиоза: состояние воды в клотко, состояния организмов, биологический и физико-химический аспекты устойчивости биосистем, основные подходы в решении проблемы анабиоза.

Несмотря на то, что в литературе постулируется образование гелей в биосистемах при обезвоживании и действии ._i3iax температур, природа их и свойства не изучены. Работа Туманова ч1979) по гелеобразованизо в тканях древесных растений ,при подготовке орга-иизиа к морозам является единственным исследованием такого рода. Предполагая проявление первичных свойств анабиоза у одноклеточных (Голдовск"й,1981), следует обратить внимание на то обстоятельство, что не только у высокоорганизованных биосистем, но и в мире микроорганизмов широко распространены эволюционные "ь.дстройки" над' казне способно!1 структурой (многослойные оболочки, защитные вещества и др.). Выяснено, чтп не существует универсального объекта для изучен*« механизмов анабиоза. Бакером (1984) высказана конструк-тцрная идея подбирать модели"по задачам исследования. Перепектив-шш объектами для изучения устойчивости фотоскнтетического аппарата явл."этся микроводоросли.'Данные о сост тнии их пигментной системы в условг.ях высушивания и опицотелытых температур практически отсутствуют.

Состояние воды в бкосистемах успешно изучается отечественными и иностранными исследователями (напршер, Авдронпяашвили с со-ивт.,1967,1988; Аскоченская с соавт.,1970,1972,1978; Аксенов с со-авт.,196Э-Ь<36; Н. тола ев с coa вт., 1972,1984,1985; Гусев ,1974; Сулей,танов, 1974; Анисимов с соавт.,1977,1980; Габуда, Ржавии, 1978; Щегилева,1984,1986,1989; Балла с соавт.,1985,1989; Cooke, Kuntz, 1974; Kuutz, Kausmarm, 1974; bing, I9to,1978,1983; Droat-Harmen, 1965,1982; Swift',' 1973; Bslton, 1973; Beal e.a. ,1976-1983; Eocanyl e.a.,1983; Aahworth, Abeles, 1984; и др.). Существуют определенные трудности в однозначной интерпретации результатов, полученных на ра-чообразн:."i объектах и различными методами, что следует из дкскуссЕ"'шссти многих положений состояния и структуры водн(Рапли, 1984; Хепр,1984; и др.) в биологических систе эх. Авторы предлагают комлатпыентние модели состояния воды (Herbat, Goldstein, 1984; K'iiissll, 19Ю). Манззль и Клег выделяют водные компартмен-

tu: цитозоль, нуклеоплазму и внутреннюю среду мембран. Сдел- н вывод о том, что i-мевтся разрк^ между достижениями в изучении свойств води в бяосй(_;емах и прогноз1фованием способов консервации и хранения биопрепаратов. Дашше по иммобилизации небольшого количества води белково-ллпкднши структурами (Аксенов с соавт., 1969,197?,1978; Николаев с соавт.,1972,1984; Шкидченко с соавт., 1984; и др.), по-вишшшу, на отражают всего многообразия состояния воды в биосистемах.

Рассмотрены теории, объясняющие повреждения клеток: при изменении объема (Meryman, 1966); вне- и внутриклеточная кристаллизация води (Красавцев,1968,1972,1984; Самютш,Г"54,1988); деформа-тшя и обезвоживание клеток при образовании лада (Гаврклова.Самы-гин,1988); многофакторная теория повреждений (Цушкарь, Белоус, 1977; Бекер, Дамберг, Рапопорт,I981); новые течения солевой теории (Xiovelook, 1953), объясняющие устойчивос-ь клеток осмотическими силами, возникающими на мембране (Diller, Lynch,'1984; Heubusch е.а.,1985) и контролирующими процессы массопередачи (Анисимов, 1988).

Б состоянии анабиоза устойчивость биоструктур должна быть обеспечена за счет их более высокой стабильности (Аксенов, 1984, 1985), особенно мембран- Однако, как правило, при обезвоживании (сушка и замораживание) происходит дестабилизация мембран: найлю-хлется их перестройка (Нокс, Кононенко, Рубил,1977), изменяется энергетическое состояние (Дронова о соавт.,1988), увеличиваются критическое напряжение (Горелов с соавт.,1388) и микровязкость (Гарифуллина,1988). Кроме того, стабильность отдельных белков не зависит от состояния момбран (например, фермегты гликолиза). Несмотря на сходны» характер повреждений при обезгоживании сушкой и замораживанием, не существует общей теории анабиоза, хотя и имеются предпосылки для ее создания. Кроу (Crows, 1979,1983) показал, что одни и та же веиествг (полиолы) способны защищать мембраны как при замораживании, так и при сушке. Ведемся поиск эффективно действующих на воду веществ, снижающих концентрацию солей, изменяющих pH в эвтектических точках, обеспечивающих структурную совмб-стимость Н-связей мевду биополимерами и водой (Воротилин, 1977; Franke е.а., 1983; и др.). Сохранение при обезвоживании мембран и их стабилизация в ламеллярной фазе в присутствии антифризов ж крисЯфотекторов дает основание предположить, что мембраны из кид-

кокристаллического состояния переходят в фазу двумерного геля (Тьардислов с соавт. ,1987). Таким образом, устойчивость биосистем, по-видимому, связана с организацией ксерогелей и их динамически.! поведением в водной среде.

Глава 2. Материал и методц исследования. Объектами исследования служили водоросли Chlorella vulgaris Bejor ('адреевз,1975), Spirullzta plateriBie (Hordat) fsitl,, SyneohoooccuiJ elongatua IIäg и водородокислящая бактерия Alkaiigenca eutrophna z-1 {Савельева, Жилина,I9S8), товарные пекарские дрожжи Saccharonyces coro-visiae (ГОСТ 171-69), зерновка кукурузы сорта Ель-1, второй гибрид, а также другие свдезеленые ж хлоронокковыо водоросли.

Образцы белков и белково-лигидного кшплекса приготовляли по методике Слмененко (1972). '1асти зерна - обо. ;чху с алейроновым слоем, эндосперм и зародыш со щитком - получали механическим разделением под бинокулярной гдтой. Кукурузный крал.а л и масло были товарные..

Биомассу микроорган :змов получали непрерывным культивированием в yt гановках, разработанных в Институте физики, на сбалансирован ых средах (Гительзон, Кузьмина, Базанова,1967; Кеслор, 1973) при непрерывна.! круглосуточна.! освещении (для водорослей) ксеноно-выми лампами ДКсТВ-бООГ и в накопительном релме на лашюстатах со стабилизацией оптимальной температуры для кавдой водоросли.Продуктивность учитывали по сухой биомассе с I м2 освещаемой поверх- ' ности за единицу времени. Замораживали биомассу в хстод лышх камерах (до -Ю°С), в камере лиофильной ус тан^ки производства ЧССР КС-30 (~35°С), на парах азота (-60°С) л погружением в жидкий азот (-196°С). Скорость замораживания регистрировали термопарой. Обезвоживали клетки конвективным, контактным и лиофилышм способами. Содержание воды в образцах определят методом доведения биомассы до постоянного веса.

Способ определения жизнеспособности зависел от условий опита и вида организма (Пяменова с соавт., 1965; Шевченко, Кордш, 1975; Гавриленко с соавт.,1975; и др.). Состояние фотосинтетического аппарата учитывал>. по динамике пигментов на Cv-I4 (Jefferey, Humphrey, 1957; Гольд, 1971), накопляют феофптина (.Хоботьев, Капков, 1971), по --'.змелошпо интенсивности и спектрам возбуждения флуоресценции хлорофилла "а", устойчивости хлорофилл-белкового комплекса (Ншпяева, Ii 72).

Структурные особенности среднего белка устанавливали в дшга-цзх свободной энергии по фор^ле = с/(а + в), где а - содержание объемных аминокислотных остатков (Ala. Val, Leu, lie ), важных в гидрофобной стабилизации белка; в - количество аминокислотных остатков, аффективно связывающихся с плоскими молекулами (Phe, Туг, Тгр); с - содержание аминокислотных остатков, участвующих в поворотах полипвптидной цепи и дестабилизирующих структуру белка (Pro.Gly,Авп ).

Ультратонкие среды контрастировали цитратом свинца и просматривали на микроскопах R1-I00C и ЭВМ-100Л при ускоряющем напряжении G0 и 75 кВ.

Состояние воды' изучалось методом снятия темпепатурных зависимостей (ТЗ) времен ролаксацш на спектрометре ШР-спиновое эхо, имеющем блок температурной стабилизации, изготовленном по стандартной схеме "в ПьрмГ/. Пределы измерения времен релаксации от 10 мке до I с, магнит 4,£ кЭ. Tj определяли методом "стимулированного" эха, Т2 - по Хану. Образец выдерживали при заданной температуре 15 млн.

Спектры низкого разрешения образцов снимали на спектрометре пироких линий пш (Япония) в интервале температур +30 + -140° в поло 10,5 кЭ, неоднородность шля Ю-5.

Кривые потеря веса и ДТА получали на дериватографс фирмы МСМ и.лпгрия). Расчет теплот дегидратации производили по методу Иванова с соавт.(1972).

Количество прочно-связанной воды регистрировали в поле СВЧ на установке, собранной на кафедре биофизики КрасГУ.

Все спектры и графики строились по средни- значениям 5-7 измерений. Достоверный интервал рассчитывался для ;-?овня значимости 0,05 по критерии Стъвдента. ,

Глава 3. Устойчивость протоплазмы к обезвоживанию и действию томпературы (теоретический подход). Протоплазма клетки описана как многокомпонентный раствор биополимеров в водной среде. Ее структурная организация зависит от взаимосвязанных факторов: химического состава полимерной фракции и растворителя, ког.формаций макромолекул, характера их взаимного пространственного распределения, совокупности все-х взаимодействий, температуры и других внеш. них условий.

Состав. В многокомпонентном растворе объемная доля <í, -го

компонента (<ц = С -лкг, РНК, ДНК я т.д.) обозначается чер з Х4 ; объемные доли всей полимерной фракции л и молекул растворителя (воды) сределены соотношениями

х = У к X = 1-Х. (I)

Т * 1 ъ

Обезвоживание соответствует увеличению х. Макромолекулы являются цегными гетерополимерами, характеризуются стопеныо полимер;.аации

1 построены из различных мономеров (белки - из аминокислот, РНК ь ДНК - из нуклиотвдов) и могут находиться в различных конфор-мациях.

внутренняя энергия. Структурная организация такого раствора зависит презде всего от -нутренней нергии Е., которая представляется в виде суммы парных взаимодействий между злементарнииа структурными еднничамг. Все взаимодействия являются короткодействуп-'-ми н соответствуют притгчению. Нетриг ильную часть энергии Е удается выразить только через эффективное взаимодействие ыозду парой мономеров I и | в В-рзстворитела:

где и... и.а и Ч,.- соответственно энергии паимсдейстгчя мономо-

4' »ь . о

ров сортов I- я | , мономера. I с молекулой в дь о и явух молекул

¿оды.

Совокупность параметров определяет энер етический

спектр взаимодействие в системе (их обит э число равно (+1)/2, где Е - число сортов мономеров). Если (притяжение), то

энергетически выгодна ассоциация данной пары, т.е. ыономеры обладают взаимным сродством в растворителе; если ¿-^Х^то мономеры отталкиваются, т.е. им эг'ргетически выгоде быть связанными с ио-леку.т,ами растворителя 6, нежели друг с . .ругом. самым .ерархия вг-имодействий может быть разбита в общем случае га две совс-упно-стн (ii

ЦН Ц1 Ц)+ (3)

отрицательных (связывающих) и положительных (обеспечивают.. растворимость) взаимодействий.

Свободная энергия. Равновесные свойства системы описываютс свободной энергией Р— Е. - Т Б1 где Т - абсолютная температура

Б - энтропия. В приближении среднего поля (справедливого длг описания хаотическгч смесей) вьуажениз для свободной энергии многокомпонентного раствор . гетерополимерных макромолекул сведено к стандартному виду для свободной анергии однокомпонелтлого раствора (Де Еен, 1982) с усредненным значением степени полимеризации

к средним эффективны;,1 параметрсм 6 . Знак € существен, для описания общих свойств раствора. Если 6 > О, то при любых концентрациях полимера х и температурах раствор является прсотранствен-но однородным (фаза I). Если же в раствопе £ < О , то при низких температурах он расслаивается,, т.е. становится пространственно неоднородным (фаза П); при повышении температур:, возрастает энтропийный вклад и "тенденция к расслоению уменьшается. На фазовой плоскости (х,Т) имеется кривая сосуществования фаз I и П (бинодаль), выше которой раствор с е < О превращается в однородный, и спино-даль, нижо коюрой будет происходить рзсслоегле.

Формирование надмолекулярных клеточных структур. Мономеры макромолекул обладают некоторой кинетической подвижностью,которая откр1гозет пути пространственной перестройки системы для достг^'ё-ния минимума свободной энергии.

В совокупности (3) взаимодействия отражают тенденцию

к образованию межмолекулярных комплексов и далее - к формированию надмолекулярных структур (органалл) г расслоении. Взаимодействия, ьи счет которых формируются рибосомы, хромосомы, воз» :шо, мембраны, являются достаточно сильными и обеспечивают их стабильность при физиологических условиях.

Водный раствор макромолекул, не вошедших в состав органелл, представляет собой цитоплазму и описывается сезокупностью остаточных взаимодействий или средним эффективным пара^тром £. Однородность т)астгора имеет место либо при £>0, либо выше линии бинода-ли при £< О. Приведенные соображения позволяют рассматривать протоплазму при промежуточных температурах как гетерофазную систему: • в пространственно однородную часть протоплазмы (т.е. цитоплазму) "погружены" стабильные надмолекулярные образования.

Структура цитоплазмы. Гэлеобразование. Исследопны концентрационные свойства цитоплазмы (через X', по-прежнему, обозначена объемная доля полимеров в цитоплазме). При макромолекулы практически независимы и раствор находится в золь-фазе (цитозоль). Увеличивая концентрацию полимера (т.е. обезволивая систему).можно

достигнуть некоторой критической.концентрациг х, зависящей от степени полимеризации и колформаций макромолекул, когда они будут касаться и перекрываться друг с другом. При х»х* за счет возникновения чисто гесматрпческих контактов между Ькнсромолекулами вся полимерная фракция представляет собой единое пространственное образование, шзхлшое "геометрическим" гелем. На основания теории протекания приведены выражения для х*, когда в цитоплазме содержатся цепи в конфоргациях статистического клубка, к глобулы. Области протекания изображены на рис.3.

—эк- ПРОТЕКАНИЕ->

II ПО ПОЛИМЕРУ

^.ГЕОМЕТуИНЕОСИЙ" ГЕАЬ)

_"/Г __ь V

X* ■ Г"

• п.отекание -»

по ристборителю

Рис. I. Области протекания в макро-• молекулярном растворе.

Физический гель возникает из "геометрического", когда некоторая часть макроыолекулярных контактов превращается . у. :ойчшзце связи, или сшивки. Сшивки в определегаой сюпени фиксируют пространственную структуру системы, которая похожа на трехмерную сетку (каркас) из "сшитых" макромолекул.

Гели, сформированные из глобул или жестких цепей, отнесены к классу аэрогелей (после удаления раствгчителя остается жесткий каркас, заполненный воздухом). Гели, образовашг-е из гибких цепных макромолекул, отнесет к истшшш, так как оня обладают упругими свойствами энтропийной природы. Если сшивки являются неустойчивыми (рвутся в одних местах и возникают в других), возникает ге-леподобное состояние (тиксотрошшй гель). Критерий гелеобразова-ния: среднее число сшивок на макромолекулу должно быть больше двух.

Раг'ювесные свойства истинного геля. Дополнительный вклад в свободную энергию геля, обусловленной энтропийной упругостью геле-

зш

вой сетки, представлен в виде

гае С - число упруго-активных сусделей сетки; 33 - функция, описывающая аффекты сжатия-набухания субцепи; Ye - равновесии* по деформациям объем геля; Х0 - соответствующая равновесная концентрата. Обоснован сладуютй чид функции АОр для гибких цепей {рис. 2fí)i

щуКг-о-Ц-

Выражение для свободной знергии геля состоит иг трех принципиально важных частей

F Е. ;- TSt + (б>

в котором описывает совокупность остаточных взаимодействий, второй - конфигурационную энтрогап молекул рютворителя, гретий -ентропийную упругость. Одной из важнейших характеристик геля .является его осмотическое давление П«=-(1Р/}У).Еоли и< то система

К«»-' СЖАТИЕ ХА.ШЕ

Рис. 2. Oct отичвские свойства гелей: а - функция энтропийной упругости oO^ ; стрелками показано направление возникающего при деформации осмотического давленая; б - линия нулевого осмотического давления гелч и бино-даль (пунктир) соответствующего раствор^ без сшивок.

сгкшается, если Г1 0 она расширяется (набуха< "). В соо )етст-вии с (6) П состоит из трех слягаемых

П = П., ^ П + П. 17)

' - Гп ' "Р

Если средний п.- чу.тр ос-тточны: взаимодействий £<OjTO П.^ < Г ПКонф всегда положительно. Пу^. может иметь pa3Hi_i знак: при набухали ( V?V0) возникает отрицательное осмотическое давленго Лупр< 0, стремяассся сжать гел~ и, наоборот, при сжатии (V< Vo ) %пр. 0. Равновесно- состояние геля соответствует нулевому осмотическое давлению (П -0). Решением уравнений П = 0 является линия нулевого осмотического давления на фаь-вой плоскости { хД ), изображенная на рис. 26: пр фиксирова' чой те. лературе гель набухае1

О 117111 сь-алается (), для достижения равновесной концентрации .

Гелевые структуры. На основание классификации гелей и их общих свойств рассмотрена модель ць.оплаэмы клетки, в полимерную фракцию которой входят -цепи (I) и глобулы (2). Си тем., описывается параметрами аффективного взаимодействия £и , £JJ % £u , которьв могут быть как положительными, ттк и отрицательными. Качественно описано поведение системы при различных расплело/" киях знаков этих ираметров.

Обез э.тчвание, анабиоз и регидратапйя клетки. При Обезвоживании цитоплазм :, в состав которой входят гибкие ц'чи, возможно ее коллапсирование (...аксюлальное сжатие) с полным удалением _оды. Обратимое восстановление свойств при регидратации происходит лжеь в том случае, если _ обезвоженном состоянии не возн._:эют «овые сшивки ("паразитарные"). Если полимерная фракция состоит йз водо-раствс. целого бе^а ( £>0 \ то обратимость '"яцественно увеличивайся. При физиологических условиях обье;: гая дож воды в к этке Цъ 0,75-0,85. При дегидратации доля молекул воды,приходящаяся на ма1фомолекулы, т.е. отношение /хд = ; )/х снижается. Следо-тельно, начиная с определенней степе и обезвоживания, характер биохимических процессов должен опровоздзться изменением уровня метаболической активности. При концентрациях полимера х> i \ (см. рис Л), когда прекращается протека, .ле по растворителю (воде) .этот уровень приближается к нулю. Если обезвоженное состояние обратим'1, то клетка находится в состоянии анабиоза. Можно видеть, что при обезвоживании (увеличении х) клетка переходит через гюмежуто лую

стадию, когда имеется протекание и по п' патеру .. по воде (метабиоз) .

Классификац. л кссрогелей би систем. Устойчивость биосистем свяьеюэют с количеством белка, особе! :о водорастворимого. Если допустить, что весь белок клетки участвует в гелеобразовании тгрп обезвояшватг', можно на основе идей теории пр^^екания провести классификацию биосистем. Концентрационны пороги протекания для разл даых решеток сопоставляй с объемной долей белка в семенах растений, микроорганизмах и мембранах бактерий. Предложена классификация- ксерс-елей биосистем по величине (х-хе). На устойчивость в^ чет не только концентрация белка, но и конформация макромолекул (рис. 3). Голь из гиС их ц пей может быть платно упакован и X

/' Рис. 3. Схематический виц

_ _ ——4.—| зависимости концентрации по-

■ лимера к от степени с озво-

. кивания ь> : I - гибкие цепи;

— *____2 - полуис 'ткие цепи; 3----

5 1 ; ж зт о цопи (стержни).

коллапсировэть, занимая о^лем, соответствующий максимальной кон-цент; ши полимера = I щ . р = т. Ге"ь из жестких цепей сжимается только до 'екото^ого минимального объема ; при обезвоживании ( \41) объем геля не меняется, однако в ячейках каркаса вместо молекул воды появляются дырки, при Í полужестки, гель превр-'цается в азрогель.

Согласно приведенной схеме, низкое содержание бо. .;э в клет-"IX эндо 1ерма зерновок («апршер глютении пшеншщ) соответствует полужьиткой развернутой crrpj туре макромолекул, которые образуют аэрогель,укрепленный крахмалы -да зернами. Гель алейроп зих зерен эндосперма образован гибкими макромолекула- i води- и солераст-воримых белков, способных коллапсировять и занимать вооь объем ва-куолп Высокое содержание белков в бактериальных клетках, по-вдлимому, формирует различные 'гелоподобнио обрзовонил.

Глава 4. Coi ояюы воды у подготовленных и кепоцготоплентгу к анабиозу биосистем.- Все пронесен в клетке интегрируются чороз водную среду (Шполь.Ю.^; Гусев, IU74), ярляясь естественной типовой м чкой, протоны воды служат удобном ориотлргел при исслолова-

нии -лойств цитоплазмы и органоидов клетки. Известно, что водо- и солерзстворимне белки входят в метрике цитозоля (фракции 1 и П) и цитоскелв1^ (фракция Л), соле- и щелочорастворт ю белкг компонует рибосомы (фракции П .1 Ш), а трудно извлекаемая фракция (1У) состоит из интегральных и полуинтеггчльных белков мембран (АааЫпа, 1959; Ро11сагс1, 1966). Поскольку концентрированные растворы полимеров являются условными гелями (Папков,1974), правомочно изучать свойства цитозоля и оргэно. дов на моделях: растворимых (".гиков (РГ', структурных белков (СБ) и белково-липидных комплексах ^БЛK).

Состояние води в модельгчх системах микроорганизмов (рис.4). ТЗ времь'л релаксации 2 образцов РБ, СБ, БЛК внчоких влажностей при температ-рах ниже 1!уля гаг-от относительно простой вид: чаблю-дается их монотонное уменьшение. В образцах малой влажности (м<зс$) ?"мет1 ; ст^укт: рпнй переход, напоминающий переход белка из открыс >го в закрытое состояние (Кяйвяряйнен,1980). В положительной области ТЗ имеют■сложный вид: выявляется два максимума ре-лаксацп протоноь во"ч. Первый максимум ("водный") прослеживается у всех обрэзпов, второй (высокотемпературный) - у СБ и БЛК. Даже неболы, зе количество липидов (не более &% от сух.в за) смещает мэксям мы, приближая значения внеонотемпех нурного максимума " температурам оптимума роста исследуемых объект в.

Выраженность "водного" максимума, значение времени тек.^е-рлтура структурного перехода з образцах малой влажности расть^ри-мых и еттэуг -урн' х белков позволяют констатировать высокую гвдрати-рующую способность белков бактерий и низкую хлореллы.

Состояние воды л клетках микроорганизмов. Вода в клетках неодг сродна и разделяется на две фра задай; вода, близкая по своим свойствам к "свободной" воде (фррт'ция Л) и вода "гидратнэя" (фр х-ция В). При влажностях, соответствующих исчезновению скачка в районе 0°С ^фрркция А) у образцов бактер'" дс. 30%-ной влажности ТЗ сливаются, а при бол* низких влажностях имеемся перегиб, с несенный к обмену протонами между двумя подсистемами гвдраткой воды -фракция В2 10-30$) и фракция Вг Метод СВЧ даст

близкие значения количес вз ' чочно-связэнпой вода в клетках различных микроорганизмов (0,12 г НгО/г су., -ва), замерзающей чрп -80 * -Ю0°С (Абрамо", 1981). Кз ьл1с. 5 следует, что вод" хлореллы пгоготь до 12/'-)Юй влажности проявляет свойства сь^бодной. Данные ДТА подт.вер да^т высокое содержание свободной вг-щ у хлореллы (рис.6).

Рис 4 Температурные зависимости времен релаксации Т2 модельных эбшзцов разной влажности: .а - РБ; б - СЬ, в - БЖ (- алкалиген з:----чшорьл"а;

_____ син хококкус); цифра на кривой - влвжност- образа, %.

_ 15 ЗЛ 2.7 ЗД

Т^мс ;—'—'—

6.4 ПК

л

од

0.4

_ 553.4 3.7 3.«

Т МС —с—г

3.? 3.6 3.7 Л8 3.9

+¿0 -Но О -(О -20 >

а

г О '

Рис. 5. Температурные зависимости времен релаксации Т2: а - бактерий(алка-

лигенес -■ ; сянехококкус - —); б - Т2 хлореллы; в - хлорелла

( VI ^ 12,4$). ■

Рис. 6. Кривые ДТА хлореллы различной влажности

Рис. 7. ТЗ времен релаксации кукурузного зерна и его компонент.

Состояние води в ксерoreло зерновки кукурузы. В зерне кукурузы имеется 4 фракции поди, принадлежащие различным матрицам (рис. 7). В зародыше со щитком удается ниже температуры -Ю°С(вымерзание лит^щов) разделить липиднуп и водную составляющие. Вода зародыша, несмотря на подвига;ость, с трудом отдается при нагревании (энергия дегидратации £2,8 ккал/моль), что объясняется иммобилизацией ее белково-липидным комплексом. По исчезновению узкой компоненты на спектре Я"? низкого разрешения установлена температура замерзания: оболочки о алейроновым слоем (-50°С), крахмалистого слоя эндосперма (-I.J8°C) я зародыша со щитком (~94°С).

Глава 5. Состояния мэза- и анабиоза у мпкроводорослей при сухой консервации. Ксероустойчнвостъ микроводорослей определяется видовыми особенностями объекта, способом и продолжительностью сушки (рис. 8).

Рис. 8. Ксерограммы водорослей: I - Chi. vulgaris, контактная сушка 0,5 мин; 2 - конвективная сушка 40 млн; 3 -конвективная сушка 40 мин; 4 -Syn.elongatuo, конвективная сушка 40 мин; 5—Anabaena variabilis контактная сутака; В - Sp.platen-sis ,конвективная сушка 40 мин; 7 - Ao.nidulans, контактная сушка; 8 - конвективная сушка 40 мин.

Ю зо 76 90

.Не у всех водорослей можно заметить состояние мезабиоза. Однако оно проявляется при анализе пигментной: системы: наблюдается резкое возрастание количества хлорофилла и ослабление металл-органической связи в форбиновом ядре молекулы. Минимум интегральной-

so

to

<Р

2.4

5с.

7Î

Pire. 9. Зависимость интегральной флуоресценции- (Ф) хлореллы от влажности (W ).

флуоресценции хлорофилла "а" у хлореллы приходится на условную границу содержания воды во втором гидратом слое (26^-ная влажность) (см« ри-. 9).

Схема реактивации включала этап регвдратацяи 0,1-0,2 М раствором NaCl и перевод клеток на обменные процессы эволюционних предшественников. Эффективность реактивации проверялась по способности клеток эндогенно восстанавливать ыетиленовый синий. Опыты показали, что бескислородная среда увеличивает способность клеток эздогенно восстанавливать краситель только высушенных проб. Наиболее эффективной для реактивации оказалась водородная этмос^рз: посла инкубации клетки помещались на свет. При 16$-ной влажности восстанавливалось не более 30% клеток.

Глава 6. Состояния чеза- и анабиоза у микроЕэдорослей щм холодовой консервации. По состоянию функциональных систем клетки в результате кратковременных и длительных опытов (red-ox -потенциалу, состоянию фотосинтетического яппарата, жизнеспособности) установлена область мезабиоза для хлореллы (до -60°) и синезела-ных водорослс! (до -35°). Наиболее критическими были'температуры, в которых происходит замерзание объемной воды (-2 + -Ю°С). Эндогенное повышение углеводов за счет трансформации б№ лэссы (аго-гное голодание) не предохраняет клетки микроводорослей (в суспензии) от гибели. Повышение уровня освещенности и температуры культивирования, а также рециркуляция культурал*ной среды снижают жизнеспособность клеток при хранении. Определены оптималыще режщ.и консервирования для хлоречлы: прохождение зоны мезабиоза со ско-

% ■

о 4 а (2 не ¿о

Рис.1 10. Зависимость устойчивости клеток хлореллы от скорости замораживания VI) и оттаивания (2).

ростью 4 °/мин; ввод в анабиоз при -196° (со скоростью 100 %шн) ; быстрое оттаивание; зашитн„л оредз - 1%-msïï глицерин + 1,5$ глюкозы (см. рис. 10). '

• Глава 7. Выбор способа консервирования по состоянию воды. Анализ структурных особенностей "среднего" белка по фракциям(и общего) про- и эукариотических микроорганизмов, белков семян, говяжьего мяса, казеина показал, что белки, способные образовывать гели, шеют высокие знь хенля Э£ (у, казеина эе = С,4; у глютелина кукурузы сё = 0,3; эндос:крма ячменя ге - 0,67; зародыша пшеницы Ж = 0,52). У бактерий зе< 0,2, т.е. белки шеют компактную гидрофобную .структуру, легче формируют при обезвоживании гелеподобное состояние протоплазмы. Белки хлореллы (эе первой фракции ~ 0,96) г условиях кинетической подвижности способны к гелеобразованию. Таким образом, обнаруженные структурные особенности белков хлореллы и водородной бактерии соответствуют результатам состояния воды. Ка рис, II приведено строение ксерогелей водорослевой и бактериальной клеток, Клетки хлореллы вследствие жесткости клеточной оболочки сохраняют свою форму, но протоплазма сильно сжимается. Клетки водородной бактерии почти не плазмолизируются, в них заметны две области - конденсированный нуклеоид я.область, заполненная рибосомами и растворимыми белками, По-ви^имо;.у, ксерогель хлореллы - гель, находящийся а состоянии коллапса; ксерогель водородной бактерии представляет собой нуклеиновый "аэрогель" и гелепо-

А Б

Рис. II.,Влияние конвектавной сутки на клетки: А - хлорелла, увел. 60 ООО; Б - водородная бактерия, увел. 80 ООО.

лобное образование из белков. Поскольку устойчивость клеток зависит от состояния воды (1Усев,19?4), можно предложить способы определения устойчивости к сушке г низким температурам по элэргли активации Т2 первого и сдвигу «второго максимумов релаксации протонов воды. Нами установлено соответствие мевду состоянием воды. п . гкдрагаой оболочке и структурой ксерогеля. Макровязгсость обычно связаки с объемной долей полимера и не зависит от структурной организации белка. Ниже границы свободной воды показатель Т^ как функция влажности ) булат отражать особегчости гэаимодействия ' воды с поверхностью макромолекул, т.е. в какой-то степени характеризовать "микровязкость'' системы. Увеличение макро.вяз»ости для всех исследуемых объектов д^ ЗСЙ-ной влажности (¿А )' примерно одинаково, угол наклона -ЕлТ^л/) значительно изменяется (¿р ) ниже этого уровня (рис. 12).

С

Рис. 12. Круговая диаграмма состояния воды: ¿^ - свободная вода; гидратная вода.

По показателю Р? который принимает различные значения,

можно судить о типе ксерогеля и прогнозировать способы консервирования. Как показали исследования, возможны 4 случая изменения вязкости ниже уровня гидратной води:

1. - аэрогель с вязкими свойствами (оптимальншп способами консервирования являются сутака и замораживание) - бактерии.

2.^ = I - коллапсирующий гель (только замораживание ступенчатым способом в защитной среде) - хлорелла

3. | > 1 - не коллапсирующий гель (замораживание или быстрые способы сутки) - синезеленая термофильная водоросль. Высокая эластичность белков видна из рис.. 4в ( V/ ~ 10^).

4. ^<0 - гель, содержащий иммобилизованную воду в белково-липидных комплексах (сушки и замораживание) - дрожжи.

Заключение. Имеющийся большой поток богатой информации по состоянию воды в клетках пленительно к задачам консервирования и анабиоза еще не дал достаточно обоснованного критерия физиологической устойчивости-на физико-химическом уровне и надежных рекомендаций в практику. В связи с этим, основной целью работы являлось изучение влияния структурной организации ксерогелей на устойчивость клеток к обезвоячванию. Учитывая связь устойчивости организмов с состоянием-водл, основное внимание уделялось связи остаточной- влажности с жизнеспособностью клетки и ее пигментным аппаратом, изучению состояния воды у подготовленных и неподготовленных к обезвоживанию биосистем.

Для получения контрастных различий в организации протоплазмы исследования проводились на про- и эунариотических организмах без учета штэмм'овых особенностей. Предположив, что первичное свойство анабиотических систем реализуется на физико-химическом уровне, проведено теоретическое и экспериментальное рассмотрение с'-руктурной организации протоплазмы при обезвоживании. Протоплазма представлена как специфический макроиолекулярннй раствор в врд-ной среде. Гетерополимерность биомакр-мцлекул обусловливает присутствие в системе широкого спектра эффективных взаимодействий, благодаря которым возникают самые разнообразные структуры и комплексы (гели и гелеподобные образования). Модельное описанир геле-образования опирается на теорию протекания, с помощью которой удалось определить физико-химическое состояние анабиоза - протекание по полимеру, мезабтоэза - протекание по воде и полимеру, биоза -протекание по воде. Устойчивость к мезабиозу определяется количеством гидратной водн и способностью клеточной стенки обеспечивать отток свободной воды к центрам кристаллизации. Показано, что у водорослей наиболее чувствительной является пигментная система. В клетках микроорганизмов присутствует один или большее число слоев гидратной воды, подготовленные к анабиозу системы (зерновка., дрожжи) содержат иммобилизованную воду. Новый методический подхрд определения состояния воды в гидратной оболочке, а также предложенный прием установления структурных особенностей "среднего" белка цитозоля и органоидов клетки позволили подойти к решению главного вопроса физико-химического аспекта анабиоза - доказательству.

влияния структурной организации ксерогелей на физиологическую устойчивость организма. Формирование ксерогеля происходит под влияние;,! строения клеточной стенк.:, структурных осоиенносте* белка, липвдов и здпасных веществ.оУс/ановление типов гелей - "азоогевд", истинного геля, гелеподобных систем - облегчает проведение сопоставления устойчивости клето.; с состоянием воды и дает возможность уыбирать оптимальный способ консервирования и хранения микроорганизмов.

Отличие анабиотически."' систем состоит в укреплении ксерогеля клэток запаонши веществами (твёрдые гели). Эволюция йнабиоза" у прокариотов была направлена на защиту наследственного материала и болок-синтезирующего аппарат л клетки. Появились вещества, .укреп, л-ющие ДНК изнутри (дишшолинат кальция, водорастворимые белки, тре-галоза и др.), повышающие механическую прочность клеток, сохраняющие объем и тиксотропию белка. Можно думать, что устройство спор и зародышевых клеток семян (центральное расположение ДНК, выдвиш-нче одтозодя на периферию), берет свое начало от прокэриотическои " организации.

Дальнейшая эволюция анабиотических систем (эукариоты) била направлена на образование истинных гелей, регулирующих свой объем. При оводнении гелеподобные структуры (белки), способные к неограниченному набуханию, создают благоприятную среду и "запускают" ■ сборку гелевого цитоскелета. Синтез антифризов, по-видимс.лу, является приспособительным механизмом для сохранения Селевых структур клетки.

Дальнейшее изучение физико-химических аспектов анабиоза может быть посвящено расшифровке и более тонкой детализации влияния биохимических компонентов клетки на организацию ксерогелей и выбор способа консервирования.

ВЫВОДЫ

1. На основании физико-химического рассмотрения свойств протоплазмы как многокомпонентного раствора биомакромолекул с эффективными взаимодействиями показаны отличительные свойства геометрического (гелоподобного вещества) и физического геля в процессе обезвоживания и действия температур.

2. Предполагается, что изначальная устойчивость органоидов клетки при эф]ектив1шх взаимодействиях мономеров биополимеров п

водной среде при €. < О является первичным и всеоо'дим свойством жизнеспособных структур; ., '.тойчивость цитоплазмы к обезвоживанию заключается в синтезе большого количества водорастворимых белков (£> О), обладающих высокой, обратимостью в процессах обезвоживания - регидратации.

3. Экспериментально, •тсследуя жизнеспособность, состояние воды и пигментный аппарат микроводорослэй, установлено состоянис. мэзабиоза, которое в рэг-ках теории перколяцяи тоактуется как протекание по растворителю и полимеру.

4. На основе примег^ния комплекса физических методов, а также модельного подхода выявлено четыре фракции воды. Подготовленные к аиабиозу системы имеют иммобилизованную воду, неподготовленные отличаются между собой количеством гидратной воды.

5. Проведено сравнительное изучение организации ксерогелей бактериальной и водорослевой клеток (хлорелла). Установлена- зависимо .ть структурной организации ксерогелей от видовой принадлежности организма'и структурной организации "среднего" белка цито-золя и мембран.

6. Предложен способ выбора метода консервирования по состоять воды в гидратной оболочке, имеющей свойства ньютоновской жидкости у неустойчивых организмов до дилатантного и пластичного вещества у устойчивых.

7. Предполагается, что первичные свойства анабиоза присущи клеткам прокариотической организации. Вершиной эволюции онтогенетического (семена растений) и вынужденного (мельчайшие организмы животного происхождения, например, тихоходки) анабиоза стало появление гелевых структур (гелевый скелет ядра, цитоплазма, органоиды) , способных га только предохранять наследственный материал клетки от механических деформаций, но и регулировать процессы обезвоживания-набухрчия.

Основное -содержание диссертации изложено в следующих публикациях:

1. Кузьмина Р.И., Трубачев И.Н., Андреева Р.И. Трансформация^ органических веществ в микроводорослевом культиваторе // Изв.СО АН СССР. - 1972. - № 3. - С. 9Р-97.

2. Кузьмина Р.И., Ян H.A. и др. Предварительная оценка некоторых протококковых и вольвоксовых водорослей как возможного звена

замкнутых систем // Матер. УЧ Всесоюз.рабоч.совещ. по вопросам круговорота веществ. - Киев: Наук.думка, 1972.- С.71-75.

3.„ Терешкова Г.М., Кузьмина .".И. Сухой анабиоз микровс:• орослей// Анабиоз.и преданабиоз v.oi(pj0praHH3M0B.-Рига, 1973.-С.Т-'75.

4. Кузьмина Р.И., Терешкова Г.М.,Иванов В.В. и др. Состояние, го-, ды в клетках хлореллы прл- обезвоживании // Биологическая спек-трофотометрия: Тез." 3 Всесоюз.совещ.-Красноярск, 1973.-С.55-56.

5. Кузьмина Р.И., Терешкова Г.М., Хиченко В.И., Абрамов В.Л.

К вопросу об устойчивоjth растгтельной к.-.етки п. и обезвохива-' нии '// Тез. 3 Всесоюз. совьу. по управлению биоси'тезом микроорганизмов. -Красноярск, 1973. -.С. 133-135.

6. Абрамов В.Л., Кузьмина ¿.И., Терешкова Г.М. Определение связанной воды в высушенных образцах хлореллы методом СВЧ // Матер. УШ Всесоюз. совещ. по вопросам круговорота веществ. -Киев: Наук.думка, 1974. - С. i20-122.

7. Кузьмина Р.И., Терешкова Г.М., Асташева Л.А. К вопросу хранения микроводорослей JJ Матер. Всесоюз.рабоч.совещ. по вопрос:: круговорота веществ.- Киев: Наук, думке1976. - C.I29-I3I.

8. Кузьмина Р.И., Нестеренко Т.В., Терешкова Г.М. Устойчивость синезеленых водорослей к действию низких температур и обезвоживания // 2-й Международн.симпозиум "Рост микроорганизмов на Ci-соединениях". - Лущино, 1977. - С. I3I-I32.

9. Терешкова Г.М., Кузьмина °.И. Резистентность хлорелль к действию низких температур // Физиол. растений. - 1977. - Т. 24, №2. - С. 390-394.

10. Верховцева Е.Е., Кашкина Л.В., Абрамов В.'Л., Кузьмина Р.И. Изучение состояния воды в крахмале методом ЯМР // Биологические исследования в ВУЗах Красноярского края. - Красноярск, 1977. - С. 144-147.

11. Абрамов В.Л., Кашкина Л.В., Лоскугов С.Р., Миронов П.В., Кузьмина Р.И. Состояние воды в зерне кукуруш при низких температурах методом ЯМР и термического анализа // ЯМР в биологии и медицине: Тез. снмп. / И® АН СССР. - М., 1977. - С. 80-81.

12. Кузьмина Р.И., Абрамов В.Л., Кашкина Л.В. Состояние воды в клетках водородной бактерии // Хемосинтез в непрерывной куль. туре. - Новосибирск: Наука, 1978. - С. .03-109.

13. Кузьмина Р.И., Нестеренко Т.В., Терешкова Г.М. Стабильность' состояния воды как показатель устойчивости микроорганизмов к

обезвоживанию 1/ Биотехнология и биоинженерия: Тез. докл. симпозиума стран СЭВ. F.ira, 1978. - С. 91-92.

14. Кузьмина Р.И., Нестеренко Т.В.-Реактивация микроводорослей из состояние сухого анабиогл // Биотехнология и биоинженерия: Тез. докл.симпозиума cipa'' СЭВ. - Рига, 1978. - С. 94-95.

15. Абрамов В.Л., Капшина Г.В., Кузьмина Р.И. Изучение состояния, воды в биологических объектах Ц Биотехнология и биоитсенерл : Тез. докл. симпозиум- стран СЗВ. - Рига, 1978. - С. 3-5.

16. Кий*mina, R.I.j Kashkina, I.V.; Abramov, V.L. Water fractions in maize grain // So- '.et Plant Physiology. - 1930. - Vol.27, II 2, part 1. - P.200-205 (En.)

17. Кузьмина Р.И., Терешкова P.M., Хохлова В„В. Состояние пигментной системы хлореллы после хранений при низких температурах // Параметрическое управление биосинтезом микроводорослей. -Новосибирск: Наука, 1980. - С. 88-93.

18. Ij-зьмина Р.И., Трубачев H.H. Влияние температуры на характер взаимодействий нативных белков и белково-липидних комплексов с водой // I Всесоюз. биофнзич. съезд. - М., 1982. - С.95-96.

19. Кузьмина Р.И., Терешкова ГЛ., Калачева Г.С."Экспериментальное изучение жизнеспособности и фотосинтетического аппарата водорослей при анабиозе // Вопросы управления биосинтезом низших растений. -Новосибирск: Науке, S982. - С. 128-135.

20. Терешкова Г.М., Кузьмина Р.И. Влияние низких температур на спектр_возбуждения флуоресценции // Вопр. управления биосинтезом низших растений. - Новосибирск: Наука, х982.~ С.135- 139.

21. Нестеренко Т.В., Кузшина Р.И. Реактивация микроводорослей из состояния сухого анабиоза // Вопросы управления биосинтезом низших растбкиК. - Новосибирск.: Наука, 1982. - С. 139-143.

"¡22. Кузьмина Р.И., Терешкова Г.М. К вопросу устойчивости микроводорослей к действию отрицательных температур // X Всэсоюз." симп. ''Биологические проблема Севера ".-Магадан, 1983.-Ч. 2.-С.290.

23. Кузьмина Р.И., Капшина Л.В., Холостова З.Г. Влияние строения клеточной стенки на устойчивость микроорганизмов к анабиотическим факторам среды // Экспериментальный анабиоз: II Всесоюз. конф. по анабиозу. - Рига, 1984. - С. 77.

24. Медведева C.E.V Терешкова Г.М., Кузьмина Р.И. Влияние режимов консервирования на жизнеспособность и ультраструктуру клетки

// Экспериментальный анабиоз:. Тез. П Всесоюз. конф. - Рига, 1984. - С. 88.

25., Печуркин Н.С., Кузьмина Р.И. и др. Молекулярные и п:туляцион-ные i.ia хднизмы динамичесмой устойчивости и эврлюции биосистем // ВНШЦ № 8II02799. - Красноярск: КрасГУ, 1985. - 80 с.

26. Кузьмина Р.И., Медведева С.5., Терешкова Г.М. Сравнительное изучение действия нйзких температур и сушки на Chiorella vulgaris и Alkaligenea eutrophurc J J Биол. науки.-1987.-й 8.-С.63-69.

27. Кузьмин Е.В., Кузьмина V.H. Гелеобразоваше и клэточный анабиоз; 4.1. - Красноярск, 1987. - 44 с. (Препринт / Ин-т физики СО АН СССР; JS 423 Ф).

28. Кузьмина Р.И., Кузьмин L..B. Гелеобразование и клеточный анабиоз. 4.2. - Красноярск, 1987. -,54 с. (Препринт / Ин-т физики СО АН СССР; № 454 Ф).

29. Кузьмина Р.И. О двух типах ксерогеля в клетках хлореллы // Актуальные проблемы современной альгологии: Тез. I Всесоюз. конф. - Черкассы, 1987. - С. 227.

30. Кузьмина Р.И., Абрамов В.Л. Определенно состояния пигментной системы хлореллы флуоресцентным методом при обезвоживании // Актуальные проблемы современной альгологии: Тез. I Всесоюз. конф. - Черкассы, 1987. - С. 225-226.

31. А.с. СССР № 1445398 // Бол. изобрет. - 1988. - № 4G.

32. Кузьмина Р.И. Условия существования ксерогелей биоспс^ем // Математическая биофизика.-Красноярск, КрасГУ,1988.-С.63-70. .

33. Кузьмина Р.И., Кузшин Е.В., Новошинский Г.Г. Гелеобразование и клеточный анабиоз. Ч.З. - Красноярск, 1088. - 50 с. (Препринт J Ин-т физики СО АН СССР; JP 5395).

34. Кузьмин Е.В., Кузьмина Р.И., Новошинский Г.Г. Физические принципы анализа свойств протоплазмы при описании состояний организмов // Биофизические и биотехнические аспекты гомеостаза. Красноярск, № СО АН СССР, 1989. - С. 61-68.

Ло. Кузьмина Р.И., Кузьмин Е.В., Новошинский Г.Г. Биофизический уровень гомеостазиса анабиотических систем // Биофизические и биотехнические аспекты гомеостаза. - Красноярск, ИФ СС.АН СССР, 1989. - С. 69-76.

и другие