Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре

Щеглова, Оксана Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре
ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре"

На правах рукописи

Щеглова Оксана Олеговна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ЛЕЙКОЦИТОВ ПОСЛЕ ВЫХОДА ИЗ ХОЛОДОВОГО АНАБИОЗА ПРИ УМЕРЕННО-НИЗКОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

03.00.13 - физиология, 14.00.29 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киров 2005

Работа выполнена в Институте физиологии Коми научного центра Уральского отделения Российской академии наук (РАН)

Научный руководитель: доктор медицинских наук,

профессор Сведенцов Евгений Павлович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Иржак Лев Исаакович

доктор медицинских наук, профессор Шардаков Виктор Иванович

Ведущая организация: Челябинская государственная

медицинская академия (г. Челябинск)

Защита состоится «¿6» ^ССО^Я 2005 г. в 4С часов на заседании диссертационного совета К 208.036.01 при ГОУВПО «Кировская государственная медицинская академия» по адресу: 610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 112

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Кировской государственной медицинской академии по адресу: 610027, г. Киров, ул. К. Маркса, 137

Автореферат разослан «»У» (Xfl^tU^- 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук, доцент Хлыбова Светлана Вячеславовна

Mb*

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. В последние десятилетия большое внимание уделяется изучению проблемы влияния холодового анабиоза на биологические объекты различного уровня организации (Цуцаева A.A., 1981; Голдовский A.M., 1986; Белоус A.M., 1994; Сведенцов Е.П., 2003). Под анабиозом понимают такое состояние живой системы, когда в ней обратимо приостанавливаются или частично затормаживаются метаболические и физиологические процессы (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994).

Показано (Лозина-Лозинский Л.К., 1972), что животные клетки по-разному реагируют на замораживание. Ядросодержащие клетки со сложной внутренней структурой нуждаются в индивидуальном подборе режима замораживания и оттаивания, что особенно справедливо в отношении лейкоцитов, для которых необходимо учитывать процессы, протекающие при кристаллизации воды, изменения их органелл, а также состав хладоограждающего раствора и режима замораживания. Как известно, потребность в запасах банка лейкоцитов обусловлена их использованием при лечении сепсиса, разлитого перитонита, инфекционного менингита и других заболеваний (Cairo M. et al, 1992; Мельникова B.H., 1995; Жибурт Е.Б., 2002). Многими авторами (Леонтович В.А. и соавт., 1973, 1975; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов C.B. и соавт., 1995; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999,2000, 2004) предложены технологии замораживания лейкоцитов для их длительного хранения, однако, несмотря на большое количество работ, посвященных изучению этого вопроса и механизмов криоповреждения и криозащиты лейкоцитов крови человека (Абезгауз H.H. и соавт., 1966, 1978; Zhang Q„ Tiersch T., 1995; Svedentsov E. et al, 1998; Halle P. et al, 2001; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2003, 2004), проблема сохранения функциональной активности лейкоцитов далека от окончательного разрешения.

В настоящее время наиболее эффективным приемом поддержания жизнеспособности лейкоцитов является глубокий криоанабиоз (-136°С--196°С), при котором наряду с полным снижением метаболизма и замерзанием всех фракций воды сохраняются орбитальные переходы электронов в атомах биомолекул (Цуцаева A.A., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 2004). Однако использование этой дорогостоящей и небезопасной для персонала жидкоазотной технологии возможно далеко не во всех лечебных учреждениях. Поэтому встает вопрос о создании более доступного и эффективного метода замораживания лейкоцитов крови человека без использования жидкого азота, в частности при умеренно-низких (-30°С+-50°С) температурах, при которых внеклеточная, свободная и частично связанная внутриклеточные фракции воды замерзают, а фиксированная фракция остается в незамерзшем состоянии, и в клетке наблюдается замедленный метаболизм (Сведенцов Е.П., 2004). Использование для этих технологий электрических морозильников упрощает и удешевляет процесс криоконсервирования лейкоцитов (Сведенцов Е.П. и соавт., 2003). Однако

РОС. Ь'ЛЦМОН Ч-гЬНДЯ

hit-J 3 ^»'НЙА

mQк

экспериментальных исследований в отношении сохранности функциональных свойств лейкоцитов при умеренно-низких температурах, в частности при -40°С, не проводилось. Их результаты могут представлять интерес и для криофизиологии, изучающей механизмы репарации клеток после холодового стресс-воздействия (Белоус A.M., Грищенко В И., 1994). Все это послужило основой для постановки цели и задач исследования.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительную оценку хладоограждающих свойств трех растворов (№1, №2, №3), компонентами которых являются гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ), фумарат натрия и лимонная кислота, и предназначенных для сохранения жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе и хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия (-40°С) в течение 24 часов.

2. Изучить жизнеспособность и морфологический состав лейкоцитов, фагоцитарную и метаболическую активность нейтрофилов и фагоцитарную активность моноцитов, замороженных с использованием оптимального хладоограждающего раствора по экспоненциальной программе и хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия (-40°С) в течение 1-60 суток.

3. Оценить в опытах на животных «острую», «хроническую» токсичность, пирогенность оптимального хладоограждающего раствора и исследовать переносимость аутологичных лейкоцитных концентратов, подвергнутых замораживанию и хранению при -40°С в течение 24 ч с данным раствором.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании впервые изучена жизнеспособность и функциональная активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при —40°С, введение в который осуществлялось по экспоненциальной программе замораживания и с применением нового хладоограждающего раствора (патент №2184449 от 10.07.2002), включающего криопротектор - ГМБТОЭМ (в конечной концентрации - 15%), антигипоксант - фумарат натрия (1,4%) и антикоагулянт - лимонную кислоту (0,03%). Установлено, что использование указанной программы и раствора позволяет сохранить на высоком уровне жизнеспособность и функциональную активность лейкоцитов в течение 30 суток холодового анабиоза при -40°С, а также избежать разрушения мембран клеток и их органелл и денатурации клеточных белков.

криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ, антигипоксант биоэнергетической направленности - фумарат натрия и антикоагулянт -лимонная кислота. Данный раствор является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносимым, при его внутривенном введении, экспериментальными животными, следовательно, не требует отмывания от биообъекта после его отогрева и может быть рекомендован для криобиологической практики и для научных исследований в лабораториях биологического и медицинского профиля.

Доказано, что наиболее предпочтительной, эффективной и легко выполнимой (по сравнению с линейной принудительной программой) является экспоненциальная программа замораживания лейкоцитов, которая позволяет разным видам ядросодержащих клеток входить в холодовой анабиоз постепенно на разных его уровнях, благодаря чему на термограмме не наблюдается явного выброса кристаллизационного тепла и, следовательно, не происходит процессов рекристаллизации, которые выявлены при замораживании лейкоцитов в условиях использования линейной программы (Леонтович В.А и соавт., 1973, 1975; Махатадзе И.К. и соавт., 1975).

Благодаря применению вышеуказанной композиции

хладоограждающего раствора и экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов крови человека до -40°С их жизнеспособность и функциональная активность сохраняются на высоком уровне в течение длительного времени (30 суток). Эти данные расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты на клеточном уровне.

На основе полученных положительных результатов о сохранении функциональных свойств лейкоцитов крови человека, перенесших холодовое стресс-воздействие (-40°С), предложен эффективный, доступный и надежный в методическом плане метод криоконсервирования данных клеток, включающий в себя применение хладоограждающего раствора, медленной экспоненциальной программы замораживания и быстрого отогрева.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. Оптимальный хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ, фумарат натрия и лимонную кислоту, являясь нетоксичным, апирогенным, хорошо переносимым экспериментальными животными и не требующим отмывания от биообъекта после его опаивания, позволяет сохранить функциональные свойства лейкоцитов, хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия при —40°С в течение 30 суток.

2. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз до —40°С дает возможность получить высокий процент выхода жизнеспособных и функционально активных лейкоцитов после перенесения ими холодового стресс-воздействия в течение 30 суток при данной температуре.

3. Лейкоциты человека обладают высокими репаративными возможностями, что позволяет им проявлять функциональную активность после холодового стресс-воздействия (-40°С в течение 30 суток).

Апробация работы. Результаты работы доложены на Всероссийской научной конференции «Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика» (Киров, 2003), заседании Кировского отделения физиологического общества имени И.П. Павлова (Киров, 2004), научной сессии Кировского филиала Российской Академии Естествознания (Киров, 2004), международной конференции «Сохранение генетических ресурсов» (С.-Петербург, 2004), заседании Ученого совета Института физиологии Коми НЦ УрО РАН (Сыктывкар, 2004), заседании Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2005).

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 3 - в центральных журналах.

Личное участие автора в получении результатов. Автором были выполнены все исследования по изучению функциональных свойств и морфологического состава нативных и размороженных лейкоцитов, проведена их статистическая обработка. Автор принимал участие в разработке метода введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при —40°С, в проведении биологических испытаний криозащитного раствора и в написании статей.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 116 машинописных страницах, состоит из введения, четырех глав (обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты экспериментальных исследований, обсуждение результатов экспериментальных исследований), выводов, списка использованной литературы (218 источников, из них 121 отечественный и 97 иностранных) и списка работ, опубликованных по теме диссертации. Диссертация содержит 22 таблицы, 13 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служил концентрат лейкоцитов (ЛК), выделенный из цельной донорской крови при цитаферезе (БогуеН, 2500 об/мин, 5 мин с охлаждением; гемоконсервант СОР) в отделении гравитационной хирургии крови при клинике ГУ КНИИГиПК. Полученное количество ЛК в среднем составляло 21,27+5,3 мл. ЛК смешивали с одним из трех (№1, №2, №3) хладоограждающих растворов (табл. 1), физико-химические свойства которых изучали в лаборатории консервирования крови и тканей ГУ КНИИГиПК. Оптическую плотность растворов определяли на рефрактометре ИРФ-23, а их рН - на ионометре ЭВ-74 стеклянными электродами при комнатной температуре. Смешивание ЛК с одним из трех хладоограждающих растворов производили в соотношении 1:1 и экспонировали при комнатной температуре в течение 20 минут. После этого

клеточная взвесь подвергалась замораживанию по экспоненциальной программе до —40°С, для чего подготовленный биообъект погружали в заполненную хладоносителем (96% этиловым спиртом) 4-литровую ванну камеры электроморозильника «Криостат» (разработан Институтом проблем криобиологии и криомедицины HAH Украины и ГУ КНИИГиПК), охлажденную до -28°С (температура адаптации). На 15-18-й минутах экспозиции в данной камере биоматериал переносили в электроморозильник на -40°С (фирмы Derby, Дания) для дальнейшего замораживания и хранения. Регистрацию температуры осуществляли с помощью прибора ГСП - 04, датчик (ТСМ-3-02) которого был установлен в одном из контейнеров с имитатором - криозащитным раствором с конечной концентрацией его ингредиентов, как при смешивании с JIK. Скорость движения ленты самописца составляла 240 мм/ч. При температуре —40°С биообъект с хладоограждаюшими растворами №1, №2 и №3 хранили 1 сутки, а с оптимальным раствором №2 - 1, 20, 30, 40, 50, 60 суток. Быстрое размораживание ЛК производили в 20-литровой водяной ванне при температуре +38°С в течение 45-60 сек (в зависимости от объема JTK) при интенсивном покачивании контейнера (3-4 раза в секунду) до температуры биообъекта +2°С++4°С.

Оценку pH JIK (всего 239 замеров) проводили с помощью ионометра ЭВ-74 стеклянными электродами при комнатной температуре после его смешивания с хладоограждающими растворами и после размораживания.

Изучение морфологического состава и функциональных свойств лейкоцитов JIK осуществляли до введения в холодовой анабиоз и после выхода из него по следующим методикам.

Для подсчета количества лейкоцитов в ЛК общепринятым методом в камере Горяева (239 исследований) использовали 0,4 мл 3-5% ледяной уксусной кислоты, которую смешивали с 0,02 мл ЛК, оставляли смесь на 10 мин для разрушения эритроцитов. Подсчет лейкоцитов (в 1 мкл) проводился при световой микроскопии (объектив 40х, окуляр 7х).

Изучение морфологического состава (239 исследований) ЛК проводили под иммерсией (увеличение 90х) путем подсчета различных видов лейкоцитов в мазках, окрашенных красителями Май-Грюнвальда и Романовского (Козинец Г.И, Макаров В.А., 1997).

Жизнеспособность лейкоцитов ЛК (239 исследований) определяли по методу R. Shreck (1936) в пробах исключения эозина, для чего небольшую каплю ЛК смешивали на предметном стекле с равной каплей 1% водного раствора эозина и сразу же подвергали световой микроскопии (объектив 40х, окуляр 7х) не более 3 мин. Признаком нарушения целостности мембраны лейкоцита считали его диффузное окрашивание в розовый цвет, а подсчет поврежденных и жизнеспособных (неокрашенных эозином) лейкоцитов производили на 100 клеток.

Фагоцитарную активность нейтрофилов (ФАН) и моноцитов (ФАМ) оценивали (в 860 исследованиях) по методу С.Г. Потаповой и соавт. (1977),

основанному на определении способности клеток поглощать инертные частицы латекса. Для этих целей готовили раствор, состоящий из среды Хенкса и частиц латекса диаметром 1,05 мкм (разведение 1:200), 0,05 мл которого смешивали с 0,1 мл ЛК. Смесь помещали в термостат при +37°С на 30 минут и через каждые 10 минут перемешивали встряхиванием, затем готовили мазки, которые последовательно окрашивали красителями Май-Грюнвальда и Романовского. Подсчитывали число фагоцитировавших нейтрофилов и моноцитов, которое выражали в процентах к соответствующим клеткам, что отражало ФАН или ФАМ, а также для нейтрофилов и моноцитов вычисляли фагоцитарный индекс (ФИ), т.е. количество захваченных частиц латекса в расчете на 1 клетку.

Оценку окислительно-восстановительного метаболизма нейтрофилов (860 исследований) осуществляли с помощью НСТ-теста, или теста спонтанного восстановления красителя нитросинего тетразолия до диформазана, который в виде грубодисперсных темно-синих гранул откладывается в клетках (Гольдберг Е.Д. и соавт., 1992). Раствор НСТ (2 мг сухого НСТ, растворенного в 1 мл буфера) в количестве 0,02 мл смешивали с 0,02 мл буфера и 0,05 мл ЛК. Смесь термостатировали при +37°С 30 минут. Из нее готовили мазки, которые последовательно фиксировали в метиловом спирте (5-7 мин), высушивали и проводили окрашивание 2% раствором метилового зеленого (15 мин). Тест оценивали по проценту нейтрофилов с диформазаном.

Влияние криозащитного раствора на сохранность лейкоцитов ЛК человека (1260 исследований) изучалось в 3-х сериях; для этого ЛК смешивали с тестируемым хладоограждающим раствором в соотношении 1:1 и экспонировали в течение 24 часов: в серии 1 - при +20°С, в серии 2 - при +4°С, а в серии 3 - после 24-часового хранения ЛК при -40°С и его размораживании - при +20°С (серия За) или при +4°С (серия 36). В каждой серии оценивали жизнеспособность лейкоцитов (по эозиновой пробе), их общее число и морфологический состав, а также ФАН.

Изучение стабильности (270 исследований) криозащитных свойств хладоограждающего раствора проводили в соответствии с «Временной инструкцией по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре» (1979). Для этих целей раствор в течение 45 суток термостатировали при +60°С (что эквивалентно 2 годам хранения раствора при +4°С), после чего проверяли его прозрачность и рН и оценивали его криозащитное действие в условиях хранения ЛК в течение 24 часов при -40°С, определяя с этой целью жизнеспособность лейкоцитов ЛК (по эозиновой пробе), их общее число и морфологический состав, а также ФАН и окислительно- восстановительный метаболизм нейтрофилов (по НСТ-тесту).

Испытание хладоограждающего раствора на «острую» токсичность проводили на белых мышах обоего пола (п=5) массой 19-20 г. согласно методике Х1-ой Государственной Фармакопеи (1990). Раствор вводили в объеме 0,5 мл в хвостовую вену мыши со скоростью 0,1 мл/с. Срок

наблюдения за животными после введения раствора составлял 5 суток. Раствор считался выдержавшим испытание, если в течение 5-дневного срока наблюдения отсутствовала гибель животных.

Испытание хладоограждающего раствора на «хроническую» токсичность проводили на мышах и кроликах. При исследовании на мышах испытываемый раствор в тест-дозе 0,5 мл вводился ежедневно внутрибрюшинно 20 животным весом 19-20 г в течение 10 дней. В эти же сроки контрольной группе мышей (п=5) весом 19-20 г внутрибрюшинно вводился аналогичный объем 0,9% раствор ЫаС1. После 10-й инъекции все мыши подвергались эвтаназии (эфиром) для гистологического исследования легкого, сердца, печени, почки, надпочечника, селезенки, тонкого кишечника, половой, щитовидной и поджелудочной желез, головного мозга (всего изучено 275 препаратов) по общепринятому методу с целью выявления деструктивных изменений. Тестируемый раствор считался выдержавшим испытание, если после 10-дневного введения все животные оставались живыми, в исследованных органах отсутствовали деструктивные изменения. В опытах на кроликах обоего пола (не альбиносах) массой 2-3,5 кг хладоограждающий раствор вводили 10 животным ежедневно в течение 10 дней в краевую вену ушной раковины в тест-дозе 6,6 мл/кг массы тела со скоростью 0,05 мл/с. В эти же сроки контрольной группе кроликов (п=5) весом 2-3,5 кг вводили 0,9% раствор ИаС1 (в том же объеме). В 1-й день (до введения испытываемого раствора) и на 10-й день испытания у животных проводили общий анализ крови и мочи и измеряли массу тела. На 6-й день эксперимента у кроликов регистрировали ЭКГ (II стандартное отведение; электрокардиограф типа ЭК-1Т-03) за 1 час до и через 1 час после введения раствора. На 10-й день эксперимента кроликов подвергали эвтаназии (внутривенное введение 50-60 мл воздуха) с целью обнаружения деструктивных изменений в легких, сердце, печени, почках, надпочечниках, половой железе, селезенке, тонком кишечнике и головном мозге (исследовано 135 препаратов) по общепринятой методике. Хладоограждающий раствор считали выдержавшим испытание, если после его 10-дневного введения не погибало ни одно из подопытных животных, показатели крови, мочи и ЭКГ оставались в пределах нормы и в исследованных органах отсутствовали деструктивные изменения.

Испытание хладоограждающего раствора на пирогенность проводили на здоровых кроликах обоего пола (п=3), неальбиносах, массой 2-3,5 кг, с ректальной температурой 38,5-39,5°С, измеряемой медицинским термометром на протяжении 3-х суток и за 30 мин до испытания в соответствии с ГФ XI (1990). Раствор вводили в ушную вену в количестве 6,6 мл/кг массы тела животного с последующим измерением ректальной температуры через 1, 2, 3 ч. и считали его апирогенным при условии, что сумма повышений ректальной температуры при 3-х измерениях не превышала 1,4°С.

Переносимость трансфузии ЛК, замороженного с хладоограждающим раствором № 2 и хранящегося при —40°С в течение 24 ч, исследовали на

здоровых беспородных собаках (п=3) массой 10, 12 и 18 кг. У животного производили взятие венозной крови в объеме 1% от массы тела, ее подвергали центрифугированию (центрифуга ЦР-3, 2000 об/мин, 7 мин) и получали из центрифугута JTK с помощью плазмоэкстрактора фирмы Baxter. Полученные таким способом JIK смешивали с хладоограждающим раствором № 2 в соотношении 1:1, экспонировали при комнатной температуре в течение 20 мин и замораживали до -40°С по экспоненциальной программе в течение 18-20 мин. Через сутки биообъект размораживали в течение 2-3 мин и внутривенно вводили аутологичные JIK животным со скоростью 60 капель/мин. В день взятия крови и спустя сутки после трансфузии JIK животным, у них оценивали поведение, замеряли массу тела, частоту пульса и дыхания, ректальную температуру и показатели крови и мочи (на основе их общего анализа). Критерием переносимости трансфузии ЛК, замороженного с тестируемым хладоограждающим раствором, считали отсутствие изменений всех перечисленных показателей.

В целом, проведено 83 эксперимента по изучению функциональных свойств и морфологического состава лейкоцитов JIK, полученных от 23 доноров-добровольцев. Результаты исследования (всего 4571 наблюдений), обработаны методами параметрической статистики; результаты выражали в виде М±о, а различия оценивали по критерию Стьюдента (Гланц С., 1998); их считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Оценка влияния экспоненциальной программы замораживания до -40°С и хладоограждающих растворов на функциональное состояние лейкоцитов при их хранении в течение 24 часов. Установлено, что при введении лейкоцитов, смешанных с одним из трех хладоограждающих растворов, состав которых представлен в таблице 1, в состояние холодового анабиоза при —40°С по экспоненциальной программе (рис.1) наилучшему сохранению жизнеспособности и функциональной активности этих клеток способствует раствор №2 (табл. 2, 3, 4). Исходя из полученной термограммы замораживания лейкоцитов (рис. 1), отметим, что для экспоненциальной программы осуществляемой в три этапа (на 1-м - со скоростью 7-8°/мин до точки эвтектики, т.е. до -2,6°С, при которой весь раствор застывает в сплошную аморфную массу, состоящую из мелких кристаллов; на 2-м - со скоростью 1-2°/мин до температуры -28°С; на 3-м - со скоростью 3-4°/мин до -40 С), не характерно явление кристаллизационного выброса тепла, о чем свидетельствует отсутствие так называемого (Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С., 1994) плато кристаллизации. Следовательно, применяемая нами экспоненциальная программа более эффективна, щадяща и предпочтительна, чем линейная программа (Пушкарь Н.С. и соавт., 1978), причем не только при замораживании лейкоцитов, как это было показано ранее, до -80°С (Утемов C.B., 1999), -50°С (Сведенцов Е.П. и соавт., 2003) и -20°С (Сведенцов Е.П. и соавт., 2004), но и до -40°С. Очевидно, что этот режим

замораживания можно использовать для введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при разных отрицательных температурах.

Таблица 1

Конечная концентрация ингредиентов трех хладоограждающих растворов после их

смешивания (1 1) с лейкоконцентратом

Номер Ингредиенты растворов

раствора ГМБТОЭМ, в % фумарат натрия, в % лимонная кислота, в %

1 18 1,6 0,045

2 15 1,4 0,030

3 12 1,2 0,015

Выявлено, что при использовании хладоограждающего раствора №2 показатели жизнеспособности (табл. 2) и функциональной активности (табл. 4) лейкоцитов, введенных в холодовой анабиоз (-40°С) после их суточного хранения оказались достоверно выше, чем при использовании растворов №1 и №3. В частности, показано (табл. 2), что при использовании всех трех хладоограждающих растворов количество клеток, которые не окрашивались диффузно эозином в розовый цвет (т.е. с сохраненным свойством избирательной проницаемости мембраны), после размораживания достоверно (р<0,05) снижалось, но при использовании раствора №2 это снижение было наименьшим (ргч.з^ОЗ).

Рис.1. Термограмма замораживания лейкоцитного концентрата до -40°С с хладоограждающим раствором № 2

Установлено (табл.3), что применение хладоограждающего раствора №2 не приводило к существенному (р>0,05) снижению количества гранулоцитов после размораживания, тогда как при использовании растворов №1 и №3 их количество достоверно (р<0,05) снижалось.

При оценке ФАН (табл. 4) установлено, что после суточного хранения лейкоцитов в состоянии холодового анабиоза при -40°С наблюдалось ее достоверное снижение при использовании хладоограждающих растворов №1

и №3, тогда как при замораживании клеток с раствором №2 снижение ФАН было наименьшим (97,5±2,59% от исходного уровня, р213<0,05).

Таблица 2

Количество жизнеспособных лейкоцитов до введения и после выхода из суточного холодового анабиоза при -40°С, с тремя хладоограждающими растворами (M±q)

Номер раствора Число опытов Количество жизнеспособных лейкоцитов

до замораживания после размораживания

в % к общему числу лейкоцитов в% к общему числу лейкоцитов в % к исходному уровню

1 10 98,15±0,69 51,9114,87* 52,82±5,09

2 10 94,29±5,35 70,5+1,29* 81,86±4,67

3 10 98,36±0,75 62,57±9,68* 54,86±8,44

Достоверность различия между растворами - Рм,з<0,05 ры,з<0,05

Примечание * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05)

Таблица 3

Количество гранулоцитов до введения и после выхода из суточного холодового анабиоза

при -40°С, с тремя хладоограждающими растворами (Mio)

Номер раствора Число опытов Количество гранулоцитов

до замораживания после размораживания

в % к общему числу лейкоцитов в % к общему числу лейкоцитов в % к исходному уровню

1 10 27,69±6,46 15,10±3,11* 61,29±6,13

2 10 32,14±ЭД9 29,00±2,83 90Д0±3,49

3 10 30,07±4,12 17,36±3,75* 57,08±6,53

Достоверность различия между растворами - р2.1.з<0,05 Р2-и<0,05

Примечание * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05).

Таким образом, при использовании хладоограждающего раствора №2 для введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз (-40°С), содержащего в конечной концентрации криопротектор ГМБТОЭМ - 15%, антигипоксант фумарат натрия - 1,4%, лимонную кислоту - 0,03% (табл. 1), достигнута более высокая функциональная сохранность лейкоцитов, чем при использовании растворов Xsl и №3. Полагаем, что в концентрации 15% входящий в раствор №2 криопротектор ГМБТОЭМ способствует наиболее «оптимальному» выходу воды из клетки и ее стабилизации, чем в концентрациях 12% (раствор № 1) или 18% (раствор № 3). Кроме того, в этой концентрации (15%) ГМБТОЭМ, вероятно, позволяет избежать глубоких фазовых изменений и нарушения проницаемости мембран лейкоцитов, подвергаемых холодовому анабиозу. Полагаем, что другие компоненты хладоограждающего раствора № 2 (фумарат натрия и лимонная кислота) при

использовании их в конечных концентрациях, равных 1,4% и 0,03% соответственно, в большей степени способствуют поддержанию метаболизма лейкоцитов в процессе их хранения и размораживания, чем эти же компоненты в растворах № 1 и № 3.

Таблица 4

Число фагоцитарно активных нейтрофилов до введения и после выхода из суточного холодового анабиоза при -40°С, с тремя хладоограждающими растворами

(М±о)

Номер раствора Число опытов Фагоцитарная активность нейтрофилов

до замораживания после размораживания

в % к общему числу нейтрофилов в % к общему числу нейтрофилов в % к исходному уровню

1 10 37,43±4,28# 17,29±2,06* 49,78±6,82

2 10 40,00±2,08 39,33±1,51 97,5±2,59

3 10 49,14±2,27# 27,18±3,71* 50,44±4,75

Достоверность различия между растворами - Рм,з<0,05 Р2-и<0,05

Примечание' * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05)

Дальнейшие исследования функционального состояния лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при -40°С проведены с применением раствора №2, который был признан оптимальным.

2. Зависимость функционального состояния нативных и размороженных лейкоцитов, перенесших суточный анабиоз при -40°С, от длительности экспозиции (1-24 ч) с хладоограждающим раствором № 2.

Эти исследования были проведены с целью определения длительности сохранения функциональных свойств размороженных лейкоцитов, что имеет большое значение, прежде всего для криофизиологии и трансфузиологии.

Эксперименты показали, что в процессе экспозиции при +20°С и при +4°С все функциональные свойства нативных лейкоцитов, в особенности такие как ФАН, постепенно снижались. Количество жизнеспособных лейкоцитов при +20°С (серия 1), оставалось выше 50% в течение первых 6 ч экспозиции. Оно начинало достоверно снижаться в сравнении с исходным уровнем, равным 99,5011,56%, уже через 2 ч (90,95±2,52%). При +4°С (серия 2) количество жизнеспособных лейкоцитов оставалось выше 50% в течение 24 часов, а достоверное снижение от исходного уровня наблюдалось только через 4 ч экспозиции с данным раствором (90,21±5,23%). Число гранулоцитов при +20°С (серия 1) и +4°С (серия 2) достоверно (р<0,05) снижалось уже через 2 ч экспозиции с хладоограждающим раствором (от 32,20+1,64% в исходном состоянии до 24,49±% при +20°С и до 28,56+1,47% при +4°С). Эта же тенденция прослеживалась и в отношении ФАН (от 41,1514,21% в исходном состоянии до 32,16+2,24% при +20°С и до 35,1213,01% при+4°С).

Функциональные свойства у лейкоцитов, подвергнутых предварительно суточному хранению при -40°С и последующему размораживанию, сохранялись в течении более короткого времени в процессе экспозиции при +20°С (серия За) или +4°С (серия 36), чем у нативных лейкоцитов. В частности, количество жизнеспособных клеток при +20°С и при +4°С составляло более 50% в течение 2 ч от начала экспозиции, а достоверное (р<0,05) снижение этого показателя наблюдалось уже через 30 мин после размораживания (с 75,00±1,23% в исходном состоянии до 71,12±2,44% при +20°С и до 72,5112,10% при +4°С). Аналогично, спустя 30 минут от начала экспозиции достоверно снижалось количество гранулоцитов (с 29,6013,13% в исходном состоянии до 12,5612,10% при +20°С и до 15,6313,12% при +4°С) и число фагоцитарно активных нейтрофилов (с 39,38+1,41% в исходном состоянии до 19,8612,45% при +20°С и до 21,3011,52% при +4°С). Более высокую скорость снижения функциональных свойств размороженных лейкоцитов по сравнению с нативными можно объяснить снижением их репарационных возможностей в процессе криоконсервации. Наши результаты согласуются с данными М.Ф. Заривчацкого (1995), А. АЬс!е1-К^еесЗ (1997) и XV. НиЫ е1 а1. (1997), согласно которым исходный ЛК при температуре +4°С сохраняется не более 24 часов, что объясняется быстрым истощением энергетического потенциала клеток вследствие прекращения гликолиза.

Таким образом, после хранения лейкоконцентрата при -40°С оценку функциональной активности его лейкоцитов следует проводить в первые 30 минут после размораживания, так как при более длительном хранении в условиях положительных температур лейкоциты быстро «стареют» за счет сниженных способностей к репарации и активно протекающих процессов метаболизма, что приводит к гибели клеток.

3. Влияние длительного (в течении 45 суток при +60°С) хранения

оптимального хладоограждающего раствора на его криозащитные

свойства.

Хранение оптимального хладоограждающего раствора, т.е. раствора № 2 при указанных условиях, которые приравниваются к хранению в течение 2-х лет при +4°С (Временная инструкция..., 1979), не снижало криозащитных свойств этого раствора (табл. 5). Действительно, результаты исследования показали, что все 9 проб раствора №2, хранившегося 45 суток при +60°С, способствуют сохранению функциональной активности лейкоцитов (табл. 5) в такой же степени, как и свежеприготовленный раствор №2, т.е. не подвергавшийся «старению» (табл. 2, 3 и 4). Нами также установлено, что хладоограждающий раствор №2 после 45-суточного хранения сохранил прозрачность, а значения его рН за этот период изменилось незначительно (с 7,2 до 7,6). Все это позволяет утверждать, что к концу 2-летнего хранения при +4°С хладоограждающего раствора №2, содержащего ГМБТОЭМ, фумарат натрия и лимонную кислоту, его основные свойства не будут

претерпевать существенных изменений. Это означает, что хладоограждающий раствор №2 можно применять в экспериментах по длительному хранению JIK в условиях низких температур.

Таблица 5

Показатели лейкоконцентрата (М±я) до и после выхода из суточного холодового анабиоза при -40°С с хладоограждаюицим раствором № 2, подвергнутым ускоренному «старению»

(п=9)

Показатели лейкоконцентрата До замораживания После размораживания

ед.измерения ед измерения в % к исходному уровню

Общее количество лейкоцитов 16240±560в 1мкл 14830±350 в 1 мкл 91,32±2,58

Количество жизнеспособных лейкоцитов 95,43±3,26% 74,10±3,87% * 77,67±4,80

Морфологический состав гранулоциты 32,33±2,44% 28,67±3,35% 88,67±4,56

моноциты 13,57±3,13% 15,86*4,07% 117,87± 18,03

лимфоциты 55,67±1,83% 57,29±1,67% 102,93±9,70

Количество фагоцитарно активных нейтрофилов 44,44±4,35% 43,00±2,65% 96,76±5,00

Количество диформазанположительных нейтрофилов 24,00±4,76% 69,50±1,41% * 289,58±12,26

Примечание' * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05)

4. Жизнеспособность и функциональная активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз (-40вС) разной длительности с использованием хладоограждающего раствора №2 и экспоненциальной программы замораживания.

Исследования, провидимые спустя соответственно 1, 20, 30, 40, 50 и 60 суток хранения ЛК в состоянии холодового анабиоза при -40°С, показали (табл. 6, 7 и 8, рис. 2), что функциональные свойства лейкоцитов сохраняются достаточно долго - в пределах 30 суток. Однако достоверное (р<0,05) снижение количества лейкоцитов происходит только спустя 50 суток (спустя одни сутки хранения в ЛК после его размораживания число сохранившихся лейкоцитов составляет 93,71+3,59% от исходного уровня, а после 50 суток хранения - 84,71±2,56% от исходного уровня, р<0,05). Наименьшей устойчивостью к условиям холодового анабиоза при -40°С обладали гранулоциты, а наибольшей - лимфоциты и моноциты (табл. 6).

Количество фагоцитарно активных нейтрофилов достоверно (р<0,05) уменьшалось (2,3 раза) спустя 40 суток хранения ЛК при -40°С, а фагоцитарный индекс нейтрофилов, т.е. количество поглощенных частиц латекса одним нейтрофилом, достоверно (р<0,05) снижался после 50-суточного хранения ЛК (табл. 7).

Количество жизнеспособных лейкоцитов и их морфологический состав (М±о) до введения

в холодовой анабиоз (-40°С, раствор № 2) и после выхода из него на различных сроках __хранения (п=7)_

Сроки хранения, сутки Количество клеток до замораживания Количество клеток после размораживания

в % к общему числу лейкоцитов в % к общему числу лейкоцитов в % к исходному уровню

Количество жизнеспособных лейкоцитов

1 94,29+5,35 70,50+1,29* 81,8614,67

20 97,57±2,44 70,4015,23* 75,1417,97

30 96,57±2,99 63,5015,45* 61,8615,43 #

40 99,14+1,46 62,7519,36* 60,7113,35 #

50 99,71 ±0,49 61,25112,82* 60,2012,80 #

60 98,29+3,79 60,00+1,63* 61,7511,71 #

Количество гранулоцитов

1 32,14±3,29 29,00±2,83 90,2013,49

20 32,2Ш,64 29,60+3,13 89,2517,09

30 32,6716,80 22,60±2,30 * 64,4014,51 #

40 32,00±5,80 18,71±5,82 * 57,8619,77 #

50 42,82±9,94 19,8612,07 * 42,4313,16 #

60 35,71+6,82 11,80+2,39* 30,2519,78 #

Количество лимфоцитов

1 53,8611,18 55,43±1,05 103,2912,24

20 52,71±1,64 52,4213,13 99,42112,88

30 52,85±5,60 56,7114,76 106,0013,19

40 56,0014,83 64,8615,34* 116,1415,80#

50 44,43+8,83 59,5614,26* 136,57114,22#

60 55,57±6,16 64,1417,84* 115,4218,45#

Количество моноцитов

1 13,17±2,49 16,1613,36 109,16112,14

20 13,42±2,16 17,5014,69 111,80118,07

30 12,57+1,41 22,7114,39* 172,00113,47#

40 12,67±1,52 19,1412,55* 166,50110,21#

50 11,33±1,58 22,2912,55* 197,33122,36#

60 12,85+1,45 23,1614,41* 180,23124,49#

Примечание' * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05), # - различие с результатами хранения в течение 1 суток достоверно (р<0,05)

Процент активированных нейтрофилов, т.е. содержащих диформазан, достоверно (р<0,05) увеличивался после размораживания (рис. 2), что, согласно данным литературы (Clark R., 1983, 1990, 1999; Маянский А.Н., Маянский Д.Н., 1989; Gauss К., 2002; Granfeldt D., 2002), отражает проявление респираторного взрыва нейтрофилов. Спустя сутки хранения этот показатель возрастал с 22,00±4,65% до 67,33±6,25%. Аналогично, спустя 20 суток хранения он возрастал с 24,43±3,3% до 71,00+1,58%. Однако после 30 суток хранения рост этого показателя был более выраженным (р<0,05) - с

27,33±8,74% до 96,80+7,16%. Это говорит о почти полном истощении возможностей системы, генерирующей активные формы кислорода после 30 суток холодового анабиоза при -40°С.

Таблица 7

Показатели фагоцитарной активности нейтрофилов (М±ст) до их введения в холодовой анабиоз (-40°С, раствор № 2) и после выхода из него на различных сроках хранения (п=7)

Сроки хранения, (сутки) Количество фагацитарно активных нейтрофилов Фагоцитарный индекс нейтрофилов

до замораживания после размораживания ДО замораживания после размораживания

в % к общему числу нейтрофилов в % к общему числу нейтрофилов в% к исходному уровню

1 40,00±2,08 39,33±1,51 97,50±2,59 4,43±0,53 4,57±0,98

20 35,86+4,56 # 31,29±5,22 # 94,80±1,11 # 4,57±1,40 4,43+1,27

30 48,00±4,47 # 47,25±2,22 # 94,50±1,21 # 2,86±0,69 # 3,43±0,98 #

40 38,00±1,41 20,14+1,86 *# 53,14±4,59 # 3,29+1,38 3,00±0,82 #

50 33,86±1,07# 15,43±2,07 *# 45,86±7,69 # 3,29+0,95 1,57±0,53 *#

60 36,43±5,38 13,67±3,27 »# 34,29+9,91 # 3,25+0,96 # 1,29±0,49 *#

Примечание * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05); # - различие с результатами хранения в течение 1 суток достоверно,(р<0,05)

Количество фагоцитарно активных моноцитов (ФАМ) и их фагоцитарный индекс не зависели от сроков хранения, т.е. оставались постоянными на протяжении всех 60 суток хранения (табл. 8), что говорит о выраженной устойчивости этих клеток к холодовому стресс-воздействию (-40°С).

Представленные данные дают основание заключить, что предложенный нами метод введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоза при -40°С, включающий в себя применение оптимального криозащитного раствора и экспоненциальной программы замораживания, позволяет сохранить жизнеспособность и функциональную активность данных клеток в течение 30 суток на высоком уровне.

~--- * _ . - н * _ «г

- ш й5 ►Ж* -

1 сутки ?* суток » суток

□до ммораживания □ после рашоражиаання

Рис 2 Кислородзависимый метаболизм нейтрофилов (в % от общего количества нейтрофилов), криоконсервированных при в зависимости от срока

хранения, * - различие с исходным уровнем (до замораживания) достоверно (р<0,05)

Показатели фагоцитарной активности моноцитов (М±о) до их введения в холодовой анабиоз (-40UC, раствор № 2) и после выхода из него на различных сроках хранения (п=7)

Сроки хранения, (сутки) Количество фагацитарно активных моноцитов Фагоцитарный индекс моноцитов

до замораживания после размораживания ДО замораживания после размораживания

в % к общему числу моноцитов в % к общему числу моноцитов

1 3,29±0,49 3,34±0,69 1,2910,49 1,8610,69

20 3,5710,53 3,57±0,79 1,7110,76 2,0010,82

30 3,29±0,49 3,42±0,53 1,4310,53 1,7110,76

40 3.2910,76 3,14±0,69 1,4310,53 2,0010,82

50 3,71 ±0,49 3,57±0,79 1,8610,69 1,2910,49

60 3,29±0,58 2,8510,69 1,4310,53 1,1410,38

Примечание различия с исходным уровнем (до замораживания) и с результатами хранения в течение 1 суток носят недостоверный характер (р<0,05)

5. Оценка в опытах на животных «острой» и «хронической» токсичности, пирогенности оптимального хладоограждающего раствора и переносимости аутологичных лейкоцитных концентратов после их хранения в течение 24 ч при -40°С с данным раствором.

Установлено, что однократное внутривенное введение мышам хладоограждающего раствора №2 не сопровождается гибелью животных. Это означает, что раствор не проявляет «острую» токсичность. Он также не проявлял и «хроническую токсичность - все животные (мыши и кролики) остались живыми после ежедневного внутрибрюшинного введения раствора №2 в течение 10 дней, не менялась их масса тела, не претерпевало существенных изменений их поведение, в том числе не менялся аппетит, а во внутренних органах и в мозге, как показали гистологические исследования, отсутствовали признаки деструктивных изменений. Об отсутствии признаков «хронической» токсичности раствора №2 свидетельствуют также неизменность показателей ЭКГ, зарегистрированные у кроликов за 1 час до введения раствора №2 и через час после этой процедуры, и результаты общего анализа крови (число эритроцитов, уровень гемоглобина и т.д.) и мочи (цвет, прозрачность, относительная плотность и т.д.) кроликов. Показано, что раствор №2 является апирогенным - при его введении кроликам отклонение ректальной температуры от базового уровня не превышало 0,17±0,05°С.

В опытах с собаками показано, что трансфузия размороженного аутологичного лейкоконцентрата с хладоограждающим раствором №2 после его суточного хранения при —40°С, не вызывает существенных отклонений в поведении животных, не сопровождается изменением их массы тела, ректальной температуры, пульса, частоты дыхания, показателей крови (число эритроцитов, уровень гемоглобина и т.д.) и мочи (рН, цвет, прозрачность, относительная плотность мочи, содержание в моче сахара, белка, эритроцитов, лейкоцитов и трипельфосфатов). Все это говорит о хорошей переносимости процедуры переливания размороженных

лейкоцитных концентратов, криоконсервированных с хладоогражлаюшим раствором №2.

Итак, на основании проведенных биологических исследований («острой», «хронической» токсичности, пирогенности, переносимости) хладоограждающего раствора №2 доказано, что он является безвредным для организма. По этой причине данный раствор не требует отмывания от биообъекта после его оттаивания. В целом, можно заключить, что исследуемый хладоограждающий раствор (№2) отвечает всем требованиям, предъявляемым к криозащитным средам - он нетоксичен, переносим экспериментальными животными, хорошо растворим в воде, эффективно снижает количество вымораживаемой воды при данной температуре и полностью предотвращает кристаллизацию воды из эвтектической смеси «криопротектор - вода», поддерживает в растворенном состоянии соли и белки вплоть до эвтектического перехода в аморфное состояние. Все это выгодно отличает его от других криозащитных средств, например, от глицерина, диметилсульфоксида (ДМСО), которые, согласно данным литературы (Пушкарь Н.С. и соавт., 1978), являются токсичными и требуют удаления перед применением биообъектов, что дополнительно травмирует клетки, особенно лейкоциты.

Применяемая в нашей работе экспоненциальная программа замораживания лейкоцитов, в отличие от широко известной линейной, обладает рядом преимуществ: она легко выполнима, не требует специального оборудования и обслуживающего персонала, эффективна и позволяет разным видам ядросодержащих клеток входить в холодовой анабиоз постепенно на разных его уровнях, благодаря чему на термограмме не наблюдалось явного выброса кристаллизационного тепла и, следовательно, не происходили процессы рекристаллизации, которые выявлены при замораживании клеток по линейной принудительной программе (Леонтович В.А и соавт., 1973, 1975; Махатадзе И.К. и соавт., 1975).

Использование быстрого размораживания ЛК позволяет избежать образования крупных кристаллов льда, которые возникают в результате роста мелких кристаллов, что предотвращает риск дополнительного травмирования лейкоцитов и разрыва их клеточных и внутриклеточных мембран.

В теоретическом аспекте полученные нами данные расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты лейкоцитов крови человека, подвергнутых холодовому анабиозу при -40°С и демонстрируют высокий потенциал репаративной системы этой популяции клеток крови.

выводы

1. Оптимальным хладоограждающим раствором для сохранения жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе до -40°С и хранившихся в течение 24 часов, является раствор №2, который содержит криопротектор ГМБТОЭМ (15% в конечной концентрации), антигипоксант фумарат натрия (1,4%), лимонную кислоту (0,03%). Под его защитой сохраняется 93,7% лейкоцитов, из которых 81,9% имеют неповрежденную мембрану, а 97,5% нейтрофилов проявляют фагоцитарную активность. Хладоограждающие свойства у данного раствора сохраняются в течении 45 суток (при +60°С), что эквивалентно 2 годам хранения при +4°С.

2. Оптимальный срок сохранения на высоком уровне жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -40°С под защитой оптимального криозащитного раствора - 30 суток. К этому времени сохраняется 87,3% лейкоцитов, из которых 61,9% имеют неповрежденную мембрану. В этот срок 94,5% нейтрофилов проявляют фагоцитарную активность и имеют высокий (в 3,5 раза выше исходного) окислительно-восстановительный метаболизм. На протяжении всех сроков хранения (1-60 суток) моноциты сохраняют такую же фагоцитарную активность, как и в исходном состоянии (в среднем 3,3%), проявляя тем самым выраженную устойчивость к холодовому стресс-воздействию.

3. Хладоограждающий раствор №2 при его внутривенном введении экспериментальным животным, не вызывает их гибель, не изменяет поведение, не влияет на показатели ЭКГ, гемограммы и урограммы, не приводит к деструктивным изменениям сердца, печени, почек и других органов, не повышает ректальную температуру, т.е. является нетоксичным и апирогенным. Введение аутологичных лейкоконцентратов экспериментальным животным, смешанных с хладоограждающим раствор №2 (1:1) и перенесших 24-часовой холодовой анабиоз (-40°С) не вызывает отрицательной реакции и осложнений, что свидетельствует о хорошей переносимости данного раствора.

4. Применение хладоограждающего раствора №2 и экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов является перспективным методом их криоконсервации в условиях умеренно-низкой температуры (-40°С), что может иметь важное значение для криофизиологии и трансфузиологии.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Метод криоконсервации лейкоцитов человека (патент №2184449 от 10.07.2002), основанный на использовании хладоограждающего раствора №2, экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов и их хранения при —40°С (в электрическом морозильнике, например, фирмы Derby), при котором функциональная активность лейкоцитов сохраняется в течение 30 суток на высоком уровне, рекомендуется для использования в криофизиологии и в лабораториях биологического и медицинского профиля.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Щеглова О.О. Особенности введения лейкоцитов в холодовой анабиоз при -40°С по экспоненциальному режиму / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, C.B. Утемов // Современные методы исследования в медицине и фармации: Мат-лы науч.-практ. конф. - Казань: КГМУ, 2002. - С.44-45.

2. Щеглова О.О. Функциональное состояние лейкоцитов человека, вышедших из холодового анабиоза при -40°С / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, C.B. Утемов // Там же - С.45-46.

3. Сведенцов Е.П. Применение оригинального хладоограждающего раствора для криоконсервирования лейкоцитов крови человека при - 40°С / Е.П. Сведенцов, О.О. Щеглова, Т.В. Туманова, C.B. Утемов, О.Н. Деветьярова, A.A. Костяев // Актуальные проблемы гематологии и трансфузиологии: Мат-лы V съезда гематологов и трансфузиологов республики Беларусь. - Минск: НПООО «Стринко», 2003. - С.392-394.

4. Щеглова О.О. Сравнительные морфофункциональные исследования нейтрофилов, хранившихся разные сроки при температуре -40°С / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, C.B. Утемов, Д.А. Карпов // Актуальные проблемы регионального экологического мониторинга: теория, методика, практика: Мат-лы Всеросс. науч. школы.-Киров: ВятГГУ, 2003. - С.267-268.

5. Щеглова О.О. Морфофункциональные показатели лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при —40°С в течение 20 суток / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, С.В Утемов, О.Н. Деветьярова // Науке нового века - знания молодых: Мат-лы 3-й науч. конф. аспирантов и соискателей. - Киров: ВГСХА, 2003. - С.90-91.

6. Щеглова О.О. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека, консервированных с хладоограждающим раствором при умеренно-низких температурах / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, C.B. Утемов, О.Н. Деветьярова, Д.А. Карпов // Там же. - С.91-92.

7. Сведенцов Е.П. Фагоцитарная активность нейтрофилов и лимфоцитов после различных сроков хранения в состоянии холодового анабиоза (-40°С) / Е.П. Сведенцов, О.О. Щеглова, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, A.A. Костяев, C.B. Утемов // Бюлл. эксперим. биол. и мед,-2004. - Т.138, № 10. - С.400-402.

8. Svedentsov Ye.P. Conservation of biological full value leucocytes at freezing with original cryoprotective solutions under an exponential programme / Ye.P. Svedentsov, O.O. Chtcheglova, O.N. Devetyarova, T.V. Tumanova, S.V. Utyomov, A.A. Kostyayev // Сохранение генетических ресурсов: Мат-лы межд. науч. конф.: Цитология. - 2004. - Т. 46, № 9. - С. 853-854.

9 Патент РФ №2240000. Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, C.B. Утемов, A.A. Костяев, О.О. Щеглова. Заявлено 4.12.2002; Опубл. 20.11.2004, Бюл.32.

Список сокращений:

ГМБТОЭМ - гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина

ГУ КНИИГиПК - Государственное учреждение Кировский научно-

исследовательский институт гематологии и переливания крови

ГФ - Государственная Фармакопея

ДМСО- диметилсульфоксид

ЛК - лейкоконцентрат

НСТ - нитросиний тетразолий

ПЭО - полиэтиленоксид

ФАМ - фагоцитарная активность моноцитов

ФАН - фагоцитарная активность нейтрофилов

ФИ - фагоцитарный индекс

ЭКГ - электрокардиография (грамма)

Отпечатано в типографии КГМА, г. Киров, ул. К. Маркса, 112. Заказ 216. Тираж 100 экз.

РНБ Русский фонд

2005-4 45163

19 Ш 2005

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Щеглова, Оксана Олеговна

Список использованных сокращений.

Введение.

Глава 1. Современное состояние проблемы введения лейкоцитов в холодовой анабиоз (обзор литературы).

1.1. Организация лейкоцитных клеток.

1.2. Методы получения лейкоцитного концентрата.

1.3. Функциональные и морфологические изменения лейкоцитов, вызванные воздействием холодового стресса.

1.4. Хладоограждающие растворы для лейкоцитов.

1.5. Способы оценки физиологической полноценности различных клеток до введения в криоанабиоз и после выхода из него.

Глава 2. Материалы и методы исследований.

Глава 3. Результаты экспериментальных исследований.

3.1. Оценка влияния экспоненциальной программы замораживания до -40°С и хладоограждающих растворов на функциональное состояние лейкоцитов при хранении в течение 24 часов.

3.2. Зависимость функционального состояния нативных и размороженных лейкоцитов, перенесших суточный анабиоз при -40°С, от длительности экспозиции (1-24 ч) с хладоограждающим раствором №2.

3.3. Влияние длительного (в течение 45 суток при +60°С) хранения оптимального хладоограждающего раствора на его криозащитные свойства.

V* 3.4. Жизнеспособность и функциональная активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз (-40°С) разной длительности с использованием хладоограждающего раствора №2 и экспоненциальной программы замораживания.

3.5. Оценка в опытах на животных «острой» и хронической» токсичности, пирогенности оптимального хладоограждающего раствора и переносимости аутологичных лейкоцитных концентратов после их хранения в течение 24 ч при -40°С с данным раствором.

Глава 4. Обсуждение результатов экспериментальных исследований.

Выводы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре"

Актуальность исследования. В последние десятилетия большое внимание уделяется изучению проблемы влияния холодового анабиоза на биологические объекты различного уровня организации (Mazur Р., 1970; Дудаева А.А., 1981; Голдовский A.M., 1986; Сведенцов Е.П., 2003). Под анабиозом понимают такое состояние живой системы, когда в ней обратимо приостанавливаются или частично затормаживаются метаболические и физиологические процессы (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994).

Показано (Лозина-Лозинский Л.К., 1972), что животные клетки по-разному реагируют на замораживание. Ядросодержащие клетки со сложной внутренней структурой нуждаются в индивидуальном подборе режима замораживания и оттаивания, что особенно справедливо в отношении лейкоцитов, для которых необходимо учитывать процессы, протекающие при кристаллизации воды, изменения их органелл, а также состав хладоограждающего раствора и режима замораживания. Как известно, потребность в запасах банка лейкоцитов обусловлена их использованием при лечении сепсиса, разлитого перитонита, инфекционного менингита и других заболеваний (Cairo М. et al, 1992; Мельникова В.Н., 1995; Жибурт Е.Б., 2002). Многими авторами (Леонтович В.А. и соавт., 1973, 1975; Аграненко В.А. и соавт., 1982; Утемов С.В. и соавт., 1995; Сведенцов Е.П. и соавт., 1999, 2000, 2004) предложены технологии замораживания лейкоцитов для их длительного хранения, однако, несмотря на большое количество работ, посвященных изучению этого вопроса и механизмов криоповреждения и криозащиты лейкоцитов крови человека (Абезгауз Н.Н. и соавт., 1966, 1978; Zhang Q., Tiersch Т., 1995; Svedentsov Е. et al, 1998; Halle P. et al, 2001; Сведенцов Е.П. и соавт., 2000, 2003, 2004), проблема сохранения функциональной активности лейкоцитов далека от окончательного разрешения.

В настоящее время наиболее эффективным приемом поддержания жизнеспособности лейкоцитов является глубокий криоанабиоз (-1360О-при котором наряду с полным снижением метаболизма и замерзанием всех фракций воды сохраняются орбитальные переходы электронов в атомах биомолекул (Цуцаева А.А., 1983; Сведенцов Е.П. и соавт., 2004). Однако использование этой дорогостоящей и небезопасной для персонала жидкоазотной технологии возможно далеко не во всех лечебных учреждениях. Поэтому встает вопрос о создании более доступного и эффективного метода замораживания лейкоцитов крови человека без использования жидкого азота, в частности при умеренно-низких (-30°С-г-температурах, при которых внеклеточная, свободная и частично связанная внутриклеточные фракции воды замерзают, а фиксированная фракция остается в незамерзшем состоянии, и в клетке наблюдается замедленный метаболизм (Сведенцов Е.П., 2004). Использование для этих технологий электрических морозильников упрощает и удешевляет процесс криоконсервирования лейкоцитов (Сведенцов Е.П. и соавт., 2003). Однако экспериментальных исследований в отношении сохранности функциональных свойств лейкоцитов при умеренно-низких температурах, в частности при -40°С, не проводилось. Их результаты могут представлять интерес и для криофизиологии, изучающей механизмы репарации клеток после холодового стресс-воздействия (Белоус A.M., Грищенко В.И., 1994). Все это послужило основой для постановки цели и задач исследования.

Цель исследования - определить сохранность функционального состояния лейкоцитов после их выхода из холодового анабиоза при -40°С, введение в который осуществлялось по экспоненциальной программе замораживания с применением нового хладоограждающего раствора. Задачи исследования: 1. Провести сравнительную оценку хладоограждающих свойств трех растворов (№1, №2, №3), компонентами которых являются гексаметиленбистетраоксиэтилмочевина (ГМБТОЭМ), фумарат натрия и лимонная кислота, и предназначенных для сохранения жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе и хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия (-40°С) в течение 24 часов.

Научная новизна. В лабораторно-экспериментальном исследовании впервые изучена жизнеспособность и функциональная активность лейкоцитов, перенесших холодовой анабиоз при -40°С, введение в который осуществлялось по экспоненциальной программе замораживания и с применением нового хладоограждающего раствора (патент №2184449 от 10.07.2002), включающего криопротектор - ГМБТОЭМ (в конечной концентрации - 15%), антигипоксант - фумарат натрия (1,4%) и антикоагулянт - лимонную кислоту (0,03%). Установлено, что использование указанной программы и раствора позволяет сохранить на высоком уровне жизнеспособность и функциональную активность лейкоцитов в течение 30 суток холодового анабиоза при -40°С, а также избежать разрушения мембран клеток и их органелл и денатурации клеточных белков.

Научно-практическая значимость работы. Дано научное обоснование криозащитных свойств предложенного хладоограждающего раствора, ингредиентами которого являются вещества отечественного производства -криопротектор смешанного действия ГМБТОЭМ, антигипоксант биоэнергетической направленности — фумарат натрия и антикоагулянт — лимонная кислота. Данный раствор является нетоксичным, апирогенным, хорошо переносимым, при его внутривенном введении, экспериментальными животными, следовательно, не требует отмывания от биообъекта после его отогрева и может быть рекомендован для криобиологической практики и для научных исследований в лабораториях биологического и медицинского профиля.

Благодаря применению вышеуказанной композиции хладоограждающего раствора и экспоненциальной программы замораживания лейкоцитов крови человека до —40°С их жизнеспособность и функциональная активность сохраняются на высоком уровне в течение длительного времени (30 суток). Эти данные расширяют представления о механизмах криоповреждения и криозащиты на клеточном уровне.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимальный хладоограждающий раствор, содержащий ГМБТОЭМ, фумарат натрия и лимонную кислоту, являясь нетоксичным, апирогенным, хорошо переносимым экспериментальными животными и не требующим отмывания от биообъекта после его оттаивания, позволяет сохранить функциональные свойства лейкоцитов, хранившихся в условиях холодового стресс-воздействия при -40°С в течение 30 суток.

2. Экспоненциальная программа введения лейкоцитов в холодовой анабиоз до -40°С дает возможность получить высокий процент выхода жизнеспособных и функционально активных лейкоцитов после перенесения ими холодового стресс-воздействия в течение 30 суток при данной температуре.

3. Лейкоциты человека обладают высокими репаративными возможностями, что позволяет им проявлять функциональную активность после холодового стресс-воздействия (-40°С, в течение 30 суток).

Кировского областного научного общества гематологов и трансфузиологов (Киров, 2005).

По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, из которых 3 - в центральных журналах.

Заключение Диссертация по теме "Физиология", Щеглова, Оксана Олеговна

Выводы

1. Оптимальным хладоограждающим раствором для сохранения жизнеспособности и функциональной активности лейкоцитов крови человека, замороженных по экспоненциальной программе до -40°С и хранившихся в течение 24 часов, является раствор №2, который содержит криопротектор ГМБТОЭМ (15% в конечной концентрации), антигипоксант фумарат натрия (1,4%), лимонную кислоту (0,03%). Под его защитой сохраняется 93,7% лейкоцитов, из которых 81,9% имеют неповрежденную мембрану, а 97,5% нейтрофилов проявляют фагоцитарную активность. Хладоограждающие свойства у данного раствора сохраняются в течение 45 суток при +60°С, что эквивалентно 2 годам хранения при +4°С.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Щеглова, Оксана Олеговна, Киров

1. Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А. Замораживание белых клеток периферической крови для длительного хранения при ультранизких температурах // Пробл. гематологии и переливания крови. 1966. - № 9 - С. 24-30.

2. Аграненко В.А., Ермолович С.В. Криоконсервирование лейкоцитов // Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. А.А. Цуцаевой. — Киев: Наукова думка, 1983. С. 98-106.

3. Актуальные проблемы криобиохимии // Криобиология и криомедицина / A.M. Белоус, В.И. Луговой, А.К. Гулевский. Киев, 1975. - С.8-15.

4. Алексеев Н.А. Клинические аспекты лейкопений, нейтропений и функциональных нарушений нейтрофилов. СПб.: Фолиант, 2002. - 416 с.

5. Антимикробная активность миелопероксидазы пероксидазосом нейтрофила / П.Г. Бут, Р.А. Муравьев, В.А. Фомина и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2002. - № 3. - С. 266-270.

6. Арзуманян В.Г., Ожован И.М. Модифицированный метод оценки целостности цитоплазматической мембраны клеток эукариот // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2002.- Т. 134, № 7. - С. 118-120.

7. А.С. 189689 СССР. Способ получения криопротектора в водном растворе / В.П. Архиреев, Ж.Г. Савагина, Е.П. Сведенцов, Е.В. Кузнецов, В.А. Журавлев. № 3053075; Опубл. 06.06.83; Приоритет 29.06.82.

8. А.С.419617 СССР. Способ получения тетраоксиалкилзамещенных мочевин / В.П. Архиреев, Е.В. Кузнецов, В.Г. Костромина. Опубл. в Б.И., 1974, №10.

9. Атлас клеток крови и костного мозга / Под ред. профессора Г. И. Козинца. М.: Триада - X, 1998. - 160 с.

10. Беклемишев Н.Д. Иммунопатология и иммунорегуляция (при инфекциях, инвазиях и аллергиях). М.: Медицина, 1986. - 256 с.

11. Белоус A.M., Гордиенко Е.А., Розанов Л.Ф. Замораживание и криопротекция.-М.: Высшая школа, 1987. 80 с.

12. Белоус A.M., Грищенко В.И. Криобиология. Киев: Наукова Думка, 1994.-430 с.

13. Биологические свойства криоконсервированных лейкоцитов и их клиническое применение / Аграненко В.А., Файнштейн Ф.Э., Ермолович С.В. и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1982. - № 4. - С. 6-10.

14. Биохимия (учебник для вузов) / Под ред. Е.С. Северина. М.: ГЭОТАР-МЕД, 2003. - 925 с.

15. Бондаренко Т.П., Белоус A.M. Изменение липидного слоя мембран митохондрий после действия низкой температуры // Укр. биохим. журн. — 1977.-Т. 49, №2.-С. 30-33.

16. Бондаренко В.А., Лемешко В.В., Белоус A.M. Влияние разных режимов замораживания-оттаивания на хемилюминесценцию митохондрий печени щук // Укр. биохим. журн. 1975. - Т.47, №6. - С. 746-783.

17. Быков В.Л. Цитология и общая гистология (функциональная морфология клеток и тканей человека). СПб.: СОТИС, 1999. - 520 с.

18. Виксман М.Е., Маянский А.Н. Применение реакции восстановления нитросинего тетразолия для оценки функционального состояния нейтрофилов человека // Казан, мед. журн. 1997. - Т. 55, №5. - С. 99-100.

19. Виноград Финкель Ф.Р., Киселев А.Е. Актуальные проблемы замораживания крови // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1970. -№ 4. - С. 3-4.

20. Влияние низкотемпературной консервации на поверхностные свойства лимфоцитов крови / Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова, Г.М. Щербак, Э.П. Обозный // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Мат-лы симпоз. Киев, 1974.- С. 67-69.

21. Временная инструкция по проведению работ с целью определения сроков годности лекарственных средств на основе метода ускоренного старения при повышенной температуре. МЗ СССР. М., 1979. - 7 с.

22. Гайер Г. Электронная гистохимия.- М.: Мир, 1974. -488 с.

23. Герасимов И.Г., Игнатов Д.Ю. Функциональная неравнозначность нейтрофилов крови человека: генетика активных форм кислорода // Цитология. 2001. - Т. 43, №5. - С. 432-436.

24. Герасимов И.Г., Калуцкая О.А. Кинетика реакции восстановления нитросинего тетразолия нейтрофилами крови человека // Цитология. — 2000. -Т. 42, №2.-С. 160-165.

25. Гительзон И.И., Павленко Р.А., Куденко Ю.А. Использование возможности хранения клеток крови, охлажденной ниже 0°С, в условиях высокого давления // Гематология и трансфузиология. 1986. - №10. - С. 1518.

26. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1998. —459 с.

27. Голдовский A.M. Анабиоз и его практическое применение. — JL: Наука, 1986.- 167 с.

28. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. — Томск: Изд-во Томского гос. ун-та, 1992. — 264 с.

29. Гордиенко Е.А., Пушкарь Н.С. Физические основы низкотемпературного консервирования клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1994. - 144 с.

30. Государственная фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа, лекарственное растительное сырье / 11-е изд. М.: Медицина, 1990. - С. 182185

31. Гусейнов И.С., Федорова Л.И. Выделение лейкоцитов из крови доноров для экспериментальных и клинических целей // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1963. №4. - С. 52-55.

32. Демин С.Ю. Основные типы и жизненные формы периферических и ФГА-стимулированных лимфоцитов человека, выявляемые in vitro // Цитология. 2003. - Т. 45, №6. - С. 535-547.

33. Долгушин И.И., Бухарин О.В. Нейтрофилы и гомеостаз. — Екатеринбург: Изд-во УрО РАН, 2001.-278 с.

34. Жибурт Е.Б. Трансфузиология. СПб.: Питер, 2002. -736 с.

35. Замораживание: факторы, механизмы и гипотезы криоповреждения биологический суспензий / Ю.А. Иткин, B.JI. Бронштейн, Е.А. Гордиенко, В.Ф. Марценюк // Консервирование клеточных суспензий. Киев: Наукова Думка, 1983.-С. 26-34.

36. Изучение поглотительной способности нейтрофилов крови с использованием инертных частиц латекса / С.Г. Потапова, B.C. Хрустиков, Н.В. Демидова, Г.И. Козинец // Пробл. гематологии и переливания крови. -1977.-№9.-С. 58-59.

37. Инструкция по применению полимерных контейнеров «Гемакон» и «Компопласт» / В.П. Кошивая, Е.М. Макарова, Н.М. Шишов и др. М., 1983. -13 с.

38. Испытание эффективности режимов с постоянной скоростью охлаждения для замораживания гранулоцитов человека / В.А. Леонтович, В.М. Трошина, В.Т. Новичков и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1975. - №9. - С. 23-25.

39. Исследование системы крови в клинической практике / Под ред. Г.И. Козинца и В.А. Макарова. М.: Триада-Х, 1997. - 480 с.

40. Калинин И.Н. Получение и применение концентрата тромбоцитов и лейкоцитов // Пробл. гематологии и переливания крови. 1980. - №10. - С. 50-56.

41. Консервирование гранулоцитов с раствором «лейкокриодмац» / В.А. Аграненко, Н.Н. Абезгауз, В.М. Трошина и др. // Гематология и трансфузиология. 1986. - № 12. - С.26-29.

42. Консервирующие растворы для крови и ее компонентов / Аграненко

43. B.А., Тибилова Н.Н. // Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга: Справочник М.: Медицина, 1997. - С. 150-161.

44. Корреляция скоростей охлаждения с ограждающей средой в поиске оптимальных режимов замораживания гранулоцитов / И.К. Махатадзе, JI.X. Каличава, Н.Н. Мгебришвили и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1975. - №9. - С. 25-27.

45. Криоконсервирование клеточных суспензий / Под ред. А.А. Цуцаевой — Киев: Наукова Думка, 1983. 240 с.

46. Криоконсервирование лейкоцитов с новым ограждающим раствором /

47. C.В. Утемов, Е.П. Сведенцов, А.А. Костяев и др. // Вопросы трансфузионной и клинической медицины: Мат-лы 6-й науч. конф. молодых ученых (Киров, 29-30 марта 1999 г.). Киров, 1999. - С.28.

48. Криопротекторы / Н.С. Пушкарь, М.Н. Шраго, A.M. Белоус, Ю.В. Калугин. Киев: Наукова Думка, 1978. - 204 с.

49. Криоустойчивость лимфоцитов крови и лимфоидных тканей / А.А. Цуцаева, А.Н. Попов, Т.Н. Воскобойникова и др. // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов I Всесоюзн. симпоз. (Москва, 27-29 сентября, 1981 г.). -М.Д981.-С.75-77.

50. Кровезаменители, консерванты крови и костного мозга / Под ред. Г.Н. Хлябича. -М.: Медицина, 1997. 192 с.

51. Лаврик С.С., Зверкова А.С., Афанасьева Е.Ю. Консервирование клеток селезенки поливинилпирролидоном методом глубокого замораживания // Врачеб. дело. 1971. - №2. - С. 9-12.

52. Лаврик С.С., Когут Г.И., Афанасьева Е.Ю. Применение низкомолекулярного ПВП в качестве защитной среды для консервирования и длительного хранения лейкоцитов методом глубокого замораживания // Врачеб. дело. 1971. - №12. - С. 80-83.

53. Ларионов Л.Ф. Химиотерапия злокачественных опухолей. М.: Медгиз, 1962. - 464 с.

54. Лебедев К.А. Клинический анализ крови с определением субпопуляции лимфоцитов и возможные ошибки при его интерпретации // Физиология человека. 2001. - Т. 27, №4. - С. 104-109.

55. Лебедев К.А., Понякина И.Д. Иммунограмма в клинической практике. М.: Наука, 1990.-224 с.

56. Левин С.В. Структурные изменения клеточных мембран. Л.: Наука, 1976.- 197 с.

57. Леонтович В.А., Абезгауз Н.Н., Трошина В.М. Метод замораживания гранулоцитов с диметилацетамидом // Современные пробл. криобиологии и криомедицины. М., 1975. - С.75-84.

58. Леонтович В.А., Абезгауз Н.Н., Трошина В.М. Получение лейкоцитной массы из периферической крови человека и ее фракционирование на гранулоциты и лимфоциты // Пробл. гематологии и переливания крови. — 1971.-№1.-С. 51-57.

59. Лобынцева Г.С., Тимошенко Ю.П. Влияние скорости отогрева на выживаемость клеток крови // Криобиология и криомедицина. 1981. - №8. -С. 15-18.

60. Лобынцева Г.С., Щербак Г.М., Полякова А.И. Низкотемпературное консервирование ядросодержащих клеток крови под защитой полиэтиленоксида различного молекулярного веса // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Мат-лы симпоз. Киев, 1974.- С. 69-70.

61. Лозина-Лозинский Л.К. Очерки по криобиологии. Адаптация и устойчивость организмов и клеток к низким и сверхнизким температурам. — Л.: Наука, 1972.-288 с.

62. Матюшичев В.Б, Шамратова В.Г, Музафарова Д.А. Взаимосвязи количества лейкоцитов и параметров распределения объема клеток белой крови человека // Физиология человека. — 2001. №1. — С. 122-126.

63. Маянский А.Н., Маянский Д.Н. Очерки о нейтрофиле и макрофаге. -Новосибирск: Наука, Сиб. отд-ние, 1989. 344 с.

64. Мельникова В.Н. Получение и клиническое применение при гнойно-септических заболеваниях лейкоцитарной взвеси из крови иммунных доноров // Трансфузионная медицина. 1995. - №5. - С. 32-36.

65. Механизм бактерицидной активности в фагосомах нейтрофилов / Р.А. Муравьев, П.Г. Бут, В.А. Фомина и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. — 2002.-№4.-С. 437-441.

66. Механизмы индукции и репарации нелетальных криоповреждений / А.А. Цуцаева, А.О. Котляров, О.В. Кудокоцева и др. // Цитология. 2004. -Т. 46, №9. - С. 879.

67. Мечников И.И. Учение о фагоцитозе и его экспериментальные основы // Вопросы иммунитета / И.И. Мечников. М.: Изд-во АН СССР, 1951. - С. 520-646.

68. Миелопероксидаза пероксидазосом нейтрофила / П.Г. Бут, В.А. Фомина, Р.А. Муравьев и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2003. - № 3. -С. 261-265.

69. Митерева Д.Е., Агафонов В.Е. Исследование функциональной активности фагоцитов цельной крови сенсибилизированных морских свинок с помощью модифицированного метода хемилюминесцентного анализа // Мед. иммунология. 2003. - Т.5, №3-4. - С. 207.

70. Молекулярные механизмы криоповреждения мембранных структур / A.M. Белоус, Т.П. Бондаренко, В.А. Бондаренко // Криобиология и криомедицина. 1979. - № 5. - С. 3-13.

71. Морфологические и функциональные свойства гранулоцитов через разные сроки хранения при -20°С / Е.П. Сведенцов, О.Н. Деветьярова, Т.В. Туманова и др. // Мат-лы науч. сессии (Киров, 30-31 марта 2004 г.). Киров, 2004.-С. 120-121.

72. Муравьев Р.А., Роговин В.В. Химические основы неспецифического иммунитета // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2001. - №3. - С. 284-292.

73. Муравьев Р.А., Фомина В.А., Роговин В.В. Желатиназные гранулы нейтрофильных гранулоцитов // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. -2003. №4. -С. 389-394.

74. Набокина С.М. Внутриклеточная локализация белка LAMP 1 в нейтрофилах человека // Бюл. эксперим. биологии и медицины. - 2001. — Т. 131, №2.-С. 160-161.

75. Нестерова И.В., Колесникова Н.В. Цитокиновая регуляция и функционирующая система нейтрофильных гранулоцитов // Гематология и трансфузиология. 1999. - Т.44, №2. - С. 43-47.

76. Низкотемпературная консервация лимфоцитов / Н.С. Пушкарь, А.И. Полякова, А.А. Цуцаева и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. -1974.-№7.-С. 23-26.

77. Основы трансфузиологии / Под ред. М.Ф. Заривчацкого. Пермь: Изд-во Пермского ун-та, 1995. - С. 74-75.

78. Основы физиологии человека / Под ред. Б.И. Ткаченко. СПб.: Международный фонд истории науки, 1994. - С. 212-218.

79. Осташко В.Ф., Осташко Ф.И. Температурный шок клеток как гидравлический удар в резонансной системе // Цитология. 2004. - Т. 46, №9.-С. 831-832. "

80. Патент на изобретение №2184449. Криозащитный раствор для замораживания лейкоцитов при умеренно-низкой температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, А.Н. Семенов, С.А. Хомякова, А.А. Костяев, С.В. Утемов. Приоритет 18.04.2001. Опубл. 10.07.2002.

81. Патент на изобретение №2049391 (РФ)- Средство для криоконсервирования костного мозга / Е.П. Сведенцов, В.П. Архиреев, Д.С. Симкин, Е.В. Кузнецов. Опубл. 10.12.1995.

82. Пигаревский В.Е. Зернистые лейкоциты и их свойства. — М.: Медицина, 1978.-С. 104-108.

83. Пигаревский В.Е. Лизосомально-катионный тест: (Методические рекомендации). -М., 1979. 10 с.

84. Полякова А.И. Влияние низкотемпературной консервации на клеточный состав лейкоконцентрата донорской крови // Актуальные вопросы криобиологии и криомедицины: Мат-лы симпоз. Киев, 1974. - С. 124-126.

85. Полякова А.И. Изучение влияния низких температур (-196 С) и криопротектора (ПЭО-400) на сохранность клеток лейкоконцентрата илимфоконцентрата периферической крови: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Харьков, 1975.- 14 с.

86. Попов С.В. Функциональные реакции нейтрофилов и макрофагов на растительные полисахариды: Автореф. дис. . канд. биол. наук. Сыктывкар, 1999.- 19 с.

87. Применение лейкоконцентрата при гнойно-септических состояниях / С.В. Рыжков, А.Н. Плоцкий, С.Ф. Малахов и др. // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. (С.-Петербург, 1995 г.).-СПб., 1995.- С. 343-344.

88. Проблемы криобиохимии / A.M. Белоус, В.И. Луговой, В.В. Лемешко и др. // Вест. АН СССР. Сер. 40. 1976. - № 2. - С. 38-48.

89. Пушкарь Н.С., Белоус A.M. Введение в криобиологию. Киев: Наукова Думка, 1975.-342 с.

90. Разработка оптимальных программ охлаждения для замораживания гранулоцитов и лимфоцитов человека / В.А. Леонтович, Н.Н. Абезгауз, В.Я. Перфильев и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1973. - №9. -С. 44-47.

91. Разработка оптимальных режимов программного замораживания лейкоцитов / Н.С. Пушкарь, Г.С. Лобынцева, А.И. Полякова и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1978. - №8. - С. 8-13.

92. Ре Л. Консервация жизни холодом. М.: Мир, 1962. - 155 с.

93. Резник С.Е. Мечников. М.: Молодая гвардия, 1973. - 365 с.

94. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Муштакова В.М. Состав пероксидазосом нейтрофилов // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. 2001. - №4. - С. 396-401.

95. Роговин В.В., Пирузян Л.А., Муравьев Р.А. Пероксидазосомы. М.: Наука, 1977.-204 с.

96. Руководство по общей и клинической трансфузиологии / Ю.Л. Шевченко, В.Н. Шабалин, М.Ф. Заривчацкий, Е.А. Селиванов. СПб.: Фолиант, 2003.-608 с.

97. Руководство по трансфузионной медицине / Под ред. Е.П. Сведенцова. -Киров, 1999.-715 с.

98. Рыжков С.В., Калеко С.П., Плоцкий А.Н. Клиническое применение лейкоконцентрата // Вест, хирургии. 1992. - №1-3. - С.78-82.

99. Сведенцов Е.П. К классификации разных уровней отрицательных температур, используемых для консервирования биообъектов // Мат-лы науч. сессии (Киров, 30-31 марта 2004 г.). Киров, 2004. - С. 117-120.

100. Сведенцов Е.П. Получение и криоконсервирование костного мозга для клинического применения: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Л., 1987. - 45 с.

101. Славинский А.А. Цитоплазматическая зернистость нейтрофильных лейкоцитов // Клинич. лаб. диагностика. 2002. - №3. - С. 39-42.

102. Славинский А.А., Никитина Г.В. Цитохимическое выявление катионных белков в гранулоцитах крови амидо черным 10Б для визуальной оценки и компьютерного анализа изображения // Клинич. лаб. диагностика. — 1999.-№2.-С. 35-37.

103. Смольянинова Е.И., Липник Т.Н., Гордиенко О.И. Проницаемость мембран ооцитов мыши для криозащитных веществ ряда диолов и амидов // Цитология. 2004. - Т. 46, №9. - С. 855-856.

104. Способ введения лейкоцитов крови человека в холодовой анабиоз при -50°С / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, С.А. Якшина и др. // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2003. - №11. - С. 35-37.

105. Точилкин А.И. Лимонная кислота // БМЭ. 1980. - Т. 13. - С.131-132.

106. Трошина В.М., Абезгауз Н.Н., Леонтович В.А. Применение диметилацетамида в качестве криопротектора при замораживаниигранулоцитов // Пробл. гематологии и переливания крови. 1977. - №5. - С. 50-53.

107. Углекислый газ универсальный ингибитор генерации активных форм кислорода клетками (к расшифровке одной загадки эволюции) / А.Х. Коган, С.В. Грачев, С.В. Елисеева и др. // Изв. РАН. Сер.: Биологическая. - 1997. — №2.-С. 204-217.

108. Утемов С.В. Методы выделения лейкоцитов для клинических целей // Препараты крови и кровезаменители — производство, контроль и клиническое применение: Мат-лы науч.-практ. конф. Киров, 1995. - С. 68.

109. Утемов С.В., Сведенцов Е.П., Костяев А.А. Современные методы низкотемпературного консервирования лейкоцитов // Препараты крови и кровезаменители производство, контроль и клиническое применение: Мат-лы науч.-практ. конф. - Киров, 1995. - С. 69-70.

110. Физико-химические и токсико-фармакологические характеристики жидкой формы криопротектора А-378 / Е.П. Сведенцов, В.П. Архиреев, С.В. Утемов и др. // Актуальные вопросы трансфузионной и клинической медицины: Мат-лы науч. конф. Киров, 1997. - С. 34.

111. Физиология лейкоцитов человека / Под ред. В.А. Алмазова Л.: Наука, 1979.-232 с.

112. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М.: Высшая школа, 1993. - С. 348-350.

113. Фролова О.Е. Морфофункциональная характеристика моноцитов. Значение исследования нуклеолярного аппарата (обзор литературы) // Клинич. лаб. диагностика. 1998. - №10. - С. 3-8.

114. Ханевич М.Д., Маринин А.В. Использование лейкоцитарной массы при лечении тяжелых форм разлитого перитонита // Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии: Тез. докл. Рос. конф. (С.-Петербург, 1995 г.). -СПб, 1995.-С. 344-345.

115. Цитохимия замороженной клетки / Э.И. Обозная, Н.С. Пушкарь, О.П. Маркова, Е.Я. Панков. Киев: Наукова Думка, 1981. - С. 38-43.

116. Электронная микроскопия лейкоцитов в процессе их хранения / Э.И. Терентьева, В.А. Леонтович, З.Г. Шишканова и др. // Пробл. гематологии и переливания крови. 1978. - №1. - С. 28-34.

117. Энзиматическая диагностика криоповреждений клеток лейкоконцентрата / В.И. Луговой, А.Н. Дзюба, Л.П. Кравченко и др. // Консервирование крови и ее компонентов: Сб. мат-лов I Всесоюз. симпоз. (Москва, 27-29 сентября, 1978 г.). М., 1981. - С. 64-65.

118. Ярилин А.А. Основы иммунологии. М.: Медицина, 1999. - 605 с. A convenient and economical freezing procedure for mononuclear cells / J. Vingerhoets, G. Vanham, L. Kestens, P. Gigase // Cryobiology. - 1995. - Vol. 32. -P. 105-108.

119. Abdel-Mageed A., Rosalio M.L.U., Hutcheson C.E. Effect of temperature variation on cell number, viability and clonogenic potential // Blood. 1997.- Vol. 90,№10.-P. 321b (4194).

120. Aderem, A. A., Underhill D. M. Mechanisms of phagocytosis in macrophages // Annu. Rev. Immunol. 1999. - Vol. 17. - P. 593-623.

121. Babior B.M., Kipnes R.S., Curnutte J.T. Biological defense mechanisms. The production by leukocytes of superoxide, a potential bactericidal agent // J. Clin. Invest. 1973. - Vol. 52. - P. 741-744.

122. Bainton D.F. Distinct granule populations in human neutrophils and lysosomal organelles identified by immuno-electron microscopy // J. Immunol. Methods. 1999. - Vol. 232, №1-2.-P. 153-168.

123. Bainton D.F. Neutrophilic leukocyte granules: from structure to function // Adv. Exp. Med. Biol. 1993. - Vol. 336. - P. 17-33.

124. Biosynthesis of granule proteins in normal human bone marrow cells. Gelatinase is a marker of terminal neutrophil differentiation / N. Borregaard, M. Sehested, B. S. Nielsen et al.//Blood. 1995.-Vol. 85, №3.-P. 812-817.

125. Borregaard N., Cowland I. Granules of the human neutrophils polymorphonuclear leukocyte // Blood. 1997. - Vol. 89, №10. - P. 3503.

126. Bux J. Herstellung von Blutcomponenten // Transfiisionsmedizin. C. Mueller-Eckhurut-Hrig. Berlin: Springer. - 1996. - P. 229-244.

127. Cham B.P., Gerrard J.M., Bainton D.F. Granulophysin is located in the membrane of azurophilic granules in human neutrophils and mobilizes to the plasma membrane following cell stimulation // Am. J. Pathol. 1994. - Vol. 144. -P. 1369-1380.

128. Clark R.A. Activation of the neutrophil respiratory burst oxides // J. Infect. Dis. 1999. - Vol.179. -P.309-317.

129. Clark R.A. The human neutrophil respiratory burst oxides // J. Infect. Dis. -1990. Vol. 161, №12. - P. 1140-1147.

130. Clark RA. Extracellular effects of the myeloperoxidase-hydrogen peroxide-halide system // G. Weissmann. Advances in Inflammation Research. New York: Raven Press, 1983.-P. 107-146.

131. Cloning and sequencing of rabbit leukocyte NADPH oxidase genes reveals a unique p67phox homolog / K. A. Gauss, P. L. Mascolo, D. W. Siemsen et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2002. - Vol. 71. - P. 319-328.

132. Coates Т., Cui W., Torres M. Human polymorphonuclear neutrophils is exhibit two distinct states of motion that utilize deferent cytoskeletal mechanisms // Blood. 1997. - Vol.90, №10. - P. 436.

133. Crawford N., Chahal H., Jackson P. The isolation and characterization of guineapig polymorphonuclear leukocyte actin and myosin // Biochim. Biophys. Acta. 1980. - Vol.626, №1. - P. 218-233.

134. Cryopreservation of hematopoetic progenitor cells with 5-percent dimethyl sulfoxide at -80°C without ratecontrolled freezing / A. Galmes, I. Besalduch, I. Barday et al. // Transfusion. 1996. - Vol. 36, №9. - P. 794-797.

135. Dharmawardhane S., Bokoch G. Rho GTPases and leukocyte cytoskeletal regulation // Current Opinion in Hematology. 1997. - Vol. 4, №1. - P. 12.

136. Differentiation of human basophils: an overview of recent advances and pending questions / M. Arock, E. Schneider, M. Boissan et al. // Journal of Leukocyte Biology. 2002. - Vol. 71. - P. 557-564.

137. Effect of pentoxifylline on polarization and migration of human leukocytes / C. Dominguez-Jimenez, D. Sancho, M. Nieto, M.C. Montoya, O. Barreiro, F. Sanchez-Madrid, R. Gonzalez-Amaro // Journal of Leukocyte Biology. 2002. — Vol. 71.-P. 588-596.

138. Effect of storage on stem cell concentration and viability in cord blood / W. Hubl, J. Iturraspe, C.E. Hutcheson et al. // Blood. 1997.- Vol. 90, №10. - P. 4217.

139. Farrant J., Morris G.J. Thermal shock and dilution shock as the causes of freezing injury // Cryobiology. 1973. - Vol. 10, №2. - P. 134-140.

140. Flower D.R. The lipocalin protein family: structure and function // J. Biochemistry. 1996. - Vol. 318, № 1. - P. 1 -14.

141. Functional activity of blood polymorphonuclear leukocytes as an oxidative stress biomarker in human subjects / S.S. Chan, H.P. Monteiro, G.P. Deucher et al. //Free Radical Biology and Medicine. 1998. -Vol. 24, №9.-P. 1411-1418.

142. Genetic, biochemical, and clinical features of chronic granulomatous disease / B.H. Segal, T.L. Leto, J.I. Gallin et al. // Medicine. 2000. - Vol. 79. - P. 170200.I

143. Grant C.K. A simple method for the cryopreservation of lymphocytes. Retention of specific immune effector functions by frozen-stored cells // Clinical Experimental Immunology. 1976. - Vol. 23, №1. - P. 166-174.

144. Granulocyte Transfusions: eficacy in treating fungal infections in neutropenic patients following bone marrow transplantation / S. Bhatia, J. McCullough, E.H. Репу et. al. // Transfusion. 1994. - Vol. 134. - P. 226-232.

145. Granulocytic cryopreservation: further studies on the pathogenesis of impaired cellular function / D.M. McCarthy, P. Skacel, K. Raja et al. // Br. J. Haematol. 1984. - Vol. 56, №1. - P. 45-54.

146. Growley J.P., Rene A., Valeri C.R. The recovery, structure, and function of human blood leukocytes after freeze-preservation // Cryobiology. 1974. - Vol. 11, №5.-P. 395-409.

147. Haberland M.E., Mottino G. Le M., Frank J.S. Sequestration of aggregated LDL by macrophages studied with freeze-etch electron microscopy // J. Lipid. Res. 2001. - Vol. 42, №4. - P. 605-619.

148. Hampton M.B., Kettle A.J., Winterbourn C.C. Inside the neutrophil phagosom: oxidants, myeloperoxidase and bacterial killing // Blood. 1998. - Vol. 92,№9.-P. 3007-3017.

149. Hastie R. Ultrastructure of human basophil leukocytes studied after spray freezing and freeze-substitution // Lab. Invest. 1990. - Vol. 62, №1. - P. 119-130.

150. Hayhoe F.G.J., Quaglino D. Haematological Cytochemistry. Churchill Livingston. Edinburgh, London. New York, 1980. P. 55-56.

151. Hill R.S., Kennedy M., Mackinder C. Nitroblue tetrazolium (NBT) activity in human leucocytes after freezing // Pathology. 1978. - Vol. 10, №1. - P. 69-75.

152. Human neutrophil granule heterogeneity: immunolocalization studies using cryofixed, dried and embedded specimens / S.A. Livesey, E.S. Buescher, G.L. et al. // Scanning Microsc. Suppl. 1989. Vol. 3. - P. 231-240.

153. Kjeldersen L. Gelatinase granules in human neutrophils // European Journal Hematology. 1995. - Vol. 54, №56. - P. 9-30.

154. Klebanoff S.J. Mieloperoxidase: occurrence and biological function // Peroxidases in Chemistiy and Biology / Eds Everse J., Everse K.E., Grisham M.B. Boca Ration.: CRC Press, 1992. Vol. 1. - P. 571-589.

155. Magnusson U., Hoist H.J. Assaying granulocyte phagocytosis by chemiluminescence: Effect of storage time and temperature of blood samples // Vet. Med. B. 1998. - Vol. 45, №4. - P. 217-222.

156. Makino M., Baba M. A cryopreservation method of human peripheral blood mononuclear cells for efficient production of dendritic cells // Scand. J. Immunol. 1997. - Vol. 45, №6. - P. 618-622.

157. May R.C., Machesky L.M. Phagocytosis and the actin cytoskeleton // Journal of Cell Science. 2001. - Vol. 114, №6.-P. 1061-1077.

158. Mazur P. Cryobiology. The freezing of biological system // Science. 1970. -Vol. 169, №5135.-P. 939-949.

159. McCaa C., Diller K.R., Aggarwal S.J., Takahashi T. Cryomicroscopic determination of the membrane osmotic properties of human monocytes at subfreezing temperatures // Cryobiology. 1991. - Vol. 28, №4. - P. 391-399.

160. Merymen H.T. Crioprotectiv agents: A review //Cryobiology. 1971. - Vol. 3, №2, - P. 173-183.

161. Merymen H.T. Freezing injure and its prevention in living cells // Annu. Rev. Biophysical andBioeng. 1974.-Vol.3.-P.341-363.

162. Механизмы воспаления и активации лейкоцитов / Н. АН, В. Haribabu, R. М. Richardson, R. Snyderman // Medical Clinics of North America. 1997. -Vol. 81, №1.-P. 15-28.

163. Morfological investigation of human blood neutrophil phagocytosys in vitro by AFM / S.N. Pleskova, M.I. Zaslavzkaja, Yu.Yu. Guschina et al. // Physics of Low-Dimensional Structures. 2001. - Vol. 3. - P. 229-236.

164. Myhrvold V., Morland B. The use of frozen monocytes in phagocytosis studies // Acta. Patho.l Microbiol. Immunol. Scand. 1985. - Vol. 93, №2. - P. 43-48.

165. Nakanishi M. Rapid reconstitution of a transmembrane protein into supported planar lipid membranes // FEBS Lett. 1984. - Vol. 176, №2. - P. 385388.

166. Neppert J. Therapie mit Granulozyten // Transfiisionsmedizin. Berlin: Verlag-Springer, 1996. - P. 339-344.

167. Nesterova I.V., Kolesnikova N.V. Current Views on the Role of Neutrophil Granulocyte System // Russ. J. Immunol. 1999. - Vol. 4, №3. - P. 229-233.

168. Nishimura M., Mitsunaga S., Juji T. Frozen-stored granulocytes can be used for an immunofluorescence test to detect granulocyte antibodies // Transfusion. -2001.-Vol. 41,№10.-P. 1268-1272.

169. On the problem of dehydration and intracellular crystallization during freezing of cell suspension / N.S. Pushkar, Yu.A. Itkin, V.L. Bronshtein et al. // Ibid. -1976. Vol. 13, №2. - P. 147-152.

170. Pennell C.A. Heat shock proteins in immune response in the Fall of 2004 // Immunology. 2005. - Vol. 114, №3. - P. 297-300.

171. Pettit E.J., Fay F.S. Cytosolic Free Calcium and the Cytoskeleton in the Control of Leukocyte Chemotaxis // Physiological Reviews. 1998. - Vol. 78, №4. - P. 949-967.

172. Priming of human neutrophil respiratory burst by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) involves partial phosphorylation of p47(phox) / P.M. Dang, C. Dewas, M. Gaudry et al. // J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274.-P. 20704-20708.

173. Randomized trial of granulocyte transfusions versus intravenous immuneglobulin therapy for neonatal neutropenia and sepsis / M.S. Cairo, C.C. Worchester, R.W. Rset et. al. // J.Pediatr. 1992. - Vol. 120. - P. 281-285.

174. Risom L., Knudsen L.E. Use of cryopreserved peripheral mononuclear blood cells in biomonitoring // Mutat. Res. 1999. - Vol. 440, №2. - P. 131-138.

175. Role of the liver in regulating numbers of circulating neutrophils / J. Shi, G. E. Gilbert, Y. Kokubo, T. Ohashi // Blood. 2001. - Vol. 98, №4. - P. 1226-1230.

176. Schreck R. A method for counting the viable cells in normal and malignant cell suspension//Ann. J. Cancer 1936. - Vol. 28-P. 389-391.

177. Scheiwe M.W., Korber C. Quantitative cryomicroscopic analysis of intracellular freezing of granulocytes without cryoadditive // Cryobiology. 1987. - Vol. 24, №5. - P. 473-483.

178. Schierbeek A., Measuring the invisible world. The life and works of A. van Leeuwenhoek. L. - N. Y., 1959. - P. 259.

179. Shimada K., Asahia E. Visualization of intracellular ice crystals formed in very rapidly frozen cells at -27°C // Cryobiology. 1975. - Vol. 12, №3. - P. 209218.

180. Siegenthaler R.K., Christen P. The importance of having thermosensor control in the DnaK chaperone system // J. Biol. Chem. 2005. - № 10. - P. 8057.

181. Signal transduction and cytoskeletal activation in the neutrophils / G.M. ■if Omann, R.A. Allen, G.M. Bokoch et al. // Physiol. Rev. 1987. - Vol. 67, №1.1. P. 285-319.

182. Signaling mechanisms of enhanced neutrophil phagocytosis and chemotaxis by the polysaccharide purified from Ganoderma lucidum / M.J. Hsu, S.S. Lee, S.T. Lee, W.W. Lin // British Journal of Pharmacology. 2003. - Vol. 139. - P. 289298.

183. Signaling to localized degranulation in neutrophils adherent to immune complexes / C. Naucler, S. Grinstein, R. Sundler, H. Tapper // Journal of Leukocyte Biology. 2002. - Vol. 71. - P. 701-710.-ft

184. Singer SJ. A fluid lipid-globular protein mosaic model of membrane structure//Ann. New York Acad. Sci.-1972.-Vol. 195.-P. 113-115.

185. Souzu H. The phospholipid degradation and cellular injury oaused by freeze-thawing or freeze-drying of yeast // Cryobiology. 1973. - Vol. 10, №5. -P. 427-431.

186. Srivastava P.K. Immunotherapy for human cancer using heat shock protein-Peptide complexes // Curr. Oncol. Rep. 2005. - Vol. 7, №2. - P. 104-108.

187. Storage of macrophages at -196 degrees С. / B. Lukomska, W.L. Olszewski, B. Pawtel et al. //Arch. Immunol. Ther. Exp. 1978. - Vol. 26, №1. -P. 417-422.

188. Taylor M.J., Bank H.L. Function of lymphocytes and macrophages after cryopreservation by procedures for pancreatic islets: potential for reducing tissue immunogenicity // Cryobiology. 1988. - Vol. 25, №1. - P. 1-17.

189. Triggle D.J. Some aspects of the role of lipids in lipid-protein interaction and cell membrane structure and function //Recent Progr. Surface Sci. 1970. -Vol.3, №4.-P. 273-290.

190. Venkataraman M., Westerman M.P. Effects of cryopreservation on the mononuclear cells of patients with lung cancer and normal controls // Cryobiology. 1987. - Vol. 24, №2. - P. 103-111.

191. Weiner R.S., Normann S.J. Functional integrity of cryopreserved human monocytes // J. Natl. Cancer. Inst. 1981. - Vol. 66, №2. - P. 255-260.

192. Zhang Q., Tiersch T. R. Cryopreservation of leucocytes of channel catfish gor subsequent cytogenetic analysis // J. Fish. Biol. 1995. - P. 1016-1025.

193. Список опубликованных работ по теме диссертации

194. Щеглова О.О. Функциональное состояние лейкоцитов человека, вышедших из холодового анабиоза при -40°С / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, С.В. Утемов // Там же.- С.45-46.

195. Щеглова О.О. Фагоцитарная активность нейтрофилов крови человека, консервированных с хладоограждающим раствором при умеренно-низких температурах / О.О. Щеглова, Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, С.В. Утемов, О.Н. Деветьярова, Д.А. Карпов // Там же. С.91-92.

196. Патент РФ №2240000. Хладоограждающий раствор для замораживания лейкоцитов при субумеренно-низкой температуре / Е.П. Сведенцов, Т.В. Туманова, О.Н. Деветьярова, С.В. Утемов, А.А. Костяев, О.О. Щеглова. Заявлено 4.12.2002; Опубл. 20.11.2004, Бюл.32.

Информация о работе

Щеглова, Оксана Олеговна
кандидата биологических наук
Киров, 2005
ВАК 03.00.13

Диссертация

Функциональное состояние лейкоцитов после выхода из холодового анабиоза при умеренно-низкой температуре - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы